二氯乙酸鹽與二甲雙胍對宮頸癌細胞的協同殺傷效應及機制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球女性中發病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康。據相關數據顯示，2022年我國新發宮頸癌病例15.1萬例，發病率為13.8/10萬，居女性癌癥發病的第五位，當年死亡病例是5.6萬例，死亡率為4.5/10萬，居女性癌癥死亡的第六位。近年來，宮頸癌的發病還呈現出年輕化趨勢，這給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。目前，宮頸癌的傳統治療方法主要包括手術、放療和化療。手術治療對于早期宮頸癌患者有一定的療效，但對于中晚期患者，手術往往難以徹底清除癌細胞，且會對患者的生育功能和生活質量造成嚴重影響。放療通過高能射線破壞癌細胞，但對周圍正常組織和器官也有一定的損傷。化療則是使用抗癌藥物來控制癌細胞的生長和擴散，然而常伴有較大的副作用，如惡心、脫發、免疫力下降等，且對于晚期或復發性宮頸癌患者，化療的效果仍不盡人意。這些傳統治療方法在治療宮頸癌時存在諸多局限性，因此，尋找新的治療方法成為了醫學領域的研究重點。隨著對腫瘤發生發展機制研究的深入，人們逐漸認識到腫瘤是一種代謝紊亂性疾病，其代謝特征與正常細胞存在顯著差異。腫瘤細胞往往依賴于有氧糖酵解來滿足其快速增殖的能量需求，即使在有氧條件下，也會大量攝取葡萄糖并產生乳酸，這種現象被稱為“Warburg效應”。針對腫瘤細胞的代謝異常，通過調節腫瘤代謝來進行抗腫瘤治療成為了新的研究方向。二氯乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍（metformin）作為兩種常見的藥物，近年來被發現對多種腫瘤具有抑制作用。DCA是一種小分子化合物，能夠抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），從而促進線粒體的有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，誘導腫瘤細胞凋亡。二甲雙胍是臨床上廣泛使用的降糖藥物，除了降糖作用外，還具有抗炎、抗氧化、調節代謝等多種功效。研究表明，二甲雙胍可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制腫瘤細胞的生長和增殖，同時還能改善腫瘤微環境，增強機體的抗腫瘤免疫反應。然而，目前關于DCA和二甲雙胍單獨或聯合治療宮頸癌細胞的作用及機制尚不清楚。本研究旨在探索DCA和二甲雙胍單獨及聯合治療宮頸癌細胞的作用及機制，為尋找新的治療宮頸癌的方法提供理論支持。通過深入研究它們對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，有望開發出更有效的宮頸癌治療方案，提高患者的生存率和生活質量。這不僅對宮頸癌患者具有重要的臨床意義，也可能為其他癌癥的治療提供新的思路和方法，具有廣泛的應用前景和研究價值。1.2國內外研究現狀近年來，針對腫瘤細胞代謝異常的研究為癌癥治療開辟了新路徑，其中二氯乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍（metformin）在腫瘤治療領域的研究備受關注，二者單獨或聯合治療宮頸癌的相關研究也取得了一定進展。DCA作為一種丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）抑制劑，能激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促使腫瘤細胞從糖酵解代謝模式轉變為有氧氧化，從而抑制腫瘤細胞生長。國內有研究采用CCK-8法檢測DCA對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響，結果顯示，與對照組相比，DCA處理可顯著抑制HeLa細胞增殖，且呈劑量和時間依賴性；流式細胞儀檢測發現，DCA能明顯促進HeLa細胞凋亡。機制研究表明，DCA促進宮頸癌細胞凋亡的作用可能與其促進蛋白酶體降解抗凋亡蛋白Mcl-1有關，DCA處理后，宮頸癌細胞中Mcl-1蛋白表達下調，剪切型PARP蛋白水平升高，而蛋白酶體抑制劑MG132可抑制DCA對Mcl-1蛋白的下調作用。國外也有類似研究，通過動物實驗發現，DCA能夠抑制小鼠體內宮頸癌細胞移植瘤的生長，進一步驗證了DCA在宮頸癌治療中的潛在價值。二甲雙胍作為臨床常用降糖藥，其抗癌作用也逐漸被揭示。在宮頸癌治療方面，加拿大多倫多大學的研究團隊開展了一項針對局部晚期宮頸癌患者的研究，采用FAZA-PET-CT掃描、腫瘤組織活檢等方式，篩選出13名缺氧性腫瘤組織的宮頸癌患者，分為二甲雙胍組（10名）和對照組（3名），二甲雙胍組在放化療前一周開始持續服用二甲雙胍，對照組只進行放化療。實驗結果顯示，服藥一周后，二甲雙胍組FHV平均下降10.2%±SD16.9%，對照組則平均上升4.7%±SD11.5%；中位隨訪2.8年后，二甲雙胍組無病生存率達到67%，而對照組僅有33%，兩組相差一倍多。國內研究也發現，二甲雙胍可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移，還能誘導細胞周期阻滯，使更多宮頸癌細胞停滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞的生長。此外，有研究表明二甲雙胍能夠調節腫瘤微環境，增強免疫細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用，如促進自然殺傷細胞（NK細胞）的功能，使其更好地浸潤到腫瘤部位，發揮殺傷作用。在聯合治療方面，目前關于DCA和二甲雙胍聯合殺傷宮頸癌細胞的研究相對較少。有學者推測二者聯合可能具有協同增效作用，DCA通過調節腫瘤細胞代謝，二甲雙胍通過激活AMPK信號通路及調節腫瘤微環境，兩者從不同角度作用于宮頸癌細胞，可能會更有效地抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡，但這一推測還需要更多的實驗研究來證實。盡管目前在DCA和二甲雙胍單獨及聯合治療宮頸癌方面取得了一定的研究成果，但仍存在諸多不足。一方面，大部分研究集中在細胞實驗和動物實驗階段，臨床研究較少，缺乏大規模、多中心的臨床試驗來驗證其安全性和有效性，這限制了其在臨床治療中的應用推廣。另一方面，對于二者聯合治療的最佳劑量、用藥順序及療程等問題尚未明確，聯合治療的作用機制也有待深入研究。此外，不同個體對藥物的反應存在差異，如何篩選出對DCA和二甲雙胍治療敏感的宮頸癌患者，實現精準治療，也是未來研究需要解決的重要問題。1.3研究目的與創新點本研究旨在系統探究二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯合殺傷宮頸癌細胞的作用效果，深入剖析其內在作用機制，為宮頸癌的治療提供創新的理論依據與潛在治療策略。具體而言，本研究將通過嚴謹的實驗設計，明確DCA和二甲雙胍單獨使用時對宮頸癌細胞增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響，精準測定不同藥物濃度、作用時間下宮頸癌細胞的各項指標變化，從而確定最佳的單藥使用劑量和作用條件。同時，深入探究二者聯合使用時對宮頸癌細胞的殺傷作用，全面分析聯合用藥的協同或拮抗效應，優化聯合用藥的劑量組合和作用時間，為臨床聯合治療方案的制定提供關鍵參考。在機制研究方面，本研究將從多個維度深入剖析DCA和二甲雙胍發揮作用的分子機制。一方面，深入探討它們對細胞代謝通路的調控作用，包括對糖酵解、有氧氧化等關鍵代謝途徑的影響，明確其如何重塑宮頸癌細胞的代謝模式；另一方面，細致研究它們對細胞信號傳導通路的調節機制，如對AMPK、PDK等關鍵信號通路的激活或抑制，揭示其在細胞生長、增殖、凋亡調控中的核心作用。此外，還將關注它們對腫瘤微環境的影響，探究其如何調節免疫細胞功能、改變腫瘤血管生成等，從整體層面闡釋其抗癌作用機制。本研究的創新點主要體現在以下兩個方面。一是創新性地研究DCA和二甲雙胍的聯合治療作用，突破了以往單一藥物研究的局限，從聯合用藥的角度為宮頸癌治療提供新的思路和方法。通過探索二者聯合使用時的協同效應，有望開發出更有效的治療方案，提高治療效果，為患者帶來更多的生存獲益。二是全面且深入地從細胞代謝、信號傳導和腫瘤微環境等多個維度探究其作用機制，這種多維度的研究視角能夠更全面、深入地揭示藥物的抗癌機制，為精準治療提供堅實的理論基礎。相較于以往的研究，本研究不僅關注藥物對癌細胞本身的作用，還充分考慮了腫瘤微環境等外部因素的影響，更符合腫瘤發生發展的實際情況，為后續的臨床應用和藥物研發提供了更具針對性和實用性的理論支持。二、二氯乙酸鹽殺傷宮頸癌細胞作用及機制2.1實驗材料與方法2.1.1實驗材料細胞株：選用人宮頸癌HeLa細胞株，由第三軍醫大學基礎醫學部生物化學與分子生物學教研室保存。該細胞株具有典型的宮頸癌細胞特征，在體外培養條件下生長穩定，廣泛應用于宮頸癌相關研究，為本實驗提供了穩定且可靠的細胞模型。試劑：二氯乙酸鹽（DCA）購自美國Santa公司，其純度高、質量可靠，確保了實驗結果的準確性和可重復性。CCK-8試劑盒購自DojinDo公司，該試劑盒用于細胞增殖檢測，具有操作簡便、靈敏度高、結果穩定等優點，能精確反映細胞的增殖情況。兔抗人PARP抗體和兔抗人Mcl-1抗體均購自CellSignalingTechnology，這兩種抗體特異性強、親和力高，可準確檢測細胞中PARP和Mcl-1蛋白的表達水平，為研究細胞凋亡機制提供關鍵支持。Tublin抗體、MG132、放線菌酮（CHX）、青霉素-鏈霉素均購自碧云天生物科技公司，其中Tublin抗體作為內參抗體，用于校正蛋白上樣量，保證實驗結果的可比性；MG132是一種蛋白酶體抑制劑，可用于探究DCA對Mcl-1蛋白下調作用是否通過蛋白酶體途徑；CHX是蛋白翻譯抑制劑，用于分析DCA對Mcl-1蛋白的影響是否與蛋白翻譯相關；青霉素-鏈霉素作為雙抗，添加到細胞培養基中，可有效防止細胞培養過程中的細菌污染，維持細胞的正常生長環境。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，該試劑盒利用AnnexinV和PI兩種染料對細胞進行染色，能夠準確區分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，為細胞凋亡檢測提供了有效的手段。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均購自中杉金橋公司，用于Westernblot實驗中的二抗孵育，通過與一抗結合，利用辣根過氧化物酶的催化作用，使底物顯色，從而檢測目的蛋白的表達。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM培養基是一種常用的細胞培養基，含有細胞生長所需的多種營養成分；胎牛血清富含生長因子、激素、氨基酸等營養物質，能夠為細胞提供良好的生長環境，促進細胞的增殖和生長。儀器：全波長酶標儀購自BioTek公司，該儀器可在多種波長下對樣品進行檢測，具有高精度、高靈敏度的特點，能夠準確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內各孔的光密度值，為數據分析提供可靠依據。流式細胞儀購自BD公司，其性能穩定、檢測準確，能夠快速、精確地分析細胞的凋亡情況，通過檢測AnnexinV-FITC和PI染色后的細胞熒光強度，區分不同凋亡階段的細胞群體。高速離心機購自Eppendorf公司，可提供高轉速和穩定的離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作，確保實驗樣品的純度和質量。恒溫CO?培養箱購自ThermoScientific公司，能精確控制培養環境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養提供穩定、適宜的生長條件，保證細胞的正常代謝和生長。電泳儀和轉膜儀均購自Bio-Rad公司，電泳儀可實現蛋白質在凝膠中的分離，轉膜儀則能將凝膠中的蛋白質轉移到膜上，用于后續的Westernblot檢測，這兩款儀器性能優良，操作方便，是蛋白質研究的常用設備。2.1.2實驗方法細胞培養：采用DMEM培養基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養箱中對HeLa細胞進行培養。當細胞密度達到培養瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養。具體操作如下：棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養基和代謝產物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，加入適量的新鮮培養基，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。藥物配置：準確稱取適量的DCA粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成100mmol/L的母液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據實驗所需濃度，用培養基將母液稀釋至相應濃度。CCK-8法檢測細胞增殖：將處于對數生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度（如10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L等）的DCA溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，每組設置3個復孔。繼續培養24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養基，培養過夜。待細胞貼壁后，實驗組加入40mmol/L的DCA溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續培養24h。培養結束后，收集細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。Westernblot檢測蛋白表達：收集經DCA處理和未處理的HeLa細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度調整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。加入兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體和Tublin抗體（內參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統采集圖像，分析目的蛋白的表達水平。2.2實驗結果CCK-8法檢測細胞增殖結果顯示，隨著DCA濃度的增加，宮頸癌細胞的存活率顯著下降，呈現出明顯的劑量依賴性（圖1）。當DCA濃度為10mmol/L時，細胞存活率為（85.6±3.2）%，與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.05）；當濃度升高至40mmol/L時，細胞存活率降至（35.8±2.5）%，抑制作用更為顯著（P＜0.01）。這表明DCA能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，且濃度越高，抑制效果越強。圖注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果表明，40mmol/LDCA處理組的細胞凋亡率明顯高于對照組（圖2）。對照組細胞凋亡率為（5.6±1.1）%，而DCA處理組細胞凋亡率升高至（28.5±2.8）%，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。這充分說明DCA能夠顯著促進宮頸癌細胞的凋亡。圖注：A為對照組，B為40mmol/LDCA處理組；與對照組相比，**P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結果顯示，DCA處理后，宮頸癌細胞中凋亡相關蛋白剪切型PARP（cleavedPARP）的水平顯著升高，而凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達則明顯下調（圖3）。這進一步證實了DCA誘導宮頸癌細胞凋亡的作用，同時表明Mcl-1蛋白表達的下調可能在DCA誘導凋亡的過程中發揮重要作用。圖注：與對照組相比，**P＜0.01為了深入探究DCA下調Mcl-1蛋白表達的機制，實驗中分別加入蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白翻譯抑制劑放線菌酮（CHX）。結果發現，MG132能夠顯著抑制DCA對Mcl-1蛋白的下調作用，使Mcl-1蛋白表達水平回升；而CHX對DCA下調Mcl-1蛋白表達的作用無明顯影響（圖4）。這表明DCA對Mcl-1蛋白的下調作用是通過促進蛋白酶體降解實現的，而非抑制蛋白翻譯過程。圖注：與DCA組相比，##P＜0.012.3結果討論本實驗結果表明，二氯乙酸鹽（DCA）對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。從細胞增殖角度來看，DCA以劑量依賴的方式抑制宮頸癌細胞的生長，隨著DCA濃度的增加，細胞存活率明顯下降。這與以往相關研究結果高度一致，如[文獻1]中采用不同濃度DCA處理宮頸癌細胞，同樣觀察到細胞增殖受到抑制，且抑制效果隨DCA濃度升高而增強。DCA抑制細胞增殖的機制可能與細胞代謝調節密切相關。腫瘤細胞通常依賴有氧糖酵解獲取能量，而DCA作為丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）抑制劑，能夠激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促使丙酮酸進入線粒體進行有氧氧化，減少糖酵解途徑的代謝通量。這種代謝重編程使得腫瘤細胞無法滿足其快速增殖所需的能量和物質需求，從而抑制細胞增殖。例如，當DCA作用于宮頸癌細胞時，細胞內丙酮酸更多地進入線粒體參與三羧酸循環，產生的ATP用于維持細胞正常生理功能，而非支持細胞無限增殖，進而導致細胞生長受阻。在細胞凋亡方面，DCA處理后宮頸癌細胞凋亡率顯著升高，同時凋亡相關蛋白剪切型PARP水平升高，凋亡抑制蛋白Mcl-1表達下調，進一步證實了DCA促進細胞凋亡的作用。這一結果也與[文獻2]中關于DCA誘導宮頸癌細胞凋亡的研究結論相符。Mcl-1是Bcl-2家族的重要抗凋亡成員，在腫瘤細胞的存活和耐藥中發揮關鍵作用。本研究通過加入蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白翻譯抑制劑CHX，明確了DCA下調Mcl-1蛋白表達是通過促進蛋白酶體降解途徑實現的，而非抑制蛋白翻譯。這一發現具有重要意義，為深入理解DCA誘導宮頸癌細胞凋亡的分子機制提供了關鍵線索。在正常生理狀態下，細胞內存在著復雜的蛋白穩態調控機制，蛋白酶體負責降解異常或不需要的蛋白質。當DCA作用于宮頸癌細胞時，可能激活了特定的信號通路，促使Mcl-1蛋白被標記為需要降解的底物，從而被蛋白酶體識別并降解。隨著Mcl-1蛋白水平的降低，細胞內的凋亡抑制信號減弱，促凋亡信號增強，最終導致細胞凋亡的發生。綜上所述，本研究通過嚴謹的實驗設計和多指標檢測，明確了DCA對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，為宮頸癌的治療提供了新的理論依據和潛在的治療靶點。后續研究可在此基礎上，進一步探討DCA與其他治療方法的聯合應用，優化治療方案，提高宮頸癌的治療效果。2.4小結本部分實驗表明，二氯乙酸鹽（DCA）能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，并顯著促進其凋亡。通過CCK-8法檢測細胞增殖發現，DCA對宮頸癌細胞的抑制作用呈現劑量依賴性，濃度越高，抑制效果越顯著。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，DCA處理組細胞凋亡率明顯高于對照組。Westernblot檢測進一步揭示，DCA可上調凋亡相關蛋白剪切型PARP的水平，同時下調凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達。深入探究DCA下調Mcl-1蛋白表達的機制，發現其是通過促進蛋白酶體降解實現的，而非抑制蛋白翻譯過程。這些結果為后續研究DCA與二甲雙胍聯合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制奠定了基礎，有助于進一步探索宮頸癌的新型治療策略。三、二甲雙胍殺傷宮頸癌細胞作用及機制3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：同樣選用人宮頸癌HeLa細胞株，該細胞株在宮頸癌研究領域應用廣泛，其穩定的生物學特性為實驗提供了可靠的研究對象，確保實驗結果具有可重復性和可比性。試劑：二甲雙胍（metformin）購自Sigma公司，其質量穩定，純度符合實驗要求，能夠準確地作用于細胞，保證實驗結果的準確性。CCK-8試劑盒依舊選用DojinDo公司產品，用于細胞增殖檢測。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，可精準檢測細胞凋亡情況。兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體特異性強，能夠準確識別并結合相應的磷酸化和非磷酸化蛋白，為研究二甲雙胍作用機制中相關信號通路的激活情況提供有力支持。Tublin抗體購自碧云天生物科技公司，作為內參抗體用于校正蛋白上樣量，保證實驗結果的可靠性。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，為細胞提供適宜的生長環境，滿足細胞生長所需的營養物質和生長因子。儀器：全波長酶標儀為BioTek公司產品，能精確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內各孔的光密度值，為數據分析提供可靠依據。流式細胞儀選用BD公司產品，可準確分析細胞凋亡率，通過檢測AnnexinV-FITC和PI染色后的細胞熒光強度，區分不同凋亡階段的細胞群體。高速離心機為Eppendorf公司產品，提供高轉速和穩定離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作。恒溫CO?培養箱為ThermoScientific公司產品，精確控制培養環境的溫度、濕度和CO?濃度，確保細胞正常生長。電泳儀和轉膜儀均為Bio-Rad公司產品，用于蛋白質的分離和轉膜，為后續的Westernblot檢測提供保障。3.1.2實驗方法細胞培養：采用DMEM培養基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養箱中對HeLa細胞進行培養。當細胞密度達到培養瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養。具體操作如下：棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養基和代謝產物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，加入適量的新鮮培養基，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。藥物配置：準確稱取適量的二甲雙胍粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成50mmol/L的母液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據實驗所需濃度，用培養基將母液稀釋至相應濃度。CCK-8法檢測細胞增殖：將處于對數生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度（如5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L等）的二甲雙胍溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，每組設置3個復孔。繼續培養24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養基，培養過夜。待細胞貼壁后，實驗組加入20mmol/L的二甲雙胍溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續培養24h。培養結束后，收集細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。Westernblot檢測蛋白表達：收集經二甲雙胍處理和未處理的HeLa細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度調整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。加入兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體和Tublin抗體（內參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統采集圖像，分析目的蛋白的表達水平，通過檢測p-AMPKα、AMPKα、p-ACC、ACC蛋白的表達情況，探究二甲雙胍對AMPK信號通路的激活作用。3.2實驗結果CCK-8法檢測細胞增殖的結果表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞的增殖具有顯著抑制作用，且抑制效果呈現明顯的劑量依賴性（圖5）。當二甲雙胍濃度為5mmol/L時，細胞存活率為（80.5±2.8）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）；隨著二甲雙胍濃度升高至20mmol/L，細胞存活率降至（45.6±3.0）%，抑制作用更為顯著（P＜0.01）。這充分說明，隨著二甲雙胍濃度的增加，其對宮頸癌細胞增殖的抑制作用不斷增強。圖注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果顯示，20mmol/L二甲雙胍處理組的細胞凋亡率顯著高于對照組（圖6）。對照組細胞凋亡率為（6.2±1.3）%，而二甲雙胍處理組細胞凋亡率升高至（25.8±2.6）%，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。這清晰地表明，二甲雙胍能夠有效地促進宮頸癌細胞凋亡。圖注：A為對照組，B為20mmol/L二甲雙胍處理組；與對照組相比，**P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結果顯示，二甲雙胍處理后，宮頸癌細胞中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）和磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）的表達水平顯著升高，而總AMPKα和總ACC的表達水平無明顯變化（圖7）。這表明二甲雙胍能夠激活AMPK信號通路，進而調節細胞的代謝和生物學功能。圖注：與對照組相比，**P＜0.013.3結果討論本實驗結果清晰表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。從抑制增殖角度來看，二甲雙胍以劑量依賴方式顯著抑制宮頸癌細胞的生長，隨著二甲雙胍濃度從5mmol/L升高至20mmol/L，細胞存活率從（80.5±2.8）%降至（45.6±3.0）%，這一結果與以往相關研究高度吻合。如[文獻3]中針對宮頸癌細胞的研究，同樣觀察到二甲雙胍對細胞增殖的抑制呈現劑量依賴性，當二甲雙胍濃度增加時，細胞的增殖活性明顯受到抑制。二甲雙胍抑制細胞增殖的機制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路密切相關。在正常細胞中，AMPK作為細胞能量代謝的關鍵調節因子，能夠感知細胞內的能量狀態。當細胞能量水平下降時，AMPK被激活，進而通過一系列下游信號傳導，調節細胞的代謝和生長。在宮頸癌細胞中，二甲雙胍的作用促使細胞內AMPK被激活，使其α亞基的Thr172位點發生磷酸化，從而激活AMPK的活性。激活后的AMPK可以抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，mTOR是細胞生長和增殖的關鍵調節因子，其活性受到抑制后，細胞的蛋白質合成、核糖體生物發生等過程受到阻礙，進而抑制細胞的增殖。此外，AMPK還可以通過調節其他代謝相關酶的活性，如抑制乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的活性，減少脂肪酸合成，影響細胞的能量代謝和物質合成，從而抑制宮頸癌細胞的增殖。在促進凋亡方面，20mmol/L二甲雙胍處理組的細胞凋亡率顯著升高，從對照組的（6.2±1.3）%增加至（25.8±2.6）%，有力地證明了二甲雙胍能夠有效誘導宮頸癌細胞凋亡。這一結果與[文獻4]中關于二甲雙胍誘導宮頸癌細胞凋亡的研究結論一致。二甲雙胍誘導細胞凋亡的機制可能與激活AMPK信號通路后對細胞凋亡相關蛋白和信號通路的調節有關。一方面，激活的AMPK可以調節Bcl-2家族蛋白的表達和活性。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡中起著關鍵作用，其中Bcl-2和Bcl-xL等是抗凋亡蛋白，而Bax和Bad等是促凋亡蛋白。二甲雙胍通過激活AMPK，可能上調促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而打破細胞內促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細胞凋亡的發生。另一方面，AMPK的激活還可能影響線粒體的功能。線粒體是細胞凋亡的重要調控中心，二甲雙胍通過激活AMPK，可能導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關因子，進而激活caspase級聯反應，最終誘導細胞凋亡。此外，二甲雙胍還可能通過調節其他信號通路，如抑制PI3K/Akt信號通路，間接影響細胞凋亡過程。PI3K/Akt信號通路在細胞存活和增殖中發揮重要作用，抑制該通路可以促進細胞凋亡，而二甲雙胍激活AMPK后，可能通過抑制PI3K/Akt信號通路的活性，增強細胞對凋亡信號的敏感性，促進宮頸癌細胞凋亡。綜上所述，本研究通過嚴謹的實驗設計和多指標檢測，明確了二甲雙胍對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，進一步驗證了二甲雙胍在宮頸癌治療中的潛在價值。后續研究可在此基礎上，深入探討二甲雙胍與其他治療方法的聯合應用，優化治療方案，為宮頸癌患者提供更有效的治療策略。3.4小結本部分實驗表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。CCK-8法檢測結果顯示，二甲雙胍對宮頸癌細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，隨著二甲雙胍濃度升高，細胞存活率顯著降低。流式細胞儀檢測發現，二甲雙胍處理組細胞凋亡率明顯高于對照組，證實了其促進細胞凋亡的作用。Westernblot檢測進一步揭示，二甲雙胍可激活AMPK信號通路，使宮頸癌細胞中p-AMPKα和p-ACC的表達水平顯著升高。這些結果為后續研究二甲雙胍與二氯乙酸鹽聯合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制奠定了基礎，有助于深入探討宮頸癌的聯合治療策略，為臨床治療提供更有效的理論依據。四、二氯乙酸鹽與二甲雙胍聯合殺傷宮頸癌細胞作用及機制4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料細胞株：依舊選用人宮頸癌HeLa細胞株，其在前期研究中已被證實具有穩定的生物學特性，能為聯合用藥實驗提供可靠的細胞模型，確保實驗結果的準確性和可重復性。試劑：二氯乙酸鹽（DCA）購自美國Santa公司，二甲雙胍（metformin）購自Sigma公司，二者純度均符合實驗要求，可保證聯合用藥實驗的可靠性。CCK-8試劑盒購自DojinDo公司，用于細胞增殖檢測，該試劑盒靈敏度高，能準確反映細胞增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，可精確檢測細胞凋亡情況。兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體、兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體特異性強，可用于檢測相關蛋白表達，探究聯合用藥的作用機制。Tublin抗體購自碧云天生物科技公司，作為內參抗體用于校正蛋白上樣量。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，為細胞提供適宜的生長環境。儀器：全波長酶標儀為BioTek公司產品，能精確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內各孔的光密度值。流式細胞儀選用BD公司產品，可準確分析細胞凋亡率。高速離心機為Eppendorf公司產品，提供高轉速和穩定離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作。恒溫CO?培養箱為ThermoScientific公司產品，精確控制培養環境的溫度、濕度和CO?濃度，確保細胞正常生長。電泳儀和轉膜儀均為Bio-Rad公司產品，用于蛋白質的分離和轉膜，為后續的Westernblot檢測提供保障。4.1.2實驗方法細胞培養：采用DMEM培養基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養箱中對HeLa細胞進行培養。當細胞密度達到培養瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養。具體操作如下：棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養基和代謝產物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，加入適量的新鮮培養基，輕輕搖勻，置于培養箱中繼續培養。藥物配置：準確稱取適量的DCA粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成100mmol/L的母液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。準確稱取適量的二甲雙胍粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成50mmol/L的母液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據實驗所需濃度，用培養基將母液稀釋至相應濃度。聯合用藥設計：根據前期單藥實驗結果，確定聯合用藥的濃度組合。設置不同實驗組，包括對照組（加入等體積的PBS緩沖液）、DCA單藥組（如40mmol/LDCA）、二甲雙胍單藥組（如20mmol/L二甲雙胍）、聯合用藥組（40mmol/LDCA+20mmol/L二甲雙胍）等。每組設置3個復孔，以確保實驗結果的可靠性。細胞處理：將處于對數生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養箱中培養過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，按照聯合用藥設計，分別加入相應的藥物溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液。繼續培養24h，用于后續檢測。檢測指標及方法：CCK-8法檢測細胞增殖：培養24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同組的細胞存活率，評估DCA和二甲雙胍單獨及聯合作用對宮頸癌細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養基，培養過夜。待細胞貼壁后，按照聯合用藥設計加入相應藥物，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續培養24h。培養結束后，收集細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率，以探究DCA和二甲雙胍單獨及聯合作用對宮頸癌細胞凋亡的影響。Westernblot檢測蛋白表達：收集經藥物處理和未處理的HeLa細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度調整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。加入兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體、兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體和Tublin抗體（內參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統采集圖像，分析目的蛋白的表達水平，通過檢測相關蛋白表達變化，深入探究DCA和二甲雙胍聯合作用的機制。4.2實驗結果CCK-8法檢測細胞增殖結果顯示，與對照組相比，DCA單藥組（40mmol/LDCA）和二甲雙胍單藥組（20mmol/L二甲雙胍）的細胞存活率均顯著降低（圖8）。其中，DCA單藥組細胞存活率為（35.8±2.5）%，二甲雙胍單藥組細胞存活率為（45.6±3.0）%，差異均具有高度統計學意義（P＜0.01）。而聯合用藥組（40mmol/LDCA+20mmol/L二甲雙胍）的細胞存活率進一步降低至（18.6±1.8）%，與單藥組相比，差異同樣具有高度統計學意義（P＜0.01）。這表明DCA和二甲雙胍聯合使用對宮頸癌細胞增殖的抑制作用明顯強于單藥使用，二者具有協同增效作用。圖注：與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果表明，DCA單藥組和二甲雙胍單藥組的細胞凋亡率均顯著高于對照組（圖9）。DCA單藥組細胞凋亡率為（28.5±2.8）%，二甲雙胍單藥組細胞凋亡率為（25.8±2.6）%，與對照組相比，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。聯合用藥組的細胞凋亡率則升高至（45.2±3.2）%，明顯高于單藥組，差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。這充分說明，DCA和二甲雙胍聯合使用能夠更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。圖注：A為對照組，B為DCA單藥組，C為二甲雙胍單藥組，D為聯合用藥組；與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結果顯示，聯合用藥組中凋亡相關蛋白剪切型PARP（cleavedPARP）的水平顯著高于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達則進一步下調（圖10）。同時，聯合用藥組中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）和磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組。這表明DCA和二甲雙胍聯合使用不僅增強了對凋亡相關蛋白的調節作用，還進一步激活了AMPK信號通路，從而更有效地誘導宮頸癌細胞凋亡和抑制細胞增殖。圖注：與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.014.3結果討論本實驗結果顯示，二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍聯合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協同殺傷作用。從細胞增殖角度來看，聯合用藥組的細胞存活率顯著低于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，表明二者聯合能更有效地抑制宮頸癌細胞的增殖。這一協同增效作用可能源于它們作用機制的互補。DCA主要通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促進線粒體有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，從而抑制細胞增殖；而二甲雙胍則主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，阻礙細胞的蛋白質合成和核糖體生物發生等過程，進而抑制細胞增殖。當二者聯合使用時，從不同代謝途徑和信號通路對宮頸癌細胞進行干預，使得細胞增殖所需的能量供應和物質合成均受到更嚴重的阻礙，從而表現出更強的增殖抑制效果。在細胞凋亡方面，聯合用藥組的細胞凋亡率明顯高于單藥組，表明DCA和二甲雙胍聯合使用能更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。這可能是由于聯合用藥對凋亡相關蛋白的調節作用更強。DCA通過促進蛋白酶體降解凋亡抑制蛋白Mcl-1，使細胞內促凋亡信號增強；二甲雙胍激活AMPK信號通路后，可能通過調節Bcl-2家族蛋白的表達和活性，如上調促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促使細胞凋亡。聯合用藥時，這兩種作用相互協同，進一步打破了細胞內促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，從而更顯著地促進細胞凋亡。此外，聯合用藥還可能通過其他途徑促進細胞凋亡，如對線粒體功能的影響。線粒體是細胞凋亡的重要調控中心，DCA和二甲雙胍聯合作用可能導致線粒體膜電位下降更明顯，釋放更多的細胞色素C等凋亡相關因子，進而激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。從蛋白表達結果來看，聯合用藥組中剪切型PARP水平顯著升高，Mcl-1表達進一步下調，同時p-AMPKα和p-ACC的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組，這進一步證實了聯合用藥不僅增強了對凋亡相關蛋白的調節作用，還進一步激活了AMPK信號通路。這種多途徑、多層次的調節作用使得聯合用藥對宮頸癌細胞的殺傷效果更顯著。DCA和二甲雙胍聯合治療宮頸癌具有潛在的優勢。一方面，聯合用藥可以提高治療效果，增強對宮頸癌細胞的殺傷作用，有望更有效地控制腫瘤的生長和擴散。另一方面，聯合使用較低劑量的DCA和二甲雙胍即可達到較好的治療效果，可能減少單藥高劑量使用帶來的副作用，提高患者的耐受性和依從性。然而，聯合治療也可能存在一些潛在問題。例如，聯合用藥的最佳劑量和療程尚未明確，不同患者對藥物的反應可能存在差異，需要進一步研究以實現個體化治療。此外，長期使用聯合藥物可能導致腫瘤細胞產生耐藥性，如何克服耐藥問題也是未來研究需要關注的重點。綜上所述，本研究明確了DCA和二甲雙胍聯合使用對宮頸癌細胞具有協同殺傷作用，其機制涉及對細胞增殖、凋亡相關蛋白的調節以及對AMPK信號通路的激活。這為宮頸癌的治療提供了新的思路和潛在的治療方案，但仍需要進一步的研究來優化聯合治療方案，解決潛在問題，以推動其臨床應用。4.4小結本部分實驗表明，二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍聯合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協同殺傷作用。通過CCK-8法檢測細胞增殖發現，聯合用藥組的細胞存活率明顯低于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，說明二者聯合能更有效地抑制宮頸癌細胞的增殖。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，聯合用藥組的細胞凋亡率顯著高于單藥組，證實了聯合使用能更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。Westernblot檢測進一步揭示，聯合用藥組中凋亡相關蛋白剪切型PARP的水平顯著升高，凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達進一步下調，同時p-AMPKα和p-ACC的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組，表明聯合用藥不僅增強了對凋亡相關蛋白的調節作用，還進一步激活了AMPK信號通路。這些結果為宮頸癌的聯合治療提供了新的理論依據，有望為臨床治療宮頸癌提供更有效的策略。五、研究總結與展望5.1研究總結本研究系統地探究了二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在DCA單獨作用方面，通過CCK-8法、流式細胞儀檢測以及Westernblot等實驗技術，明確了DCA能夠以劑量依賴的方式顯著抑制宮頸癌細胞的增殖，有效促進其凋亡。深入的機制研究發現，DCA通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促進線粒體有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，進而抑制細胞增殖。在誘導凋亡方面，DCA能夠促進蛋白酶體降解凋亡抑制蛋白Mcl-1，上調凋亡相關蛋白剪切型PARP的水平，打破細胞內促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，最終誘導宮頸癌細胞凋亡。對于二甲雙胍單獨作用的研究，同樣借助多種實驗方法，證實了二甲雙胍對宮頸癌細胞具有明顯的抑制增殖和促進凋亡作用，且抑制效果呈劑量依賴性。機制研究表明，二甲雙胍主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路來發揮作用。激活后的AMPK抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，阻礙細胞的蛋白質合成和核糖體生物發生等過程，從而抑制細胞增殖。同時，AMPK的激活還調節Bcl-2家族蛋白的表達和活性，上調促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促使細胞凋亡；此外，還可能通過影響線粒體功能，導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關因子，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。在聯合作用研究中，結果顯示DCA和二甲雙胍聯合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協同殺傷作用。聯合用藥組的細胞存活率明顯低于單藥組，細胞凋亡率顯著高于單藥組。進一步的機制研究表明，聯合用藥不僅增強了對凋亡相關蛋白的調節作用，使剪切型PARP水平顯著升高，Mcl-1表達進一步下調，還進一步激活了AMPK信號通路，p-AMPKα和p-ACC的表達水平明顯高于二甲雙胍單藥組。這種協同作用源于它們作用機制的互補，從不同代謝途徑和信號通路對宮頸癌細胞進行干預，使得細胞增殖所需的能量供應和物質合成均受到更嚴重的阻礙，同時更顯著地促進細胞凋亡，從而表現出更強的殺傷效果。本研究為宮頸癌的治療提供了新的理論依據和潛在的治療策略。DCA和二甲雙胍單獨及聯合作用對宮頸癌細胞的顯著殺傷作用，為開發新的宮頸癌治療方法奠定了基礎。聯合治療可能具有提高治療效果、減少單藥高劑量使用帶來的副作用等優勢，有望為宮頸癌患者帶來更好的治療前景。5.2研究不足與展望盡管本研究在二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。從實驗模型角度來看，本研究主要基于體外細胞實驗，雖然細胞實驗能夠精確控制實驗條件，深入探究藥物作用機制，但體外環境與體內環境存在顯著差異。在體內，腫瘤細胞與周圍的基質細胞、免疫細胞、血管等共同構成復雜的腫瘤微環境，腫瘤微環境中的各種因素，如細胞因子、生長因子、細胞外基質成分等，都可能影響藥物的作用效果。因此，后續研究可建立動物模型，如宮頸癌小鼠模型，進一步驗證DCA和二甲雙胍單獨及聯合治療