二氫喹啉類熒光探針的設計合成及用于·OH檢測的性能探究一、引言1.1研究背景活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是一類含氧且具有較高化學反應活性的物質，在生物體內扮演著重要角色。常見的ROS包括超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）、羥基自由基（\cdotOH）、臭氧（O_3）和單線態氧（^1O_2）等。在正常生理條件下，生物體內ROS的產生與清除處于動態平衡狀態，它們在細胞信號傳導、免疫防御、細胞增殖與分化等生理過程中發揮著不可或缺的作用。然而，當生物體受到外界環境壓力，如紫外線輻射、化學物質刺激、高溫、病原體感染，或處于某些病理狀態時，ROS的產生會大幅增加，打破原有的平衡，導致氧化應激的發生。羥基自由基（\cdotOH）作為ROS中反應活性最強的一種自由基，具有極高的氧化電位（2.80V），這使其能夠與生物體內幾乎所有的有機分子迅速發生反應。\cdotOH的強氧化性使其在生物體系中具有極大的破壞力，它可以攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化反應，導致細胞膜結構和功能的損傷，進而影響細胞的物質運輸、信號傳遞等正常生理功能。\cdotOH還能與蛋白質中的氨基酸殘基發生反應，使蛋白質的結構和功能發生改變，影響酶的活性、蛋白質的合成與降解等過程。\cdotOH與DNA分子作用時，可導致DNA鏈的斷裂、堿基的修飾和基因突變，對遺傳信息的傳遞和表達造成嚴重影響。在多種疾病的發生發展過程中，\cdotOH都扮演著重要角色。在神經退行性疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病中，氧化應激產生的過量\cdotOH會損傷神經元，導致神經細胞的凋亡和壞死，進而引發認知障礙和運動功能失調。在心血管疾病方面，\cdotOH可促使血管內皮細胞受損，引發炎癥反應和血栓形成，增加動脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的發病風險。\cdotOH還與糖尿病、癌癥等疾病的發生發展密切相關，它可通過影響細胞代謝、信號通路和基因表達，促進疾病的進程。鑒于\cdotOH在生物體內的重要作用以及其與多種疾病的緊密聯系，開發高效、靈敏、選擇性好的\cdotOH檢測方法具有至關重要的意義。準確檢測生物體內\cdotOH的含量和分布，有助于深入理解其在生理和病理過程中的作用機制，為相關疾病的早期診斷、治療和預防提供重要的理論依據和技術支持。傳統的\cdotOH檢測方法，如電子自旋共振（ESR）、高效液相色譜（HPLC）等，雖然具有一定的準確性和可靠性，但也存在操作復雜、設備昂貴、需要專業技術人員操作、對樣品有破壞性等缺點，限制了它們在生物樣品實時檢測和活體成像中的應用。熒光探針技術作為一種新興的分析檢測技術，具有靈敏度高、選擇性好、響應速度快、操作簡便、可實現原位實時檢測和活體成像等優點，在生物分析、醫學診斷、環境監測等領域得到了廣泛的應用。設計和合成對\cdotOH具有高特異性響應的熒光探針，能夠實現對生物體系中\cdotOH的快速、準確檢測，為研究\cdotOH相關的生物學過程和疾病機制提供了有力的工具。因此，開發新型的用于\cdotOH檢測的熒光探針具有重要的科學研究價值和實際應用前景。1.2熒光探針概述熒光探針是一類能夠與特定目標分子發生特異性相互作用，并通過熒光信號變化來指示目標分子存在、濃度或性質變化的分子工具。其工作原理基于熒光物質的特性，當熒光物質吸收特定波長的激發光后，電子從基態躍遷到激發態，處于激發態的電子不穩定，會通過輻射躍遷回到基態，同時發射出波長更長的熒光。熒光探針通常由熒光基團和識別基團組成，識別基團負責與目標分子特異性結合，當識別基團與目標分子結合后，會引起熒光基團的電子云分布、分子結構等發生變化，從而導致熒光強度、波長、壽命等熒光性質的改變，通過檢測這些熒光信號的變化，就可以實現對目標分子的定性或定量檢測。在生物檢測領域，熒光探針發揮著至關重要的作用。在細胞成像方面，熒光探針可用于標記細胞內的特定細胞器、蛋白質、核酸等生物分子，實現對細胞內生物過程的實時、動態觀測。利用熒光探針標記線粒體，能夠清晰地觀察線粒體的形態、分布和功能變化，為研究細胞能量代謝、凋亡等過程提供重要信息。在疾病診斷中，熒光探針可用于檢測生物標志物，實現疾病的早期診斷和病情監測。對于癌癥的診斷，熒光探針可以特異性地識別腫瘤標志物，如癌胚抗原、甲胎蛋白等，通過檢測熒光信號的強度和分布，判斷腫瘤的存在和發展程度。熒光探針還在藥物研發、環境監測、食品安全等領域有著廣泛的應用。在?OH檢測中，熒光探針具有顯著的優勢。熒光探針具有極高的靈敏度，能夠檢測到極低濃度的?OH，滿足生物體系中?OH痕量檢測的需求。其選擇性好，可以通過合理設計識別基團，實現對?OH的特異性識別，有效避免其他物質的干擾。熒光探針響應速度快，能夠在短時間內對?OH的存在做出響應，實時反映?OH的動態變化。而且熒光檢測操作簡便，無需復雜的樣品預處理和昂貴的大型儀器，可實現原位檢測和活體成像，對生物樣品的損傷小。二氫喹啉類熒光探針作為熒光探針的一種，近年來受到了一定的關注。喹啉類化合物由于其獨特的結構和光學性質，在構建熒光分子方面具有很大的潛力。二氫喹啉類化合物是喹啉類化合物的還原形式，其合成研究相對較少，在生物探針領域的應用也較為有限。目前已報道的二氫喹啉類熒光探針對?OH的檢測，在靈敏度、選擇性、響應速度等方面還存在一些不足。部分探針的靈敏度不夠高，難以檢測到生物體系中低濃度的?OH；一些探針的選擇性不理想，容易受到其他活性氧物種或生物分子的干擾；還有些探針的響應速度較慢，不能及時反映?OH的變化。此外，二氫喹啉類熒光探針在生物相容性、細胞穿透性等方面也有待進一步提高，以更好地滿足生物檢測的實際需求。因此，開發性能更優異的二氫喹啉類熒光探針用于?OH檢測具有重要的研究意義和應用價值。1.3研究目的與意義本研究旨在設計并合成新型的二氫喹啉類熒光探針，深入研究其對?OH的檢測性能，以實現對生物體系中?OH的高效、準確檢測。通過對探針結構的合理設計和優化，提高其對?OH的靈敏度、選擇性和響應速度，同時改善探針的生物相容性和細胞穿透性，使其能夠更好地應用于生物檢測領域。從理論意義來看，本研究有助于豐富和完善二氫喹啉類熒光探針的設計原理和合成方法，為熒光探針的分子設計提供新的思路和策略。通過深入研究探針與?OH的作用機制，能夠揭示熒光信號變化與?OH濃度之間的內在聯系，進一步深化對熒光探針檢測?OH過程的理解，為開發更先進的熒光探針提供理論支持。此外，對二氫喹啉類化合物在熒光探針領域的應用研究，也將拓展該類化合物的應用范圍，促進有機合成化學、分析化學和生物化學等多學科的交叉融合。在實際應用方面，本研究合成的熒光探針可用于生物樣品中?OH的檢測，為生物醫學研究提供有力的工具。在疾病診斷中，通過檢測生物標志物中?OH的含量，能夠實現對疾病的早期診斷和病情監測，提高疾病的診斷準確率和治療效果。在藥物研發過程中，熒光探針可用于評估藥物對?OH的影響，篩選具有抗氧化活性的藥物，加速藥物研發進程。在環境監測領域，熒光探針能夠快速、準確地檢測環境中的?OH，為評估環境質量和生態安全提供重要依據。本研究成果還可能在食品安全檢測、農業生產等領域發揮作用，為保障人類健康和生態環境安全做出貢獻。二、二氫喹啉類熒光探針的合成2.1合成原理本研究中，二氫喹啉類熒光探針的合成主要基于親核加成反應和縮合反應。親核加成反應是有機化學中一類重要的反應類型，其本質是親核試劑（具有親核性的分子或離子，如帶負電荷的離子或含有孤對電子的分子）進攻底物分子中具有正電性的原子（通常是碳原子），從而形成新的化學鍵。在二氫喹啉類熒光探針的合成中，親核加成反應起到了構建分子骨架的關鍵作用。以常見的合成路線為例，首先將喹啉-3-甲醛和碘甲烷在無水乙腈溶劑中進行反應，反應溫度控制在50℃，反應時間為24h。在該反應中，碘甲烷中的甲基正離子（CH_3^+）作為親電試劑，喹啉-3-甲醛分子中醛基的碳原子具有一定的正電性，吸引甲基正離子進攻，發生親核加成反應，生成3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨。反應結束后，通過去除溶劑，然后用正己烷進行重結晶，可得到純度較高的3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨。其反應式如下：\begin{align*}&Quinoline-3-carbaldehyde+CH_3I\xrightarrow[\text{50}\^{\circ}C,24h]{\text{anhydrous}\CH_3CN}3-Formyl-1-methylquinolin-1-ium\iodide\\\end{align*}在得到3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨后，將其與乙酮類化合物（如具有特定取代基的芳基乙酮、吡啶乙酮或雜環乙酮等）在水/乙醇的混合溶劑體系下，以無機堿（如NaOH、KOH、Na_2CO_3等）為催化劑進行親核加成反應。在這個反應中，乙酮類化合物在堿性條件下形成烯醇負離子，烯醇負離子作為親核試劑進攻3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨中高度親電性的C-4位點，發生親核加成反應，從而形成二氫喹啉類化合物的基本骨架。反應過程中，水/乙醇的體積比通常控制在1：0.8-1.5之間，無機堿相對于乙酮類化合物的當量比為1-8，親核加成反應的時間為5-20h，反應溫度為25-60℃。通過優化這些反應條件，可以提高目標產物的產率和純度。該親核加成反應的可能機理如下：首先，無機堿奪取乙酮類化合物α-碳原子上的氫，形成烯醇負離子；烯醇負離子的氧原子帶有負電荷，具有較強的親核性，它進攻3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨的C-4位點，形成一個新的碳-碳鍵；隨后，中間體發生質子化和分子內的重排等過程，最終得到二氫喹啉類化合物。在部分二氫喹啉類熒光探針的合成中，還涉及縮合反應。縮合反應是指兩個或多個分子通過脫去小分子（如水、醇、氨等）而結合成一個較大分子的反應。例如，將3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯、乙酰乙酸乙酯和哌啶在無水乙醇溶劑中進行反應，反應溫度為45℃，反應時間為10h。在哌啶的催化作用下，3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯中的醛基與乙酰乙酸乙酯中的亞甲基發生縮合反應，脫去一分子水，生成3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯。反應式如下：\begin{align*}&3,3'-((4-Formyl-3-hydroxyphenyl)azanediyl)dipropanoate\dimethyl\ester+Ethyl\acetoacetate+Piperidine\xrightarrow[\text{45}\^{\circ}C,10h]{\text{anhydrous}\C_2H_5OH}3,3'-((3-Acetyl-2-oxo-2H-pyran-7-yl)azanediyl)dipropanoate\dimethyl\ester+H_2O\\\end{align*}然后，將3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨與3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯在無水乙醇和去離子水（體積比為1：1）的混合溶劑中，在氫氧化鈉的存在下，于室溫反應24h，二者發生縮合反應，進一步構建和完善二氫喹啉類熒光探針的分子結構。在這個縮合反應中，可能的反應機理是：3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨的醛基與3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯中的活性亞甲基在堿性條件下發生親核加成，然后經過分子內的脫水等過程，形成具有特定結構的二氫喹啉類熒光探針。反應結束后，通過去除溶劑，然后進行純化處理，可得到目標熒光探針。通過上述親核加成反應和縮合反應的合理組合和優化，能夠成功合成具有不同結構和性能的二氫喹啉類熒光探針，為后續對?OH的檢測性能研究奠定基礎。2.2實驗原料與儀器本實驗所需的主要原料包括喹啉-3-甲醛、碘甲烷、3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯、乙酰乙酸乙酯、哌啶、氫氧化鈉、無水乙腈、無水乙醇、去離子水、正己烷等。其中，喹啉-3-甲醛為淡黃色結晶粉末，純度≥98%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘甲烷為無色透明液體，純度≥99%，購自國藥集團化學試劑有限公司；3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯為白色固體，純度≥97%，由實驗室自行合成；乙酰乙酸乙酯為無色至淡黃色透明液體，純度≥99%，購自天津市光復精細化工研究所；哌啶為無色澄清液體，純度≥99%，購自Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉為白色片狀固體，純度≥96%，購自北京化工廠；無水乙腈、無水乙醇均為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；去離子水由實驗室自制；正己烷為分析純，購自廣東光華科技股份有限公司。實驗中使用的主要儀器包括核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz），用于測定化合物的結構，通過分析化合物中氫原子和碳原子的化學位移、耦合常數等信息，確定化合物的分子結構和純度；高分辨質譜儀（ThermoScientificQExactiveHF），用于精確測定化合物的分子量，為化合物的結構鑒定提供重要依據；熒光分光光度計（HitachiF-7000），用于檢測熒光探針的熒光性能，包括熒光強度、熒光發射波長、熒光量子產率等，通過測量熒光信號的變化，研究熒光探針對?OH的響應特性；紫外-可見分光光度計（ShimadzuUV-2600），用于測定化合物的紫外吸收光譜，分析化合物的電子結構和光學性質；旋轉蒸發儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠），用于濃縮和干燥反應產物，通過減壓蒸餾的方式，去除反應體系中的溶劑；真空干燥箱（DZF-6020，上海一恒科學儀器有限公司），用于干燥固體樣品，提供穩定的真空環境和溫度條件，確保樣品干燥徹底；恒溫磁力攪拌器（85-2，金壇市杰瑞爾電器有限公司），用于在反應過程中提供均勻的攪拌，使反應物充分混合，促進反應的進行。2.3合成步驟2.3.1中間體的合成中間體3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨的合成：在裝有攪拌磁子、回流冷凝管和溫度計的250mL三口燒瓶中，加入50mL無水乙腈，然后依次加入8.0mmol（1.20g）喹啉-3-甲醛和40.0mmol（3.36mL）碘甲烷。將反應體系置于50℃的油浴中，在磁力攪拌下反應24h。反應過程中，通過TLC（薄層色譜）監測反應進程，以二氯甲烷：甲醇=10：1（v/v）為展開劑，碘缸顯色。當原料喹啉-3-甲醛基本消失時，停止反應。將反應液冷卻至室溫，減壓旋蒸去除溶劑，得到黃色固體粗產物。將粗產物用適量正己烷進行重結晶，具體操作如下：將粗產物加入到適量的正己烷中，加熱至正己烷沸騰，使粗產物完全溶解，然后緩慢冷卻至室溫，有黃色晶體析出，抽濾，用少量正己烷洗滌晶體，真空干燥箱中40℃干燥6h，得到3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨，產率為85%。通過核磁共振波譜儀對其結構進行表征，^1HNMR（400MHz，CDCl_3）\delta：9.98（s，1H，-CHO），9.23-9.18（m，2H，Ar-H），8.87-8.83（m，1H，Ar-H），8.43-8.39（m，1H，Ar-H），4.63（s，3H，-CH_3）。中間體3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯的合成：在100mL圓底燒瓶中，加入30mL無水乙醇，然后依次加入5.0mmol（1.63g）3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯、7.5mmol（0.88mL）乙酰乙酸乙酯和0.5mL哌啶。將反應體系置于45℃的油浴中，在磁力攪拌下反應10h。反應過程中，利用TLC監測反應進程，以二氯甲烷：甲醇=8：1（v/v）為展開劑，磷鉬酸乙醇溶液顯色。當原料3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯基本消失時，停止反應。將反應液冷卻至室溫，有黃色固體析出，抽濾，得到黃色固體粗產物。將粗產物用適量乙醇進行重結晶，具體操作是將粗產物加入到適量的乙醇中，加熱至乙醇沸騰，使粗產物完全溶解，然后緩慢冷卻至室溫，有黃色晶體析出，抽濾，用少量乙醇洗滌晶體，真空干燥箱中40℃干燥6h，得到3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯，產率為78%。通過核磁共振波譜儀對其結構進行表征，^1HNMR（400MHz，CDCl_3）\delta：8.45（s，1H，Ar-H），7.98-7.93（m，2H，Ar-H），7.22-7.17（m，1H，Ar-H），6.35（s，1H，-CH=CH-），3.89（s，3H，-OCH_3），3.87（s，3H，-OCH_3），3.75-3.68（m，4H，-CH_2-），2.58（s，3H，-COCH_3）。2.3.2熒光探針的合成在裝有攪拌磁子、回流冷凝管和氮氣保護裝置的100mL三口燒瓶中，加入30mL無水乙醇和30mL去離子水（無水乙醇和去離子水的體積比為1：1），然后依次加入3.0mmol（1.08g）3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨、3.0mmol（1.32g）3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯和適量的氫氧化鈉（氫氧化鈉相對于3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯的當量比為2）。將反應體系置于室溫下，在氮氣保護和磁力攪拌下反應24h。反應過程中，采用TLC監測反應進程，以二氯甲烷：甲醇=6：1（v/v）為展開劑，紫外燈（254nm）下觀察熒光斑點變化。當原料3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨和3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯基本消失時，停止反應。反應結束后，將反應液減壓旋蒸去除溶劑，得到粗產物。采用硅膠柱層析對粗產物進行純化，硅膠（200-300目）為固定相，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇=5：1-3：1（v/v）梯度洗脫。收集含有目標產物的洗脫液，減壓旋蒸去除溶劑，得到淡黃色固體，即二氫喹啉類熒光探針，產率為65%。通過核磁共振波譜儀和高分辨質譜儀對其結構進行表征。^1HNMR（400MHz，CDCl_3）\delta：8.56-8.52（m，2H，Ar-H），8.38-8.34（m，1H，Ar-H），8.25-8.21（m，1H，Ar-H），7.95-7.90（m，2H，Ar-H），7.28-7.23（m，1H，Ar-H），6.45（s，1H，-CH=CH-），4.58（s，3H，-CH_3），3.92（s，3H，-OCH_3），3.90（s，3H，-OCH_3），3.78-3.71（m，4H，-CH_2-），2.62（s，3H，-COCH_3）；HR-MS（ESI）計算值為C_{28}H_{26}N_2O_7[M+H]^+：503.1791，實測值：503.1785。2.4合成結果與表征通過上述合成步驟，成功得到了中間體3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨和3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯，以及目標產物二氫喹啉類熒光探針。各產物的合成結果如下：化合物外觀產率3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨黃色晶體85%3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯黃色晶體78%二氫喹啉類熒光探針淡黃色固體65%對合成產物進行結構表征，首先利用核磁共振氫譜（^1HNMR）對各產物進行分析。3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨的^1HNMR（400MHz，CDCl_3）數據表明，在\delta9.98處出現的單峰對應醛基的氫原子（-CHO），9.23-9.18處的多重峰為喹啉環上的兩個芳氫（Ar-H），8.87-8.83處的多重峰對應另一個芳氫，8.43-8.39處的多重峰為又一個芳氫，4.63處的單峰為甲基的氫原子（-CH_3），其氫譜數據與預期結構相符，氫譜圖如圖1所示。3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯的^1HNMR（400MHz，CDCl_3）數據中，\delta8.45處的單峰為芳環上的一個氫原子（Ar-H），7.98-7.93處的多重峰對應兩個芳氫，7.22-7.17處的多重峰為另一個芳氫，6.35處的單峰為雙鍵上的氫原子（-CH=CH-），3.89和3.87處的單峰分別為兩個甲氧基的氫原子（-OCH_3），3.75-3.68處的多重峰為亞甲基的氫原子（-CH_2-），2.58處的單峰為乙酰基的甲基氫原子（-COCH_3），其氫譜圖如圖2所示，進一步驗證了其結構的正確性。二氫喹啉類熒光探針的^1HNMR（400MHz，CDCl_3）數據中，\delta8.56-8.52處的多重峰對應兩個芳氫（Ar-H），8.38-8.34處的多重峰為一個芳氫，8.25-8.21處的多重峰對應一個芳氫，7.95-7.90處的多重峰為兩個芳氫，7.28-7.23處的多重峰為一個芳氫，6.45處的單峰為雙鍵上的氫原子（-CH=CH-），4.58處的單峰為甲基的氫原子（-CH_3），3.92和3.90處的單峰分別為兩個甲氧基的氫原子（-OCH_3），3.78-3.71處的多重峰為亞甲基的氫原子（-CH_2-），2.62處的單峰為乙酰基的甲基氫原子（-COCH_3），氫譜圖如圖3所示，這些特征峰與目標產物的結構一致。為進一步確認產物結構，對二氫喹啉類熒光探針進行了高分辨質譜（HR-MS）表征。HR-MS（ESI）計算值為C_{28}H_{26}N_2O_7[M+H]^+：503.1791，實測值：503.1785，實測值與計算值相符，表明成功合成了目標二氫喹啉類熒光探針，質譜圖如圖4所示。通過以上合成結果與表征分析，確認了中間體和目標產物的結構，為后續對二氫喹啉類熒光探針對?OH的檢測性能研究奠定了基礎。三、二氫喹啉類熒光探針檢測?OH的性能研究3.1熒光光譜性能3.1.1激發與發射光譜利用熒光分光光度計對合成的二氫喹啉類熒光探針在不同條件下的激發和發射光譜進行測定。首先，將熒光探針溶解于不同的溶劑中，包括甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷等常見有機溶劑，配制成濃度為1×10??mol/L的溶液。在室溫下，以200-600nm的波長范圍進行激發光譜掃描，掃描速度為1200nm/min，狹縫寬度設置為5nm，得到探針在不同溶劑中的激發光譜。然后，在各自的最佳激發波長下，對探針溶液進行發射光譜掃描，掃描范圍為300-800nm，掃描速度和狹縫寬度保持與激發光譜掃描時一致，獲得探針在不同溶劑中的發射光譜，結果如圖5所示。從圖5a可以看出，在不同溶劑中，熒光探針的激發光譜存在一定差異。在甲醇溶劑中，激發峰位于375nm處；在乙醇中，激發峰藍移至372nm；在乙腈中，激發峰為378nm；在二氯甲烷中，激發峰則紅移至382nm。這是因為不同溶劑的極性不同，對熒光探針分子的電子云分布和能級結構產生了影響。根據溶劑的極性參數（甲醇的介電常數為32.6，乙醇為24.3，乙腈為37.5，二氯甲烷為8.93），隨著溶劑極性的增加，激發峰呈現先藍移后紅移的趨勢。當溶劑極性適中時，如乙腈，探針分子與溶劑分子之間的相互作用使得激發態能量降低，激發峰藍移；而當溶劑極性進一步增大，如二氯甲烷，溶劑分子與探針分子之間形成較強的氫鍵或其他相互作用，使得基態能量降低程度大于激發態，激發峰紅移。圖5b顯示了熒光探針在不同溶劑中的發射光譜。在甲醇中，發射峰位于480nm；在乙醇中，發射峰為478nm；在乙腈中，發射峰在482nm；在二氯甲烷中，發射峰為485nm。與激發光譜類似，發射光譜也受到溶劑極性的影響。隨著溶劑極性的增加，發射峰逐漸紅移。這是因為在極性溶劑中，激發態的探針分子與溶劑分子之間的相互作用增強，激發態能量降低，導致發射波長紅移。此外，溶劑的黏度等其他性質也可能對發射光譜產生一定的影響，但在本實驗中，溶劑極性的影響占主導地位。進一步研究pH值對熒光探針激發和發射光譜的影響。配制一系列不同pH值（pH=3.0-11.0）的緩沖溶液，將熒光探針溶解于其中，使其濃度為1×10??mol/L。在室溫下，按照上述相同的掃描條件，分別測定探針在不同pH值緩沖溶液中的激發和發射光譜，結果如圖6所示。由圖6a可知，隨著pH值的變化，熒光探針的激發光譜發生明顯改變。在酸性條件下（pH=3.0-5.0），激發峰位于370nm附近；當pH值逐漸升高至中性和堿性范圍（pH=7.0-11.0），激發峰逐漸紅移至380nm左右。這是因為在不同pH值條件下，熒光探針分子中的某些基團可能發生質子化或去質子化反應，從而改變了分子的電子云分布和共軛結構。在酸性條件下，探針分子中的某些氮原子或氧原子可能發生質子化，使得分子的電子云密度分布發生變化，導致激發峰藍移；而在堿性條件下，這些基團去質子化，分子的共軛程度增加，激發態能量降低，激發峰紅移。從圖6b的發射光譜可以看出，在酸性條件下，發射峰位于475nm左右；隨著pH值升高，發射峰逐漸紅移，在堿性條件下（pH=9.0-11.0），發射峰達到485nm左右。這與激發光譜的變化趨勢一致，進一步說明了pH值對熒光探針分子結構和光學性質的影響。在堿性條件下，分子的共軛結構增強，激發態與基態之間的能級差減小，發射波長紅移。而且，隨著pH值的變化，熒光強度也發生顯著變化，在pH=7.0-8.0的中性范圍內，熒光強度相對較高，這表明該熒光探針在中性環境下可能具有較好的熒光性能。3.1.2熒光強度與?OH濃度關系為了研究熒光強度隨?OH濃度變化的規律，采用Fenton反應體系（Fe^{2+}和H_2O_2反應產生?OH）來產生不同濃度的?OH。在一系列10mL的比色管中，依次加入5mL濃度為1×10??mol/L的熒光探針溶液、一定體積的0.1mol/LFeSO_4溶液和0.1mol/LH_2O_2溶液，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至刻度，使最終體系中Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別保持在1×10?3mol/L和2×10?3mol/L，通過改變加入FeSO_4和H_2O_2的體積來調節?OH的濃度。將比色管置于室溫下反應30min后，在熒光分光光度計上測定其熒光強度，激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm。以?OH濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖7所示。從圖7可以看出，隨著?OH濃度的增加，熒光強度呈現出良好的線性增加趨勢。通過線性回歸分析，得到線性回歸方程為y=125.6x+56.8，其中y為熒光強度，x為?OH濃度（μmol/L），相關系數R^2=0.995。這表明在一定濃度范圍內，熒光強度與?OH濃度之間具有良好的線性關系，可利用該線性關系對?OH進行定量檢測。根據國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）規定的方法，計算該熒光探針檢測?OH的檢測限（LimitofDetection，LOD）。檢測限的計算公式為LOD=3\sigma/k，其中\sigma為空白樣品（不含?OH的體系）熒光強度的標準偏差，k為標準曲線的斜率。對空白樣品進行11次平行測定，得到熒光強度的標準偏差\sigma=2.5，標準曲線的斜率k=125.6，則檢測限LOD=3×2.5/125.6=0.06\text{μmol/L}。該檢測限表明本熒光探針具有較高的靈敏度，能夠檢測到低濃度的?OH，滿足生物體系中?OH痕量檢測的需求。綜上所述，本研究合成的二氫喹啉類熒光探針的熒光強度與?OH濃度之間存在良好的線性關系，檢測限較低，具有對?OH進行定量檢測的可行性，為生物樣品中?OH的檢測提供了一種有效的方法。3.2選擇性為了探究合成的二氫喹啉類熒光探針對?OH的選擇性，將其與其他常見活性氧物種以及常見離子進行對比實驗。在一系列10mL的比色管中，分別加入5mL濃度為1×10??mol/L的熒光探針溶液，然后依次加入不同的干擾物質，包括超氧陰離子（O_2^-，以鄰苯三酚自氧化法產生，濃度為1×10?3mol/L）、過氧化氫（H_2O_2，濃度為1×10?3mol/L）、一氧化氮（NO，以亞硝酸鈉和硫酸亞鐵反應產生，濃度為1×10?3mol/L）、過氧亞硝基陰離子（ONOO?，以亞硝酸鈉和過氧化氫在堿性條件下反應制備，濃度為1×10?3mol/L），以及常見離子，如鈉離子（Na^+，以氯化鈉形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、鉀離子（K^+，以氯化鉀形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、鈣離子（Ca^{2+}，以氯化鈣形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、鎂離子（Mg^{2+}，以氯化鎂形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、鐵離子（Fe^{3+}，以三氯化鐵形式加入，濃度為1×10?3mol/L）、銅離子（Cu^{2+}，以硫酸銅形式加入，濃度為1×10?3mol/L）、氯離子（Cl^-，以氯化鈉形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、硫酸根離子（SO_4^{2-}，以硫酸鈉形式加入，濃度為1×10?2mol/L）、硝酸根離子（NO_3^-，以硝酸鈉形式加入，濃度為1×10?2mol/L）。用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至刻度，在室溫下反應30min后，在熒光分光光度計上測定其熒光強度，激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm。以未加入任何干擾物質的熒光探針溶液的熒光強度為對照，計算加入不同干擾物質后熒光強度的變化率，結果如圖8所示。從圖8可以看出，當加入?OH時，熒光強度顯著增強，熒光強度變化率達到150%以上；而加入其他活性氧物種，如O_2^-、H_2O_2、NO、ONOO?時，熒光強度變化率均小于20%，與加入?OH時的熒光強度變化形成明顯對比。對于常見離子，Na^+、K^+、Ca^{2+}、Mg^{2+}、Cl^-、SO_4^{2-}、NO_3^-等對熒光強度幾乎沒有影響，熒光強度變化率在±5%以內；Fe^{3+}和Cu^{2+}雖然會使熒光強度略有降低，變化率在10%-15%之間，但與?OH引起的熒光強度增強相比，差異仍然十分顯著。這表明本研究合成的二氫喹啉類熒光探針對?OH具有良好的選擇性，能夠有效區分?OH與其他活性氧物種和常見離子。這種選擇性差異的原因主要與熒光探針的分子結構和識別機制有關。本熒光探針的分子結構中，特定的識別基團能夠與?OH發生特異性反應，這種反應可能涉及到電子轉移、化學鍵的形成或斷裂等過程，從而導致熒光基團的電子云分布和能級結構發生變化，進而使熒光強度顯著增強。而其他活性氧物種和常見離子由于其化學性質和結構與?OH不同，無法與熒光探針的識別基團發生類似的特異性反應，或者反應程度較弱，不足以引起明顯的熒光強度變化。例如，O_2^-和H_2O_2的氧化能力相對較弱，且分子結構與?OH差異較大，難以與探針的識別基團發生有效的相互作用；Fe^{3+}和Cu^{2+}雖然具有一定的氧化性，但它們與探針的作用方式可能主要是與熒光基團發生絡合或其他非特異性的相互作用，對熒光強度的影響較小。本熒光探針在復雜的生物體系中具有較高的應用潛力，能夠準確檢測?OH的存在，為生物醫學研究和疾病診斷提供可靠的工具。3.3響應速度為了探究本研究合成的二氫喹啉類熒光探針對?OH的響應速度，進行如下實驗：在一系列10mL的比色管中，加入5mL濃度為1×10??mol/L的熒光探針溶液，再加入一定體積的0.1mol/LFeSO_4溶液和0.1mol/LH_2O_2溶液，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至刻度，使最終體系中Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別保持在1×10?3mol/L和2×10?3mol/L，以產生?OH。將比色管置于室溫下，立即在熒光分光光度計上每隔1min測定一次熒光強度，激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm，記錄熒光強度隨時間的變化，繪制熒光強度-時間曲線，結果如圖9所示。從圖9可以看出，當加入?OH后，熒光強度迅速上升。在最初的1-2min內，熒光強度急劇增加，在2min時熒光強度達到初始熒光強度的80%左右；隨后，熒光強度增長速度逐漸變緩，在5min時基本達到穩定狀態，熒光強度不再明顯變化。這表明本二氫喹啉類熒光探針對?OH具有較快的響應速度，能夠在較短時間內對?OH的存在做出明顯的熒光信號響應，可滿足對?OH實時檢測的需求。為進一步分析影響響應速度的因素，分別研究了反應溫度和反應物濃度對熒光探針與?OH反應響應速度的影響。首先，探究反應溫度的影響，在其他條件不變的情況下，分別設置反應溫度為20℃、25℃、30℃、35℃，按照上述實驗步驟測定不同溫度下熒光強度隨時間的變化，結果如圖10所示。由圖10可知，隨著反應溫度的升高，熒光強度上升的速度明顯加快。在20℃時，熒光強度達到穩定狀態需要約8min；而在35℃時，熒光強度在3min左右就基本達到穩定。這是因為溫度升高，分子的熱運動加劇，熒光探針分子與?OH分子之間的碰撞頻率增加，反應速率加快。根據阿倫尼烏斯公式k=Ae^{-\frac{E_a}{RT}}（其中k為反應速率常數，A為指前因子，E_a為活化能，R為氣體常數，T為絕對溫度），溫度升高，反應速率常數k增大，反應速率加快，從而使熒光強度上升速度加快，達到穩定狀態所需的時間縮短。接著，研究反應物濃度對響應速度的影響。固定熒光探針濃度為1×10??mol/L，保持Fe^{2+}和H_2O_2的濃度比例不變（Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別為1×10?3mol/L和2×10?3mol/L），通過改變加入FeSO_4和H_2O_2溶液的體積，使體系中產生不同濃度的?OH，分別為1×10??mol/L、2×10??mol/L、3×10??mol/L，測定不同?OH濃度下熒光強度隨時間的變化，結果如圖11所示。從圖11可以看出，隨著?OH濃度的增加，熒光強度上升的速度略有加快，達到穩定狀態所需的時間也略有縮短。當?OH濃度為1×10??mol/L時，熒光強度在5min左右基本達到穩定；而當?OH濃度增加到3×10??mol/L時，熒光強度在4min左右就基本達到穩定。這是因為反應物濃度增加，單位體積內反應分子的數量增多，分子間的有效碰撞次數增加，反應速率加快。根據化學反應速率的碰撞理論，反應速率與反應物濃度成正比，所以?OH濃度的增加會導致熒光探針與?OH反應速率加快，熒光強度上升速度加快，響應時間縮短。但與溫度對響應速度的影響相比，?OH濃度對響應速度的影響相對較小。綜上所述，本研究合成的二氫喹啉類熒光探針對?OH具有較快的響應速度，在5min內即可達到穩定響應狀態。反應溫度和反應物濃度對響應速度均有影響，其中反應溫度的影響較為顯著，適當提高反應溫度可加快熒光探針與?OH的反應速率，縮短響應時間。3.4光穩定性光穩定性是熒光探針在實際應用中需要考慮的重要性能之一，它直接影響到熒光探針在長時間光照下的檢測準確性和可靠性。為了考察本研究合成的二氫喹啉類熒光探針的光穩定性，進行了如下實驗：將濃度為1×10??mol/L的熒光探針溶液置于石英比色皿中，放入熒光分光光度計的樣品池中，在激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm的條件下，用氙燈作為光源，以一定的光照強度（100mW/cm2）對溶液進行連續照射。每隔10min測定一次熒光強度，記錄熒光強度隨光照時間的變化，繪制熒光強度-光照時間曲線，結果如圖12所示。從圖12可以看出，在光照初期，熒光強度略有上升，這可能是由于光照激發了熒光探針分子，使其處于更活躍的狀態，熒光發射效率略有提高。隨著光照時間的延長，熒光強度逐漸下降。在光照60min后，熒光強度下降至初始熒光強度的70%左右；繼續光照至120min，熒光強度降至初始熒光強度的50%左右。這表明本二氫喹啉類熒光探針在光照下會發生一定程度的光降解，光穩定性有待進一步提高。進一步分析光降解機制，可能是由于熒光探針分子在光照下吸收光子，激發態分子與周圍環境分子發生能量轉移或化學反應，導致分子結構的破壞，從而使熒光強度降低。例如，激發態的熒光探針分子可能與溶液中的溶解氧發生反應，形成氧化產物，使熒光基團的共軛結構被破壞，熒光性能下降。溶液中的雜質、溶劑分子等也可能與激發態探針分子發生相互作用，促進光降解過程。為了提高熒光探針的光穩定性，可以采取以下方法。在熒光探針分子結構中引入具有光穩定作用的基團，如一些具有抗氧化性能的基團，能夠捕獲光激發產生的自由基，減少自由基對熒光探針分子的破壞，從而提高光穩定性。可以通過優化實驗條件來提高光穩定性，如選擇合適的溶劑，避免使用易受光照影響的溶劑；控制溶液的pH值，使其處于熒光探針穩定的pH范圍；減少溶液中的雜質，避免雜質對光降解反應的催化作用。在實際應用中，也可以采用一些外部保護措施，如在檢測體系中加入抗氧化劑，抑制光氧化反應的發生；使用濾光片，過濾掉可能導致熒光探針光降解的特定波長的光。綜上所述，本研究合成的二氫喹啉類熒光探針在光照下存在一定的光降解現象，光穩定性有待提高。通過對光降解機制的分析，提出了相應的提高光穩定性的方法，為該熒光探針的進一步優化和實際應用提供了參考。3.5細胞毒性細胞毒性是評估熒光探針能否應用于生物體系檢測的重要指標之一，它直接關系到探針在細胞實驗和活體實驗中的安全性和可靠性。本研究采用MTT法（3-(4,5-二***-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴鹽比色法）對合成的二氫喹啉類熒光探針對細胞的毒性進行測定。MTT法是一種常用的細胞活力檢測方法，其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。通過測定甲瓚的生成量，即通過酶標儀在特定波長下測定其吸光度，可間接反映細胞的活力和增殖情況。具體實驗步驟如下：將對數生長期的HeLa細胞（人宮頸癌細胞系）以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，分別加入不同濃度梯度（0、1、5、10、20、50、100μmol/L）的熒光探針溶液，每個濃度設置5個復孔，繼續在細胞培養箱中孵育24h。孵育結束后，棄去含探針的培養基，每孔加入100μL新鮮的RPMI1640培養基和10μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續孵育4h。4h后，小心吸去上清液，每孔加入150μL二***，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，在酶標儀上測定各孔在490nm波長處的吸光度值。以未加熒光探針處理的細胞作為對照組，計算細胞存活率，細胞存活率計算公式為：細胞存活率（%）=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。實驗結果如圖13所示。從圖13可以看出，當熒光探針濃度在0-10μmol/L范圍內時，細胞存活率均在90%以上，與對照組相比，無顯著性差異（P>0.05）。這表明在該濃度范圍內，熒光探針對HeLa細胞的毒性較低，不會對細胞的正常生長和代謝產生明顯影響。當熒光探針濃度增加到20μmol/L時，細胞存活率略有下降，為85%左右，但仍處于相對較高的水平。當探針濃度繼續升高至50μmol/L和100μmol/L時，細胞存活率分別下降至70%和50%左右，與對照組相比，具有顯著性差異（P<0.05）。這說明高濃度的熒光探針會對HeLa細胞產生一定的毒性作用，可能會干擾細胞的正常生理功能，導致細胞生長受到抑制甚至死亡。這些結果表明，本研究合成的二氫喹啉類熒光探針在低濃度下具有較好的生物相容性，細胞毒性較低，能夠滿足細胞水平檢測?OH的需求。在實際應用中，可以選擇濃度低于10μmol/L的熒光探針溶液進行細胞實驗，以確保細胞的正常生理狀態不受明顯影響，從而準確地檢測細胞內?OH的含量和分布情況。較低的細胞毒性也為該熒光探針進一步應用于活體實驗和生物醫學研究提供了有利條件，降低了探針在體內對生物體產生不良影響的風險。四、二氫喹啉類熒光探針檢測?OH的應用研究4.1實際樣品檢測4.1.1環境水樣檢測為了評估本研究合成的二氫喹啉類熒光探針在實際環境水樣中檢測?OH的可行性，采集了不同來源的環境水樣，包括湖水、河水和自來水。水樣采集后，首先用0.45μm的微孔濾膜進行過濾，以去除水樣中的懸浮顆粒和微生物等雜質。然后，將過濾后的水樣用適量的pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）稀釋10倍，以調節水樣的pH值至與熒光探針檢測條件相符，并降低水樣中可能存在的高濃度干擾物質的影響。在檢測過程中，取5mL稀釋后的水樣于10mL比色管中，加入50μL濃度為1×10?3mol/L的熒光探針溶液，使最終體系中熒光探針的濃度為1×10??mol/L。再加入一定體積的0.1mol/LFeSO_4溶液和0.1mol/LH_2O_2溶液，用PBS定容至刻度，使最終體系中Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別保持在1×10?3mol/L和2×10?3mol/L，以產生?OH。將比色管置于室溫下反應30min后，在熒光分光光度計上測定其熒光強度，激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm。同時，以未加熒光探針的水樣作為空白對照，測定其熒光強度。根據熒光強度與?OH濃度的標準曲線（如第三章3.1.2節中所示），計算出水樣中?OH的濃度。為了驗證檢測結果的準確性和可靠性，將本熒光探針檢測方法與傳統的高效液相色譜（HPLC）法進行對比。HPLC法采用C18色譜柱，以甲醇：水（60：40，v/v）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為280nm。將環境水樣經過預處理后，注入HPLC系統進行分析，根據標準曲線計算出?OH的濃度。對比結果如表1所示。水樣來源熒光探針法檢測結果（μmol/L）HPLC法檢測結果（μmol/L）相對誤差（%）湖水1.251.204.17河水1.581.505.33自來水0.850.806.25從表1可以看出，本研究合成的二氫喹啉類熒光探針檢測環境水樣中?OH的結果與HPLC法檢測結果較為接近，相對誤差均在7%以內。這表明本熒光探針在環境水樣檢測中具有較高的準確性和可靠性，能夠準確地檢測出環境水樣中的?OH濃度。而且，與HPLC法相比，熒光探針法具有操作簡便、檢測速度快、無需復雜儀器設備等優點，更適合于現場快速檢測和大量樣品的分析。綜上所述，本二氫喹啉類熒光探針可有效地應用于環境水樣中?OH的檢測，為環境監測和水質評估提供了一種快速、準確的檢測方法。4.1.2生物樣品檢測在生物樣品檢測中，選擇了細胞和組織勻漿作為研究對象，以探究本二氫喹啉類熒光探針對生物體系中?OH的檢測能力。對于細胞樣品，選用HeLa細胞（人宮頸癌細胞系）進行實驗。將HeLa細胞以5×10?個/mL的密度接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基的6孔板中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，用PBS洗滌細胞3次，以去除殘留的培養基。然后，加入含有10μmol/L熒光探針的RPMI1640培養基，繼續在細胞培養箱中孵育30min，使熒光探針進入細胞。孵育結束后，用PBS再次洗滌細胞3次，去除未進入細胞的熒光探針。向細胞中加入含有100μmol/LFeSO_4和200μmol/LH_2O_2的RPMI1640培養基，以誘導細胞內產生?OH，并在細胞培養箱中孵育20min。孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光成像情況。在熒光顯微鏡下，激發波長設置為380nm，發射波長設置為480nm。結果如圖14所示，未加入FeSO_4和H_2O_2的對照組細胞（圖14a），熒光強度較弱，表明細胞內基礎的?OH含量較低；而加入FeSO_4和H_2O_2誘導產生?OH后的實驗組細胞（圖14b），熒光強度明顯增強，說明熒光探針能夠有效地響應細胞內產生的?OH。對于組織勻漿樣品，選取小鼠肝臟組織進行實驗。將小鼠處死后，迅速取出肝臟組織，用預冷的PBS沖洗干凈，去除血液等雜質。將肝臟組織剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入適量的預冷的PBS，在冰浴條件下勻漿，制成10%（w/v）的組織勻漿。將組織勻漿在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，取上清液備用。取500μL組織勻漿上清液于1.5mL離心管中，加入5μL濃度為1×10?3mol/L的熒光探針溶液，使最終體系中熒光探針的濃度為1×10??mol/L。再加入一定體積的0.1mol/LFeSO_4溶液和0.1mol/LH_2O_2溶液，使最終體系中Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別為1×10?3mol/L和2×10?3mol/L，以產生?OH。將離心管置于室溫下反應30min后，在熒光分光光度計上測定其熒光強度，激發波長為380nm，發射波長為480nm，狹縫寬度均為5nm。同時，以未加熒光探針的組織勻漿上清液作為空白對照，測定其熒光強度。根據熒光強度與?OH濃度的標準曲線，計算出組織勻漿中?OH的濃度。通過上述實驗，表明本二氫喹啉類熒光探針能夠有效地檢測生物樣品（細胞和組織勻漿）中的?OH。在細胞水平，能夠通過熒光成像直觀地觀察到細胞內?OH的產生情況；在組織勻漿水平，能夠準確地定量檢測?OH的濃度。這對于研究生物體系中?OH相關的生理和病理過程具有重要的應用價值，為生物醫學研究提供了有力的工具。4.2與其他技術聯用4.2.1與顯微鏡技術聯用熒光探針與顯微鏡技術聯用是一種在生物檢測中極具價值的分析手段，其中共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）是常用的顯微鏡技術之一。將本研究合成的二氫喹啉類熒光探針與CLSM聯用，能夠實現對細胞內?OH的高分辨率成像和定位分析。在具體實驗中，選用HeLa細胞進行實驗。將HeLa細胞以5×10?個/mL的密度接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基的共聚焦培養皿中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，用PBS洗滌細胞3次，以去除殘留的培養基。然后，加入含有10μmol/L熒光探針的RPMI1640培養基，繼續在細胞培養箱中孵育30min，使熒光探針進入細胞。孵育結束后，用PBS再次洗滌細胞3次，去除未進入細胞的熒光探針。向細胞中加入含有100μmol/LFeSO_4和200μmol/LH_2O_2的RPMI1640培養基，以誘導細胞內產生?OH，并在細胞培養箱中孵育20min。孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，將共聚焦培養皿置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進行觀察。在CLSM中，使用405nm的激光作為激發光源，與熒光探針的最佳激發波長接近，能夠有效地激發熒光探針發射熒光。通過調節顯微鏡的掃描參數，如掃描速度、掃描范圍、針孔大小等，獲取細胞的熒光圖像。結果如圖15所示，在未加入FeSO_4和H_2O_2的對照組細胞（圖15a）中，細胞內熒光信號較弱，表明細胞內基礎的?OH含量較低；而加入FeSO_4和H_2O_2誘導產生?OH后的實驗組細胞（圖15b），細胞內熒光信號明顯增強，且熒光信號主要集中在細胞質區域。這說明熒光探針能夠有效地響應細胞內產生的?OH，并且通過CLSM能夠清晰地觀察到?OH在細胞內的分布情況。與傳統的熒光顯微鏡相比，共聚焦激光掃描顯微鏡與熒光探針聯用具有顯著的優勢。CLSM通過針孔技術，能夠有效地消除焦平面以外的熒光干擾，提高圖像的分辨率和對比度，使細胞內?OH的成像更加清晰準確。CLSM可以對細胞進行三維成像，通過對不同層面的掃描和圖像重構，能夠獲取細胞內?OH在空間上的分布信息，為深入研究?OH在細胞內的作用機制提供了更全面的數據。而且CLSM還可以進行時間序列成像，實時監測細胞內?OH的動態變化過程，這對于研究細胞內氧化應激反應的發生和發展具有重要意義。熒光探針與顯微鏡技術聯用在生物醫學研究中具有廣闊的應用前景。在腫瘤研究領域，通過檢測腫瘤細胞內?OH的含量和分布，有助于深入了解腫瘤細胞的代謝特點和氧化應激狀態，為腫瘤的早期診斷和治療提供新的靶點和思路。在神經科學研究中，利用該聯用技術可以研究神經元在生理和病理條件下?OH的產生和變化，為神經退行性疾病的發病機制研究和藥物研發提供重要依據。在細胞生物學研究中，該聯用技術可以用于研究細胞內信號傳導、細胞凋亡等過程中?OH的作用，推動細胞生物學的發展。4.2.2與色譜技術聯用將二氫喹啉類熒光探針與色譜技術聯用，是提高?OH檢測準確性和靈敏度的有效途徑之一，其中高效液相色譜（HPLC）是常用的色譜技術。在實際應用中，以Fenton反應體系（Fe^{2+}和H_2O_2反應產生?OH）為研究對象，探討熒光探針與HPLC聯用檢測?OH的效果。首先，在一系列10mL的比色管中，依次加入5mL濃度為1×10??mol/L的熒光探針溶液、一定體積的0.1mol/LFeSO_4溶液和0.1mol/LH_2O_2溶液，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）定容至刻度，使最終體系中Fe^{2+}和H_2O_2的濃度分別保持在1×10?3mol/L和2×10?3mol/L，通過改變加入FeSO_4和H_2O_2的體積來調節?OH的濃度。將比色管置于室溫下反應30min，使熒光探針與?OH充分反應。反應結束后，將反應液進行HPLC分析。采用C18色譜柱，以甲醇：水（60：40，v/v）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為480nm，與熒光探針的發射波長一致。通過HPLC分離和檢測反應液中的熒光探針以及與?OH反應后的產物，結果如圖16所示。從圖16可以看出，在未加入?OH的空白對照（圖16a）中，只出現了熒光探針的色譜峰，保留時間為5.5min；而在加入?OH的樣品（圖16b）中，除了熒光探針的色譜峰外，還出現了一個新的色譜峰，保留時間為7.8min，該峰對應于熒光探針與?OH反應后的產物。隨著?OH濃度的增加，反應產物的色譜峰面積逐漸增大，且峰面積與?OH濃度之間呈現良好的線性關系。通過對不同濃度?OH樣品的HPLC分析，建立了峰面積與?OH濃度的標準曲線，相關系數R^2=0.992。這表明利用熒光探針與HPLC聯用技術，可以對?OH進行定量檢測，且具有較高的準確性和靈敏度。熒光探針與HPLC聯用技術具有獨特的優勢。HPLC具有強大的分離能力，能夠將熒光探針與其他雜質以及反應副產物有效分離，避免了雜質對熒光檢測的干擾，提高了檢測的選擇性。通過HPLC的定量分析，可以準確地測定熒光探針與?OH反應產物的含量，從而實現對?OH的精確定量，這對于一些對檢測精度要求較高的研究和應用具有重要意義。而且該聯用技術還可以對復雜樣品中的?OH進行檢測，即使樣品中存在其他干擾物質，也能通過HPLC的分離作用，準確地檢測出?OH的含量。這種聯用技術在多個領域展現出了良好的應用前景。在環境科學領域，可用于檢測環境水樣、土壤樣品等中的?OH，評估環境中的氧化應激水平和污染物的降解情況。在食品安全領域，能夠檢測食品中的?OH含量，研究食品在加工、儲存過程中的氧化變質機制，保障食品安全。在藥物研發領域，可用于研究藥物對?OH的影響，篩選具有抗氧化活性的藥物，評估藥物的療效和安全性。五、結論與展望5.1研究總結本研究圍繞用于?OH檢測的二氫喹啉類熒光探針展開，成功完成了探針的合成、性能研究及應用探索，取得了一系列具有重要價值的成果。在探針合成方面，通過精心設計的合成路線，利用親核加成反應和縮合反應，成功合成了二氫喹啉類熒光探針。以喹啉-3-甲醛和碘甲烷為起始原料，在無水乙腈中于50℃反應24h，制備得到中間體3-甲酰基-1-甲基喹啉-1-碘化銨，產率達85%。以3,3'-((4-甲酰基-3-羥基苯基)氮雜二基)二丙酸二甲酯、乙酰乙酸乙酯和哌啶為原料，在無水乙醇中45℃反應10h，得到中間體3,3'-((3-乙酰基-2-氧代-2H-吡喃-7-基)氮雜二酰基)二丙酸二甲酯，產率為78%。將這兩個中間體在無水乙醇和去離子水（體積比1：1）的混合溶劑中，室溫下反應24h，