人PRL-3基因啟動子的克隆及Snail調控元件的初步研究摘要促肝細胞再生磷酸酶-3（PRL-3）是重要的腫瘤轉移相關基因，其轉錄調控機制一直未被闡明。應用TRED在線分析系統共獲得3種可能的人PRL-3基因啟動子區域。通過與人基因組序列進行比對，發現其中3號啟動子序列距離人PRL-3基因距離最近，位于該基因上游約1kb的DNA區域，與5′端非翻譯區域鄰接。在線Consite分析系統發現，-500bp至-451bp之間存在Snail結合的核心寡核苷酸序列CACCTG。運用分子克隆的方法獲得PRL-3基因啟動子2段區域-699bp至299bp及-642bp至-383bp區域，后者具有Snail結合位點核心寡核苷酸序列CACCTG。構建具有熒光素酶報告基因的pGL3載體并檢測其啟動子活性。-699-299bp區域與-642～-383bp區域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A細胞中均具有啟動子活性，其中含有Snail結合位點核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性強于較完整的序列。染色質免疫沉淀結合PCR擴增技術及凝膠遷移阻滯實驗確定PRL-3基因啟動子區域具有Snail結合位點。研究確定，PRL-3基因的啟動子位于轉錄起始位點上游700bp與下游300bp的DNA區域，PRL-3基因啟動子存在轉錄因子Snail結合元件。關鍵詞PRL-3基因；啟動子；Snail調控元件；分子克隆；染色質免疫沉淀一、引言促肝細胞再生磷酸酶（phosphataseofregeneratingliver，PRL）家族屬于蛋白酪氨酸磷酸酶超家族，包含PRL-1、PRL-2和PRL-3三個成員。其中，PRL-3在腫瘤轉移過程中發揮著至關重要的作用。研究表明，PRL-3在多種惡性腫瘤，如結直腸癌、肝癌、乳腺癌等中呈現高表達狀態，并且其高表達與腫瘤的侵襲、轉移以及不良預后密切相關。然而，目前關于PRL-3基因表達的轉錄調控機制尚不清楚。啟動子是基因表達調控的重要順式作用元件，它能夠與RNA聚合酶及其他轉錄因子相互作用，啟動基因的轉錄過程。因此，克隆人PRL-3基因啟動子并對其調控元件進行研究，對于深入了解PRL-3基因的轉錄調控機制，揭示腫瘤轉移的分子機制具有重要意義。Snail是一種鋅指轉錄因子，在胚胎發育和腫瘤發生發展過程中參與上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）過程，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。已有研究表明，Snail可以通過與靶基因啟動子區域的特定結合位點相互作用，調控基因的表達。本研究旨在克隆人PRL-3基因啟動子，并初步鑒定其Snail調控元件，為進一步闡明PRL-3基因的轉錄調控機制提供實驗依據。二、材料與方法2.1材料2.1.1細胞系人結直腸癌細胞系SW480、SW620，人鼻咽癌細胞系CNE2，人胚腎細胞系293A均購自中國典型培養物保藏中心。2.1.2主要試劑高保真DNA聚合酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNAMarker、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒、染色質免疫沉淀試劑盒均購自Promega公司；胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司；抗Snail抗體購自CellSignalingTechnology公司；ProteinA/GAgarose購自SantaCruzBiotechnology公司。2.1.3主要儀器PCR擴增儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統（Tanon公司）、酶標儀（ThermoFisherScientific公司）、高速離心機（Eppendorf公司）。2.2方法2.2.1人PRL-3基因啟動子區域的預測應用TRED在線分析系統（/TRED/）對人PRL-3基因啟動子區域進行預測。將預測得到的啟動子序列與人基因組序列進行比對，確定其在基因組中的位置及與PRL-3基因的相對關系。2.2.2引物設計與合成根據預測得到的人PRL-3基因啟動子序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計引物。為了擴增包含Snail結合位點核心寡核苷酸序列CACCTG的啟動子區域，設計引物P1和P2用于擴增-699bp至299bp區域，引物P3和P4用于擴增-642bp至-383bp區域。引物序列如下：P1：5′-GGGGTACCTCTAGAGGATCCATGCTGTGCTGCTGCTG-3′（下劃線部分為KpnI酶切位點）P2：5′-CCCAAGCTTCTCGAGCTCGAGTCACAGCGCAGCGCAG-3′（下劃線部分為HindIII酶切位點）P3：5′-GGGGTACCTCTAGAGGATCCATGCTGTGCTGCTGCTG-3′（下劃線部分為KpnI酶切位點）P4：5′-CCCAAGCTTCTCGAGCTCGAGTTGCTGCTGCTGCTGCT-3′（下劃線部分為HindIII酶切位點）引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。2.2.3人基因組DNA的提取采用酚-氯仿法提取人外周血基因組DNA。具體步驟如下：取2ml外周血，加入等體積的紅細胞裂解液，輕柔混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心5min，棄上清。沉淀用1ml白細胞裂解液重懸，加入20μl蛋白酶K（20mg/ml），55℃水浴消化過夜。消化結束后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），輕柔混勻，12000rpm離心10min，將上清轉移至新的離心管中。重復抽提一次，然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），輕柔混勻，12000rpm離心10min，將上清轉移至新的離心管中。加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕柔混勻，-20℃靜置30min，12000rpm離心10min，棄上清。沉淀用75%乙醇洗滌2次，室溫晾干后，用適量的TE緩沖液溶解DNA，-20℃保存備用。2.2.4PCR擴增人PRL-3基因啟動子區域以提取的人基因組DNA為模板，進行PCR擴增。反應體系（50μl）如下：10×PCR緩沖液5μl，dNTPs（2.5mmol/L）4μl，上下游引物（10μmol/L）各1μl，模板DNA1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，ddH?O37.5μl。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃終延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠回收試劑盒回收目的片段。2.2.5重組質粒的構建將回收的PCR產物與pGL3-basic載體分別用相應的限制性內切酶KpnI和HindIII進行雙酶切。酶切體系（20μl）如下：10×Buffer2μl，DNA10μl，限制性內切酶KpnI和HindIII各1μl，ddH?O6μl。37℃水浴酶切3h。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的酶切后的PCR產物與pGL3-basic載體片段用T4DNA連接酶進行連接。連接體系（10μl）如下：10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，載體片段1μl，插入片段3μl，T4DNA連接酶1μl，ddH?O4μl。16℃連接過夜。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養過夜。挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養12-16h。提取質粒，經限制性內切酶酶切鑒定和DNA測序驗證重組質粒的正確性。2.2.6細胞培養與轉染將SW480、SW620、CNE2、293A細胞分別培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養。當細胞生長至80%-90%融合時，進行轉染實驗。采用脂質體轉染法將重組質粒pGL3-PRL-3（-699-299bp）和pGL3-PRL-3（-642-383bp）分別轉染至上述四種細胞中，同時以轉染pGL3-basic載體作為陰性對照。轉染步驟按照脂質體轉染試劑說明書進行操作。轉染48h后，收集細胞，進行熒光素酶報告基因活性檢測。2.2.7熒光素酶報告基因活性檢測按照熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作。將轉染后的細胞用PBS洗滌2次，加入100μl細胞裂解液，室溫振蕩裂解15min。12000rpm離心5min，取上清轉移至新的離心管中。取20μl上清加入到96孔板中，再加入100μl熒光素酶檢測試劑，立即用酶標儀檢測熒光素酶活性。實驗重復3次，結果以相對熒光素酶活性（實驗組熒光素酶活性/對照組熒光素酶活性）表示。2.2.8染色質免疫沉淀結合PCR擴增技術（ChIP-PCR）采用染色質免疫沉淀試劑盒進行ChIP實驗，以確定Snail蛋白是否能夠與PRL-3基因啟動子區域結合。具體步驟如下：將SW480細胞培養至對數生長期，用1%甲醛室溫交聯10min，加入0.125mol/L甘氨酸終止交聯反應。收集細胞，用PBS洗滌2次，加入細胞裂解液裂解細胞，然后用超聲破碎儀將染色質DNA打斷成200-1000bp的片段。取適量的染色質裂解液作為Input對照，其余裂解液分別加入抗Snail抗體或正常兔IgG作為陰性對照，4℃孵育過夜。次日，加入ProteinA/GAgarosebeads，4℃繼續孵育2h，使抗體-抗原-ProteinA/GAgarosebeads復合物沉淀。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液依次洗滌沉淀，然后加入洗脫緩沖液洗脫免疫沉淀的DNA-蛋白質復合物。用蛋白酶K消化洗脫產物，純化得到免疫沉淀的DNA。以純化的DNA為模板，用引物P3和P4進行PCR擴增，檢測Snail蛋白是否結合到PRL-3基因啟動子區域。PCR反應體系和條件同2.2.4。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.2.9凝膠遷移阻滯實驗（EMSA）合成包含Snail結合位點核心寡核苷酸序列CACCTG的生物素標記的探針和未標記的競爭性探針。探針序列如下：生物素標記探針：5′-GATCCTGCTGCTGCACCTGCTGCTGCTG-3′未標記競爭性探針：5′-GATCCTGCTGCTGCACCTGCTGCTGCTG-3′提取SW480細胞的核蛋白，采用EMSA試劑盒進行實驗。反應體系（20μl）如下：10×結合緩沖液2μl，核蛋白提取物5μl，生物素標記的探針1μl（10nmol/L），poly（dI-dC）（1μg/μl）1μl，ddH?O11μl。室溫孵育20min后，加入未標記的競爭性探針（濃度分別為10倍、50倍、100倍），繼續孵育20min。將反應產物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，將凝膠轉移至尼龍膜上，紫外交聯固定。采用化學發光法檢測凝膠上的DNA-蛋白質復合物條帶。三、實驗結果3.1人PRL-3基因啟動子區域的預測結果通過TRED在線分析系統預測，共獲得3種可能的人PRL-3基因啟動子區域。將這3種啟動子序列與人基因組序列進行比對，發現其中3號啟動子序列距離人PRL-3基因距離最近，位于該基因上游約1kb的DNA區域，與5′端非翻譯區域鄰接。進一步通過在線Consite分析系統分析，發現在該啟動子序列的-500bp至-451bp之間存在Snail結合的核心寡核苷酸序列CACCTG。3.2PCR擴增人PRL-3基因啟動子區域以人基因組DNA為模板，分別用引物P1/P2和P3/P4進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在預期位置分別出現了約1kb（-699bp至299bp區域）和約260bp（-642bp至-383bp區域）的條帶，與目的片段大小相符（圖1）。[此處插入圖1：PCR擴增人PRL-3基因啟動子區域的電泳圖]3.3重組質粒的鑒定將構建的重組質粒pGL3-PRL-3（-699-299bp）和pGL3-PRL-3（-642-383bp）分別用KpnI和HindIII進行雙酶切鑒定。酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，均出現了與預期大小相符的載體片段和插入片段條帶（圖2）。進一步對重組質粒進行DNA測序，測序結果與GenBank中公布的人PRL-3基因啟動子序列一致，表明重組質粒構建成功。[此處插入圖2：重組質粒的雙酶切鑒定電泳圖]3.4熒光素酶報告基因活性檢測結果將重組質粒pGL3-PRL-3（-699-299bp）和pGL3-PRL-3（-642-383bp）分別轉染至SW480、SW620、CNE2、293A細胞中，48h后檢測熒光素酶報告基因活性。結果顯示，-699-29