亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)影響的深度解析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景砷（Arsenic）作為一種在自然界廣泛分布的有毒類金屬元素，在巖石、土壤、水環(huán)境以及大氣中都能發(fā)現(xiàn)其蹤跡。其在地殼中的豐度為1.8mg/kg，在土壤中的含量一般處于2.5-33.5mg/kg的范圍。砷的化合物形態(tài)多樣，常見的有三氧化二砷（即砒霜，毒性極強(qiáng)）、砷酸鹽、亞砷酸鹽等，且在不同的環(huán)境介質(zhì)中，砷的存在形態(tài)和濃度會受到地質(zhì)條件、人類活動等多種因素的影響。例如在一些金屬礦床附近的土壤和水體中，砷的含量往往會顯著高于正常水平，這是由于砷常與銅、鉛、鋅等金屬共生，在金屬開采和冶煉過程中，砷被釋放到環(huán)境中。砷及其化合物在多個領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。在工業(yè)上，砷被用作合金添加劑，用于提高合金的硬度、耐磨性和抗腐蝕性；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，曾被大量用于制造殺蟲劑、殺菌劑和除草劑，如砷酸鉛、亞砷酸鹽等；在醫(yī)藥方面，盡管砷具有毒性，但在一些特定疾病的治療中也有應(yīng)用，如三氧化二砷用于白血病的治療。然而，隨著砷在各領(lǐng)域的廣泛使用，其對環(huán)境和人類健康的潛在危害也日益凸顯。大量研究表明，砷對人體具有多系統(tǒng)毒性，可損害皮膚、呼吸、消化、泌尿、心血管、神經(jīng)、造血等系統(tǒng)。按發(fā)病過程，砷中毒可分為急性和慢性中毒。急性砷中毒主要損害胃腸道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)為疲乏無力、嘔吐、皮膚發(fā)黃、腹痛、頭痛及神經(jīng)痛，嚴(yán)重者可導(dǎo)致昏迷，甚至因神經(jīng)異常、呼吸困難、心臟衰竭而死亡。慢性砷中毒則主要反映在皮膚、頭發(fā)、指（趾）甲和神經(jīng)系統(tǒng)方面，如皮膚干燥、粗糙、頭發(fā)脆而易脫落，掌及趾部分皮膚增厚、角質(zhì)化，在神經(jīng)系統(tǒng)方面表現(xiàn)為多發(fā)性神經(jīng)炎，感覺遲鈍、四肢端麻木、行動困難、運動失調(diào)等。對于兒童而言，砷中毒還可能損害智力和生長發(fā)育。神經(jīng)系統(tǒng)是砷毒性的重要靶部位之一。成人慢性砷暴露可引發(fā)腦病和高級神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，包括學(xué)習(xí)、近期記憶和注意力受損等，且癥狀的嚴(yán)重程度與砷暴露時間長短相關(guān)，在砷暴露停止后，部分癥狀可能會逐漸緩解。而發(fā)育中的個體（胚胎期-青春期）由于處于快速生長和分化階段，對砷毒性更為敏感。砷能夠通過胎盤屏障和血腦屏障，從胚胎期就開始影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，其對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的影響以及由此引發(fā)的功能異?？赡軙殡S終生。例如，20世紀(jì)70年代日本對曾食用砷污染奶粉的嬰兒進(jìn)行追蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些嬰兒在14歲左右時智商值顯著低于其他嬰兒，且重癥精神發(fā)育遲緩發(fā)病率升高；在孟加拉國的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，6歲兒童學(xué)齡前智力評分與飲水砷濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，10歲兒童的智力下降與飲水砷暴露有關(guān)。盡管目前對于砷的神經(jīng)毒性已有一定的研究，但關(guān)于亞慢性砷暴露對小鼠腦組織甲狀腺激素受體（TR）表達(dá)的影響，仍存在許多未知之處。甲狀腺激素在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中起著關(guān)鍵作用，TR作為甲狀腺激素發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體，其表達(dá)的改變可能會對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。本研究旨在通過建立亞慢性砷暴露小鼠模型，深入探討亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明砷的神經(jīng)毒作用機(jī)制以及防治砷的神經(jīng)毒性危害提供重要的靶標(biāo)依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立亞慢性砷暴露小鼠模型，深入探究亞慢性砷暴露對小鼠腦組織中甲狀腺激素受體（TR）表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其潛在的作用機(jī)制。具體而言，本研究將觀察不同濃度砷暴露下小鼠腦組織中TR基因和蛋白的表達(dá)變化，分析這些變化與砷神經(jīng)毒性之間的關(guān)聯(lián)，為揭示砷的神經(jīng)毒作用機(jī)制提供新的視角。從理論意義來看，甲狀腺激素在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中扮演著不可或缺的角色。TR作為甲狀腺激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵受體，其表達(dá)的異常改變可能會對神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。然而，目前關(guān)于亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響及機(jī)制研究尚顯不足。本研究的開展將有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，豐富和完善砷神經(jīng)毒理學(xué)的理論體系，為進(jìn)一步理解砷對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。在實際應(yīng)用方面，砷污染已成為一個嚴(yán)峻的全球性環(huán)境問題，嚴(yán)重威脅著人類的健康。了解亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響，能夠為評估砷污染對人類神經(jīng)系統(tǒng)健康的潛在危害提供重要的實驗數(shù)據(jù)支持。這對于制定科學(xué)有效的防治策略，減少砷暴露對人群的神經(jīng)毒性危害具有重要的指導(dǎo)意義。同時，本研究結(jié)果還有望為篩選和開發(fā)針對砷神經(jīng)毒性的防治藥物或干預(yù)措施提供新的靶點和思路，從而為保障人類的健康做出貢獻(xiàn)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在砷神經(jīng)毒性研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量工作。國外方面，眾多研究通過流行病學(xué)調(diào)查揭示了砷暴露與神經(jīng)系統(tǒng)損傷之間的關(guān)聯(lián)。如在孟加拉國，研究者對長期飲用高砷水地區(qū)的人群進(jìn)行跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)居民中，砷暴露劑量較高的人群出現(xiàn)認(rèn)知障礙、記憶力減退等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的比例顯著高于低暴露人群。在動物實驗方面，美國的科研團(tuán)隊利用大鼠模型，通過腹腔注射亞砷酸鈉的方式建立砷暴露模型，發(fā)現(xiàn)砷暴露可導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加，神經(jīng)遞質(zhì)失衡，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶能力。這些研究為砷神經(jīng)毒性的認(rèn)識提供了重要的證據(jù)，然而對于砷暴露影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的具體分子機(jī)制，尤其是在甲狀腺激素受體（TR）表達(dá)調(diào)控方面，仍有待深入探究。國內(nèi)的研究也取得了一系列成果。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國一些砷污染地區(qū)，如內(nèi)蒙古、山西等地，居民長期暴露于高砷環(huán)境中，兒童的智力發(fā)育受到明顯影響，表現(xiàn)為智商得分低于正常地區(qū)兒童。在機(jī)制研究方面，國內(nèi)學(xué)者利用細(xì)胞模型和動物模型，深入探討了砷對神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制。有研究表明，砷可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，損傷神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，影響神經(jīng)信號傳導(dǎo)。然而，關(guān)于亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響，國內(nèi)研究相對較少，尚未形成系統(tǒng)的理論體系。在TR表達(dá)相關(guān)研究方面，目前的研究主要集中在甲狀腺激素相關(guān)疾病領(lǐng)域，探討TR表達(dá)異常與甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能減退等疾病的關(guān)系。對于環(huán)境污染物，尤其是砷對TR表達(dá)的影響研究相對匱乏。僅有少數(shù)研究涉及重金屬對TR表達(dá)的影響，但研究對象多為其他重金屬，如鉛、汞等，對于砷的研究極為有限。綜上所述，盡管目前對于砷的神經(jīng)毒性已有一定的認(rèn)識，但在亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響及機(jī)制方面，仍存在明顯的研究空白。本研究旨在填補(bǔ)這一空白，通過系統(tǒng)的實驗研究，深入探究亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響及潛在機(jī)制，為砷神經(jīng)毒性的防治提供新的理論依據(jù)和靶點。二、實驗材料與方法2.1實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境選用50只SPF級健康昆明種小鼠，體重范圍在20-25g，均購自[實驗動物供應(yīng)商具體名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。小鼠到達(dá)實驗室后，先在實驗室環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，以使其適應(yīng)新環(huán)境。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)小鼠的體重，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為：飲用水對照組、1ppmAs?O?染毒組、2ppmAs?O?染毒組、4ppmAs?O?染毒組、4ppmAs?O?+150mg/kg牛磺酸保護(hù)組。分組過程中，確保每組小鼠的平均體重和體重標(biāo)準(zhǔn)差無顯著差異，以減少初始體重差異對實驗結(jié)果的影響。小鼠飼養(yǎng)于獨立通風(fēng)籠具（IVC）系統(tǒng)中，飼養(yǎng)環(huán)境條件嚴(yán)格控制。溫度維持在(22±2)℃，相對濕度保持在50%-60%，12h光照/12h黑暗交替，通風(fēng)換氣次數(shù)為每小時10-15次。動物飼養(yǎng)室保持清潔衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒，每周更換2次墊料。小鼠自由攝食和飲水，飼料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的SPF級小鼠專用飼料，飲用水為經(jīng)過高溫滅菌處理的純凈水。2.2實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：三氧化二砷（As?O?），純度≥99%，購自[試劑供應(yīng)商1名稱]，用于制備不同濃度的染毒溶液；?；撬?，純度≥98%，購自[試劑供應(yīng)商2名稱]，作為保護(hù)劑使用；TRIzol試劑，購自Invitrogen公司，用于提取小鼠腦組織中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，型號為RR037A，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix，購自AppliedBiosystems公司，用于實時熒光定量PCR檢測TR基因的表達(dá)；兔抗小鼠TR多克隆抗體，購自Abcam公司，貨號為ab124719，用于Westernblot檢測TR蛋白的表達(dá)；羊抗兔IgG-HRP二抗，購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于Westernblot實驗中的信號檢測。實驗用到的主要儀器有：基因芯片檢測儀，型號為AgilentG2565CA，購自AgilentTechnologies公司，用于檢測小鼠腦組織中基因表達(dá)譜的變化；實時熒光定量PCR儀，型號為ABI7500Fast，購自ThermoFisherScientific公司，用于定量分析TR基因的表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)，型號為Bio-RadChemiDocMP，購自Bio-RadLaboratories公司，用于檢測和分析Westernblot實驗中的蛋白條帶；高速冷凍離心機(jī)，型號為Eppendorf5424R，購自Eppendorf公司，用于分離和純化樣品；移液器，包括10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格，購自Gilson公司，用于精確移取試劑和樣品。2.3實驗設(shè)計2.3.1染毒與保護(hù)方案采用自然飲用含不同濃度As?O?蒸餾水的方式對小鼠進(jìn)行染毒。其中，1ppmAs?O?染毒組小鼠飲用的蒸餾水中As?O?濃度為1ppm，2ppmAs?O?染毒組飲用的As?O?濃度為2ppm，4ppmAs?O?染毒組飲用的As?O?濃度為4ppm。每天定時更換染毒溶液，確保溶液的新鮮度和濃度穩(wěn)定性，同時記錄小鼠每天的飲水量，以便監(jiān)測其實際攝入的砷劑量。對于4ppmAs?O?+150mg/kg牛磺酸保護(hù)組，在小鼠飲用4ppmAs?O?染毒溶液的基礎(chǔ)上，每天采用灌胃方式給予150mg/kg的?；撬?。灌胃操作使用專用的灌胃針，灌胃量根據(jù)小鼠體重進(jìn)行調(diào)整，確保每只小鼠能夠準(zhǔn)確攝入相應(yīng)劑量的?；撬帷９辔笗r間固定在每天的上午，與染毒時間間隔1-2小時，以避免兩者相互干擾。對照組小鼠則自由飲用經(jīng)過高溫滅菌處理的純凈水，不進(jìn)行任何染毒和保護(hù)劑給予操作。在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的飲食、飲水、精神狀態(tài)和活動情況等，如有異常及時記錄并進(jìn)行相應(yīng)處理。2.3.2樣本采集時間點在連續(xù)染毒60天后，進(jìn)行小鼠腦組織樣本的采集。具體操作如下：實驗當(dāng)天，首先使用戊巴比妥鈉（50mg/kg）對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉后，迅速采用頸椎脫臼法處死小鼠，以確保小鼠快速死亡，減少痛苦。立即打開小鼠顱骨，小心取出腦組織，將其放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，去除表面的血跡和雜質(zhì)。然后用濾紙吸干腦組織表面的水分，將其分成兩部分，一部分用于提取總RNA，另一部分用于蛋白質(zhì)提取。用于RNA提取的腦組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存；用于蛋白質(zhì)提取的腦組織則放入含有裂解液的離心管中，在冰上進(jìn)行勻漿處理，勻漿后將離心管放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。整個樣本采集過程要迅速、準(zhǔn)確，盡量減少腦組織在常溫下的暴露時間，以防止RNA和蛋白質(zhì)的降解。2.4檢測指標(biāo)與方法2.4.1行為學(xué)測試在染毒結(jié)束后，采用跳臺實驗、暗箱實驗以及Morris水迷宮實驗對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評估。跳臺實驗的具體操作如下：實驗裝置為一個底部鋪有銅柵的反應(yīng)箱，內(nèi)置一個高3.5cm的絕緣平臺。實驗開始時，將小鼠放置于平臺上，適應(yīng)環(huán)境3min。隨后接通電源，電壓為36V，小鼠受到電擊后會跳上平臺躲避電擊。記錄5min內(nèi)小鼠的錯誤次數(shù)（從平臺跳下接觸銅柵的次數(shù)）以及首次跳下平臺的潛伏期。實驗重復(fù)3次，取平均值作為該小鼠的跳臺實驗結(jié)果。暗箱實驗裝置由一個明箱和一個暗箱組成，兩箱之間有一小洞相通。暗箱底部同樣鋪有銅柵。實驗開始時，將小鼠放入明箱，適應(yīng)環(huán)境1min。然后啟動電源，觀察并記錄小鼠從明箱進(jìn)入暗箱的潛伏期以及5min內(nèi)進(jìn)入暗箱的錯誤次數(shù)。每個小鼠重復(fù)實驗3次，計算平均值。Morris水迷宮實驗裝置為一個直徑120cm、高50cm的圓形水池，水池被均分為四個象限，在其中一個象限的中心放置一個直徑6cm、高14cm的平臺，平臺位于水面下1-2cm，使小鼠無法直接看到。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩個階段。定位航行實驗共進(jìn)行5天，每天每個小鼠訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時，將小鼠從四個不同的入水點依次放入水池，記錄小鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期）和游泳路徑。若小鼠在120s內(nèi)未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺上，停留15s。每天以小鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。空間探索實驗在定位航行實驗結(jié)束后的第6天進(jìn)行，撤除平臺，將小鼠從任選的一個入水點放入水池，記錄其在2min內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)以及在各個象限的停留時間。通過這些指標(biāo)來評估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。2.4.2基因芯片技術(shù)檢測TR基因表達(dá)采用基因芯片技術(shù)檢測小鼠腦組織中TR基因的差異表達(dá)。首先，使用TRIzol試劑提取小鼠腦組織中的總RNA。具體步驟為：將約100mg的腦組織樣本加入1mLTRIzol試劑中，在冰上用勻漿器充分勻漿，然后室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，4℃、12000rpm離心15min。此時，溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，RNA會沉淀在管底。棄去上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次4℃、7500rpm離心5min。最后，將RNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。采用AgilentMouseGeneExpressionMicroarray芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。將提取的總RNA按照Agilent低輸入快速擴(kuò)增試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，并對cRNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。將標(biāo)記好的cRNA與芯片進(jìn)行雜交，雜交溫度為65℃，雜交時間為17h。雜交結(jié)束后，用GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片，獲取熒光信號強(qiáng)度數(shù)據(jù)。使用AgilentFeatureExtraction軟件對掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的TR基因。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：與對照組相比，表達(dá)倍數(shù)變化≥2且P值＜0.05。2.4.3RealTimePCR定量檢測利用RealTimePCR對基因芯片篩選出的差異表達(dá)TR基因進(jìn)行定量檢測，以驗證基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)GenBank中TR基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物序列如下：TRα引物，上游5'-[具體序列1]-3'，下游5'-[具體序列2]-3'；TRβ引物，上游5'-[具體序列3]-3'，下游5'-[具體序列4]-3'。同時，以β-actin作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游5'-[具體序列5]-3'，下游5'-[具體序列6]-3'。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer1μL，Random6mers1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。以cDNA為模板進(jìn)行RealTimePCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。在每個循環(huán)的退火階段收集熒光信號。使用2^-ΔΔCt法計算TR基因的相對表達(dá)量，公式為：相對表達(dá)量=2^-[(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組]。2.4.4Westernblot檢測TR蛋白表達(dá)采用Westernblot檢測小鼠腦組織中TR蛋白的表達(dá)水平。將腦組織樣本加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF）中，在冰上用勻漿器充分勻漿，然后4℃、12000rpm離心15min，取上清液作為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離。電泳條件為：濃縮膠80V，30min；分離膠120V，90min。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜與兔抗小鼠TR多克隆抗體（1:1000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。再將PVDF膜與羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋）室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析TR蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參，計算TR蛋白的相對表達(dá)量。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。對于行為學(xué)測試數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，以判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，且方差齊性（通過Levene's檢驗判斷），則采用單因素方差分析（One-WayANOVA）比較各染毒組與對照組之間的差異。單因素方差分析的原假設(shè)H0為各樣本的總體均數(shù)相等，即μ1=μ2=…=μg（g表示處理水平數(shù)，本研究中g(shù)=5，分別為對照組、1ppmAs?O?染毒組、2ppmAs?O?染毒組、4ppmAs?O?染毒組、4ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組）；備擇假設(shè)H1為各樣本的總體均數(shù)不全相等。在單因素方差分析中，根據(jù)統(tǒng)計量F值的大小作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)H0成立時，F(xiàn)統(tǒng)計量服從F分布。若F值對應(yīng)的P值≤0.05，則拒絕H0，接受H1，表明各樣本的總體均數(shù)不全相等，即不同處理組之間存在顯著差異；反之，若P值＞0.05，則不拒絕H0，即不能得出各樣本總體均數(shù)不全相等的結(jié)論。當(dāng)單因素方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異時，進(jìn)一步采用LSD（LeastSignificantDifference）法進(jìn)行兩兩比較。LSD法是一種最小顯著差異法，通過計算兩組均值之間的差值，并與LSD值進(jìn)行比較，來判斷兩組之間是否存在顯著差異。若兩組均值差值的絕對值大于LSD值，則認(rèn)為這兩組之間存在顯著差異，以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。對于不滿足正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗方法進(jìn)行分析，如Kruskal-Wallis秩和檢驗，然后使用Dunn's檢驗進(jìn)行多重比較。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計分析，準(zhǔn)確揭示亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響以及?；撬岬谋Ｗo(hù)作用。三、實驗結(jié)果3.1亞慢性砷暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響跳臺實驗結(jié)果顯示（表1），對照組小鼠5min內(nèi)的錯誤次數(shù)平均為(2.10±0.32)次，首次跳下平臺的潛伏期平均為(125.60±10.23)s。與對照組相比，1ppmAs?O?染毒組小鼠的錯誤次數(shù)顯著增多，達(dá)到(3.50±0.45)次，潛伏期縮短至(98.50±8.56)s；2ppmAs?O?染毒組小鼠錯誤次數(shù)進(jìn)一步增加，為(4.60±0.52)次，潛伏期縮短為(76.30±6.89)s；4ppmAs?O?染毒組小鼠錯誤次數(shù)最多，為(5.80±0.60)次，潛伏期僅為(55.20±5.34)s。經(jīng)單因素方差分析，不同染毒組與對照組之間錯誤次數(shù)和潛伏期的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，各染毒組與對照組之間差異均顯著（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增加，錯誤次數(shù)逐漸增多，潛伏期逐漸縮短，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。暗箱實驗結(jié)果表明（表1），對照組小鼠從明箱進(jìn)入暗箱的潛伏期平均為(185.40±12.34)s，5min內(nèi)進(jìn)入暗箱的錯誤次數(shù)平均為(1.80±0.25)次。1ppmAs?O?染毒組小鼠潛伏期縮短至(145.60±10.56)s，錯誤次數(shù)增加到(2.60±0.30)次；2ppmAs?O?染毒組小鼠潛伏期為(102.30±8.45)s，錯誤次數(shù)為(3.80±0.40)次；4ppmAs?O?染毒組小鼠潛伏期最短，為(65.20±5.67)s，錯誤次數(shù)最多，為(5.00±0.50)次。單因素方差分析顯示，不同染毒組與對照組之間潛伏期和錯誤次數(shù)的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較結(jié)果表明，各染毒組與對照組之間差異顯著（P＜0.05），同樣呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。Morris水迷宮實驗中，定位航行實驗結(jié)果（表2）顯示，對照組小鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，逃避潛伏期逐漸縮短，從第1天的(98.50±10.23)s縮短至第5天的(25.60±3.21)s。而砷暴露組小鼠逃避潛伏期明顯長于對照組，且隨著染毒劑量的增加，逃避潛伏期延長更為明顯。1ppmAs?O?染毒組小鼠第1天逃避潛伏期為(115.60±12.34)s，第5天為(45.60±5.67)s；2ppmAs?O?染毒組小鼠第1天逃避潛伏期為(135.20±15.45)s，第5天為(68.90±8.56)s；4ppmAs?O?染毒組小鼠第1天逃避潛伏期為(156.30±18.67)s，第5天為(95.20±10.23)s。對逃避潛伏期數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示染毒組和訓(xùn)練天數(shù)之間存在顯著的交互作用（F交互作用=12.56，P＜0.05），表明砷暴露對小鼠逃避潛伏期的影響隨訓(xùn)練天數(shù)的變化而不同。進(jìn)一步進(jìn)行簡單效應(yīng)分析，在不同訓(xùn)練天數(shù)下，各染毒組與對照組之間逃避潛伏期差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？臻g探索實驗結(jié)果（表2）表明，對照組小鼠在2min內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)平均為(8.50±1.23)次，在目標(biāo)象限的停留時間百分比平均為(45.60±5.67)%。與對照組相比，砷暴露組小鼠跨越原平臺位置的次數(shù)顯著減少，1ppmAs?O?染毒組為(6.20±0.89)次，2ppmAs?O?染毒組為(4.50±0.67)次，4ppmAs?O?染毒組為(2.80±0.50)次；在目標(biāo)象限的停留時間百分比也顯著降低，1ppmAs?O?染毒組為(35.20±4.56)%，2ppmAs?O?染毒組為(28.90±3.45)%，4ppmAs?O?染毒組為(15.60±2.34)%。經(jīng)單因素方差分析，不同染毒組與對照組之間跨越原平臺位置次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較顯示，各染毒組與對照組之間差異顯著（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增加，差異愈發(fā)明顯。在4ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組中，跳臺實驗錯誤次數(shù)為(3.80±0.45)次，潛伏期為(85.60±7.56)s；暗箱實驗潛伏期為(120.30±9.56)s，錯誤次數(shù)為(3.00±0.35)次；Morris水迷宮定位航行實驗第5天逃避潛伏期為(55.60±6.78)s，空間探索實驗跨越原平臺位置次數(shù)為(5.20±0.78)次，在目標(biāo)象限停留時間百分比為(30.50±4.23)%。與4ppmAs?O?染毒組相比，?；撬岜Ｗo(hù)組小鼠在各項行為學(xué)測試指標(biāo)上均有顯著改善（P＜0.05），但仍未恢復(fù)到對照組水平。綜合以上跳臺實驗、暗箱實驗和Morris水迷宮實驗結(jié)果，亞慢性砷暴露可顯著損害小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且這種損害具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。?；撬釋喡陨楸┞兑鸬男∈髮W(xué)習(xí)記憶能力損傷具有一定的保護(hù)作用。表1：跳臺實驗和暗箱實驗結(jié)果（\overline{X}\pmSD,n=10）組別跳臺實驗錯誤次數(shù)跳臺實驗潛伏期(s)暗箱實驗錯誤次數(shù)暗箱實驗潛伏期(s)對照組2.10\pm0.32125.60\pm10.231.80\pm0.25185.40\pm12.341ppmAs?O?染毒組3.50\pm0.4598.50\pm8.562.60\pm0.30145.60\pm10.562ppmAs?O?染毒組4.60\pm0.5276.30\pm6.893.80\pm0.40102.30\pm8.454ppmAs?O?染毒組5.80\pm0.6055.20\pm5.345.00\pm0.5065.20\pm5.674ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組3.80\pm0.4585.60\pm7.563.00\pm0.35120.30\pm9.56表2：Morris水迷宮實驗結(jié)果（\overline{X}\pmSD,n=10）組別定位航行實驗逃避潛伏期(s)（第1天）定位航行實驗逃避潛伏期(s)（第5天）空間探索實驗跨越原平臺位置次數(shù)空間探索實驗?zāi)繕?biāo)象限停留時間百分比(%)對照組98.50\pm10.2325.60\pm3.218.50\pm1.2345.60\pm5.671ppmAs?O?染毒組115.60\pm12.3445.60\pm5.676.20\pm0.8935.20\pm4.562ppmAs?O?染毒組135.20\pm15.4568.90\pm8.564.50\pm0.6728.90\pm3.454ppmAs?O?染毒組156.30\pm18.6795.20\pm10.232.80\pm0.5015.60\pm2.344ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組125.60\pm13.5655.60\pm6.785.20\pm0.7830.50\pm4.233.2亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR基因表達(dá)的影響3.2.1基因芯片檢測結(jié)果基因芯片檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，各染砷組小鼠大腦和小腦組織中TRβ基因表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)（表3）。具體數(shù)據(jù)為，1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因表達(dá)量為對照組的(0.85±0.05)倍，小腦組織中為對照組的(0.88±0.06)倍；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因表達(dá)量為對照組的(0.72±0.04)倍，小腦組織中為對照組的(0.75±0.05)倍；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因表達(dá)量為對照組的(0.55±0.03)倍，小腦組織中為對照組的(0.58±0.04)倍。經(jīng)單因素方差分析，各染砷組與對照組之間TRβ基因表達(dá)量的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，4ppmAs?O?染毒組下調(diào)更為明顯，呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。而在TRα基因表達(dá)方面，各組之間小鼠大腦和小腦組織TRα基因表達(dá)沒有明顯差異（P＞0.05），其表達(dá)量在各染砷組與對照組之間波動范圍較小，具體數(shù)據(jù)為，1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因表達(dá)量為對照組的(0.98±0.07)倍，小腦組織中為對照組的(1.02±0.08)倍；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因表達(dá)量為對照組的(1.05±0.06)倍，小腦組織中為對照組的(1.03±0.07)倍；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因表達(dá)量為對照組的(0.96±0.05)倍，小腦組織中為對照組的(0.99±0.06)倍。這表明亞慢性砷暴露主要對小鼠腦組織中的TRβ基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，而對TRα基因表達(dá)影響不明顯。表3：基因芯片檢測小鼠腦組織TR基因表達(dá)結(jié)果（\overline{X}\pmSD,n=10，與對照組相比，*P＜0.05）組別大腦組織TRβ基因表達(dá)量（與對照組比值）小腦組織TRβ基因表達(dá)量（與對照組比值）大腦組織TRα基因表達(dá)量（與對照組比值）小腦組織TRα基因表達(dá)量（與對照組比值）對照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001ppmAs?O?染毒組0.85±0.05*0.88±0.06*0.98±0.071.02±0.082ppmAs?O?染毒組0.72±0.04*0.75±0.05*1.05±0.061.03±0.074ppmAs?O?染毒組0.55±0.03*0.58±0.04*0.96±0.050.99±0.063.2.2RealTimePCR定量檢測結(jié)果為了進(jìn)一步驗證基因芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用RealTimePCR對小鼠腦組織中TRβ基因表達(dá)進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示（表4），砷染毒組小鼠大腦和小腦組織中TRβ基因表達(dá)水平與基因芯片檢測結(jié)果趨勢一致，均顯著低于對照組。1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因相對表達(dá)量為(0.82±0.06)，小腦組織中為(0.86±0.07)；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因相對表達(dá)量為(0.70±0.05)，小腦組織中為(0.73±0.06)；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ基因相對表達(dá)量為(0.53±0.04)，小腦組織中為(0.56±0.05)。經(jīng)單因素方差分析，各染砷組與對照組之間TRβ基因相對表達(dá)量的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增加，TRβ基因表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同樣，在TRα基因方面，RealTimePCR定量檢測結(jié)果表明，各染砷組與對照組之間小鼠大腦和小腦組織TRα基因相對表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因相對表達(dá)量為(0.97±0.08)，小腦組織中為(1.01±0.09)；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因相對表達(dá)量為(1.04±0.07)，小腦組織中為(1.02±0.08)；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα基因相對表達(dá)量為(0.95±0.06)，小腦組織中為(0.98±0.07)。RealTimePCR定量檢測結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實了亞慢性砷暴露能夠顯著下調(diào)小鼠腦組織中TRβ基因的表達(dá)，而對TRα基因表達(dá)無明顯影響。表4：RealTimePCR定量檢測小鼠腦組織TR基因表達(dá)結(jié)果（\overline{X}\pmSD,n=10，與對照組相比，*P＜0.05）組別大腦組織TRβ基因相對表達(dá)量小腦組織TRβ基因相對表達(dá)量大腦組織TRα基因相對表達(dá)量小腦組織TRα基因相對表達(dá)量對照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001ppmAs?O?染毒組0.82±0.06*0.86±0.07*0.97±0.081.01±0.092ppmAs?O?染毒組0.70±0.05*0.73±0.06*1.04±0.071.02±0.084ppmAs?O?染毒組0.53±0.04*0.56±0.05*0.95±0.060.98±0.073.3亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR蛋白表達(dá)的影響采用Westernblot對小鼠腦組織中TR蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，各染砷組小鼠大腦和小腦組織中TRβ蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的降低（表5）。具體數(shù)據(jù)為，1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ蛋白相對表達(dá)量為(0.80±0.05)，小腦組織中為(0.83±0.06)；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ蛋白相對表達(dá)量為(0.68±0.04)，小腦組織中為(0.70±0.05)；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRβ蛋白相對表達(dá)量為(0.50±0.03)，小腦組織中為(0.53±0.04)。經(jīng)單因素方差分析，各染砷組與對照組之間TRβ蛋白相對表達(dá)量的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，4ppmAs?O?染毒組降低最為顯著，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。而在TRα蛋白表達(dá)方面，各組之間小鼠大腦和小腦組織TRα蛋白相對表達(dá)量沒有明顯差異（P＞0.05）。1ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα蛋白相對表達(dá)量為(0.95±0.07)，小腦組織中為(0.98±0.08)；2ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα蛋白相對表達(dá)量為(1.02±0.06)，小腦組織中為(1.00±0.07)；4ppmAs?O?染毒組小鼠大腦組織中TRα蛋白相對表達(dá)量為(0.93±0.05)，小腦組織中為(0.96±0.06)。這表明亞慢性砷暴露主要對小鼠腦組織中的TRβ蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，而對TRα蛋白表達(dá)影響不明顯，該結(jié)果與基因表達(dá)檢測結(jié)果相一致。在4ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組中，小鼠大腦和小腦組織中TRβ蛋白相對表達(dá)量分別為(0.65±0.04)和(0.68±0.05)。與4ppmAs?O?染毒組相比，?；撬岜Ｗo(hù)組小鼠腦組織中TRβ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），但仍低于對照組水平。這說明?；撬釋喡陨楸┞秾?dǎo)致的小鼠腦組織TRβ蛋白表達(dá)下調(diào)具有一定的保護(hù)作用。圖1：Westernblot檢測小鼠腦組織TR蛋白表達(dá)電泳圖（A為大腦組織，B為小腦組織，1為對照組，2為1ppmAs?O?染毒組，3為2ppmAs?O?染毒組，4為4ppmAs?O?染毒組，5為4ppmAs?O?+150mg/kg?；撬岜Ｗo(hù)組）表5：Westernblot檢測小鼠腦組織TR蛋白表達(dá)結(jié)果（\overline{X}\pmSD,n=10，與對照組相比，*P＜0.05；與4ppmAs?O?染毒組相比，#P＜0.05）組別大腦組織TRβ蛋白相對表達(dá)量小腦組織TRβ蛋白相對表達(dá)量大腦組織TRα蛋白相對表達(dá)量小腦組織TRα蛋白相對表達(dá)量對照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001ppmAs?O?染毒組0.80±0.05*0.83±0.06*0.95±0.070.98±0.082ppmAs?O?染毒組0.68±0.04*0.70±0.05*1.02±0.061.00±0.074ppmAs?O?染毒組0.50±0.03*0.53±0.04*0.93±0.050.96±0.064ppmAs?O?+150mg/kg牛磺酸保護(hù)組0.65±0.04*#0.68±0.05*#0.97±0.060.99±0.07四、討論4.1亞慢性砷暴露與小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的關(guān)聯(lián)本研究通過跳臺實驗、暗箱實驗和Morris水迷宮實驗，全面評估了亞慢性砷暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實驗結(jié)果表明，亞慢性砷暴露可顯著損害小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在跳臺實驗和暗箱實驗中，砷暴露組小鼠的錯誤次數(shù)顯著增多，潛伏期明顯縮短。這表明砷暴露使小鼠在面對外界刺激時，難以形成有效的記憶并做出正確的行為反應(yīng)。跳臺實驗中，小鼠需要記住平臺是安全區(qū)域，以躲避電擊。砷暴露組小鼠錯誤次數(shù)增多，潛伏期縮短，說明它們無法準(zhǔn)確記憶平臺的安全屬性，在受到電擊時，不能迅速跳上平臺躲避，反映出其記憶保持和再現(xiàn)能力的下降。暗箱實驗中，小鼠從明箱進(jìn)入暗箱會受到電擊，正常小鼠會記住暗箱的危險而減少進(jìn)入次數(shù)。砷暴露組小鼠進(jìn)入暗箱的錯誤次數(shù)增多，潛伏期縮短，表明它們無法有效記憶暗箱的危險信息，對環(huán)境的認(rèn)知和記憶能力受到損害。Morris水迷宮實驗的結(jié)果進(jìn)一步證實了亞慢性砷暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損害。在定位航行實驗中，砷暴露組小鼠找到平臺的逃避潛伏期明顯長于對照組，且隨著染毒劑量的增加，逃避潛伏期延長更為顯著。這說明砷暴露阻礙了小鼠對空間位置信息的學(xué)習(xí)和記憶，使其在尋找平臺的過程中需要花費更多的時間和精力。對照組小鼠隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，逃避潛伏期逐漸縮短，能夠快速找到平臺，而砷暴露組小鼠則表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力的下降，難以在訓(xùn)練中形成有效的空間記憶。在空間探索實驗中，砷暴露組小鼠跨越原平臺位置的次數(shù)顯著減少，在目標(biāo)象限的停留時間百分比也顯著降低。這表明砷暴露破壞了小鼠對曾經(jīng)存在平臺位置的記憶，影響了其空間探索和記憶鞏固能力。正常小鼠在平臺撤除后，會憑借之前的記憶在原平臺位置附近進(jìn)行探索，而砷暴露組小鼠則無法準(zhǔn)確回憶平臺的位置，說明其空間記憶受到了嚴(yán)重的損害。亞慢性砷暴露導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的機(jī)制可能與神經(jīng)系統(tǒng)的多個方面受到影響有關(guān)。從神經(jīng)細(xì)胞層面來看，砷具有較強(qiáng)的親神經(jīng)性，能夠通過血腦屏障進(jìn)入腦組織。研究表明，砷暴露可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平升高。砷進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，會干擾細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，使活性氧（ROS）生成增多。ROS的大量積累會攻擊神經(jīng)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞膜的損傷會影響神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙。ROS還會攻擊細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸，使蛋白質(zhì)變性失活，核酸損傷，影響神經(jīng)細(xì)胞的正常代謝和基因表達(dá)，進(jìn)而損害神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，最終影響學(xué)習(xí)記憶能力。在神經(jīng)遞質(zhì)方面，神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)中傳遞信息的重要化學(xué)物質(zhì)，其失衡會對學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生顯著影響。亞慢性砷暴露可干擾神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝。例如，有研究發(fā)現(xiàn)砷暴露可降低小鼠腦中5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和去甲腎上腺素（NE）等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。5-HT參與情緒調(diào)節(jié)、睡眠和記憶等多種生理過程，其濃度降低可能導(dǎo)致小鼠情緒異常，影響學(xué)習(xí)記憶的積極性和效果。DA在獎賞系統(tǒng)和運動控制中起關(guān)鍵作用，同時也參與學(xué)習(xí)記憶過程，DA濃度下降會影響小鼠的學(xué)習(xí)動機(jī)和對信息的處理能力。NE與注意力、覺醒和記憶鞏固密切相關(guān)，其濃度改變會導(dǎo)致小鼠注意力不集中，影響記憶的形成和鞏固，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降。此外，砷暴露還可能對神經(jīng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。神經(jīng)突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的關(guān)鍵部位，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要。研究表明，砷暴露可導(dǎo)致神經(jīng)突觸數(shù)量減少，突觸間隙增寬，突觸后致密物變薄等形態(tài)學(xué)改變。這些改變會影響神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間的傳遞效率，使神經(jīng)元之間的信息傳遞受阻，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的神經(jīng)信號通路，最終導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。4.2亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)影響的機(jī)制分析從分子生物學(xué)角度來看，亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR基因和蛋白表達(dá)的影響可能涉及多個層面的機(jī)制。在基因轉(zhuǎn)錄水平，砷可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子與TR基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而調(diào)控TR基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，砷可以與一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用，改變其結(jié)構(gòu)和功能。例如，砷可能與某些鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，由于砷與鋅具有相似的化學(xué)性質(zhì)，它可以取代鋅指結(jié)構(gòu)中的鋅離子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)象發(fā)生改變，使其無法正常識別和結(jié)合到TR基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件上。而這些順式作用元件對于TR基因轉(zhuǎn)錄的起始和速率起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，一旦轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件的結(jié)合受到阻礙，TR基因的轉(zhuǎn)錄就會受到抑制，從而導(dǎo)致TR基因表達(dá)水平下降。在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方面，砷可能影響TR基因mRNA的穩(wěn)定性。mRNA的穩(wěn)定性決定了其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成量。有研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一些核酸酶活性升高。這些核酸酶能夠特異性地識別和切割TR基因的mRNA，使其降解加速。例如，砷可能激活某些核糖核酸酶，這些酶能夠識別TRmRNA上的特定序列，如富含AU的元件（ARE），并與之結(jié)合后進(jìn)行切割，導(dǎo)致TRmRNA的半衰期縮短。TRmRNA的穩(wěn)定性降低，就使得參與翻譯過程的有效mRNA數(shù)量減少，最終導(dǎo)致TR蛋白的合成減少。從蛋白質(zhì)翻譯和修飾層面分析，亞慢性砷暴露可能干擾TR蛋白的翻譯過程以及翻譯后的修飾。在翻譯過程中，砷可能影響核糖體與TRmRNA的結(jié)合以及翻譯起始復(fù)合物的形成。砷暴露會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，而氧化應(yīng)激可以使一些參與翻譯起始的蛋白質(zhì)因子發(fā)生氧化修飾。例如，真核翻譯起始因子（eIF）家族中的某些成員，如eIF2α，其絲氨酸殘基可能被氧化修飾，導(dǎo)致eIF2α的活性受到抑制。eIF2α在翻譯起始過程中起著關(guān)鍵作用，它負(fù)責(zé)將起始甲硫氨酰-tRNA和mRNA與核糖體小亞基結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物。eIF2α活性降低會阻礙翻譯起始復(fù)合物的正常形成，使得核糖體無法順利結(jié)合到TRmRNA上，從而抑制TR蛋白的翻譯過程。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾方面，TR蛋白需要經(jīng)過一系列的修飾過程才能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能，如磷酸化、乙?；取Ｉ楸┞犊赡芨蓴_這些修飾過程。研究表明，砷可以抑制某些蛋白激酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。例如，某些負(fù)責(zé)TR蛋白磷酸化的蛋白激酶，在砷暴露下其活性會受到抑制，使得TR蛋白無法正常磷酸化。而磷酸化修飾對于TR蛋白的穩(wěn)定性、與配體的結(jié)合能力以及轉(zhuǎn)錄激活活性等都有著重要影響。TR蛋白磷酸化異常會導(dǎo)致其功能受損，同時也可能影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位和降解速度，進(jìn)一步影響TR蛋白的表達(dá)水平和生物學(xué)功能。4.3?；撬岜Ｗo(hù)作用的探討?；撬幔═aurine）是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)廣泛存在，具有多種重要的生理功能。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)?；撬釋喡陨楸┞秾?dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷以及腦組織TRβ表達(dá)下調(diào)具有一定的保護(hù)作用。從學(xué)習(xí)記憶能力方面來看，4ppmAs?O?+150mg/kg牛磺酸保護(hù)組小鼠在跳臺實驗、暗箱實驗和Morris水迷宮實驗中的表現(xiàn)均明顯優(yōu)于4ppmAs?O?染毒組。在跳臺實驗中，保護(hù)組小鼠的錯誤次數(shù)顯著減少，潛伏期明顯延長；暗箱實驗中，進(jìn)入暗箱的錯誤次數(shù)減少，潛伏期延長；Morris水迷宮實驗中，定位航行實驗的逃避潛伏期縮短，空間探索實驗中跨越原平臺位置的次數(shù)增加，在目標(biāo)象限的停留時間百分比升高。這表明?；撬崮軌蛟谝欢ǔ潭壬细纳苼喡陨楸┞兑鸬男∈髮W(xué)習(xí)記憶能力損害。牛磺酸對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用可能與其抗氧化作用密切相關(guān)。如前文所述，亞慢性砷暴露會導(dǎo)致小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平升高，而?；撬峋哂袕?qiáng)大的抗氧化能力。牛磺酸可以直接清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS，減少其對神經(jīng)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸的損傷。?；撬徇€能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等。研究表明，?；撬峥梢哉T導(dǎo)SOD和GSH-Px基因的表達(dá)上調(diào)，使其活性增強(qiáng)，從而提高細(xì)胞的抗氧化防御能力，減輕砷暴露引起的氧化損傷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力。在對小鼠腦組織TRβ表達(dá)的保護(hù)作用上，4ppmAs?O?+150mg/kg牛磺酸保護(hù)組小鼠大腦和小腦組織中TRβ蛋白相對表達(dá)量顯著高于4ppmAs?O?染毒組。這說明?；撬崮軌蛴行Ь徑鈦喡陨楸┞秾?dǎo)致的TRβ蛋白表達(dá)下調(diào)。?；撬岬倪@種保護(hù)作用可能涉及多個層面。在基因轉(zhuǎn)錄水平，?；撬峥赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，來對抗砷對TRβ基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響其與DNA的結(jié)合能力。牛磺酸可能與某些被砷抑制的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，恢復(fù)其正常構(gòu)象，使其能夠重新識別并結(jié)合到TRβ基因啟動子區(qū)域的順式作用元件上，從而促進(jìn)TRβ基因的轉(zhuǎn)錄。從蛋白質(zhì)翻譯和修飾角度來看，?；撬峥赡芡ㄟ^穩(wěn)定TRβmRNA的結(jié)構(gòu)，增加其穩(wěn)定性，從而促進(jìn)TRβ蛋白的合成。?；撬徇€可能調(diào)節(jié)與TRβ蛋白翻譯和修飾相關(guān)的酶活性，確保TRβ蛋白能夠正常翻譯和修飾。例如，?；撬峥赡芤种粕楸┞兑鸬哪承┖怂崦富钚陨?，減少對TRβmRNA的降解，使參與翻譯過程的TRβmRNA數(shù)量增加。在蛋白質(zhì)修飾方面，?；撬峥赡芗せ钅承┑鞍准っ富蛞阴＾D(zhuǎn)移酶的活性，使TRβ蛋白能夠正常磷酸化或乙酰化，維持其正常的生物學(xué)功能。綜上所述，?；撬釋喡陨楸┞秾?dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷和腦組織TRβ表達(dá)下調(diào)具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性以及穩(wěn)定mRNA和調(diào)節(jié)蛋白修飾相關(guān)酶活性等多種因素有關(guān)。然而，牛磺酸的保護(hù)作用仍存在一定的局限性，保護(hù)組小鼠的各項指標(biāo)雖有改善，但仍未恢復(fù)到對照組水平，這提示我們在防治砷神經(jīng)毒性危害時，可能需要進(jìn)一步探索更有效的干預(yù)措施或聯(lián)合使用多種保護(hù)劑。4.4研究結(jié)果的潛在應(yīng)用價值本研究結(jié)果在防治砷神經(jīng)毒性危害以及開發(fā)相關(guān)治療方法方面具有重要的潛在應(yīng)用價值。在防治砷神經(jīng)毒性危害方面，本研究揭示了亞慢性砷暴露對小鼠腦組織TR表達(dá)的影響，為評估砷污