第四章基因工程藥物設計與研制方法第一節重組蛋白藥物的復制預測全球生物仿制藥市場在2014年可高達一百九十四億美元。現有的生物制劑專利很大一部分即將過期，到2016年，約有250億美金份額的生物制劑將失去專利保護。新的生物藥不斷獲得批準，預測2010年批準的新藥中將有1/3是生物藥。重組蛋白藥物開發約需10億美元。組織細胞目的基因的克隆表達系統的選擇和建立穩定細胞系的建立蛋白的高效表達藥物蛋白的純化體內和體外的檢測方法的建立表達細胞的工業化培養藥物蛋白大規模純化技術質量控制臨床試驗市場開發一、復制生物技術藥品的一般技術流程實驗室階段工業化階段二、復制重組蛋白藥品存在的問題（一）復制非專利生物藥品的困難蛋白質的高級結構難以復制。藥效和安全性難以與原藥品一致。（二）復制蛋白藥物的主要問題－－免疫原性蛋白藥物免疫原性還包括：分子多聚體、污染物、分解片段等。免疫原性與患者、治療流程、制備工藝有關。開發周期較長，注冊仍需要臨床試驗。（三）產生抗體的后果多數情況無臨床后果。有時可能提高藥效。少數免疫原性太強，導致藥品無法使用。抗體還可能與內源因子反應，導致藥品禁止使用。（四）預測蛋白藥物的免疫原性的方法現有的抗原決定簇公式難以預測免疫原性。抗血清篩選不能完全說明該抗體就是由藥物蛋白激發。同一種蛋白的轉基因小鼠可以較好預測藥物蛋白的免疫原性。第二節通過對現有藥物的優化和改造研發新藥一、定向突變采用隨機的基因突變或基因重組技術與定向的突變體篩選方法相結合的分子進化技術。自然界進化：先突變后選擇。基因工程加速了進化歷程。基因工程一般預先知道突變結果。

根據已有基因的序列和功能進行設計，稱為理性設計。定向突變模擬自然進化方法，首選讓基因發生隨機突變，通過篩選系統進行定向篩選或選擇。

預先不知道基因或蛋白質序列，稱為非理性設計。定向進化技術的三個步驟制備突變體文庫。突變體文庫在適當的表達系統內表達。篩選突變體。（一）易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反應條件來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。提高鎂離子濃度。加入錳離子。改變體系中的dNTPs濃度。運用低保真度DNA聚合酶等。增加堿基錯配的方法易錯PCR的概念

易錯PCR成功的關鍵選擇合適的突變頻率。一般目的基因突變1.5-5個時，誘變結果理想。嵌套易錯PCR，使其PCR錯誤積累。（二）DNA或基因改組(DNAshuffling)以單個基因或多個同源基因為模板，將其切割成一系列隨機大小的DNA小片段，然后在體外通過聚合酶鏈式反應將這些片段隨機重組成全長基因，實現同源基因重組，達到分子進化目的的一種技術。DNA或基因改組也稱分子育種或有性PCRDNAShuffling的基本步驟Dnase或超聲波將模板產生DNA片段；隨機片段變性；隨機片段復性；延伸；反復重復2-4步后，可獲得全長DNA片段。實例：隨機挑取枯草桿菌蛋白酶DNA重組裝庫中10個克隆序列。DNAShuffling的引物如何設計？酶切片段之間互為引物和模板，無需特別設計引物。DNAShuffling為什么發生crossover，從而得到全長基因？Parentalsequence(s)是一個還是多個？多個parentalsequences成功率會提高。DNAShuffling的基本原理這是重疊延伸的結果。相關基因組（parentalsequences）相似程度；酶切產生的DNA片段大小及內切酶種類；退火溫度及PCR反應條件；突變頻率控制在適度范圍內。DNAShuffling成功的關鍵因素1、隨機引物引發體外重組在模板DNA存在的條件下，隨機引物、短暫PCR反應，得到一組DNA片段。移去模板DNA，再PCR擴增。2、交錯延伸技術在有引物的情況下，縮短PCR延伸的時間、退火溫度不合適，得到一條延伸不完全的鏈。上一輪的延伸產物作為引物，再次不完全延伸。上述步驟反復進行，得到一組DNA片段DNAShuffling的改進（三）大腸桿菌突變株用于定向突變大腸桿菌缺少一種DNA修復酶，容易產生DNA突變。（四）盒式誘變將靶基因的一段DNA刪掉，并用人工化學合成所具有的突變核苷酸的雙鏈寡核苷酸片段取代。盒式誘變基本步驟目的基因插入載體，并在目的基因中引入限制酶位點。酶切載體。人工合成的片段連接到載體上。二、定點突變定義：是指通過PCR等方法對已知的目的基因DNA片段進行堿基的添加、刪除、點突變等，從而改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。特點：突變位點是確定的；突變的個數也是預知的；突變的效應往往是未知的；定點突變的方法一般是以PCR技術為基礎的。（一）寡核苷酸引物誘變使用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，啟動單鏈DNA分子進行復制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成DNA子鏈的一個組成部分。復習m13寡核苷酸引物誘變過程M13正鏈DNA合成突變引物合成異源雙鏈DNA分子制備閉環異源雙鏈DNA分子富集轉化突變體篩選提高寡核苷酸引物誘變突變效率的方法Dut-缺陷，導致dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據的位置。

ung缺陷，不能除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基。在ung缺陷和Dut-缺陷的大腸桿菌中制備，含U的DNA。感染dut+

ung+E.coli，在細胞分裂過程中，只有新合成的DNA鏈才能起模板作用合成新的并引入了誘變位點的子代雙鏈DNA。而有U的DNA鏈，在dut+和ung+產物的作用下，尿嘧啶被水解，從而失去作為模板的能力。已知有些限制酶不能切割硫代磷酸DNA分子。硫代磷酸誘變法在異源雙鏈DNA分子制備時，加入硫代核苷酸，使之摻入突變鏈中。然后用前述酶切割，并用外切酶局部消化后，進行聚合反應，從而產生具有定點突變的異源雙鏈DNA。第三節創新藥物設計一、通過篩選同源基因的方法。二、通過RNA的表達譜。檢測患者的特異性基因表達三、蛋白質組學。四、使用寡核苷酸技術。干擾RNA五、基因功能系統分析。建立不同表型細胞模型，預測新基因功能。六、使用生物模型。Blast方法M13噬茵體載體(1)M13噬菌體的組成和結構噬菌體顆粒是絲狀的。感染宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，能夠抑制宿主細胞生長和分裂。只感染雄性大腸桿菌。M13噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成。單鏈DNA，由6407堿基組成。90%以上序列可編碼蛋白質，共有11個編碼基因。基因之間的間隔區多為幾個堿基。較大的間隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，其間有調節基因表達和DNA合成的元件。（2）M13噬菌體的基因組編碼3類蛋白質：①復制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）。②形態發生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）。③結構蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）。復制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）。形態發生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）。（3）M13噬菌體的復制

以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（－）鏈，該雙鏈稱復制型DNA（RFDNA）。

RFDNA在宿主細胞內能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。單鏈特異的DNA結合蛋白結合在（+）鏈上，阻斷了（－）鏈的合成，（+）鏈DNA仍然不斷的合成。（+）鏈DNA從細胞膜溢出，被外殼蛋白包裝成病