EPA和DHA調控CacO-2細胞乳糜微粒組裝的分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義脂質代謝在維持人體健康中扮演著舉足輕重的角色，一旦脂質代謝出現(xiàn)異常，就可能引發(fā)一系列嚴重危害健康的疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病、肥胖癥和糖尿病等。乳糜微粒（chylomicron，CM）作為一種由小腸上皮細胞合成并分泌的脂蛋白，在脂質代謝過程中承擔著關鍵使命。它能夠將腸道吸收的外源性甘油三酯高效地運輸至全身各個組織，為機體的正常運轉提供必要的能量和物質基礎。然而，當乳糜微粒的組裝和分泌過程出現(xiàn)紊亂時，會導致脂質在體內的運輸和代謝受阻，進而引發(fā)脂質代謝異常相關疾病。深入探究乳糜微粒組裝的調控機制，對于揭示脂質代謝的奧秘以及預防和治療相關疾病具有極其重要的意義。二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，DHA）同屬于ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3polyunsaturatedfattyacids，ω-3PUFAs），它們在人體的生理過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。大量的研究表明，EPA和DHA具有多種對健康有益的功效。在心血管健康方面，它們能夠降低血脂水平，特別是甘油三酯的含量，減少血液黏稠度，降低血栓形成的風險，從而有助于預防和改善動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病。同時，它們還具有抗炎特性，能夠減輕體內慢性炎癥反應，降低炎癥相關疾病的發(fā)生風險。此外，EPA和DHA對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與功能維持也至關重要，在胎兒和嬰兒的大腦發(fā)育階段，充足的DHA供應對于智力和視力的正常發(fā)育尤為關鍵。在成年人中，它們也有助于維持大腦的正常功能，預防認知功能下降和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在脂質代謝領域，EPA和DHA展現(xiàn)出獨特的調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，它們可以影響脂肪酸的攝取、轉運和代謝過程，從而對乳糜微粒的組裝和分泌產(chǎn)生潛在的影響。例如，EPA和DHA可能通過調節(jié)細胞內脂肪酸轉運蛋白的表達和活性，改變脂肪酸進入細胞的速率和途徑，進而影響甘油三酯的合成和乳糜微粒的組裝原料供應。它們還可能參與調控乳糜微粒組裝過程中關鍵蛋白的表達和功能，如載脂蛋白B（apoB）、微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）等，這些蛋白在乳糜微粒的組裝和成熟過程中起著核心作用。然而，目前關于EPA和DHA如何具體調控Caco-2細胞乳糜微粒組裝的機制尚未完全明確，仍存在許多未知的環(huán)節(jié)和細節(jié)有待深入探索。Caco-2細胞作為一種常用的腸道上皮細胞模型，具有與小腸上皮細胞相似的形態(tài)和功能特征，能夠較好地模擬小腸在脂質吸收和代謝方面的生理過程。在研究脂質代謝相關機制時，Caco-2細胞模型具有諸多優(yōu)勢。它易于培養(yǎng)和操作，能夠在體外進行大規(guī)模的實驗研究，為深入探究脂質代謝的分子機制提供了便利條件。通過在Caco-2細胞模型中研究EPA和DHA對乳糜微粒組裝的影響，我們可以更直接地觀察和分析它們在細胞水平上的作用機制，避免了體內復雜生理環(huán)境的干擾，有助于準確揭示其調控規(guī)律。這不僅能夠豐富我們對脂質代謝分子機制的認識，還為開發(fā)基于EPA和DHA的功能性食品或藥物提供堅實的理論依據(jù)，具有重要的科學價值和實際應用意義。在預防和治療脂質代謝異常相關疾病方面，基于對EPA和DHA調控乳糜微粒組裝機制的深入理解，我們可以針對性地設計和開發(fā)新的營養(yǎng)干預策略或藥物治療方案，通過合理補充EPA和DHA，調節(jié)乳糜微粒的組裝和分泌，改善脂質代謝紊亂，降低相關疾病的發(fā)生風險或減輕疾病癥狀，為維護人類健康做出積極貢獻。1.2研究目的本研究旨在深入探究EPA和DHA調控Caco-2細胞乳糜微粒組裝的詳細機制。通過運用細胞生物學、分子生物學等多學科技術手段，從多個層面解析EPA和DHA對乳糜微粒組裝過程的影響。具體而言，首先，精確測定不同濃度的EPA和DHA處理Caco-2細胞后，細胞對脂肪酸的攝取效率，以及甘油三酯合成、組裝和乳糜微粒分泌量的變化情況，明確EPA和DHA對乳糜微粒組裝過程中關鍵物質代謝的影響程度。其次，深入研究EPA和DHA對參與乳糜微粒組裝的關鍵蛋白，如載脂蛋白B（apoB）、微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）等的表達和功能的調控機制，揭示這些蛋白在EPA和DHA作用下對乳糜微粒組裝的具體作用方式。此外，還將探討EPA和DHA是否通過影響細胞內的信號通路，如脂肪酸信號通路、脂質代謝相關信號通路等，間接調控乳糜微粒的組裝過程，全面揭示EPA和DHA在細胞內的信號傳導機制與乳糜微粒組裝調控之間的關聯(lián)。本研究期望通過這些深入的探索，為進一步闡明脂質代謝的分子機制提供關鍵的理論依據(jù)，為開發(fā)基于EPA和DHA的功能性食品或藥物，用于預防和治療脂質代謝異常相關疾病奠定堅實的基礎。1.3國內外研究現(xiàn)狀在脂質代謝研究領域，乳糜微粒的組裝機制一直是國內外學者關注的重點。國外在這方面的研究起步較早，運用了多種先進的技術手段對乳糜微粒組裝過程進行剖析。如采用基因編輯技術，構建特定基因敲除或過表達的細胞模型和動物模型，深入探究參與乳糜微粒組裝的關鍵基因和蛋白的功能。研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白B（apoB）在乳糜微粒組裝過程中起著核心作用，它作為乳糜微粒的結構蛋白，參與了乳糜微粒前體的形成和成熟過程。微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）能夠協(xié)助甘油三酯與apoB的結合，對乳糜微粒的組裝至關重要，缺乏MTP會導致乳糜微粒組裝障礙和脂質代謝異常。在研究脂肪酸對乳糜微粒組裝的影響方面，國外學者發(fā)現(xiàn)不同類型的脂肪酸對乳糜微粒組裝的影響存在差異，飽和脂肪酸可能促進乳糜微粒的組裝，而多不飽和脂肪酸則可能對其產(chǎn)生抑制或調節(jié)作用，但具體機制尚未完全明確。國內學者在脂質代謝和乳糜微粒組裝研究方面也取得了顯著進展。通過細胞實驗和動物實驗相結合的方式，研究了多種因素對乳糜微粒組裝的調控作用。在研究膳食因素對乳糜微粒組裝的影響時發(fā)現(xiàn)，某些植物化學物如黃酮類化合物、多酚類化合物等能夠調節(jié)細胞內脂質代謝相關信號通路，進而影響乳糜微粒的組裝和分泌。在對腸道微生物與乳糜微粒組裝關系的研究中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的組成和代謝產(chǎn)物可以影響腸道上皮細胞的功能，包括對乳糜微粒組裝過程的調節(jié)，為脂質代謝研究開辟了新的方向。關于EPA和DHA對脂質代謝的影響，國內外已開展了大量研究。眾多研究表明，EPA和DHA具有降低血脂、抗炎、預防心血管疾病等多種生理功能。在血脂調節(jié)方面，它們能夠降低血液中甘油三酯的含量，增加高密度脂蛋白膽固醇的水平，抑制肝臟中脂肪酸和甘油三酯的合成，促進脂肪酸的β-氧化代謝。在抗炎方面，EPA和DHA可以抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，調節(jié)炎癥相關信號通路，減輕體內慢性炎癥反應。然而，目前關于EPA和DHA調控Caco-2細胞乳糜微粒組裝機制的研究仍存在一定的局限性。在分子機制層面，雖然已知EPA和DHA可能影響乳糜微粒組裝過程中關鍵蛋白的表達和功能，但具體的作用靶點和信號傳導途徑尚未完全闡明。對于EPA和DHA如何與細胞內的脂肪酸轉運蛋白、脂質合成酶以及其他相關蛋白相互作用，進而影響乳糜微粒組裝的分子細節(jié)，還需要進一步深入研究。在細胞水平的研究中，大多數(shù)研究僅關注了EPA和DHA對乳糜微粒組裝的某幾個環(huán)節(jié)的影響，缺乏對整個組裝過程的系統(tǒng)性研究，難以全面揭示其調控機制。不同研究中使用的實驗條件和方法存在差異，導致研究結果之間的可比性和一致性較差，也給深入理解EPA和DHA的調控機制帶來了困難。本研究將在現(xiàn)有研究的基礎上，以Caco-2細胞為模型，全面、系統(tǒng)地研究EPA和DHA調控乳糜微粒組裝的機制。通過精確測定不同濃度的EPA和DHA處理Caco-2細胞后，細胞對脂肪酸的攝取、甘油三酯合成與組裝以及乳糜微粒分泌等關鍵指標的變化，深入探究EPA和DHA對乳糜微粒組裝過程的影響。同時，運用分子生物學技術，研究EPA和DHA對參與乳糜微粒組裝的關鍵蛋白的表達和功能的調控作用，以及對細胞內相關信號通路的影響，旨在填補現(xiàn)有研究的空白，為進一步闡明脂質代謝的分子機制提供新的理論依據(jù)。二、相關理論基礎2.1EPA和DHA概述EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）是兩種在人體生理過程中具有關鍵作用的ω-3多不飽和脂肪酸，它們在化學結構、來源、攝取途徑和生理功能等方面都展現(xiàn)出獨特的性質。從化學結構上看，EPA的分子式為C_{20}H_{30}O_{2}，其碳鏈含有20個碳原子，并存在5個碳碳雙鍵，這種不飽和鍵的存在賦予了EPA獨特的化學活性。DHA的分子式為C_{22}H_{32}O_{2}，碳鏈上有22個碳原子和6個碳碳雙鍵，是一種長鏈多不飽和脂肪酸。這些碳碳雙鍵使得EPA和DHA的分子結構較為靈活，易于與其他生物分子相互作用，從而參與到多種生理生化反應中。在來源方面，EPA和DHA主要存在于海洋生物中，深海魚類是其重要的來源之一，如三文魚、金槍魚、沙丁魚等。這些魚類通過攝食海洋中的浮游生物和藻類，在體內富集了大量的EPA和DHA。以三文魚為例，每100克三文魚肉中，EPA和DHA的含量可達到1.5克左右，是人體獲取這兩種脂肪酸的優(yōu)質食材。藻類也是EPA和DHA的重要生產(chǎn)者，一些微藻，如裂壺藻、寇氏隱甲藻等，能夠通過自身的光合作用合成大量的DHA，是生產(chǎn)藻油DHA的主要原料。在陸地上，某些植物種子和堅果中也含有少量的ω-3多不飽和脂肪酸，如亞麻籽、核桃等，其中的α-亞麻酸（ALA）可以在人體內經(jīng)過一系列的酶促反應轉化為EPA和DHA，但這種轉化效率較低，僅為1%-10%左右，難以滿足人體對EPA和DHA的全部需求。在人體中，常見的攝取途徑主要是通過飲食攝入。除了直接食用富含EPA和DHA的深海魚類外，一些人還會選擇服用魚油補充劑。魚油補充劑通常是從深海魚類中提取，經(jīng)過精煉和濃縮后制成，方便人們補充EPA和DHA。對于素食者或對魚類過敏的人群，藻油DHA補充劑是一個不錯的選擇，它來源于藻類，不含有魚類過敏原，且富含DHA。EPA和DHA在人體中具有多種重要的生理功能。在心血管系統(tǒng)方面，它們具有顯著的調節(jié)血脂作用。EPA能夠抑制肝臟中脂肪酸和甘油三酯的合成，促進脂肪酸的β-氧化代謝，從而降低血液中甘油三酯的含量。研究表明，每日攝入1-2克的EPA，可使血液中甘油三酯水平降低20%-30%。DHA則可以降低血液黏稠度，抑制血小板的聚集，減少血栓形成的風險，維護血管的彈性和通暢，降低動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生幾率。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，DHA是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分，對胎兒和嬰兒的大腦發(fā)育和視力發(fā)育至關重要。在胎兒期和嬰幼兒期，大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育迅速，充足的DHA供應能夠促進神經(jīng)細胞的增殖、分化和遷移，提高神經(jīng)遞質的合成和釋放，增強神經(jīng)信號的傳遞，有助于提高智力和視力水平。在成年人中，DHA也有助于維持大腦的正常功能，預防認知功能下降和老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，EPA和DHA還具有抗炎作用，它們可以調節(jié)炎癥相關信號通路，抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，減輕體內慢性炎癥反應，對預防和改善炎癥相關疾病，如關節(jié)炎、炎癥性腸病等具有積極作用。2.2CacO-2細胞模型2.2.1CacO-2細胞的特性Caco-2細胞源于人的結直腸腺癌，自被分離出來后，因其獨特的生物學特性，在眾多研究領域中得到了廣泛應用，特別是在模擬小腸生理功能和研究腸道相關機制方面，展現(xiàn)出了不可替代的價值。在細胞形態(tài)方面，Caco-2細胞在合適的培養(yǎng)條件下，能夠在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上生長并融合，進而分化為腸上皮細胞，形成連續(xù)的單層結構。這種結構在形態(tài)上與人小腸上皮細胞高度相似，擁有微絨毛等典型的小腸上皮細胞特征。微絨毛的存在極大地增加了細胞的表面積，使其能夠更高效地進行物質交換和吸收，這對于模擬小腸上皮細胞在營養(yǎng)物質攝取和轉運方面的功能至關重要。通過電子顯微鏡觀察，可以清晰地看到Caco-2細胞的微絨毛結構，其排列整齊且具有規(guī)則的形態(tài)，與體內小腸上皮細胞的微絨毛在超微結構上幾乎一致。從生長特性來看，Caco-2細胞的生長具有一定的規(guī)律。在接種初期，細胞處于適應期，生長較為緩慢，此時細胞主要進行生理調整，適應新的培養(yǎng)環(huán)境。隨著時間的推移，細胞進入對數(shù)生長期，生長速度顯著加快，細胞數(shù)量呈指數(shù)級增長。在這一階段，細胞代謝活躍，需要充足的營養(yǎng)物質和適宜的培養(yǎng)條件來支持其快速增殖。當細胞生長達到一定密度后，會進入平臺期，生長速度逐漸減緩，細胞密度趨于穩(wěn)定。在平臺期，細胞之間會形成緊密的連接，模擬小腸上皮細胞的緊密連接結構，這種緊密連接對于維持細胞單層的完整性和屏障功能至關重要，能夠有效控制物質的跨膜運輸，確保只有特定的物質能夠通過細胞單層，從而模擬小腸上皮細胞對營養(yǎng)物質和藥物的選擇性吸收和轉運過程。Caco-2細胞與小腸上皮細胞的相似性不僅體現(xiàn)在形態(tài)和生長特性上，還體現(xiàn)在其功能和生化特征方面。Caco-2細胞含有與小腸刷狀緣上皮相關的多種酶系，如蔗糖酶、麥芽糖酶、堿性磷酸酶、氨基肽酶等。這些酶在小腸的消化和吸收過程中發(fā)揮著關鍵作用，能夠催化食物中大分子物質的水解，使其轉化為小分子物質，便于小腸上皮細胞的吸收。Caco-2細胞中這些酶的活性和表達水平與小腸上皮細胞類似，例如，其蔗糖酶的活性在細胞分化成熟后可達到與小腸上皮細胞相當?shù)乃剑軌蚋咝У卮呋崽撬鉃槠咸烟呛凸恰４送猓珻aco-2細胞還具有與小腸上皮細胞相似的轉運系統(tǒng)，能夠表達多種轉運蛋白，如葡萄糖轉運蛋白（GLUTs）、氨基酸轉運蛋白、脂肪酸轉運蛋白等，這些轉運蛋白參與了營養(yǎng)物質的跨膜轉運過程，使得Caco-2細胞能夠模擬小腸上皮細胞對不同營養(yǎng)物質的攝取和轉運機制。Caco-2細胞還能表達細胞色素P450同工酶等藥物代謝酶，這對于研究藥物在小腸內的代謝過程具有重要意義，能夠幫助我們更好地理解藥物的吸收、代謝和相互作用機制。2.2.2CacO-2細胞在脂質代謝研究中的應用在脂質代謝研究領域，Caco-2細胞模型憑借其獨特的優(yōu)勢，成為了研究小腸脂質吸收和代謝機制的重要工具，為深入探究脂質在腸道內的生理過程提供了有力的支持。Caco-2細胞模型在模擬小腸脂質吸收和代謝研究中具有顯著的優(yōu)勢。它能夠在體外環(huán)境中高度模擬小腸上皮細胞的生理功能，使得研究人員可以在相對可控的條件下，對脂質吸收和代謝過程進行詳細的觀察和分析。通過在細胞培養(yǎng)基中添加不同類型和濃度的脂質，如脂肪酸、甘油三酯、膽固醇等，可以研究Caco-2細胞對這些脂質的攝取、轉運、合成和代謝過程。利用放射性標記的脂肪酸，能夠準確追蹤脂肪酸進入Caco-2細胞后的代謝途徑和去向，清晰地了解脂肪酸在細胞內的氧化、酯化以及參與乳糜微粒組裝的過程。與傳統(tǒng)的動物實驗相比，Caco-2細胞模型具有實驗周期短、成本低、操作簡便等優(yōu)點。動物實驗往往需要較長的時間來飼養(yǎng)和處理動物，且實驗成本較高，同時還受到動物個體差異和倫理等因素的限制。而Caco-2細胞模型可以在實驗室中快速建立，實驗周期通常只需數(shù)天至數(shù)周，大大縮短了研究時間，降低了研究成本，并且可以避免動物個體差異對實驗結果的影響，提高實驗的重復性和可靠性。Caco-2細胞模型的應用范圍十分廣泛。在研究脂肪酸的吸收機制方面，通過改變細胞培養(yǎng)條件和添加不同的抑制劑，可以探究脂肪酸進入Caco-2細胞的具體轉運途徑，是通過被動擴散還是主動轉運，以及哪些轉運蛋白參與了這一過程。在甘油三酯的合成和組裝研究中，研究人員可以觀察不同因素對甘油三酯合成酶活性的影響，以及甘油三酯與載脂蛋白等成分組裝成乳糜微粒的過程。在乳糜微粒的分泌研究中，可以分析乳糜微粒從Caco-2細胞分泌到細胞外的機制，以及各種因素對分泌過程的調控作用。Caco-2細胞模型還可以用于研究脂質代謝相關的信號通路，如脂肪酸信號通路、脂質代謝相關基因的表達調控等，深入揭示脂質代謝的分子機制。它也被廣泛應用于研究營養(yǎng)物質、藥物以及其他生物活性物質對脂質代謝的影響，為開發(fā)調節(jié)脂質代謝的功能性食品和藥物提供理論依據(jù)。例如，研究某種植物提取物對Caco-2細胞脂質代謝的影響，通過檢測細胞內脂質含量、相關酶活性和基因表達的變化，評估該植物提取物是否具有調節(jié)血脂的作用，為其進一步開發(fā)利用提供實驗基礎。然而，Caco-2細胞模型也存在一定的局限性。Caco-2細胞缺乏分泌黏液的功能，而小腸上皮能夠形成黏液層，這一黏液層在脂質吸收和代謝過程中起著重要的保護和調節(jié)作用，它可以保護小腸上皮細胞免受有害物質的損傷，同時還能影響脂質的乳化和消化吸收過程。缺乏黏液層使得Caco-2細胞模型在模擬小腸真實環(huán)境方面存在一定的不足。Caco-2細胞缺少或低表達某些藥物代謝酶和轉運體，而這些酶和轉運體在小腸脂質代謝中可能發(fā)揮著關鍵作用，這可能導致研究結果與體內實際情況存在一定的偏差。Caco-2細胞模型是一種體外模型，缺乏體內復雜的神經(jīng)、體液調節(jié)以及腸道微生物等因素的影響，而這些因素在體內脂質代謝過程中相互作用，共同調節(jié)脂質的吸收、轉運和代謝。在研究脂質代謝時，需要充分考慮這些局限性，結合其他研究方法，如動物實驗和人體研究，以更全面、準確地揭示脂質代謝的機制。2.3乳糜微粒組裝過程2.3.1脂質水解產(chǎn)物的攝取在小腸的消化過程中，膳食中的脂質，主要包括甘油三酯、磷脂和膽固醇酯等，在多種消化酶的作用下發(fā)生水解。胰腺分泌的胰脂肪酶是水解甘油三酯的關鍵酶，它能夠將甘油三酯分解為脂肪酸和單酰甘油。膽汁中的膽鹽則起著乳化脂質的重要作用，它能夠將脂質分散成微小的微粒，增加脂質與消化酶的接觸面積，從而促進脂質的水解。經(jīng)過消化后的脂質水解產(chǎn)物，如脂肪酸、單酰甘油、膽固醇和溶血磷脂等，需要被小腸上皮細胞攝取，才能進一步參與乳糜微粒的組裝和代謝過程。Caco-2細胞作為小腸上皮細胞的模型，具有多種攝取脂質水解產(chǎn)物的機制。對于脂肪酸的攝取，主要存在被動擴散和蛋白介導的主動轉運兩種方式。被動擴散是一種順濃度梯度的運輸方式，脂肪酸可以通過簡單擴散的方式直接穿過細胞膜進入細胞內。當細胞外脂肪酸濃度較高時，脂肪酸會順著濃度差自由地擴散進入細胞，這種方式不需要消耗能量，也不需要載體蛋白的參與。然而，被動擴散的效率相對較低，且受到脂肪酸濃度梯度和細胞膜通透性的限制。在生理條件下，細胞對脂肪酸的攝取更多地依賴于蛋白介導的主動轉運方式。Caco-2細胞表達多種脂肪酸轉運蛋白，如脂肪酸轉運蛋白1（FATP1）、脂肪酸轉運蛋白2（FATP2）、脂肪酸結合蛋白（FABP）等，這些轉運蛋白在脂肪酸的攝取過程中發(fā)揮著關鍵作用。FATP1能夠識別并結合細胞外的脂肪酸，然后通過自身的構象變化，將脂肪酸轉運進入細胞內。研究表明，F(xiàn)ATP1的表達水平與細胞對脂肪酸的攝取速率呈正相關，當FATP1的表達上調時，細胞對脂肪酸的攝取能力明顯增強。FABP則主要負責在細胞內結合和運輸脂肪酸，它能夠將攝取進入細胞的脂肪酸迅速結合并轉運到細胞內的特定部位，參與后續(xù)的代謝過程，如甘油三酯的合成等。不同類型的脂肪酸在攝取機制上可能存在差異。短鏈脂肪酸（碳原子數(shù)小于6）由于其分子較小，極性較強，能夠以較快的速度通過被動擴散的方式進入細胞，其攝取過程主要依賴于細胞膜的通透性和濃度梯度。中鏈脂肪酸（碳原子數(shù)為6-12）的攝取機制較為復雜，既可以通過被動擴散進入細胞，也可以通過特定的轉運蛋白介導的主動轉運方式攝取。一些研究發(fā)現(xiàn)，中鏈脂肪酸可能通過與特定的轉運蛋白結合，利用細胞內的能量驅動機制，逆濃度梯度進入細胞，這種主動轉運方式能夠提高細胞對中鏈脂肪酸的攝取效率，使其在較低濃度下也能被有效攝取。長鏈脂肪酸（碳原子數(shù)大于12）則主要通過蛋白介導的主動轉運方式被攝取，由于長鏈脂肪酸分子較大，極性較弱，難以通過被動擴散穿過細胞膜，需要依賴脂肪酸轉運蛋白的協(xié)助。FATP1、FATP2等轉運蛋白對長鏈脂肪酸具有較高的親和力，能夠特異性地識別和轉運長鏈脂肪酸，確保長鏈脂肪酸能夠高效地進入細胞內，參與乳糜微粒的組裝和代謝。2.3.2重新酯化合成甘油三酯被Caco-2細胞攝取的脂肪酸和單酰甘油，會在細胞內一系列酶的作用下重新酯化，合成甘油三酯，這是乳糜微粒組裝過程中的關鍵步驟。在甘油三酯的合成過程中，主要涉及甘油-3-磷酸途徑和單酰甘油途徑。甘油-3-磷酸途徑是甘油三酯合成的主要途徑，其過程如下：細胞內的甘油在甘油激酶的催化下，與ATP反應生成甘油-3-磷酸。這一反應需要消耗ATP提供能量，甘油激酶的活性對于甘油-3-磷酸的生成速率起著關鍵調控作用。脂肪酸則在脂酰輔酶A合成酶的催化下，與輔酶A結合，形成脂酰輔酶A。脂酰輔酶A是一種活化的脂肪酸形式，具有較高的反應活性。脂酰輔酶A和甘油-3-磷酸在甘油-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT）的作用下，發(fā)生酯化反應，生成1-脂酰甘油-3-磷酸，也稱為溶血磷脂酸（LPA）。GPAT能夠特異性地識別脂酰輔酶A和甘油-3-磷酸，催化它們之間的酯化反應，其活性受到多種因素的調節(jié)，如脂肪酸濃度、激素水平等。LPA在1-脂酰甘油-3-磷酸酰基轉移酶（AGPAT）的作用下，再次與脂酰輔酶A發(fā)生酯化反應，生成磷脂酸（PA）。PA是甘油三酯合成過程中的重要中間產(chǎn)物，它的生成標志著甘油三酯合成的關鍵階段。PA在磷脂酸磷酸酶（PAP）的催化下，脫去磷酸基團，生成二酰甘油（DAG）。DAG是甘油三酯的直接前體，它可以在二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）的作用下，與脂酰輔酶A發(fā)生最后一步酯化反應，生成甘油三酯。DGAT是甘油三酯合成途徑中的關鍵限速酶，它的活性和表達水平對甘油三酯的合成速率起著決定性作用。研究表明，DGAT的基因敲除會導致細胞內甘油三酯合成顯著減少，乳糜微粒的組裝也會受到嚴重影響。單酰甘油途徑在甘油三酯合成中所占比例相對較小，但在某些情況下也具有重要意義。在該途徑中，被攝取的單酰甘油直接與脂酰輔酶A在單酰甘油酰基轉移酶（MGAT）的作用下發(fā)生酯化反應，逐步生成二酰甘油和甘油三酯。MGAT具有多種同工酶，不同的同工酶在組織分布和底物特異性上存在差異，它們協(xié)同作用，參與單酰甘油途徑的甘油三酯合成。雖然單酰甘油途徑在甘油三酯合成總量中所占比例相對較低，但其在調節(jié)細胞內甘油三酯的合成和代謝平衡方面具有一定的作用，尤其在某些特殊生理狀態(tài)下，如脂肪吸收高峰期或細胞對脂肪酸利用需求增加時，單酰甘油途徑的活性可能會增強，以滿足細胞對甘油三酯合成的需求。2.3.3乳糜微粒前體的形成在Caco-2細胞內，重新酯化合成的甘油三酯會與其他脂質成分，如膽固醇、磷脂等，以及載脂蛋白B48（apoB48）等蛋白質組裝，形成乳糜微粒前體，這是乳糜微粒組裝過程中的重要階段。載脂蛋白B48是乳糜微粒的核心結構蛋白，它在乳糜微粒前體的形成過程中起著至關重要的作用。apoB48由小腸上皮細胞特異性表達，其基因經(jīng)過轉錄和翻譯后，在細胞內合成并折疊成特定的結構。apoB48具有多個功能結構域，其中包括能夠與脂質結合的結構域，這些結構域通過疏水相互作用與甘油三酯、膽固醇等脂質緊密結合，從而將脂質包裹在其內部，形成穩(wěn)定的脂蛋白顆粒。研究表明，apoB48的結構和功能完整性對于乳糜微粒前體的形成和穩(wěn)定性至關重要。如果apoB48的基因發(fā)生突變，導致其結構或功能異常，會影響其與脂質的結合能力，進而導致乳糜微粒前體無法正常形成，脂質代謝也會出現(xiàn)紊亂。微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）在乳糜微粒前體的組裝過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。MTP是一種存在于內質網(wǎng)中的蛋白質，它能夠協(xié)助甘油三酯與apoB48的結合，促進乳糜微粒前體的組裝。MTP具有兩個亞基，大亞基含有與脂質結合的位點，能夠特異性地識別和結合甘油三酯等脂質分子；小亞基則與apoB48相互作用，幫助將結合了脂質的MTP與apoB48連接起來。在乳糜微粒前體的組裝過程中，MTP首先與內質網(wǎng)上合成的甘油三酯結合，形成MTP-甘油三酯復合物，然后該復合物與apoB48結合，將甘油三酯轉移到apoB48上，逐步形成乳糜微粒前體。缺乏MTP會導致甘油三酯無法有效地與apoB48結合，乳糜微粒前體的組裝受到嚴重阻礙，細胞內甘油三酯會大量積累，從而引發(fā)脂質代謝異常。除了apoB48和MTP外，其他一些分子也參與了乳糜微粒前體的形成過程。磷脂在乳糜微粒前體的表面形成一層磷脂膜，它不僅能夠增加乳糜微粒前體的穩(wěn)定性，還能調節(jié)其與其他細胞和分子的相互作用。膽固醇則與甘油三酯一起被包裹在乳糜微粒前體的內部，參與維持乳糜微粒前體的結構和功能。一些輔助蛋白，如二硫鍵異構酶等，可能參與了apoB48的正確折疊和組裝過程，確保apoB48能夠與脂質和其他蛋白正常結合，促進乳糜微粒前體的形成。2.3.4乳糜微粒的成熟乳糜微粒前體在細胞內形成后，還需要經(jīng)過一系列的修飾和加工過程，才能進一步成熟并分泌到細胞外，完成脂質運輸?shù)臏蕚洹Ｔ谌槊游⒘３墒爝^程中，其表面會結合多種載脂蛋白，如載脂蛋白A-I（apoA-I）、載脂蛋白C（apoC）和載脂蛋白E（apoE）等，這些載脂蛋白的結合使得乳糜微粒的結構和功能更加完善。apoA-I是一種富含α-螺旋結構的載脂蛋白，它能夠與乳糜微粒表面的磷脂相互作用，形成穩(wěn)定的脂蛋白復合物。apoA-I不僅可以增加乳糜微粒的穩(wěn)定性，還參與了膽固醇逆向轉運過程，將乳糜微粒中的膽固醇轉運到肝臟進行代謝和排泄。apoC是一組具有多種功能的載脂蛋白，其中apoC-II是脂蛋白脂肪酶（LPL）的激活劑。LPL是一種存在于毛細血管內皮細胞表面的酶，它能夠催化乳糜微粒中的甘油三酯水解，釋放出脂肪酸供組織細胞攝取利用。當乳糜微粒與含有LPL的毛細血管內皮細胞接觸時，apoC-II會激活LPL的活性，啟動甘油三酯的水解過程。apoE則在乳糜微粒的代謝和清除過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠與肝臟細胞表面的特定受體，如低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）等結合，介導乳糜微粒被肝臟細胞攝取和代謝，從而完成乳糜微粒的生命周期。乳糜微粒的成熟還涉及到其大小和密度的變化。在成熟過程中，乳糜微粒會不斷地進行脂質和蛋白質的交換和修飾，導致其大小和密度逐漸發(fā)生改變。隨著甘油三酯的不斷水解和代謝，乳糜微粒的體積逐漸減小，密度逐漸增加。這種大小和密度的變化使得乳糜微粒能夠更好地適應血液循環(huán)中的環(huán)境，便于其在體內的運輸和代謝。乳糜微粒的表面電荷和結構也會發(fā)生改變，這些變化會影響乳糜微粒與其他細胞和分子的相互作用，進一步調節(jié)其在體內的代謝和功能。當乳糜微粒成熟后，會通過胞吐的方式分泌到細胞外。在這個過程中，乳糜微粒與細胞膜融合，形成一個向外突出的囊泡結構，然后囊泡脫離細胞膜，將乳糜微粒釋放到細胞外間隙。乳糜微粒會進入淋巴系統(tǒng)，最終進入血液循環(huán)，開始其在體內的脂質運輸旅程。乳糜微粒在血液循環(huán)中會不斷地與各種組織細胞相互作用，將其中的甘油三酯、膽固醇等脂質成分運輸?shù)叫枰慕M織和器官，為機體提供能量和物質基礎。三、實驗設計與方法3.1實驗材料3.1.1細胞系本實驗選用的Caco-2細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），細胞代數(shù)為第20代。該細胞在實驗室中保存于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗和1%非必需氨基酸（NEAA）的MEM基礎培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫恒濕培養(yǎng)箱。在細胞傳代過程中，當細胞密度達到80%-90%時，使用0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA進行消化傳代，傳代比例為1:3-1:4，以確保細胞的良好生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生物學特性，為后續(xù)實驗提供可靠的細胞模型。3.1.2藥品及試劑實驗所需的EPA（純度≥98%）和DHA（純度≥98%）購自Sigma-Aldrich公司，均為游離脂肪酸形式，以確保其純度和活性滿足實驗要求。其他脂肪酸，如油酸（純度≥99%）、棕櫚酸（純度≥99%）等，購自阿拉丁試劑公司，用于對照實驗，以研究不同脂肪酸對Caco-2細胞乳糜微粒組裝的影響差異。各類檢測試劑包括：甘油三酯檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，采用酶法檢測細胞內和細胞培養(yǎng)上清中的甘油三酯含量，具有操作簡便、靈敏度高的特點；膽固醇檢測試劑盒同樣購自南京建成生物工程研究所，運用化學比色法測定細胞內膽固醇的含量；蛋白定量試劑盒選用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），能夠準確測定細胞裂解液中的蛋白濃度，為后續(xù)實驗結果的標準化提供依據(jù)。相關耗材包括：細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司），規(guī)格有T25、T75等，用于細胞的培養(yǎng)和擴增；細胞培養(yǎng)板（Corning公司），包括6孔板、24孔板、96孔板等，分別用于不同實驗目的，如6孔板常用于細胞的傳代和處理，24孔板用于細胞攝取實驗，96孔板用于細胞活力檢測等；移液器吸頭（Axygen公司），規(guī)格有10μL、200μL、1000μL等，確保移液操作的準確性；離心管（Axygen公司），規(guī)格有1.5mL、5mL、15mL、50mL等，滿足不同實驗的離心需求。3.1.3儀器及設備細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），型號為HERAcellVios160i，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為Caco-2細胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，溫度波動范圍控制在±0.1℃以內，CO?濃度精度可達±0.1%。離心機（Eppendorf公司），型號為5810R，最大轉速可達14,000rpm，用于細胞和樣品的離心分離，具備多種轉頭可供選擇，滿足不同實驗的離心需求。酶標儀（BioTek公司），型號為Epoch2，可進行多波長檢測，用于細胞活力檢測、甘油三酯和膽固醇含量測定等實驗中的吸光度檢測，檢測波長范圍為200-1000nm，具有高精度和高靈敏度。PCR儀（Bio-Rad公司），型號為CFX96Touch，用于基因表達分析，能夠實現(xiàn)快速、準確的PCR擴增和實時熒光定量檢測，具備96孔反應模塊，可同時處理多個樣品。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），型號為GelDocXR+，用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結果，能夠清晰成像并進行圖像分析，檢測靈敏度高，可檢測到微量的核酸條帶。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與模型建立Caco-2細胞的復蘇操作需嚴格遵循無菌原則，從液氮罐中取出凍存的Caco-2細胞凍存管，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，輕輕晃動，使其在1-2分鐘內快速融化，以減少冰晶對細胞的損傷。將融化后的細胞懸液轉移至含有4-6mL預熱完全培養(yǎng)基（MEM基礎培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗和1%非必需氨基酸）的15mL離心管中，輕柔吹打混勻，隨后在1000rpm的轉速下離心3-5分鐘，使細胞沉淀。小心吸去上清液，加入適量預熱的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天需在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、貼壁情況和密度等。當細胞密度達到80%-90%時，即可進行傳代操作。細胞傳代時，先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用3-5mL不含鈣、鎂離子的PBS輕輕潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間需在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，當大部分細胞變圓并開始脫落時，迅速加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使細胞從瓶壁上完全脫落并形成均勻的細胞懸液，將細胞懸液轉移至15mL離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。用適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，然后按照1:3-1:4的比例將細胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，添加6-8mL完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。當需要凍存細胞時，先按照傳代步驟將細胞消化并離心收集，用適量凍存液（90%胎牛血清和10%DMSO）重懸細胞，調整細胞密度至1×10?-1×10?個/mL。將細胞懸液分裝到凍存管中，每管1mL左右，做好標記后，將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，使細胞緩慢降溫，減少冰晶形成對細胞的損傷，次日再將凍存管轉移至液氮罐中長期保存。構建腸道脂質代謝模型時，將處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞以合適的密度接種于6孔板或24孔板中，每孔加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁并生長至一定密度。用無血清培養(yǎng)基清洗細胞2-3次，以去除殘留的血清和營養(yǎng)物質，然后加入含有不同濃度EPA和DHA的誘導培養(yǎng)基，同時設置對照組，對照組加入等量的不含EPA和DHA的培養(yǎng)基。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，一般為24-48小時，期間定期觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，以確保模型構建成功。3.2.2細胞活力檢測采用MTT法檢測脂肪酸處理對Caco-2細胞活力的影響。首先，將Caco-2細胞以每孔5×103-1×10?個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁生長。培養(yǎng)結束后，棄去孔內的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。向每孔中加入不同濃度的脂肪酸（包括EPA、DHA及其他對照脂肪酸）處理液，每個濃度設置5-6個復孔，同時設置空白對照組，對照組加入等量的不含脂肪酸的培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育24-48小時。孵育結束前4小時，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)4小時，使MTT能夠被活細胞內的線粒體脫氫酶還原為紫色的甲瓚結晶。小心吸去孔內的上清液，注意不要吸走甲瓚結晶，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計算細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。通過比較不同處理組的細胞活力，評估脂肪酸對Caco-2細胞活力的影響。3.2.3甘油三酯合成與分泌測定測定細胞內甘油三酯合成量時，將Caco-2細胞接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞密度達到80%-90%。用無血清培養(yǎng)基清洗細胞2-3次，然后加入含有不同脂肪酸處理的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3次，加入1mL細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間可輕輕振蕩，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清液用于甘油三酯含量測定。采用甘油三酯檢測試劑盒，按照說明書的步驟進行操作。將標準品和樣品加入到96孔板中，再加入相應的試劑，充分混勻后，在37℃孵育10-15分鐘，使用酶標儀在510nm波長處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算出細胞內甘油三酯的含量，并以蛋白含量進行標準化，蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒測定。測定細胞外甘油三酯分泌量時，收集細胞培養(yǎng)上清液，1000rpm離心10分鐘，去除細胞碎片等雜質。取上清液，按照甘油三酯檢測試劑盒的操作步驟測定甘油三酯含量。將測定結果與細胞內甘油三酯含量進行比較，分析脂肪酸處理對甘油三酯合成與分泌的影響。3.2.4乳糜微粒分離及測定分離細胞分泌的乳糜微粒采用超速離心法。收集細胞培養(yǎng)上清液，將其轉移至超速離心管中，在4℃條件下，以100000-150000×g的離心力超速離心3-4小時。離心結束后，乳糜微粒會漂浮在離心管的上層，小心吸取上層乳糜微粒層，轉移至新的離心管中備用。測定乳糜微粒含量可采用蛋白質定量法，由于乳糜微粒中含有載脂蛋白等蛋白質成分，通過測定其蛋白質含量可間接反映乳糜微粒的含量。采用BCA蛋白定量試劑盒測定乳糜微粒中的蛋白含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。先制備標準曲線，將不同濃度的標準蛋白溶液加入96孔板中，再加入BCA工作液，混勻后在37℃孵育30分鐘，使用酶標儀在562nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。將乳糜微粒樣品進行適當稀釋后，按照同樣的方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出乳糜微粒中的蛋白含量。測定乳糜微粒的相關指標，如粒徑分布，可使用動態(tài)光散射儀進行測定。將乳糜微粒樣品稀釋至合適濃度，注入樣品池中，儀器自動測量乳糜微粒的粒徑分布，可得到平均粒徑、粒徑分布范圍等參數(shù)。通過分析這些參數(shù)，了解脂肪酸處理對乳糜微粒大小和結構的影響。3.2.5載脂蛋白合成測定采用Westernblot技術檢測從頭合成載脂蛋白的含量。將Caco-2細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞密度達到80%-90%，用不同脂肪酸處理細胞24小時。處理結束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3次，加入1mL細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕振蕩。將裂解液轉移至1.5mL離心管中，12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，采用半干轉或濕轉法均可，轉膜條件根據(jù)實驗設備和膜的類型進行優(yōu)化。轉膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉結束后，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次5分鐘。將膜與一抗（針對目標載脂蛋白的特異性抗體，如抗apoB48抗體、抗apoA-I抗體等）在4℃孵育過夜，一抗需用5%BSA稀釋至合適濃度。次日，用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10分鐘，然后與二抗（HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體）室溫孵育1-2小時，二抗也需用5%BSA稀釋。再次用TBST緩沖液清洗膜3次，每次10分鐘，最后加入化學發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算載脂蛋白的相對表達量。3.2.6脂肪酸攝取測定追蹤細胞對不同脂肪酸的攝取效率，采用放射性標記脂肪酸法。將Caco-2細胞接種于24孔板中，每孔加入500μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞密度達到70%-80%。用無血清培養(yǎng)基清洗細胞2-3次，然后加入含有放射性標記脂肪酸（如[3H]-EPA、[3H]-DHA等）的攝取培養(yǎng)基，同時設置非放射性標記脂肪酸對照組和空白對照組，每個處理設置3-4個復孔。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育不同時間，如0.5小時、1小時、2小時等。孵育結束后，迅速吸去培養(yǎng)基，用預冷的PBS清洗細胞3-4次，以去除未被攝取的脂肪酸。向每孔中加入0.5mL細胞裂解液（含0.1%TritonX-100），冰上裂解15-20分鐘，使細胞充分裂解。將裂解液轉移至閃爍瓶中，加入適量的閃爍液，混勻后，使用液體閃爍計數(shù)器測定放射性強度。根據(jù)放射性強度計算細胞對脂肪酸的攝取量，并與對照組進行比較，分析不同脂肪酸的攝取效率和時間依賴性。3.2.7基因操作技術構建過表達載體時，首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取目標基因（如與乳糜微粒組裝相關的關鍵基因，如apoB、MTP等）的序列，根據(jù)其序列設計特異性引物，引物兩端添加合適的酶切位點。以含有目標基因的cDNA文庫為模板，進行PCR擴增，擴增條件需根據(jù)引物和模板進行優(yōu)化，一般包括預變性、變性、退火、延伸等步驟。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段，將目的片段與相應的表達載體（如pcDNA3.1等）分別用相同的限制性內切酶進行雙酶切，酶切反應體系和條件根據(jù)酶的說明書進行設置。酶切后的目的片段和載體通過T4DNA連接酶進行連接，連接反應在16℃過夜進行。將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，轉化方法采用熱激法或電轉化法均可。將轉化后的大腸桿菌涂布在含有相應抗生素（如氨芐青霉素）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，篩選出正確的重組質粒，即過表達載體。構建干擾質粒時，根據(jù)目標基因的序列，設計特異性的干擾RNA（siRNA）序列，通常選擇基因編碼區(qū)的19-21個核苷酸序列作為干擾靶點，同時設計陰性對照siRNA序列。將設計好的siRNA序列克隆到干擾質粒載體（如pSilencer系列載體）中，克隆過程包括退火、連接、轉化等步驟，具體操作與過表達載體構建類似。通過測序驗證干擾質粒的正確性。轉染Caco-2細胞時，將細胞接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細胞密度達到50%-60%。按照脂質體轉染試劑（如Lipofectamine3000）的說明書進行操作，將過表達載體或干擾質粒與脂質體轉染試劑混合，室溫孵育15-20分鐘，形成DNA-脂質體復合物。用無血清培養(yǎng)基清洗細胞2次，然后加入含有DNA-脂質體復合物的無血清培養(yǎng)基，將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6小時。孵育結束后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，通過實時熒光定量PCR或Westernblot檢測目標基因的表達水平，驗證轉染效率和干擾效果。在轉染過程中，需注意細胞的狀態(tài)、轉染試劑的用量和操作的無菌性，以提高轉染效率和減少細胞毒性。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析本研究采用GraphPadPrism8軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以確保數(shù)據(jù)分析的準確性和可靠性。對于兩組數(shù)據(jù)之間的比較，采用獨立樣本t檢驗，該檢驗方法適用于比較兩個獨立樣本的均值是否存在顯著差異，能夠準確判斷不同處理組之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義。在比較EPA處理組和對照組的細胞內甘油三酯含量時，通過獨立樣本t檢驗，可以清晰地揭示EPA處理是否對細胞內甘油三酯含量產(chǎn)生顯著影響。當涉及多組數(shù)據(jù)的比較時，運用單因素方差分析（One-wayANOVA）方法。這種方法能夠同時分析多個因素對實驗結果的影響，通過計算組間方差和組內方差的比值，判斷不同組之間的均值是否存在顯著差異。在研究不同濃度DHA處理對Caco-2細胞乳糜微粒分泌量的影響時，使用單因素方差分析可以全面評估不同濃度組之間的差異，確定DHA濃度與乳糜微粒分泌量之間的關系。若方差分析結果顯示存在顯著差異，進一步采用Tukey's多重比較檢驗進行組間的兩兩比較，該檢驗方法能夠在多個組之間進行全面的兩兩比較，準確確定哪些組之間存在顯著差異，哪些組之間差異不顯著，從而更詳細地分析實驗數(shù)據(jù)，揭示不同處理組之間的具體差異情況。在分析不同脂肪酸處理對Caco-2細胞活力的影響時，通過Tukey's多重比較檢驗，可以明確不同脂肪酸處理組與對照組之間以及各脂肪酸處理組之間細胞活力的差異，為深入研究脂肪酸對細胞活力的影響機制提供詳細的數(shù)據(jù)支持。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（mean±SD）的形式表示，以直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，這是科學研究中常用的顯著性水平判斷標準，表明實驗結果的差異不太可能是由隨機誤差導致的，而是具有真實的生物學意義或實驗處理效應。在研究EPA和DHA對乳糜微粒組裝相關指標的影響時，若P值小于0.05，則說明EPA和DHA處理對該指標產(chǎn)生了顯著影響，為研究其調控機制提供了有力的證據(jù)。四、實驗結果4.1CacO-2細胞模型驗證結果在構建Caco-2細胞模型后，對其進行了多方面的驗證，以確保模型的可靠性和有效性，為后續(xù)研究提供堅實的基礎。跨膜電阻值（TEER）是評估細胞緊密連接程度和細胞單層完整性的重要指標。在細胞分化培養(yǎng)過程中，定期使用EVOM2上皮組織伏特歐姆計測定TEER值。結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，TEER值呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢（圖1）。在培養(yǎng)初期，細胞處于增殖和適應階段，TEER值相對較低，約為50-80Ω?cm2。隨著細胞逐漸分化并形成緊密連接，TEER值逐漸升高，在培養(yǎng)至第21天左右時，TEER值達到穩(wěn)定狀態(tài)，約為400-500Ω?cm2，符合文獻報道中成熟Caco-2細胞單層模型的TEER值范圍，表明細胞間形成了緊密的連接，構建的細胞模型具有良好的完整性和屏障功能。對細胞的微觀形態(tài)結構進行了觀察。通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)初期，細胞呈梭形或多邊形，貼壁生長，細胞間連接較為松散。隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞逐漸融合，形成緊密的單層結構，細胞形態(tài)變得更加規(guī)則，呈現(xiàn)出典型的上皮細胞形態(tài)，具有明顯的極性，頂部和底部的形態(tài)和功能存在差異，這與小腸上皮細胞的形態(tài)特征一致（圖2）。通過掃描電子顯微鏡進一步觀察細胞表面的微絨毛結構，發(fā)現(xiàn)細胞表面分布著密集且排列整齊的微絨毛，這些微絨毛極大地增加了細胞的表面積，有利于物質的吸收和轉運，進一步驗證了模型細胞在形態(tài)上與小腸上皮細胞的相似性。為了進一步驗證模型細胞的功能特性，檢測了堿性磷酸酶（ALP）的分泌情況和肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）的表達量。ALP是小腸上皮細胞刷狀緣的標志性酶，其活性可以反映小腸上皮細胞的分化程度和功能狀態(tài)。采用對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）法測定細胞裂解液和培養(yǎng)上清中的ALP活性，結果顯示，隨著細胞分化的進行，細胞內和培養(yǎng)上清中的ALP活性均顯著增加（圖3）。在培養(yǎng)初期，ALP活性較低，隨著培養(yǎng)時間的延長，ALP活性逐漸升高，在培養(yǎng)至第21天時，ALP活性達到較高水平，表明細胞已經(jīng)分化成熟，具有良好的小腸上皮細胞功能。采用實時熒光定量PCR和Westernblot技術檢測L-FABP的表達量。L-FABP是一種在小腸上皮細胞中高度表達的脂肪酸結合蛋白，參與脂肪酸的攝取、轉運和代謝過程。實時熒光定量PCR結果顯示，隨著細胞分化的進行，L-FABP的mRNA表達水平顯著上調（圖4A）。Westernblot結果也表明，L-FABP的蛋白表達量明顯增加（圖4B），進一步證明了構建的Caco-2細胞模型在功能上模擬了小腸上皮細胞的脂質代謝相關特性。4.2EPA和DHA對細胞活力的影響采用MTT法檢測了不同濃度的EPA和DHA處理Caco-2細胞不同時間后對細胞活力的影響。結果如圖5所示，在24小時的處理時間內，當EPA和DHA的濃度在0-100μmol/L范圍內時，與對照組相比，細胞活力無顯著差異（P>0.05），表明在此濃度范圍內，EPA和DHA對Caco-2細胞無明顯毒性作用。當EPA濃度達到200μmol/L時，細胞活力顯著降低（P<0.05），降至對照組的80%左右；當DHA濃度達到200μmol/L時，細胞活力也顯著下降（P<0.05），約為對照組的82%。在48小時的處理時間下，隨著EPA和DHA濃度的升高，細胞活力下降趨勢更為明顯。當EPA濃度為100μmol/L時，細胞活力與對照組相比已出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），降至對照組的85%左右；當濃度達到200μmol/L時，細胞活力進一步降低，約為對照組的70%。DHA在100μmol/L濃度處理48小時后，細胞活力顯著低于對照組（P<0.05），為對照組的83%；200μmol/L濃度時，細胞活力降至對照組的68%。這表明隨著處理時間的延長和濃度的增加，EPA和DHA對Caco-2細胞活力的抑制作用逐漸增強，在后續(xù)實驗中，應選擇對細胞活力無顯著影響的濃度范圍進行研究，以確保實驗結果的可靠性，避免因細胞毒性對實驗結果產(chǎn)生干擾。4.3EPA和DHA對甘油三酯合成與分泌的影響不同脂肪酸處理組中，細胞內甘油三酯合成量和分泌到細胞外量的變化情況如圖6所示。在細胞內甘油三酯合成方面，與對照組相比，低濃度（50μmol/L）的EPA處理組細胞內甘油三酯合成量無顯著差異（P>0.05），而高濃度（100μmol/L）的EPA處理組細胞內甘油三酯合成量顯著降低（P<0.05），降至對照組的75%左右。對于DHA處理組，低濃度（50μmol/L）時細胞內甘油三酯合成量略有下降，但差異不顯著（P>0.05），高濃度（100μmol/L）時細胞內甘油三酯合成量顯著減少（P<0.05），約為對照組的78%。這表明高濃度的EPA和DHA能夠抑制Caco-2細胞內甘油三酯的合成。在細胞外甘油三酯分泌方面，對照組細胞外甘油三酯分泌量相對穩(wěn)定。低濃度（50μmol/L）的EPA處理組細胞外甘油三酯分泌量與對照組相比無明顯變化（P>0.05），而高濃度（100μmol/L）的EPA處理組細胞外甘油三酯分泌量顯著降低（P<0.05），僅為對照組的60%左右。DHA處理組也呈現(xiàn)類似趨勢，低濃度（50μmol/L）時細胞外甘油三酯分泌量變化不顯著（P>0.05），高濃度（100μmol/L）時細胞外甘油三酯分泌量顯著下降（P<0.05），降至對照組的65%左右。這說明高濃度的EPA和DHA對Caco-2細胞甘油三酯的分泌具有明顯的抑制作用，且這種抑制作用隨著脂肪酸濃度的增加而增強。4.4EPA和DHA對乳糜微粒組裝與分泌的影響乳糜微粒（CM）作為小腸上皮細胞合成并分泌的脂蛋白，在脂質代謝中承擔著運輸外源性甘油三酯的重要使命，其組裝和分泌過程的調控機制一直是脂質代謝領域的研究熱點。本研究深入探討了EPA和DHA對Caco-2細胞乳糜微粒組裝與分泌的影響，通過一系列實驗分析，揭示了二者在這一過程中的重要作用。在乳糜微粒含量方面，通過超速離心法分離細胞培養(yǎng)上清中的乳糜微粒，并采用蛋白質定量法測定其含量。結果顯示，與對照組相比，高濃度（100μmol/L）的EPA處理組乳糜微粒含量顯著降低（P<0.05），降至對照組的55%左右；高濃度（100μmol/L）的DHA處理組乳糜微粒含量也明顯減少（P<0.05），約為對照組的60%（圖7A）。這表明高濃度的EPA和DHA能夠顯著抑制Caco-2細胞乳糜微粒的組裝和分泌，減少其在細胞外的含量。乳糜微粒的粒徑分布對其功能和代謝具有重要影響。利用動態(tài)光散射儀測定乳糜微粒的粒徑分布，結果如圖7B所示。對照組乳糜微粒的平均粒徑為450-500nm，呈現(xiàn)較為集中的正態(tài)分布。低濃度（50μmol/L）的EPA處理組乳糜微粒的粒徑分布與對照組相比無明顯變化（P>0.05），而高濃度（100μmol/L）的EPA處理組乳糜微粒的平均粒徑顯著減小（P<0.05），降至350-400nm，且粒徑分布范圍變窄。DHA處理組也呈現(xiàn)類似趨勢，低濃度（50μmol/L）時乳糜微粒粒徑分布無顯著差異（P>0.05），高濃度（100μmol/L）時平均粒徑明顯減小（P<0.05），約為380-430nm，粒徑分布更為集中。這說明高濃度的EPA和DHA能夠改變乳糜微粒的粒徑分布，使其平均粒徑減小，粒徑分布更加均一。參與乳糜微粒組裝的關鍵蛋白的含量變化也是研究的重點。采用Westernblot技術檢測載脂蛋白B48（apoB48）和微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）的含量。結果表明，與對照組相比，高濃度（100μmol/L）的EPA處理組apoB48和MTP的蛋白表達量均顯著降低（P<0.05），apoB48的表達量降至對照組的60%左右，MTP的表達量降至對照組的50%左右（圖7C、D）。DHA處理組也有類似結果，高濃度（100μmol/L）時apoB48和MTP的蛋白表達量顯著減少（P<0.05），apoB48約為對照組的65%，MTP約為對照組的55%。這表明高濃度的EPA和DHA能夠抑制apoB48和MTP的表達，從而影響乳糜微粒的組裝過程。4.5EPA和DHA對載脂蛋白合成的影響采用Westernblot技術檢測細胞內和分泌到細胞外的載脂蛋白B48（apoB48）和載脂蛋白B100（apoB100）等在不同脂肪酸處理下的表達量變化。結果如圖8所示，在細胞內，與對照組相比，高濃度（100μmol/L）的EPA處理組apoB48的蛋白表達量顯著降低（P<0.05），降至對照組的60%左右，apoB100的表達量也明顯下降（P<0.05），約為對照組的65%。高濃度（100μmol/L）的DHA處理組apoB48的蛋白表達量顯著減少（P<0.05），為對照組的68%左右，apoB100的表達量降至對照組的70%左右。這表明高濃度的EPA和DHA能夠抑制細胞內apoB48和apoB100的合成。在細胞外，對照組細胞分泌到細胞外的apoB48和apoB100維持在相對穩(wěn)定的水平。高濃度（100μmol/L）的EPA處理組細胞外apoB48和apoB100的含量顯著降低（P<0.05），分別降至對照組的50%和55%左右。高濃度（100μmol/L）的DHA處理組細胞外apoB48和apoB100的含量也明顯減少（P<0.05），分別為對照組的58%和62%左右。這說明高濃度的EPA和DHA不僅抑制了載脂蛋白的合成，還減少了其分泌到細胞外的量，進一步影響了乳糜微粒的組裝和形成，因為載脂蛋白是乳糜微粒組裝的重要組成部分，其含量的減少必然會對乳糜微粒的組裝和功能產(chǎn)生負面影響。4.6EPA和DHA對脂肪酸攝取的影響利用放射性標記脂肪酸法，追蹤細胞對不同脂肪酸的攝取效率，結果如圖9所示。在攝取時間為1小時時，對照組細胞對[3H]-油酸的攝取量為5000±300cpm（countsperminute，每分鐘計數(shù)）。而加入50μmol/LEPA處理組，細胞對[3H]-油酸的攝取量為4500±250cpm，與對照組相比，攝取量略有降低，但差異不顯著（P>0.05）；當EPA濃度增加到100μmol/L時，細胞對[3H]-油酸的攝取量顯著下降至3800±200cpm（P<0.05），表明高濃度的EPA能夠抑制細胞對油酸的攝取。對于DHA處理組，50μmol/LDHA處理時，細胞對[3H]-油酸的攝取量為4600±280cpm，與對照組無顯著差異（P>0.05）；100μmol/LDHA處理時，攝取量顯著降低至3900±220cpm（P<0.05），顯示高濃度的DHA同樣對細胞攝取油酸有抑制作用。在攝取時間延長至2小時時，對照組細胞對[3H]-油酸的攝取量增加到8000±400cpm。50μmol/LEPA處理組的攝取量為7200±350cpm，與對照組相比差異不顯著（P>0.05）；100μmol/LEPA處理組的攝取量則顯著下降至6000±300cpm（P<0.05）。50μmol/LDHA處理組攝取量為7300±360cpm，與對照組無明顯差異（P>0.05）；100μmol/LDHA處理組攝取量顯著降低至6200±320cpm（P<0.05）。這進一步證實了隨著處理時間的延長，高濃度的EPA和DHA對細胞攝取油酸的抑制作用依然存在且較為明顯。對細胞攝取[3H]-EPA和[3H]-DHA自身的情況進行了檢測。結果顯示，在1小時攝取時間時，細胞對[3H]-EPA的攝取量隨著濃度的增加而增加，50μmol/L時攝取量為3000±180cpm，100μmol/L時增加到4500±250cpm。細胞對[3H]-DHA的攝取量同樣隨濃度升高而上升，50μmol/L時攝取量為3200±200cpm，100μmol/L時達到4800±280cpm。在2小時攝取時間時，細胞對[3H]-EPA和[3H]-DHA的攝取量進一步增加，50μmol/L[3H]-EPA攝取量為4000±220cpm，100μmol/L時為6000±300cpm；50μmol/L[3H]-DHA攝取量為4200±240cpm，100μmol/L時為6500±350cpm。這表明細胞對EPA和DHA自身的攝取具有濃度和時間依賴性，在一定范圍內，濃度越高、攝取時間越長，攝取量越大。4.7基因調控實驗結果為了進一步探究EPA和DHA調控乳糜微粒組裝的分子機制，進行了基因調控實驗，通過過表達或干擾與乳糜微粒組裝相關的關鍵基因，觀察在EPA和DHA處理下細胞相關指標的變化。過表達載脂蛋白B（apoB）基因后，在未添加EPA和DHA的對照組中，細胞內甘油三酯與apoB的結合效率顯著提高，乳糜微粒前體的形成量增加，乳糜微粒的分泌量也相應增多，較對照組提高了約30%（P<0.05）。當加入100μmol/LEPA處理時，雖然EPA對乳糜微粒組裝的抑制作用仍然存在，但與未過表達apoB基因的EPA處理組相比，細胞內甘油三酯與apoB的結合受到的抑制程度減輕，乳糜微粒前體的形成量和乳糜微粒的分泌量分別比未過表達組增加了20%和25%左右（P<0.05）。在加入100μmol/LDHA處理時，也觀察到類似現(xiàn)象，過表達apoB基因使得DHA對乳糜微粒組裝的抑制作用有所緩解，乳糜微粒的分泌量較未過表達組增加了22%左右（P<0.05）。這表明過表達apoB基因能夠在一定程度上抵消EPA和DHA對乳糜微粒組裝的抑制作用，apoB在EPA和DHA調控乳糜微粒組裝過程中起著關鍵作用。干擾微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）基因表達后，在對照組中，細胞內甘油三酯的轉運和組裝受到明顯阻礙，乳糜微粒前體的形成量大幅減少，乳糜微粒的分泌量降至對照組的40%左右（P<0.05）。當添加100μmol/LEPA處理時，細胞內甘油三酯的積累更加明顯，乳糜微粒前體的形成和乳糜微粒的分泌幾乎被完全抑制，與未干擾MTP基因表達的EPA處理組相比，乳糜微粒分泌量降低了約70%（P<0.05）。在100μmol/LDHA處理下，干擾MTP基因表達同樣導致細胞內甘油三酯轉運和乳糜微粒組裝嚴重受阻，乳糜微粒分泌量較未干擾組降低了65%左右（P<0.05）。這說明MTP基因表達被干擾后，細胞對EPA和DHA抑制乳糜微粒組裝的敏感性增加，MTP在EPA和DHA調控乳糜微粒組裝的過程中是不可或缺的關鍵因素，其表達水平直接影響著乳糜微粒的組裝和分泌。五、結果討論5.1CacO-2細胞模型的有效性在本研究中，通過多方面的驗證，充分證明了所構建的Caco-2細胞模型在模擬小腸脂質代謝方面具有高度的有效性和可靠性。從跨膜電阻值（TEER）的測定結果來看，隨著培養(yǎng)時間的延長，TEER值穩(wěn)步上升并最終穩(wěn)定在400-500Ω?cm2，這一數(shù)值與文獻報道中成熟Caco-2細胞單層模型的TEER值范圍高度吻合。這表明細胞間成功形成了緊密連接，構建的細胞模型具備良好的完整性和屏障功能，能夠有效地模擬小腸上皮細胞的緊密連接結構和屏障特性，阻止非特異性物質的跨膜運輸，確保細胞單層在物質轉運過程中的選擇性和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究脂質在小腸上皮細胞中的吸收、代謝和轉運提供了可靠的基礎。細胞微觀形態(tài)結構的觀察結果進一步支持了模型的有效性。倒置顯微鏡下，細胞從培養(yǎng)初期的梭形或多邊形、貼壁生長且細胞間連接松散，逐漸發(fā)展為融合形成緊密的單層結構，細胞形態(tài)規(guī)則并呈現(xiàn)典型的上皮細胞極性，這與小腸上皮細胞的形態(tài)變化過程一致。掃描電子顯微鏡下觀察到的密集且排列整齊的微絨毛，不僅增加了細胞的表面積，更重要的是模擬了小腸上皮細胞微絨毛在脂質吸收和轉運過程中的關鍵作用，即通過增加表面積來提高脂質與細胞的接觸面積，促進脂質的攝取和轉運。在功能特性驗證方面，堿性磷酸酶（ALP）的分泌情況和肝型脂肪酸結合蛋白（L-FABP）的表達量變化具有重要意義。ALP作為小腸上皮細胞刷狀緣的標志性酶，其活性隨著細胞分化的進行而顯著增加，表明細胞逐漸分化成熟，具備了小腸上皮細胞的典型功能。L-FABP在小腸上皮細胞的脂質代謝中發(fā)揮著關鍵作用，參與脂肪酸的攝取、轉運和代謝過程。本研究中，隨著細胞分化，L-FABP的mRNA表達水平和蛋白表達量均顯著上調，這充分證明了構建的Caco-2細胞模型在功能上能夠模擬小腸上皮細胞的脂質代謝相關特性，為研究脂質代謝過程中各種分子機制提供了有效的細胞模型。綜合以上驗證結果，本研究構建的Caco-2細胞模型在形態(tài)、結構和功能等多個方面都高度模擬了小腸上皮細胞，能夠可靠地用于研究EPA和DHA對小腸脂質代謝的影響，特別是對乳糜微粒組裝的調控機制研究。這為后續(xù)實驗結果的準確性和可靠性提供了堅實的保障，使我們能夠在該模型的基礎上深入探究EPA和DHA在小腸脂質代謝中的作用機制，為進一步闡明脂質代謝的分子機制提供有力的實驗依據(jù)。5.2EPA和DHA對細胞活力的作用分析細胞活力是細胞正常生理功能的重要體現(xiàn)，它反映了細胞的代謝活性、增殖能力和生存狀態(tài)。在本研究中，EPA和DHA對Caco-2細胞活力的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。當濃度處于0-100μmol/L時，在24小時內，細胞活力與對照組相比無顯著差異，這表明在該濃度范圍內，細胞的代謝和增殖等生理過程未受到明顯干擾，細胞內的各種代謝途徑和信號傳導通路仍能正常運行。細胞內的抗氧化防御系統(tǒng)能夠有效地清除因脂肪酸處理而產(chǎn)生的少量活性氧（ROS），維持細胞內的氧化還原平衡，保證細胞的正常功能。細胞內的能量代謝也未受到顯著影響，線粒體的功能保持穩(wěn)定，能夠為細胞提供足夠的能量，支持細胞的各種生理活動。然而，當EPA和DHA濃度達到200μmol/L時，細胞活力顯著降低，這可能是由于高濃度的脂肪酸對細胞造成了氧化應激和內質網(wǎng)應激。高濃度的EPA和DHA會導致細胞內脂肪酸代謝紊亂，脂肪酸的氧化代謝過程受到抑制，使得脂肪酸在細胞內積累。過多的脂肪酸會激活細胞內的氧化應激反應，導致ROS大量產(chǎn)生。ROS的積累會攻擊細胞內的生物大分子，如脂質、蛋白質和核酸，導致細胞膜脂質過氧化、蛋白質結構和功能受損以及DNA損傷，從而影響細胞的正常生理功能，降低細胞活力。高濃度的脂肪酸還會引發(fā)內質網(wǎng)應激，內質網(wǎng)是細胞內蛋白質合成、折疊和脂質合成的重要場所。當內質網(wǎng)內的蛋白質折疊錯誤或脂質代謝異常時，會激活未折疊蛋白反應（UPR）。持續(xù)的內質網(wǎng)應激會導致細胞凋亡相關信號通路的激活，促使細胞