第十二章DNA復制第一節DNA復制方式及有關的酶第二節DNA復制機制第三節RNA生物合成第12章DNA復制第一節DNA復制方式及有關的酶 目的要求 了解DNA半保留復制的實驗原理理解DNA復制的起始和方向掌握與DNA復制有關的主要酶與蛋白質必須掌握半不連續復制

重點難點 重點：與DNA復制有關的主要酶與蛋白質，半不連續復制概念難點：DNA復制的起始和方向，與DNA復制有關的主要酶與蛋白質，半不連續復制概念

第12章DNA復制幾個重要概念復制：以原來的DNA分子為模板合成出相同的DNA分子的過程。轉錄：以DNA分子為模板合成出相應RNA的過程。翻譯：以mRNA為模板合成相應的蛋白質肽鏈的過程。第12章DNA復制一．DNA的半保留復制1．半保留復制：復制DNA時，堿基間氫鍵破裂，雙鏈解旋、分開，分別以兩個單鍵為模板，合成新鍵，新形成的DNA分子中有一條是新合成的，一條是來自舊鏈，此過程由一個DNA合成為兩個DNA分子。.通過半保留復制說明DNA在遺傳上的穩定性

第12章DNA復制DNA半保留復制是指DNA復制時，以雙鏈DNA的每一條鏈為模板復制互補的子鏈，并以模板鏈和新合成的鏈構成子代DNA分子。這樣的復制方式可是最大程度上使子代DNA和親代DNA相同(至少有一條鏈完全相同，另一條鏈如復制時不出錯也會完全相同)，從而使DNA在遺傳上保持穩定，即子代DNA與親代DNA相同。通過半保留復制說明DNA在遺傳上的穩定性第12章DNA復制2．實驗證據：1）Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構以推測DNA合成為半保留復制。2）大腸桿菌DNA的復制實驗1958年Meselson和Stahl用15N標記大腸桿菌DNA，證明了半保留復制。大腸桿菌在以15NH4Cl為唯一氮源的培養基上培養12代，使所有DNA都標記上15N。再在含14N的培養基上培養一代，則DNA的一半含15N，一半含14N；兩代時14N-DNA與14N--15N—DNA等量；14N--15N—DNA加熱時，分成14N 鏈和15N鏈。從而證明DNA 是半保留復制的。3）研究證明半保留復制是DNA分子普遍的復制機制。無論原核生物還是真核生物；無論雙鏈DNA，還是單鏈DNA。第12章DNA復制3．DNA在代謝上的穩定性１）經過多代的復制后，DNA的多核苷酸鏈仍可保持完整，并存在于后代而不被分解掉（以分裂方式繁殖的單細胞生物）2）DNA比細胞中其他成分要穩定，這與其遺傳功能相符合。3）DNA也會發生損傷，需要修復復制和轉錄時會有損耗，需要更新；發育和分化時，DNA可能進行修飾、刪除、擴增和重排。4）從進化的角度上，DNA是處于不斷變異和發展中。第12章DNA復制二．復制的起點和單位1．復制子：基因組能獨立進行復制的單位。2．起點：每個復制子都含有控制復制起始的起點，可能還有終止復制的終點。3．復制方式：1）單向復制：從起點向一個方向復制，只有一個復制叉。2）雙向復制：從起點向兩側復制，有兩個復制叉。3）對稱復制：兩條鏈同時進行復制。4）不對稱復制：順序復制兩條鏈（先、后）。第12章DNA復制復制方式第12章DNA復制4．例：1）真核生物DNA：為線性分子，含許多復制起點，即多復制子。2）病毒DNA的復制方式：是一個復制子，可雙向、單向；對稱、不對稱復制。第12章DNA復制5．復制方向的判斷（放射自顯影）復制開始時，用低放射3H-脫氧胸苷標記，將來感光還原的銀密度低；再轉移到含高放射3H-脫氧胸苷培養基，則繼續合成區的銀密度高；如單向復制，則密度為：高—低；雙向復制，密度為：中低，兩側高。大多數生物染色體DNA是雙向、不對稱復制的。第12章DNA復制三．DNA聚合反應的有關酶1．DNA聚合反應和聚合酶1956年，Kornberg從大腸桿菌提取液中發現DNA聚合酶，在有適量DNA和Mg2+存在下，可催化dATP,dCTP,dGTP和dTTP形成DNA。（不能用相應的dNDP、NMP代替相應的dNTP）反應為：dNTP依次加到作為引物的DNA未端，放出ppi1）鏈的延長方向：從5`向3`方向延長，即DNA的3`-OH與NTP的5`-P結合。2）必須有引物（核酸鏈存在）3）加入的核苷酸順序由模板鏈決定4）產物DNA與DNA聚合酶的來源，dNTP的相對比例無關，只取決于模板DNA。5）生成與模板DNA相同的DNA，證明在DNA合成酶作用下，模板DNA的兩條鏈都可復制（以上為PCR—DNA聚合酶鏈式反應的基礎）dNTP+DNA[dNMP]n(DNA)+nPPi

聚合酶Mg2+第12章DNA復制DNA聚合酶的特點：以dNTP為底物；需DNA模板；需引物3`-OH；鏈處長方向為5`---3`第12章DNA復制2．大腸桿菌DNA聚合酶有三種，分別為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ1）共性：需要模板；需要dNTP底物；需要3`-OH的引物鏈。2）不同Ⅱ和Ⅲ可作用于小段缺口（小于100個核苷酸）的雙鏈DNAⅠ作用于有大段單鏈區的雙鏈DNA，或單鏈DNA。3）Ⅲ是大腸桿菌DNA合成的主要酶；Ⅱ是DNA損傷修復酶；Ⅰ可能也起修復作用。第12章DNA復制3．真核生物DNA聚合酶有五種：αβεδγαβδε存在于細胞核中α可合成RNA引物，同時可在引物上聚合4-5個脫氧核糖核苷酸β可能在DNA損傷修復中起作用；ε的生理功能是修補合成，補上清除引物RNA后留下豁口（Gap）；δ是DNA復制酶；γ為線粒體DNA復制酶。第12章DNA復制4．DNA連接酶1）作用：催化鏈的未端形成共價連接可將雙鏈DNA切口處的5`-P和3`-OH生成3`--5`磷酸鍵，如環狀DNA未端的連接。第12章DNA復制5.DNA的半不連續復制一條鏈是連續的，從5`---3`方向進行，另一條鏈是不連續的，3`--5`從方向進行。稱這種DNA復制方式為半不連續復制。復制方向3355滯后鏈前導鏈第12章DNA復制第12章DNA復制6.3`--5`方向鏈的合成以5`---3`方向模板鏈為籃本，合成1000個核苷酸長度的DNA片段，從5`---3`方向進行稱這種片段為岡崎片段。這些片段由DNA連接酶連接起來，這條鏈稱為滯后鏈。3．按5`---3`方向合成（以3`---5`方向鏈為模板）的鏈稱為前導鏈，其合成總是連續的。4．岡崎片段的合成DNA聚合酶需要引物，此引物為RNA片段RNA引物由引物合成酶催化，形成幾------10個核苷酸的RNA片段。并由DNA聚合酶Ⅰ切去，由DNA連接酶將岡崎片段連成長鏈（滯后鏈）第12章DNA復制SSB第12章DNA復制第12章DNA復制第12章DNA復制第二節DNA復制機制

目的要求 了解RNA指導下DNA的合成，真核細胞DNA的復制掌握DNA復制的基本規律必須掌握原核細胞DNA的復制

重點難點 重點：DNA的復制的過程難點：DNA的復制的過程

第12章DNA復制一、DNA復制的基本規律1．復制過程是半保留的2．復制起始于特定位置，叫起點（origin）,真核生物復制時有多個起點。3．復制可以是單向的，也可以是雙向的。雙向的常見，但雙向復制時，速度不一定相等。4．DNA兩條鏈的延長方向：從5`向3`方向延長，即DNA的3`-OH與NTP的5`-P結合，每次增加一個核苷酸。5．復制是半不連續的：前導鏈連續；滯后鏈不連續，真核生物的岡崎片段為100~200個核苷酸，原核生物岡崎片段為1000~2000個核苷酸。6．DNA的合需要以RNA為引物，DNA聚合酶不能動新鏈的合成，只能催化已有鏈的延長反應。7.復制過程包括起始（initiation）、鏈延伸（chainelongation）和終止（termination），開始于固定起點，結束于一定終點，需要RNA引物，以半不連續方式合成DNA片斷，再連成完整的分子。第12章DNA復制二、原核生物DNA復制過程DNA復制過程大致可以分為復制的起始（或引發Priming），DNA鏈的延伸和DNA復制的終止三個階段。EColi染色體復制從單一復制起點開始，雙向進行到兩個復制叉相遇為止。每一個復制叉上，前導鏈和滯后鏈合成由復制體（執行DNA復制功能的多種蛋白質復合體）催化，復制體由DNA解旋蛋白，引發體和DNA復制酶Ⅲ全酶組成。第12章DNA復制(一)DNA復制的起始(引發)EColi染色體復制從單一復制起點oric開始,oric245bp序列中有四個高度保守的9bp重復單位，4個DnaA蛋白（4聚體，52kD，起始因子）結合在其上后，20~40個DnaA蛋白附加結合在4個DnaA蛋白上，引起解鏈。DnaB蛋白（6聚體，50kD）結合到開鏈oric上。先形成（DnaB：DnaC：ATP）6，它在DnaT的作用下，將DnaB送入oric，脫下DnaC，ATP水解成ADP和磷酸。此時的（DnaADnaB）稱為開鏈復合物。在DNA單鏈上加入SSB，形成原引發復合物（DnaADnaBSSB）加入一個引物酶完成引發體的形成。在加入引物酶時，解旋酶PriA在PriAB，PriC幫助上結合到引發體，形成引發體（PriADnaB引物酶）每個復制叉有一個引發體。第12章DNA復制(二)DNA鏈的延伸引發體合成RNA引物后，DNA復制酶Ⅲ全酶結合到DNA上，形成復制體，從RNA引物開始，進行DNA鏈的延伸。（引發體在DNA上的移動會清除所有DnaA）雙鏈DNA解旋，SSB加入到到單鏈DNA，NA復制酶Ⅲ全酶清除SSB，進行DNA單鏈的聚合反應滯后鏈上不斷合成RNA引物，不斷清除RNA引物并補上DNA第12章DNA復制(三)DNA復制的終止EColi上的終點為Ter點（terminator）,兩個復制叉在此相遇，復制終止。其中含有5’-GTGTGTTC序列。Tus蛋白為復制終止因子，形成Tus-Ter復合物阻止復制叉前移。第12章DNA復制三、真核生物DNA復制過程1．真核生物DNA復制只在細胞分裂周期中S期（DNA合成期）進行，復制受復制許可因子（replicationlicensingfactor）控制2.復制移動速度為1000~3000bp/min，原核生物50000bp/min3．多個復制子。由于有多個復制子，150000kbp只要幾小時即可復制。4．岡崎片斷長100~200核苷酸，原核生物為1000~2000核苷酸第12章DNA復制5．DNA聚合酶：(已講)真核生物DNA有五種：αβεδγαβδε存在于細胞核中α可合成RNA引物，同時可在引物上聚合4-5個脫氧核糖核苷酸β可能在DNA損傷修復中起作用；ε的生理功能是修補合成，補上清除引物RNA后留下豁口（Gap）；δ是DNA復制酶；γ為線粒體DNA復制酶。RP-A為單鏈DNA結合蛋白，相當于EColi的SSB第12章DNA復制DNA的體外合成---PCR聚合酶鏈式反應（PCR--PolymeraseChainReaction），

是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用于疾病病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。由美國科學家PE（PerkinElmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr.Mullis發明，由于PCRPCR技術在理論和應用上的跨時代意義，因此Mullis獲得了1993年諾貝爾化學獎。第12章DNA復制PCR過程和循環第12章DNA復制PCR參數StepTemperatureTimeduringStep194℃5minStep294℃20secStep350℃30secStep472℃40secStep525moretimestostep2Step672℃10minStep74℃24hrStep8End第12章DNA復制在試管中合成DNA時要加入什么物質，起什么作用？DNA聚合酶：催化合成反應DNA：作為合成的模板，決定DNA的堿基順序短鏈DNA：引物dATPdCTPdGTPdTTP:合成的底物，不能以相應的二磷酸或一磷酸化合物取代第12章DNA復制幾個重要概念1．DNA指導下RNA的合成稱為：轉錄。2．轉錄單位：RNA鏈的轉錄起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點終止，此區域稱為轉錄單位。3．一個轉錄單位可以是一個基因，也可以是多個基因。4．轉錄的開始是由DNA的啟動子（promoter）控制。5．終止子：控制終止的部位（terminator）6．催化轉錄的酶：RNA聚合酶第12章DNA復制四、RNA指導下DNA的合成

（逆向轉錄reversetranscription）（一）逆轉錄酶（reversetranscriptase）又稱RNA指導的DNA聚合酶。是以RNA為模板合成DNA的酶。含兩個亞基，a亞基是b亞基水解產生的。含鋅。要求有模板和不少于四個核苷酸的引物，由5’向3’合成DNA。真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作為模板。此酶有多種功能，可先合成DNA－RNA雜合分子，再水解RNA（RNA酶H活力），然后復制其互補鏈，形成雙鏈DNA。第12章DNA復制逆轉錄酶（reversetranscriptase）這種酶是1970年美國科學家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別于動物致癌RNA病毒中發現的，他們并因此獲得1975年度諾貝爾生理學或醫學獎。當RNA致癌病毒，如鳥類勞氏肉瘤病毒（Roussar-comavirus）進入宿主細胞后，其逆轉錄酶先催化合成與病毒RNA互補的DNA單鏈，繼而復制出雙螺旋DNA，并經另一種病毒酶的作用整合到宿主的染色體DNA中，此整合的DNA可能潛伏（不表達）數代，待遇適合的條件時被激活，利用宿主的酶系統轉錄成相應的RNA，其中一部分作為病毒的遺傳物質，另一部分則作為mRNA翻譯成病毒特有的蛋白質。最后，RNA和蛋白質被組裝成新的病毒粒子。在一定的條件下，整合的DNA也可使細胞轉化成癌細胞。第12章DNA復制（二）逆轉錄過程：

含有逆轉錄酶的病毒叫做反轉錄病毒，逆轉錄酶催化的反應叫反轉錄（reve-rsetranscrip-tion）。在這個過程中，遺傳信息流動的方向是從RNA到DNA，正好與轉錄過程相反，故稱反轉錄。第12章DNA復制（三）意義1．逆轉錄與細胞惡性轉化有關，為腫瘤的研究和防治提供了重要線索。艾滋病、乙肝等也有逆轉錄過程。2．逆轉錄病毒經過改造，可作為信息載體，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。真核生物的基因組中多含逆假基因，可能是信使RNA經逆轉錄而整合到基因組中的。所以真核生物正常細胞也存在逆轉錄過程。第12章DNA復制第三節RNA生物合成

目的要求 了解RNA的復制，真核細胞RNA聚合酶理解RNA的轉錄后加工掌握原核細胞中RNA在DNA指導下的合成及有關酶

重點難點 重點：原核細胞中RNA在DNA指導下的合成及有關酶，RNA的轉錄后加工難點：真核細胞RNA聚合酶，原核細胞中RNA在DNA指導下的合成及有關酶，RNA的轉錄后加工

第12章DNA復制一、DNA指導的RNA聚合酶（DNAdurectedRNApolymerase）1．反應條件：1）以ATP、GTP、CTP和UTP為底物2）適當的DNA為模板3）Mg2+能促進聚合反應4）合成方向5`---3`（聚合3—5磷酸鍵5`pX3----5`pX3）且反應可逆，Ppi分解推動反應趨向聚合5）不需要引物，直接在模板上合成RNA第12章DNA復制2．產物RNA的組成取決于模板DNA的性質實驗證明產生RNA的堿基比例與模板DNA堿基比例基本一致（TMP為UMP代替）分子雜交試驗的證明：合成的RNA用放射性P標記，與模板DNA一起加熱，使DNA解鏈，再緩慢冷卻，可形成RNA/DNA雜交體。而加入非模板DNA，則不能形成雜交體。說明RNA分子是以模板DNA的堿基順序為基礎，在其上合成的。第12章DNA復制3．RNA兩條鏈的作用1）在體外（試管中），兩條鏈都可轉錄（不正常）2）在體內：（1）僅有一條鏈可以轉錄。（2）或某些區域可以從一條鏈轉錄，另外的區域由另一條鏈轉錄。（3）對應的鏈只有復制的功能，不能轉錄。即在體內轉錄時，RNA聚合物有選擇作用，可挑選正確的鏈及鏈上的區域進行復制。第12章DNA復制4．DNA的狀態1）轉錄時的全保留：以天然雙鏈DNA為模板，用RNA聚合酶轉錄RNA時，將DNA在轉錄部位局部解開，以其中的一條為模板進行RNA轉錄，合成出與其互補的RNA鏈。然后脫下合成的RNA鏈，解開的兩條DNA鏈重新形成雙螺旋結構。-----DN全保留2）天然雙鏈DNA比單鏈DNA（變性的）更有效因為RNA合成時，DNA全保留。第12章DNA復制5．RNA聚合酶的組成例1：大腸桿菌RNA聚合酶的分子量為46萬。由五個亞基α2ββ`σ組成，還有一個ω亞基，很小。有2個Zn原子，它們結合在亞基上。1）核心酶：沒有σ亞基的酶（α2ββ`）它只能使已開始合成的RNA鏈延長，但不能起始合成RNA2）σ亞基為起始因子，開始合成RNA鏈時，RNA聚合酶中必須含有σ亞基（以全酶形式存在）。第12章DNA復制3）各亞基作用（1）α未知（2）ω未知（3）β與DNA模板結合（4）β`起始和催化部位（5）σ起始作用第12章DNA復制4）RNA聚合酶的作用在細菌中，mRNA，rRNA和tRNA都由一種RNA聚合酶合成。5）轉錄過程例1：真核生物中RNA聚合酶A，存在于核仁中，催化rRNA前體；RNA聚合酶B，存在于核仁中，催化mRNA前體；RNA聚合酶C，存在于核仁中，催化小分子RNA前體（tRNA和5SRNA）；（A、B、C的分類可按與α-鵝膏蕈堿的作用來進行：

A敏感；B對低濃度的敏感；C高濃度敏感）例2：在線粒體和葉綠體中，也存在RNA聚合酶第12章DNA復制二、啟動子和轉錄因子1．啟動子：RNA聚合酶在模板DNA上識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。2．轉錄因子：RNA聚合酶在轉錄時需要的一些蛋白質稱為轉錄因子。第12章DNA復制3．酶的結合區域——起始區域—保護區域RNA5`-P3`--OHDNA5`-P3`--OH正鏈DNA3`-OH5`-P負鏈-50+20轉錄區+1Startpoint上游下游保護區域-1轉錄RNA的方向是5`-

3`OH第12章DNA復制DNA的兩條單鏈與mRNA序列相同的DNA鏈為正鏈（編碼鏈），其方向為5`-

3`OH另一條鏈為負鏈（互補鏈、模板），方向為3`-

5`P規定轉錄單位的起點（startpoint）核苷酸為+1從轉錄近端向遠端（3`

5`）計數起點的左側為上游，起點前第一個核苷酸為-1起點右側為下游，為轉錄區用足跡法測定的RNA聚合酶保護區域為-50~~~~+20第12章DNA復制4．啟動子的結構比較已知啟動子的結構，找出其共同的共有序列（保護序列consensussequence）第12章DNA復制例：大腸桿菌基因組為4.7*106bp信號序列最短為412bp(412bp=1.68*107bp>基因組4.7*106bp)信號序列不一定連續，分開距離本身也提供一定信號。1）pribnow框(box)，或-10序列在起點上游的-10處的一個保守序列：TATAAT,長6bp2)識別區或-35序列中心在上游-35處的保守序列：TTGAC，長6bp3）作用：-35序列提供RNA酶識別信號-10序列有助于DNA局部雙鏈解開（多為A=T對，只有一個G-C對）-35~~~-10方向為轉錄方向（由于啟動子是不對稱的，所以轉錄是有方向性的）第12章DNA復制例：真核生物中RNA酶B（轉錄mRNA）啟動子有三個保守區1）TATA框（hogness）中心在-25~-30，長7bp的序列，其堿基頻率為T82A97A85A63/T37A83A50/T37它決定轉錄起點。2）CAAT框在-75的9bp序列，為GGT/CCAATCT與RNA聚合酶的結合有關。3）更上游有GC框長6bp，可與轉錄因子結合，為GGGCGG第12章DNA復制三．終止子和終止因子1．終止子：提供轉錄停止信號的DNA序列。2．終止因子：協助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質，如Rho因子）3．抗終止因子：引起抗終止作用的蛋白質。4．通讀：抗終止因子可阻止終止子的作用，使酶越過終止子繼續轉錄，這稱為通讀。第12章DNA復制5．Rho因子：Rho因子：分子量為55000的蛋白質，在RNA存在進能水解NTP，即它具有依賴于RNA的NTP水解活力。它結合在新產生的RNA鏈上，利用水解NTP得到的能量推動其沿RNA鏈移動（在RNA聚合酶之后）當RNA聚合酶遇到終止子暫停時，Rho因子追上酶，并與酶相互作用，釋放RNA，使RNA酶與Rho因子一起從DNA上脫下。（它具有RNA-DNA解螺旋酶作用）第12章DNA復制6．大腸桿菌E.coli中的終止因子1）簡單終止子或不依賴于Rho（ρ）因子的終止子在終止點前有一回文結構，形成由莖環構成的發夾結構；在發夾與終點之前有6個UMP，提供信號使RNA聚合酶脫離；回文對稱區有G-C序列。2）依賴于Rho的終止子其終止點前有一個較小的發夾結構，回文區不富有G-C；在發夾與終止點之前也無U序列；需要有Rho（ρ）因子的協助進行終止作用。第12章DNA復制四、RNA的成熟（轉錄后加工）由RNA聚合酶合成的原初轉錄物需一系列的變化，包括鏈的裂解、5`端和3`端的切除、特殊結構的形成、堿基修飾、糖苷鍵的改變和拼接等過程，變成成熟的（有活性的）RNA分子。斷裂基因：真核生物的基團多被居間序列（內含子）分隔開，成為一個一個外顯子。轉錄后的長鏈要剪切拼接，除去內含子的轉錄產物。第12章DNA復制（一）．原核生物中RNA的加工1．rRNA前體的加