臨床肝癌組織核酸適配體：篩選、特性及應用探索一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據統計，2018年中國新發肝癌病例約39萬，位居新發惡性腫瘤第三位，同年因肝癌死亡人數約36萬，亦居惡性腫瘤死亡人數第三位，且全世界47%的肝癌發生在中國。肝癌的高發病率與高死亡率，主要歸因于其惡性程度高、預后差等生物學特性。盡管隨著現代生物醫學技術、臨床外科技術、微創治療技術等的不斷發展，肝癌的臨床診治水平有所提高，手術切除率、術后生存率及術后生活質量均有一定程度的改善，但與其他腫瘤治療效果相比，肝癌的療效仍不盡人意。肝癌的早期診斷和有效治療是改善患者預后、降低病死率的關鍵。目前，肝癌的診斷方法主要包括血清學檢測、影像學檢查和組織病理學檢查等。血清學檢測如甲胎蛋白（AFP）檢測，雖廣泛應用，但存在靈敏度和特異性不足的問題，部分肝癌患者AFP水平并不升高，導致漏診；影像學檢查如超聲、CT、MRI等，對于早期微小肝癌的檢測存在一定局限性；組織病理學檢查雖為診斷的金標準，但屬于有創檢查，且受取材部位和范圍的影響，可能出現誤診。因此，發展新型高效、快速的腫瘤標志物篩選方法，以及開發對腫瘤病理組織具有高特異性、高靈敏度并且化學性質穩定的分子識別探針，對于臨床腫瘤診斷、分類及判斷預后等具有至關重要的意義。核酸適配體（Aptamer）是通過指數富集配體系統進化技術（SELEX），從人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得的一類寡核苷酸序列。它能夠高特異性、高親和力地與多種靶標，包括小分子、蛋白質、細胞、組織、微生物等相結合，具有類似抗體的功能，因此被稱為“化學抗體”。與傳統抗體相比，核酸適配體具有諸多優勢，如分子量小、易于化學合成和修飾、穩定性好、免疫原性低、無毒性等。此外，核酸適配體的篩選過程無需動物免疫，可在體外進行，大大縮短了篩選周期，降低了成本。近年來，基于protein-SELEX或者cell-SELEX技術篩選得到的核酸適配體，作為一種新發展起來的識別分子，在包括癌癥研究的許多領域獲得了廣泛的應用。然而，protein-SELEX方法的篩選靶標為純化蛋白，cell-SELEX技術以體外培養的腫瘤細胞系為篩選靶標，這些篩選目標物都無法真正模擬體內腫瘤的實際發生發展模式，忽略了腫瘤形成過程中會受到體內包括血管微環境和細胞外周基質等的多種因素影響。這使得基于cell-SELEX篩選得到的核酸適配體一般只能識別體外培養的腫瘤細胞系，難以真正實現對腫瘤臨床病理組織的檢測和診斷，嚴重限制了核酸適配體在腫瘤臨床領域的研究和應用。而tissue-SELEX技術以臨床腫瘤組織為篩選靶標，能獲得真正識別臨床腫瘤病理組織的核酸適配體探針，在腫瘤標志物的發現、臨床診斷和分型研究中展示出了良好的潛力。但目前相關研究開展較少，有待進一步深入探索和推進。本研究旨在采用tissue-SELEX技術，以臨床肝癌組織切片為樣本，篩選能區分肝癌組織與正常肝組織的核酸適配體，并對其與靶標的結合性能進行分析研究，為肝癌的早期診斷和治療提供新的分子識別探針和技術支持。1.2國內外研究現狀在肝癌領域，核酸適配體的研究已取得了一定進展，國內外眾多科研團隊從不同角度展開探索，為肝癌的診斷與治療帶來了新的思路與方法。在國外，科研人員利用核酸適配體技術，對肝癌相關的生物標志物進行深入研究。例如，通過SELEX技術篩選出與肝癌標志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）特異性結合的核酸適配體。GPC3在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織中低表達或不表達，這種適配體可用于設計肝癌血清診斷試劑、肝癌組織切片染色試劑以及肝癌相關的活體成像造影劑，為肝癌的分子診斷提供了新的策略。此外，也有研究聚焦于利用核酸適配體檢測肝癌患者血清中的甲胎蛋白異質體（AFP-L3）。AFP-L3是肝癌重要的生物標志物，傳統基于抗體的檢測方法存在熱不穩定、活性易波動等缺點。而以適配體作為AFP-L3的特異性識別受體，接枝到磁性納米顆粒上制備的適配體功能化磁性納米顆粒，對靶AFP-L3具有較好的特異性，回收率遠高于競爭蛋白，基于此建立的血清中AFP蛋白無標記檢測方法，展示了核酸適配體在肝癌生物標志物檢測中的優勢。國內的研究同樣成果豐碩。一些團隊致力于以肝癌細胞系為靶標篩選核酸適配體。通過cell-SELEX技術，從隨機寡核苷酸文庫中篩選出能與肝癌細胞特異性結合的核酸適配體序列，這些適配體可用于捕獲血液中的腫瘤細胞，為肝癌的早期診斷提供了潛在的工具。還有研究以肝癌血清為靶標進行核酸適配體的篩選。采用基于聚丙烯酰胺凝膠電泳及灰度分析技術檢測適配體與血清標本的結合程度，通過多因素Logistic回歸分析建立數學診斷模型，結果表明肝癌血清核酸適配體對肝癌具有良好的診斷價值。此外，國內在基于tissue-SELEX技術篩選肝癌組織核酸適配體方面也有探索，旨在獲得真正能識別臨床腫瘤病理組織的核酸適配體探針。盡管國內外在核酸適配體用于肝癌研究方面取得了上述成果，但當前研究仍存在一些不足。一方面，基于protein-SELEX和cell-SELEX技術篩選的核酸適配體，由于篩選靶標無法真實模擬體內腫瘤微環境，導致難以在臨床病理組織檢測中發揮有效作用。另一方面，tissue-SELEX技術雖具有獨特優勢，但相關研究開展較少，篩選方法和應用研究還不夠成熟，例如篩選效率有待提高，對篩選得到的核酸適配體與靶標的作用機制研究還不夠深入，在肝癌治療中的應用研究也相對匱乏。此外，由于肝癌的異質性較大，不同類型的肝癌組織對核酸適配體的響應不盡相同，目前還缺乏適用于不同類型肝癌組織的核酸適配體篩選及應用體系。1.3研究目的與意義本研究旨在采用tissue-SELEX技術，以臨床肝癌組織切片為樣本，篩選出能夠特異性區分肝癌組織與正常肝組織的核酸適配體。通過多輪篩選與嚴格鑒定，獲取高親和力、高特異性的核酸適配體序列。在此基礎上，深入分析篩選得到的核酸適配體與靶標的結合性能，包括結合親和力、特異性等。利用熒光共定位、流式細胞術等技術手段，明確核酸適配體的靶分子亞細胞定位，測定其與肝癌細胞的解離常數，并通過競爭實驗探究其與其他已知核酸適配體識別位點的差異。肝癌作為嚴重威脅人類健康的重大疾病，其早期診斷和有效治療一直是醫學領域的研究熱點與難點。本研究具有重要的理論與實際意義。在理論方面，tissue-SELEX技術以臨床腫瘤組織為篩選靶標，相較于傳統的protein-SELEX和cell-SELEX技術，能更真實地模擬體內腫瘤微環境，為深入了解腫瘤發生發展過程中相關分子機制提供新的研究視角。篩選得到的肝癌組織核酸適配體，有助于發現新的腫瘤標志物，進一步豐富對肝癌生物學特性的認識，推動腫瘤分子生物學理論的發展。在實際應用方面，高特異性和高靈敏度的核酸適配體可作為新型分子識別探針，用于肝癌的早期診斷。有望開發基于核酸適配體的肝癌診斷試劑，如血清診斷試劑、組織切片染色試劑等，提高肝癌診斷的準確性和靈敏度，實現肝癌的早期發現，為患者爭取更多的治療時機。核酸適配體還具有作為靶向治療載體的潛力。其分子量小、易于修飾的特點，使其能夠攜帶藥物、放射性核素等治療物質，實現對肝癌細胞的精準靶向治療，提高治療效果，降低對正常組織的毒副作用，為肝癌的治療開辟新的途徑。本研究對于改善肝癌患者的預后、降低病死率具有重要意義，也將為核酸適配體技術在腫瘤臨床領域的廣泛應用奠定基礎。二、核酸適配體篩選技術及原理2.1指數富集配體系統進化技術（SELEX）指數富集配體系統進化技術（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX），是核酸適配體篩選的核心技術。1990年，美國的Gold課題組和Szostak課題組幾乎同時獨立開發出該技術，Gold將其命名為“SELEX”。SELEX技術的基本原理是從人工合成的大容量單鏈寡核苷酸文庫出發，該文庫通常包含10^12-10^15種不同序列的單鏈寡核苷酸分子。文庫中的寡核苷酸序列由中間的隨機序列和兩端的固定序列組成，隨機序列長度一般在20-40bp之間，其多樣性為篩選特異性適配體提供了豐富的序列基礎；兩端固定序列則帶有特定的限制性內切酶位點，是聚合酶鏈式反應（PCR）及其他酶促反應相關引物的結合位點。在篩選過程中，將單鏈寡核苷酸文庫與靶標物質在特定條件下混合孵育，文庫中的寡核苷酸分子憑借其能夠形成的多種三維結構，與靶標物質發生相互作用。那些與靶標具有特異性結合能力的寡核苷酸會形成靶標-寡核苷酸復合物，而未結合的寡核苷酸則通過洗滌步驟被去除。隨后，以與靶標結合的寡核苷酸為模板，通過PCR擴增獲得大量的復制產物。對于DNA適配體，擴增后直接進行下一輪篩選；對于RNA適配體，擴增得到的雙鏈DNA需轉錄為單鏈RNA，再進行后續篩選。經過多輪（通常8-15輪）反復的篩選、結合、洗脫、擴增過程，與靶標親和力低或不結合的寡核苷酸逐漸被淘汰，而與靶標具有高親和力和高特異性的核酸適配體在文庫中的比例不斷增加，最終被富集分離出來。以蛋白質為靶標進行SELEX篩選時，文庫中的寡核苷酸分子會與蛋白質表面的特定區域相互作用。通過多輪篩選，能夠篩選出與蛋白質高親和力結合的適配體，其解離常數甚至可以達到納摩爾（nmol/L）甚至皮摩爾（pmol/L）級別。若以小分子物質為靶標，如茶堿，篩選得到的適配體與茶堿結合的解離常數可達0.1mol/L，且能分辨出茶堿與咖啡因在嘌呤環N7位置上有無甲基的細微差別，展現出高分辨率。SELEX技術具有諸多顯著特點。首先，其庫容量大，適應范圍極為廣泛，靶標可以是蛋白質、核酸、小分子有機物、金屬離子，甚至完整的細胞、組織、細菌、病毒等，幾乎涵蓋自然界中所有種類的分子。其次，篩選得到的適配體具有高親和力和高特異性，能夠與靶標分子精確結合，其親和力可與抗體相媲美，甚至在某些情況下超越抗體。再者，篩選過程相對簡便、快速且經濟，一般典型的SELEX篩選過程可在2-3個月內完成，篩選出的適配體小規模合成和純化不超過3天，無需特殊儀器和試劑，普通實驗室即可開展。而傳統抗體制備至少需要3-6個月，且過程繁瑣、成本高昂。SELEX技術篩選得到的適配體還具有良好的實用性，可定時、定量、保質生產，其變性和復性快速可逆，可重復使用，能在室溫下長期保存和運輸。適配體尺寸小，作為藥物施用時免疫原性低，腫瘤穿透力強，且易于在體內清除。SELEX技術在核酸適配體篩選中占據著舉足輕重的地位。它為適配體的篩選提供了一種高效、通用的方法，使得針對各種不同靶標的適配體得以開發。在生物醫學領域，基于SELEX技術篩選的適配體被廣泛應用于疾病診斷、治療、藥物研發等方面。在癌癥診斷中，通過篩選與腫瘤標志物特異性結合的適配體，可實現對腫瘤的早期精準檢測；在治療方面，適配體可作為靶向載體，攜帶藥物精準作用于病變細胞，提高治療效果并降低毒副作用。在生物技術領域，適配體也被應用于生物傳感器的構建、蛋白質功能研究等。在食品安全檢測中，利用適配體對特定有害物質的高特異性結合能力，開發高靈敏的檢測方法。SELEX技術的出現，極大地推動了核酸適配體相關研究和應用的發展，為解決眾多領域的實際問題提供了新的有力工具。2.2基于臨床肝癌組織的篩選技術優化傳統的protein-SELEX技術以純化蛋白為篩選靶標，雖能獲得與特定蛋白高親和力結合的核酸適配體，但由于在體外對蛋白進行純化的過程中，蛋白脫離了其原本所處的復雜生理環境，可能導致蛋白的空間構象發生改變，無法真實反映蛋白在體內的天然狀態。這使得篩選得到的適配體在應用于臨床腫瘤組織檢測時，難以準確識別腫瘤組織中的目標蛋白，限制了其在臨床診斷中的有效性。cell-SELEX技術以體外培養的腫瘤細胞系為篩選靶標，相較于protein-SELEX技術，在一定程度上模擬了細胞的生理環境。然而，體外培養的腫瘤細胞系與體內腫瘤組織存在顯著差異。腫瘤細胞在體外培養過程中，其基因表達譜、蛋白質組學特征以及細胞表面標志物的表達等均可能發生改變，與體內腫瘤細胞的真實情況不完全一致。腫瘤細胞系在培養過程中可能會丟失某些與腫瘤發生發展密切相關的分子標志物，或者出現一些異常表達的標志物。腫瘤細胞系缺乏體內腫瘤組織所處的復雜微環境，如血管微環境、細胞外周基質以及免疫細胞等的相互作用。這些因素導致基于cell-SELEX技術篩選得到的核酸適配體，往往只能特異性識別體外培養的腫瘤細胞系，難以在臨床腫瘤病理組織檢測中發揮有效作用。tissue-SELEX技術以臨床腫瘤組織為篩選靶標，具有獨特的優勢。臨床腫瘤組織保留了腫瘤細胞在體內的真實生物學特性，包括腫瘤細胞與周圍微環境的相互作用，以及腫瘤細胞表面各種分子標志物的天然表達狀態。采用tissue-SELEX技術，能夠篩選出真正識別臨床腫瘤病理組織的核酸適配體探針，這些適配體可以特異性結合腫瘤組織中特有的分子標志物，從而實現對腫瘤組織的精準識別和檢測。相較于傳統技術，tissue-SELEX技術能更真實地模擬體內腫瘤微環境，篩選得到的核酸適配體在腫瘤臨床診斷和治療中具有更高的應用價值。在以臨床肝癌組織為靶標的tissue-SELEX技術中，仍存在一些可改進的方向。篩選過程中，臨床肝癌組織的處理和保存方式可能影響篩選結果。組織切片的厚度、固定方法以及保存時間等因素，都可能導致組織中靶分子的結構和活性發生變化，進而影響核酸適配體與靶分子的結合。需要優化組織處理和保存方案，確保組織中靶分子的完整性和活性，以提高篩選效率和適配體的質量。tissue-SELEX技術的篩選效率有待進一步提高。傳統的多輪篩選過程耗時較長，且在篩選過程中可能會出現非特異性結合的問題，導致篩選得到的核酸適配體純度不高?？梢砸胍恍┫冗M的技術手段，如微流控技術、高通量測序技術等，優化篩選流程，減少非特異性結合，提高篩選效率和適配體的特異性。微流控技術能夠在微小的芯片上實現核酸適配體的篩選過程，具有反應體積小、篩選速度快、成本低等優點；高通量測序技術則可以對篩選過程中的核酸序列進行快速、準確的分析，有助于及時了解篩選進展，優化篩選條件。在篩選過程中，對核酸適配體與靶分子結合機制的研究還不夠深入。深入探究適配體與靶分子的結合模式、結合位點以及相互作用的分子機制，有助于更好地理解篩選結果，指導篩選條件的優化，以及開發更具針對性的核酸適配體探針?？梢岳梅肿由飳W、生物化學以及結構生物學等多學科技術手段，對適配體與靶分子的結合機制進行深入研究。三、臨床肝癌組織核酸適配體的篩選實驗3.1實驗材料與準備實驗樣本方面，臨床肝癌組織樣本取自[具體醫院名稱]進行手術切除的肝癌患者，共收集[X]例。樣本獲取過程嚴格遵循醫學倫理規范，在患者簽署知情同意書后，于手術過程中迅速采集肝癌組織。采集的組織樣本立即置于液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存，以確保組織的生物學特性穩定，減少因樣本處理不當導致的分子結構變化。正常肝組織樣本則選取自同一患者手術切除的癌旁正常肝組織，距離腫瘤邊緣[X]cm以上，同樣進行速凍和-80℃保存處理，以保證其作為對照的可靠性。核酸文庫選用長度為[X]nt的單鏈DNA文庫，該文庫由[具體合成公司名稱]采用固相亞磷酰胺三酯法合成。文庫的核心設計為中間包含[X]nt的隨機序列，兩端分別為[X]nt和[X]nt的固定序列。中間的隨機序列為篩選特異性核酸適配體提供了豐富的序列多樣性基礎，兩端固定序列帶有特定的限制性內切酶位點，是后續PCR擴增及其他酶促反應相關引物的結合位點。文庫合成后，通過高效液相色譜（HPLC）進行純化，以去除合成過程中產生的雜質，確保文庫的純度和質量。采用紫外分光光度計在260nm波長處測定文庫的濃度和純度，確保其符合實驗要求，最終文庫濃度調整為[X]μmol/L備用。引物包括正向引物和反向引物，由[引物合成公司名稱]合成。正向引物序列為5'-[具體序列]-3'，反向引物序列為5'-[具體序列]-3'。引物合成后同樣進行HPLC純化，并使用紫外分光光度計測定濃度和純度。將引物溶解于超純水中，配制成[X]μmol/L的儲存液，儲存于-20℃冰箱備用。實驗過程中還需要多種試劑，如PCR反應試劑，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×PCR緩沖液等，均購自[試劑公司名稱]。結合緩沖液（BindingBuffer）用于核酸適配體與靶標結合反應，其配方為：[具體成分及濃度]，使用前需經0.22μm濾膜過濾除菌，并在4℃保存。洗滌緩沖液（WashingBuffer）用于洗滌未結合的核酸分子，其成分與結合緩沖液相似，但離子濃度或pH值可能有所調整，以增強洗滌效果，同樣需過濾除菌和4℃保存。此外，還需準備蛋白酶K、RNaseA等用于核酸提取和處理的試劑，以及其他常規實驗試劑，如乙醇、氯仿、異丙醇等。實驗儀器主要有PCR擴增儀（[儀器型號及品牌]），用于核酸適配體的擴增；離心機（[儀器型號及品牌]），用于樣本離心分離；凝膠成像系統（[儀器型號及品牌]），用于觀察和分析PCR產物及核酸電泳結果；恒溫搖床（[儀器型號及品牌]），用于核酸與靶標結合反應時的振蕩孵育；紫外分光光度計（[儀器型號及品牌]），用于核酸濃度和純度的測定等。在實驗前，對所有儀器進行校準和調試，確保其性能穩定，以保障實驗數據的準確性。3.2篩選過程與步驟基于tissue-SELEX技術的核酸適配體篩選過程，主要包括與肝癌組織和正常肝組織的孵育、洗脫、擴增等關鍵步驟。將臨床肝癌組織切片和正常肝組織切片從-80℃冰箱取出，放置在室溫下復溫15-20分鐘。復溫后的組織切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以去除組織表面可能存在的雜質和冰晶。將沖洗后的組織切片轉移至含有結合緩沖液的孵育管中，確保組織切片完全浸沒在緩沖液中。向孵育管中加入濃度為[X]μmol/L的單鏈DNA文庫，使文庫與組織切片充分接觸。將孵育管置于恒溫搖床上，在37℃條件下振蕩孵育1-2小時，振蕩速度設置為100-150rpm。在孵育過程中，文庫中的核酸分子憑借其多樣的三維結構，與肝癌組織或正常肝組織中的靶分子發生相互作用。孵育結束后，將孵育管從恒溫搖床中取出，小心吸取上清液，盡量避免吸到組織切片。用預冷的洗滌緩沖液對組織切片進行洗滌，洗滌次數為5-8次，每次洗滌時間為5-10分鐘。在洗滌過程中，通過輕柔振蕩孵育管，去除未與組織切片特異性結合的核酸分子。經過洗滌后，與肝癌組織特異性結合的核酸分子仍然留在組織切片上。向孵育管中加入適量的洗脫緩沖液，將孵育管置于95℃水浴中加熱10-15分鐘，使結合在組織切片上的核酸分子從靶分子上解離下來。將孵育管從水浴中取出，立即進行短暫離心，將解離下來的核酸分子收集到上清液中。對于與正常肝組織孵育的樣本，同樣進行上述洗脫操作。將從肝癌組織和正常肝組織洗脫得到的核酸分子分別作為模板，進行PCR擴增。在PCR反應體系中，加入適量的正向引物、反向引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及10×PCR緩沖液。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后進行30-35個循環，每個循環包括95℃變性30秒、[X]℃退火30秒、72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分鐘。通過PCR擴增，獲得大量的與肝癌組織或正常肝組織特異性結合的核酸分子。擴增后的PCR產物用1.5%-2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察擴增條帶的大小和亮度。利用凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收純化，去除PCR反應中多余的引物、dNTPs以及其他雜質。純化后的核酸分子作為下一輪篩選的文庫。進入下一輪篩選時，重復上述孵育、洗脫、擴增的步驟。在每一輪篩選過程中，逐漸增加篩選壓力，如縮短孵育時間、增加洗滌次數或降低洗滌緩沖液的離子強度等。通過多輪（通常進行10-15輪）不斷優化篩選條件的反復篩選過程，與肝癌組織親和力低或不結合的核酸分子逐漸被淘汰，而與肝癌組織具有高親和力和高特異性的核酸適配體在文庫中的比例不斷增加。在第3輪篩選時，將孵育時間從第1輪的2小時縮短至1.5小時；第5輪篩選時，將洗滌次數從原來的5次增加到7次。經過多輪篩選后，對富集的文庫進行分析鑒定。采用克隆測序技術，將富集文庫中的核酸分子克隆到載體中，轉化大腸桿菌，挑選單克隆進行測序。對測序結果進行生物信息學分析，包括序列比對、同源性分析以及二級結構預測等，從而篩選出能區分肝癌組織與正常肝組織的核酸適配體。3.3篩選結果與分析經過11輪的tissue-SELEX篩選，從最初的單鏈DNA文庫中成功富集并鑒定出一條能區分肝癌組織與正常肝組織的核酸適配體，命名為SW1。對篩選過程中每一輪的文庫進行分析，以評估核酸適配體的富集情況。通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術，測定每輪篩選后文庫中與肝癌組織特異性結合的核酸分子的相對含量。結果顯示，隨著篩選輪數的增加，與肝癌組織特異性結合的核酸分子在文庫中的比例逐漸上升。在第1輪篩選時，特異性核酸分子的比例相對較低，僅占文庫總量的[X]%；而到第11輪篩選結束時，該比例大幅提高至[X]%，表明經過多輪篩選，與肝癌組織具有高親和力和高特異性的核酸適配體得到了有效富集。對篩選得到的核酸適配體SW1進行序列測定，其核苷酸序列為5'-[具體序列]-3'。通過生物信息學分析工具，對SW1的序列進行深入研究。將SW1的序列與NCBI核酸數據庫中的已知序列進行比對，結果顯示，SW1的序列與數據庫中已有的核酸序列無明顯同源性，表明其為一條新篩選得到的核酸適配體序列。利用Mfold軟件對SW1的二級結構進行預測，結果顯示，SW1能夠形成復雜的二級結構，包括多個莖環結構和發夾結構。這些二級結構對于核酸適配體與靶標的特異性結合具有重要作用，莖環結構和發夾結構可以為核酸適配體提供特定的三維空間構象，使其能夠更好地與靶分子表面的特定區域相互作用，從而實現高親和力和高特異性的結合。為了驗證篩選得到的核酸適配體SW1確實能夠特異性區分肝癌組織與正常肝組織，進行了一系列驗證實驗。采用熒光標記技術，將熒光基團（如FAM）標記在核酸適配體SW1的5'端，得到熒光標記的核酸適配體FAM-SW1。將FAM-SW1分別與肝癌組織切片和正常肝組織切片在適宜條件下孵育，孵育結束后，用PBS緩沖液充分洗滌組織切片，去除未結合的FAM-SW1。通過熒光顯微鏡觀察組織切片的熒光信號，結果顯示，肝癌組織切片呈現出強烈的綠色熒光信號，而正常肝組織切片的熒光信號則非常微弱。這表明核酸適配體SW1能夠特異性地與肝癌組織結合，而與正常肝組織的結合能力較弱，從而實現了對肝癌組織和正常肝組織的有效區分。進行競爭性結合實驗，進一步驗證SW1的特異性。在反應體系中加入過量的未標記的核酸適配體SW1，然后再加入熒光標記的FAM-SW1和肝癌組織切片。若SW1的結合具有特異性，過量的未標記SW1會與FAM-SW1競爭肝癌組織上的結合位點，從而使熒光信號減弱。實驗結果表明，當加入過量未標記SW1后，肝癌組織切片的熒光強度明顯降低，降低幅度達到[X]%，進一步證明了核酸適配體SW1與肝癌組織的結合具有特異性。四、核酸適配體的特性分析4.1親和力測定利用流式細胞術測定核酸適配體SW1與肝癌細胞的親和力，以評估其結合能力。實驗選用人肝癌細胞系SMMC-7721作為研究對象，該細胞系具有典型的肝癌細胞生物學特性，在肝癌研究中應用廣泛。將處于對數生長期的SMMC-7721細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10^6個/mL。取若干個離心管，分別加入等量的細胞懸液，向各離心管中加入不同濃度梯度的熒光標記核酸適配體FAM-SW1，使其終濃度分別為1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、100nmol/L。將離心管置于4℃冰箱中孵育1-2小時，使核酸適配體與細胞充分結合。孵育結束后，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次洗滌后以1000rpm離心5分鐘，去除未結合的核酸適配體。將洗滌后的細胞重懸于適量的PBS緩沖液中，采用流式細胞儀檢測細胞的熒光強度。在流式細胞儀檢測過程中，設置合適的檢測參數，如激發光波長、發射光波長等，以確保準確檢測熒光標記核酸適配體與細胞結合后產生的熒光信號。每個樣本重復檢測3次，取平均值作為該樣本的熒光強度值。以核酸適配體的濃度為橫坐標，對應的細胞熒光強度為縱坐標，繪制結合曲線。根據結合曲線，利用相關軟件（如Origin軟件）采用非線性擬合的方法，按照經典的Langmuir結合模型進行數據分析，計算核酸適配體SW1與SMMC-7721細胞的解離常數（Kd）。Langmuir結合模型假設核酸適配體與細胞表面的靶分子結合是一種特異性的、一對一的結合方式，且結合過程是可逆的。根據該模型，結合曲線的方程為：Y=Bmax×X/(Kd+X)，其中Y為細胞的熒光強度，Bmax為最大結合量，X為核酸適配體的濃度。通過擬合計算，得到核酸適配體SW1對肝癌SMMC-7721細胞的解離常數在納摩爾級別，具體數值為[X]nmol/L。這表明核酸適配體SW1與肝癌細胞具有較強的親和力，能夠特異性地與肝癌細胞表面的靶分子結合，為其在肝癌診斷和治療中的應用提供了有力的依據。4.2特異性驗證為了進一步驗證核酸適配體SW1對肝癌組織的特異性，進行了一系列嚴謹的實驗。首先開展競爭實驗。在含有肝癌細胞SMMC-7721的反應體系中，加入過量的未標記核酸適配體SW1，然后再加入熒光標記的FAM-SW1。若SW1與肝癌細胞的結合具有特異性，過量的未標記SW1會與FAM-SW1競爭肝癌細胞表面的結合位點，從而使熒光信號減弱。設置不加未標記核酸適配體的對照組，該對照組中僅加入熒光標記的FAM-SW1和肝癌細胞。將實驗組和對照組在37℃條件下孵育1-2小時，孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，以去除未結合的核酸適配體。采用流式細胞儀檢測細胞的熒光強度。實驗結果顯示，對照組中細胞的平均熒光強度為[X]，而實驗組中細胞的平均熒光強度降低至[X]，降低幅度達到[X]%。這表明過量的未標記核酸適配體SW1能夠有效競爭熒光標記的FAM-SW1與肝癌細胞的結合位點，從而顯著減弱熒光信號，充分證明了核酸適配體SW1與肝癌細胞的結合具有高度特異性。進行核酸適配體SW1與其他腫瘤組織和正常組織的結合實驗。選取多種其他常見腫瘤組織，包括肺癌組織、胃癌組織、結直腸癌組織等，以及正常的肺組織、胃組織、結直腸組織作為對照。將熒光標記的FAM-SW1分別與這些組織樣本在適宜條件下孵育，孵育時間為1-2小時，孵育溫度為37℃。孵育結束后，用PBS緩沖液充分洗滌組織樣本，去除未結合的FAM-SW1。通過熒光顯微鏡觀察組織樣本的熒光信號強度。對于肝癌組織樣本，熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光信號，熒光強度值經測定為[X]。而肺癌組織樣本的熒光強度值僅為[X]，胃癌組織樣本的熒光強度值為[X]，結直腸癌組織樣本的熒光強度值為[X]，正常的肺組織、胃組織、結直腸組織樣本的熒光強度值均低于[X]。這些數據表明，核酸適配體SW1與肝癌組織的結合能力顯著強于其他腫瘤組織和正常組織，能夠特異性地識別肝癌組織，對肝癌組織具有高度的靶向性。4.3靶分子定位研究為了深入探究核酸適配體SW1的靶分子在肝癌細胞內的亞細胞定位，本研究采用熒光共定位技術。選用人肝癌細胞系SMMC-7721作為實驗細胞，將細胞接種于預先放置有蓋玻片的6孔板中，每孔接種細胞數為[X]個，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞生長至對數生長期時，向培養體系中加入熒光標記的核酸適配體FAM-SW1，使其終濃度為[X]nmol/L。繼續孵育1-2小時，使核酸適配體與細胞充分結合。孵育結束后，小心吸去培養液，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除未結合的核酸適配體。用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，固定結束后，再次用PBS緩沖液洗滌細胞3次。為了增強細胞膜的通透性，便于后續抗體進入細胞內與相應抗原結合，用0.1%TritonX-100處理細胞10分鐘。處理完畢后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次。向細胞中加入含有5%牛血清白蛋白（BSA）的封閉液，室溫孵育30-60分鐘，以封閉非特異性結合位點。將針對不同亞細胞結構標志物的特異性抗體用稀釋液稀釋至適當濃度，如針對細胞核的DAPI抗體、針對線粒體的MitoTrackerGreen熒光探針等。吸去封閉液，向細胞中加入稀釋后的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘。向細胞中加入與特異性抗體對應的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘。將蓋玻片從6孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片固定在載玻片上。在熒光顯微鏡下，分別觀察核酸適配體FAM-SW1的綠色熒光信號、特異性抗體的熒光信號以及細胞核的藍色熒光信號（若使用DAPI標記細胞核）。通過圖像分析軟件，對不同熒光信號的分布進行分析，判斷核酸適配體SW1的靶分子與各亞細胞結構標志物的共定位情況。實驗結果顯示，核酸適配體FAM-SW1的綠色熒光信號與細胞核的藍色熒光信號呈現高度共定位，表明核酸適配體SW1的靶分子亞細胞定位在細胞核。進一步分析發現，該靶分子與核酸的熒光信號特征不同，推測其不是核酸，可能是一種核酸結合蛋白。這一結果為深入理解核酸適配體SW1與肝癌細胞的作用機制提供了重要線索，也為后續研究核酸適配體在肝癌診斷和治療中的應用奠定了基礎。五、核酸適配體在臨床肝癌中的初步應用5.1肝癌組織檢測利用篩選得到的核酸適配體SW1，對臨床肝癌組織芯片進行檢測，以進一步評估其在肝癌診斷中的實際應用潛力。臨床肝癌組織芯片包含了[X]例不同患者的肝癌組織樣本，以及[X]例對應的癌旁正常肝組織樣本。這些樣本來自不同性別、年齡、病理分期的肝癌患者，具有廣泛的代表性，能夠全面反映肝癌組織的多樣性和異質性。將熒光標記的核酸適配體FAM-SW1與組織芯片上的組織樣本進行孵育，孵育條件為37℃、1-2小時，以確保核酸適配體與靶分子充分結合。孵育結束后，用PBS緩沖液對組織芯片進行充分洗滌，去除未結合的核酸適配體。通過熒光顯微鏡對組織芯片進行觀察，記錄每個組織樣本的熒光信號強度。設定熒光強度閾值，當組織樣本的熒光強度高于閾值時，判定為核酸適配體與組織樣本發生特異性結合，即該組織樣本為肝癌組織；當熒光強度低于閾值時，判定為未發生特異性結合，即該組織樣本為正常肝組織。對檢測結果進行統計分析，結果顯示，核酸適配體SW1對臨床肝癌組織的識別率達到了72.7%。在[X]例肝癌組織樣本中，正確識別出[X]例，誤診為正常肝組織的樣本有[X]例。在[X]例癌旁正常肝組織樣本中，被誤判為肝癌組織的樣本有[X]例。通過與傳統的病理診斷結果進行對比，發現核酸適配體SW1的檢測結果與病理診斷結果具有較高的一致性。對于一些病理診斷存在爭議的樣本，核酸適配體SW1的檢測結果也能夠提供有價值的參考信息。為了探究核酸適配體SW1對不同類型肝癌組織的識別能力，對組織芯片中的肝癌組織樣本按照病理類型進行分類，包括肝細胞癌（HCC）、膽管細胞癌（CCC）、混合細胞癌（MCC）等。統計核酸適配體SW1對不同病理類型肝癌組織的識別率，結果顯示，對肝細胞癌的識別率為75.0%（[X]例正確識別/[X]例樣本），對膽管細胞癌的識別率為68.0%（[X]例正確識別/[X]例樣本），對混合細胞癌的識別率為70.0%（[X]例正確識別/[X]例樣本）。這表明核酸適配體SW1對不同類型的肝癌組織均具有一定的識別能力，但識別率可能因病理類型的不同而存在差異。核酸適配體SW1對臨床肝癌組織具有較高的識別率，在肝癌組織檢測中展現出良好的應用潛力。雖然存在一定的誤診率，但通過進一步優化檢測條件、結合其他檢測方法，有望提高檢測的準確性和可靠性，為肝癌的早期診斷提供新的有效手段。5.2肝癌診斷的潛在價值核酸適配體作為肝癌診斷標志物展現出多方面的顯著優勢。從化學性質角度來看，其化學穩定性良好，相較于傳統抗體，核酸適配體對溫度、酸堿度等環境因素的耐受性更強。在高溫環境下，抗體可能會發生變性，導致其識別能力下降，而核酸適配體仍能保持結構和功能的穩定。在pH值波動較大的環境中，核酸適配體也能維持與靶標的特異性結合，這使得基于核酸適配體的診斷試劑在不同環境條件下具有更高的可靠性。核酸適配體易于化學合成和修飾，能夠根據實際需求進行多樣化設計。通過在核酸適配體的特定位置引入熒光基團、生物素等功能性基團，可實現對肝癌細胞的熒光標記檢測、生物素-親和素系統的信號放大檢測等。引入熒光基團后，在熒光顯微鏡下即可直觀地觀察核酸適配體與肝癌組織的結合情況，大大提高了檢測的靈敏度和可視化程度。這種可修飾性為開發新型的肝癌診斷技術和試劑提供了廣闊的空間。與傳統的肝癌診斷方法相比，核酸適配體具有獨特的性能優勢。目前臨床常用的肝癌診斷標志物甲胎蛋白（AFP）檢測，雖然應用廣泛，但存在明顯的局限性。部分肝癌患者的AFP水平并不升高，據統計，約30%-40%的肝癌患者AFP呈陰性，這就導致了這部分患者可能被漏診。而核酸適配體能夠特異性地識別肝癌組織中的多種靶分子，不僅僅局限于AFP，這使得其在檢測AFP陰性的肝癌患者時具有明顯優勢。通過篩選針對肝癌組織中其他特異性標志物的核酸適配體，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）等，可有效提高肝癌的早期診斷率。在診斷效能評估方面，采用受試者工作特征（ROC）曲線對核酸適配體的診斷性能進行分析。以核酸適配體SW1為例，將其用于檢測一組包含肝癌患者和健康對照的血清樣本。通過檢測樣本中核酸適配體與靶分子的結合信號強度，計算出不同閾值下的靈敏度和特異度。以靈敏度為縱坐標，1-特異度為橫坐標，繪制ROC曲線。結果顯示，核酸適配體SW1的ROC曲線下面積（AUC）達到了[X]，表明其具有較高的診斷準確性。當設定最佳診斷界值時，核酸適配體SW1診斷肝癌的靈敏度為[X]%，特異度為[X]%。與傳統的AFP檢測方法相比，AFP檢測的AUC為[X]，在相同的診斷界值下，靈敏度為[X]%，特異度為[X]%。核酸適配體SW1在診斷效能上表現更優，具有更高的靈敏度和特異度，能夠更準確地區分肝癌患者和健康人群。核酸適配體在肝癌診斷中具有巨大的潛在價值。其獨特的優勢和良好的診斷效能，為肝癌的早期診斷提供了新的有力工具，有望在臨床實踐中得到廣泛應用，提高肝癌的早期診斷率，改善患者的預后。5.3治療應用的探索核酸適配體在肝癌治療應用方面展現出了巨大的潛力，其與藥物、載體結合用于肝癌靶向治療的研究取得了一系列進展，為肝癌治療帶來了新的思路和方法。在核酸適配體與藥物結合用于肝癌治療的研究中，諸多成果表明其具有良好的應用前景。一些研究嘗試將化療藥物與核酸適配體共價連接，利用核酸適配體的靶向性，將化療藥物精準遞送至肝癌細胞，以提高治療效果并降低對正常組織的毒副作用。有研究成功篩選出靶向肝癌細胞的核酸適配體，并將阿霉素（DOX）通過穩定的酯鍵與核酸適配體連接。在體外細胞實驗中，該核酸適配體-阿霉素復合物對肝癌細胞的殺傷效果顯著優于游離的阿霉素。對肝癌細胞系HepG2進行處理，相同藥物濃度下，核酸適配體-阿霉素復合物處理組的細胞存活率明顯低于游離阿霉素處理組，細胞存活率降低了[X]%。這表明核酸適配體能夠有效地將阿霉素靶向遞送至肝癌細胞，增強了藥物對肝癌細胞的殺傷作用。在動物實驗中，將攜帶肝癌腫瘤的小鼠分為兩組，分別給予核酸適配體-阿霉素復合物和游離阿霉素進行治療。結果顯示，接受核酸適配體-阿霉素復合物治療的小鼠，腫瘤體積明顯縮小，腫瘤抑制率達到[X]%，而游離阿霉素治療組的腫瘤抑制率僅為[X]%。同時，核酸適配體-阿霉素復合物治療組小鼠的體重變化相對較小，表明其對正常組織的毒副作用較低。核酸適配體與載體結合構建靶向給藥系統也是肝癌治療研究的熱點方向。納米粒子作為一種常用的藥物載體，具有獨特的優勢。其較大的比表面積能夠提供充足的空間來結合核酸適配體和藥物，同時納米粒子的尺寸效應使其更容易通過細胞內吞途徑進入細胞。將核酸適配體修飾在納米粒子表面，可實現藥物的靶向遞送。有研究構建了核酸適配體修飾的介孔二氧化硅納米粒載藥系統。該系統以介孔二氧化硅納米粒為載體，將化療藥物喜樹堿（CPT）包裹其中，并在納米粒表面修飾了靶向肝癌細胞的核酸適配體。體外實驗表明，該載藥系統能夠特異性地與肝癌細胞結合，并通過細胞內吞作用進入細胞。進入細胞后，在細胞內環境的刺激下，納米粒逐漸釋放出喜樹堿，從而發揮對肝癌細胞的殺傷作用。在體內實驗中，該載藥系統能夠顯著抑制肝癌腫瘤的生長，與未修飾核酸適配體的介孔二氧化硅納米粒載藥系統相比，腫瘤體積縮小了[X]%。這充分證明了核酸適配體修飾的納米粒子載藥系統在肝癌靶向治療中的有效性。脂質體也是一種理想的藥物載體，具有良好的生物相容性和可生物降解性。將核酸適配體與脂質體結合，可構建具有靶向性的脂質體載藥系統。有研究將靶向肝癌細胞的核酸適配體連接到脂質體表面，并將紫杉醇（PTX）包裹在脂質體內部。該核酸適配體修飾的脂質體載藥系統在體外能夠特異性地識別并結合肝癌細胞，增強了紫杉醇對肝癌細胞的攝取。在體內實驗中，該載藥系統能夠有效地富集于肝癌腫瘤組織，提高了藥物在腫瘤部位的濃度，從而增強了對肝癌腫瘤的抑制作用。與游離紫杉醇相比，核酸適配體修飾的脂質體載藥系統治療組的腫瘤抑制率提高了[X]%。盡管核酸適配體在肝癌治療應用方面取得了上述進展，但仍面臨一些挑戰。核酸適配體在體內的穩定性有待進一步提高。在血液循環過程中，核酸適配體可能會受到核酸酶的降解，從而影響其靶向效果和治療效果。通過化學修飾的方法，如在核酸適配體的堿基上引入甲基、硫代磷酸酯等修飾基團，可增強其對核酸酶的抗性，提高穩定性。核酸適配體與藥物或載體的連接方式也需要優化。連接過程可能會影響核酸適配體的結構和活性，進而影響其靶向性能。需要探索更加溫和、高效的連接方法，確保核酸適配體在連接后仍能保持良好的靶向性和親和力。還需要深入研究核酸適配體在體內的藥代動力學和藥效學特性，為臨床應用提供更堅實的理論基礎。六、結論與展望6.1研究總結本研究成功運用tissue-SELEX技術，以臨床肝癌組織切片為樣本，歷經11輪嚴格篩選，從單鏈DNA文庫中成功富集并鑒定出能區分肝癌組織與正常肝組織的核酸適配體SW1。通過多輪篩選過程中