43Codeofpracticeforpurityidentificationofspongegourdhybrid(SSRmethod)I 2 2 2 本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本本文件起草人：韓小霞、胡新軍、閔子揚、李勇奇、鄧穩橋、盧亞楠、劉昆言、粟12規范性引用文件GB/T3543.2農作物種子檢驗規程扦樣SSR標記技術是一種以特異引物PCR擴增為基礎的分子標記技術。由于SSR標記廣泛存在于植物基因4主要儀器設備、試劑耗材4.1主要儀器設備4.2主要試劑氫氧化鈉（NaOH）、三羥甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane，Tris）引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（N，N，-methylemebisacrylamide）、四甲4.3主要耗材離心管（0.6ml、1.5ml、2.0mlPCR擴增板、96孔PCR擴增板管蓋、量筒、發芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。2種子扦樣參考GB/T3543.2。取絲瓜雜交種約250粒，父母本約各10粒，溫湯浸種后，28℃~30℃催7.2取樣取發芽種子胚軸0.5cm～1cm，用于DNA提取.7.3DNA提取方法將研磨好的樣品放置于48孔板架上，60℃水浴30室溫靜置3min，5,000rpm離心5的3mol/LNaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min。5,000rpm離心5mi70%的乙醇洗滌沉淀2次，風干乙醇后加入200μL用紫外分光光度計檢測DNA濃度并將DNA溶液用ddH2O稀釋到3PCR結束后，在每孔中加入2μL6×加樣緩沖液，混勻，置于4℃冰箱待檢測。對差別不大的擴增產物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴增條帶大小差別較大的擴增產物宜采用普通瓊將現配的8%丙烯酰胺（PAGE）凝膠，輕輕搖勻，緩緩灌入玻璃膠室，膠灌滿整個膠室后，插入樣每個PCR擴增產物中加2μL6×加樣緩沖5min，取出膠板，用蒸餾水漂洗2次～3次。將膠板放入盛有400mL顯影液的托盤中，輕輕搖動至條帶將PCR產物與2μL6×加樣緩沖液混合，點樣至1.0%～3.0%的瓊脂糖凝膠點樣孔內（含有0.5凝膠電泳，電泳電壓120V，電泳時間約30min8純度計算SSR擴增條帶表現雙親帶型，則為雜交種；表現任一親本帶型或者其他帶型，則為假雜種。分別統計雜交種和假雜種的樣品數量，根據式(1)計算雜P=×100%···································································(1)45A.1DNA提取試劑稱EDTA186.1g，加入已有800ml雙蒸水的燒杯中，用氫氧化鈉調節pH值至8.0，補雙蒸水至1000冰箱中保存備用。A.1.21mol/LTris-HCl（三羥基氨基甲烷鹽酸，pH8.0）溶液取1mol/LTris-HCl溶液50ml、0.5mol/LEDTA溶液20ml，稱SDS7.5g和氯化鈉14.6g加入到500ml燒杯中，用雙蒸水定容至500ml，充分混勻，使得溶液中的最終濃度為Tris?HCl100mmol/L，A.1.4氯仿:異戊醇:乙醇（80:4:1取160ml三氯甲烷，8ml異戊醇和3A.1.50.25mol/L的NaOH稱取NaOH1g，加入雙蒸水定容至1取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10ml，加雙蒸水定容A.3變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑A.3.210%（W/V）過硫酸銨溶液（APS）6A.3.56×加樣緩沖液稱取溴酚藍0.25g，二甲苯青0.25g，加98ml甲酰胺溶液和2mlEDTA（pH8.0）溶液溶解，混A.3.68%PAGE（丙烯酰胺）A.4銀染、顯影試劑A.4.1染色液稱1.5g硝酸銀，加雙蒸水1000ml溶解，再加1.5ml甲醛7ATCATTGGATGTGGGATTCTCAAGATTGAAGTGGGAAAATGTGGAGTGTTGACATTGTTTGGTTGGAGTAAGCCAAATTAGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGATCCAACTCGACCAAGAAACACTCAATCCAACCCACGAATAGTTCGCCTCAGTCCATCTAGATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTCTCCTCAAGAAAATCCACTCCAGGTAATTCTCCTCCATTATTGCCCCAAACTCTTCTATGGACAAAACTTCATAACGCCTTCGCCTCAGTCCATCTAGATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTTTCCCCATCCATACATTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCGGCGGAATACAAGAAAGATCATGTGAAAAGGGAACAGACCAACTATCACCCCTACAAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGTCTTCCTGAGAGCTTTTGCCCTCTTCTCCTTCGATCTAACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGCGTTTGAGATGTGTGCATGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGTACCTTCACCCAACTCGCTTTTGTTCTATTCCCCTCTTTCGATTACGACGACTTTCTGCTCTCGATTCTAACCAAATCATTCTACCTCTCCAATTACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGAAAGAAGGCGAGGAGTGTGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTTGGGCTCTGACATTAGAACACCTTTGGGAGATAACAAGCCTCCAAGGAAGAAGAAGAAAATACTGCCACATCATCAGCTCAGGTAAAGCAACAACCCCATAAAACCTTAATCCGGCTAGGAAAG8AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGATCCACCAACTCTCACTTTCGCATATCCCCAAAACGAACAAGACAAATTAAGGAGGGGAGGTAAGACGAGCGTAATGGTTTTCTTTCTCCTTCGCTGTCGGGATGATGATATTCGGAGCCACCCCATTTCATACACACATTCAACCTAAGAGCGAGAATTTTATGGACCTCATTCCCCTTTACCAAACCCAATTCTAGTTTGTTGGAATTAGGGTGCTTTGGGAGGAGATTGATTTACCGATGCTCTGTTCTTGTTCCCACTTCATTGTCCAATGAGAGAGAAACATTGGGAATGAGAGATTTGACTTGGGGAATGGCTAATTGGGTGAGCTATGGTGGAAGTGTTACTGTGTCTAGCCACCTCTGATATGCGTCCTACCCCTTATGACTATTTAACATGGGATAAAACGGACATCAGTTGCCGCTGTTTGAGTAAGTAACAAAC