免疫學實驗

實驗一與免疫有關細胞形態觀測

目規定：

觀測與免疫有美幾種細胞形態，理解它們在機體免疫反映中作用。

實驗器材：

顯微鏡

血液涂片(瑞氏染色)

結締組織切片

辦法：

油鏡觀測

一.血涂片觀測

(A)紅細胞：淡紅色，無核圓形細胞，因紅血球為雙凹形，故邊沿

某些染色較深，中心較淺，直徑7—8微米。

(B)顆粒白血球

嗜中性顆粒白血球：體積略不不大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉

狀，可分1—5葉，核葉之間聯以染色質細絲，染色質染成粉色，其中布滿

細小大小均勻顆粒被染成紫紅色。直徑1()一12微米。

嗜酸性顆粒白血球：略不不大于嗜中白血球，細胞核染成紫色，普通

為2葉，胞質布滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑10—15微米。

嗜堿性顆粒白血球：體積略不大于嗜酸性白血球，細胞質中有大小不

等被染成紫色顆粒，顆粒數日較嗜酸性白血球顆粒少，核為1—2葉染成淡

蘭色。直徑10—11微米。

（C）無顆粒白血球

淋巴細胞：涂片中可觀測到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅血球大小

相似，圓形。其中含致密核，染成深紫色。周邊僅有一薄層嗜磴性染成淡

藍細胞質。中淋巴細胞較大，有較寬層細胞，核圓形。6-8微米。

單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質染成灰藍色。核呈腎形或馬蹄

形，染色略淺于淋巴細胞核。直徑14-20微米。

二.肥大細胞觀測（示教）

胞體較大，呈卵圓形，胞質內布滿粗大均等嗜磴性顆粒。其中含肝素、

組織胺等物質。常成群地分布于血管周邊。

三.漿細胞觀測（示教）

細胞呈圓形或卵圓形，胞質豐富，呈嗜磴性。核圓形，著色深，多偏

于細胞一側，染色質核膜呈車輪分布。正常組織漿細胞少，慢性炎癥時增

多。漿細胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。

四.巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態不規則。常伸出短而鈍突起,

有很強吞噬能力。

附：

瑞特氏染色：

1.染色液配備

稱取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醛中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配

備時，要先將瑞特氏染料置研缽體內邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。）

2.瑞特氏染色法:

取小鼠骨動脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側劃線（限制

染液流掉）。于劃線內部滴加染液3-4滴，經3-5分鐘后，再滴加等量蒸儲

水，輕輕晃動混合。經5分鐘后，用蒸儲水洗凈，待干后用油鏡檢查。

實驗二沉淀反映

可溶性抗原與相應抗體混合，在電解質存在條件下，兩者比例適合，

即可有沉淀物浮現，叫沉淀反映（Precipitation）.由于沉淀反映抗原多系膠

體溶液。沉淀物重要是由抗體蛋白所構成。

為了求得抗原與抗體適當比例，保證有足夠抗體，并且抗原分子小，

具備較大反映面積，因而操作上普通是稀釋抗原，不稀釋抗體。

沉淀反映種類有環狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免疫電

泳等。此外尚有放射性同位素標記、酶標記等測定法。

（一）環狀沉淀反映

當抗原與相應抗體形成一種接觸面時，如兩者比例恰當，接觸面上可

形成一種乳白色環狀物即為陽性沉淀反映。

材料：

1.免疫血清：免疫兔抗人血清

2.抗原：人血清

3.小沉淀管、毛細吸管、橡皮頭、生理鹽水。

辦法：

1.取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約0.2毫升，加入第

辦法:

1.將恰當稀釋(事先滴定)診斷血清與予溶化2%瓊脂在60C水浴預

熱數分鐘后等量混合均勻制成免疫瓊脂板。

2.在免疫瓊脂板上按一定距離(1.2-1.5厘米)打孔，見圖1。

OOOOOOOOO

123456789

圖1單向瓊脂擴散實驗抗原孔位置示意圖

1-5孔加參照血清，6-7孔加待檢血清

3.向孔內滴加1：2,1：4,1：8,1：16,1：32稀釋參照血清及1：

10稀釋待檢血清，每孔10微升，此時加入抗原液面應與瓊脂板一平，不

得外溢。

4.已經加樣免疫瓊脂板置濕盒中37c溫箱擴散24小時。

5.測定各孔形成沉淀環直徑(mm),用參照血清各稀釋度測定值繪出原

則曲線，再由原則曲線查出被檢血清中免疫球蛋白含量。

(2)雙向瓊脂擴散實驗

材料：

1.診斷血清：兔抗人血清

2.待測血清：人血清

3.陰性對照血清

4.其他：生理鹽水、瓊脂粉、載玻片、打孔器、微量進樣器等。

辦法:

1.取一清潔載玻片，傾注3.5—4.0毫升加熱熔化1%食鹽瓊脂制成瓊

脂板。

2.凝固后，用直徑3毫米打孔器，孔間距為5毫米。孔排列方式如圖

2所示。

0

°0O

°oO

圖2雙向瓊脂擴散原抗體孔位置示意圖

3.用微量進樣器于中央孔加抗體，于周邊孔加各種抗原。加樣時勿使

樣品外溢或在邊沿殘存小氣泡，以免影響擴散成果。

4.加樣后瓊脂板收入濕盒內置37℃溫箱中擴散24-48小時。

5.成果觀測：若凝膠中抗原抗體是特異性，則形成抗原一抗體復合物,

在兩孔之間浮現一清晰致密白色沉淀線，為陽性反映。若在72小時仍未浮

現沉淀線則為陰性反映。實驗時至少要做一陽性對照。浮現陽性對照與被

檢樣品沉淀線發生融合，才干擬定待檢樣品為真正陽性。

6.成果分析：瓊脂擴散成果受許多因素影響。

①抗原特異性與沉淀線形狀關系：在相鄰兩完全相似抗原與抗體反映

時，則可浮現兩單沉淀線融合。反之，如相鄰抗原完全不同步，則浮現沉

淀線之交叉；兩種抗原某些相似時，則浮現沉淀線某些融合。見圖3。

圖3雙擴散實驗成果示意圖

A：已知抗體a、b：陽性對照

c、d、e、f：被檢材料

②抗原濃度與沉淀先導形狀關系：兩相鄰抗原濃度相似，形成對稱相

融合沉淀線；如果兩抗原濃度不同，則沉淀線不對稱，移向低濃度一邊。

見圖4。

圖4抗原特異性與沉淀線形狀關系

a、b：抗體A、A\B：抗原

A、B完全不同A、A，某些相似

③溫度對沉淀線影響：在一定范疇內，溫度擴散快。普通反映在0-37C

下進行。在雙向擴散時，為了減少沉淀線變形并保持其清晰度，可在37℃

下形成沉淀線，然后置于室溫或冰箱(4℃)中為佳。

④瓊脂濃度對沉淀線形成速度影響：普通來說，瓊脂濃度越大，沉淀

線浮現越慢。

⑤參加擴散抗原與抗體間距離對沉淀線形成影響：抗原、抗體相距越

遠，沉淀線形成越慢，因此在微量玻片法時，孔間距離以0.25-0.5cm為好,

距離遠影響反映速度。固然孔距過遠，沉淀線密度過大，容易發生融合，

有礙對沉淀線數目擬定。

⑥時間對沉淀線影響：沉淀線形成普通在1-3天浮現，14-21天浮現數

目最多。玻片法可在1-2小時浮現，普通觀測72小時，放量過久可浮現沉

淀線重疊消失。

（三）對流免疫電泳實驗

對流免疫電泳是在瓊脂擴散基本上結合電泳技術而建立一種簡便而迅

速辦法。此辦法能在短時間內浮現成果，故可用于迅速診斷，敏感性比雙

向擴散技術高10-15倍。

血清蛋白在PH8.6條件下帶負電荷，因此在電場作用下都向E極移動。

但由于抗體分子在這樣PH條件下只帶薄弱負電荷，并且它分子量又較大

（為r球蛋白）。因此游動慢。更重要是抗體分子受電滲作用影響較大，也

就是說點滲作用不大大于它自身遷移率。所謂電滲作用是指在電場中溶液

對于一種固定固體相對移動。瓊脂是一種酸性物質，在堿性緩沖液中進行

電泳，它帶有負電荷，而與瓊脂相接觸水溶液就帶正電荷，這樣液體便向

負極移動。抗體分子就是隨著帶正電荷液體向負極移動。而普通蛋白質（如

血清抗原）也受電滲作用影響，使泳動速度減慢，但它電泳遷移率遠遠不

不大于電滲作用。這樣抗原體就達到了定向對流，在兩者相遇且比例適當

時便形成肉眼可見沉淀線。

材料:

1.診斷血清：免抗人免疫血清

2.待檢血清：人血清

3.陰性對照血清

4.PH8.6,離子強度0.05M巴比妥緩沖液配備

巴比妥鈉10.3克

巴比妥1.84克

蒸儲水1()0()毫升

5.緩沖瓊脂板:將純化瓊脂用PH8.6離子強度().025巴比妥緩沖液(用

0.05M巴比妥緩沖液稀釋一倍即可)配成1.5%瓊脂，加入0.()1-0.02%流柳

汞防腐，保存冰箱內備用。

6.電泳儀

7.其她：生理鹽水、打孔器、微量進樣器。

辦法：

1.瓊脂板制備依照需要可選用大玻板(6厘米X9厘米)和(小玻片D

兩種。大玻板約需瓊脂1()亳升，小玻片約需3.5亳升，凝固后按圖打孔，

辦法同瓊脂擴散實驗。

2.加樣：左側孔內加患者血清(原血清及10倍稀釋血清各占一孔),

右側內加抗血清，每片應有陽性對照。

0000

O00O

OO00

抗抗抗抗

原體原體

圖5對流免疫電泳抗原孔、抗體孔位置示意圖

3.電泳

用國產普通電泳儀。其內力口().()5mPH8.6巴比妥緩沖液，加至電泳槽高

度三分之二處，注意兩槽內液面盡量水平。將加好樣品玻板置于電泳槽上，

抗原端接負極，抗體端接正極，用2—4層濾紙浸濕作鹽橋，濾紙與瓊脂板

聯接處為().5厘米。以板寬度計算電流，以板長度計算電壓。規定電流量

為2—3亳安/厘米，即大板為20毫安，小板為1()毫安。電壓為4—6伏/

厘米。通電45分鐘一2小時后觀測成果。

4.成果觀測；在黑色背景.上方，用散射光各種角度觀測，在對孔之間

有白色沉淀線即為陽性對照應浮現明顯白色沉淀線。如果抗原，兩極微沉

淀條紋不清晰，于37℃保溫數小時可增強沉淀條紋清晰度。

5.影響成果因素

(1)抗原抗體比例：抗原抗體比例適應時容易浮現沉淀帶，反之不

易發生。當抗體濃度恒定期，被檢血清含甲胎蛋白濃度高時，作10倍、20

倍或更高倍數稀釋可以提高陽性率。隨稀釋度增長，抗原抗體比例發生變

化，沉淀線由接近抗血清孔向逐漸移向兩孔中間，并可浮現不典型沉淀線

如弧形、八字須形、斜線形，這些也是陽性，應予注意。

(2)幾組電泳緩沖液其電泳成果以巴比妥鈉一鹽酸緩沖液敏捷度

最高。巴比妥一巴比妥鈉次之。Tris緩沖液更差。

(3)電壓與電流時電泳時間需要長些：電壓電流增大時，電泳時間

可更短。但電壓過高則孔徑變形，電流過大抗原抗體蛋白易變性，干擾實

驗成果。普通選取每厘米5毫升，電泳時間改為1.5小時。

(四)免疫電泳實驗

免疫電泳實驗是先將抗原物質在瓊脂凝膠中做電泳分離，然后于凝膠

槽中加入抗體血清。使抗原抗體進行雙向擴散，在比例適當部位形成特異

抗原抗體沉淀弧線。每條沉淀弧線代表一組抗原抗體復合物，故可用抗原

成分分析；且可以依照其遷移率與抗體所浮現特異反映進行鑒定。

材料：

1.待檢標本(抗原)：正常人血清。

2.抗體：正常人血清家兔免疫血清。

3.1.5%離子瓊脂(系用巴比妥緩沖液配制)

4.電泳儀

5.巴比妥緩沖液：

巴比妥1.84克

巴比妥鈉10.3克

蒸憎水1000毫升

pH8.6,離子強度(M)0.05

6.其他：載物玻片，直徑3毫米打孔器，20mmx2mm玻璃鑄型，微

量進樣器。

辦法：

L取載物玻片17.5x2.5厘米）加上3.5毫升1.5%瓊脂凝膠,制成2

毫米厚瓊脂板。

2.按圖位置，在瓊脂板未凝固時，放入抗血清槽鑄型，注意勿使鑄型

所有浸入瓊脂中，待凝固時再打孔。

3.加待檢標本：用微量進樣器往孔中加1一5微升。

4.電泳：電壓9一7伏/厘米，泳動15—20小時。

5.電泳后取出抗血清槽鑄型，加入抗血涓，進行雙擴散，普通在24

小時內沉淀弧出全。

6.觀測成果：或描繪、拍照或進行染色，染色后標本便于成果分析及

保存。

O------M

IT-Ab

OA，

圖6免疫電泳抗原孔和抗體槽位置示意圖

（五）火箭電泳實驗

火箭電泳實際是一種定量免疫電泳。其原理為：在電場作用下，抗原

在含定量抗體瓊脂介質中泳動，兩者比例在適當時在較短時間內形成狀似

火箭或錐形沉淀線，而此沉淀線高度常與抗原量成正比關系，因而本法可

以測定樣品中抗原含量。

材料：

1.診斷血清（抗體）：抗人IgG或IgA免疫血清

2.待檢血清（抗原）：人血清

3.參照血清

4.pH8.6,離子強度0.05M巴比妥緩沖液配制（見對流免疫電泳實驗）

5.其他：瓊脂粉，微量進樣器，打孔器，玻璃板，電泳儀

辦法：

1.抗體瓊脂板制備

同單向擴散法，但注意稀釋液應用pH8.6離子強度0.05M巴比妥緩沖

液。

2.打孔見下圖

o

o

o

O

O

圖7火箭電泳抗原孔位置圖

3.將用緩沖液稀釋適當濃度參照血清及恰當稀釋抗原（人血清）分別

加入各孔中，每孔10或2（）微升，規定加量精確而不外溢。

4.把加完樣免疫瓊脂板放入電泳槽中進行電泳，電壓4一6伏/厘米，

電泳時間1-5小時，直到大某些抗原孔前端浮現頂端尖窄而完全閉合火箭

狀沉淀線，關閉電源。

5.取下瓊脂板，以抗原孔中心為起點，量出各火箭狀沉淀線高度。同

單向瓊脂擴散法繪制原則曲線，查出待檢血清中1g含量。

實驗三凝集反映

當顆粒性抗原與其相應抗血清混合時，在有一定濃度電解質環境中，

抗原凝集成大小不等凝集塊，叫做凝集反映。

凝集反映廣泛地應用于疾病診斷和各種抗原性質分析。即可用己知免

疫血清來檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測特異性抗體。

一.直接凝集反映

顆粒抗原與抗體直接結合浮現凝集現象叫直接凝集反映。

（一）玻片凝集反映

材料：

I.診斷血清：1：10稀釋傷寒桿菌診斷血清

2.菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌24小時瓊脂斜面培養物

3.生理鹽水、載玻片、毛細吸管

辦法：

1.取清潔玻片一張，用蠟筆劃為三格，并注明號碼。無菌操作下，用

接種環于1、2格內加1：1（）稀釋傷寒桿菌診斷血清1-2滴，第三格加1-2

滴生理鹽水。

2.無菌操作下，用接種環取傷寒桿菌培養物少量，混于第三格中，再

混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，由于這樣將使診斷血清混入

鹽水而影響對照成臭），將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時取

菌量不可過多，使懸液呈輕度乳濁即可。

3.同法取枯草桿菌培養物少量，于第二格內混勻。

4.輕輕搖動玻片，經1-2分鐘后肉眼觀測，浮現乳白色凝集塊者，即

為陽性反映；仍為三等乳濁液者，即為陰性反映。如成果不夠清晰，可將

玻片放于低倍顯微鏡下觀測。

（二）試管凝集反映

為一種定量實驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相

對含量。

材料:

1.診斷血清1：10稀釋傷寒桿菌“H”血清，1：10稀釋傷寒桿菌“0”

血清。

2.菌液：傷寒桿菌“H”菌液，傷寒桿菌菌液。

3.生理鹽水，小試管，吸管。

辦法：

1.取干凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆

注明號碼，于每管中分別加入0.5毫升生理鹽水。

2.在第1排1管中加入1：10稀釋傷寒H血清（）.5毫升，于管內持續

吹吸3次，使血清與鹽水充分混合，而后吸出（）.5亳升注入第2管，同徉

予以混勻后吸出（）.5毫升注入第3管。依次類推，稀釋到第6管，自第6

管吸出（）.5亳升棄去。此時，自第1管至第6管血清稀釋倍數為1：20,1：

40,1：8（）,1：160,1：320,1：640o第7管不加血清作為對照。

3.同法用吸管吸取1：10稀釋傷寒桿菌O血清加入第2排第1管，

并依次如上法予以稀釋。

4.用移液管吸取傷寒桿菌H菌液,加收第1排各管中每管0.5毫升（由

鹽水對照管開始，依次由后向前加入）此時血清稀釋倍數又增長了一倍。

5.同法于第2排各管中加入傷寒。菌液0.5毫升。

6.將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜

次日取出觀測成果。

觀測成果：

1.觀測切勿搖動試管，以免凝集塊分散。

2.先看對照管，此管應無凝集現象，管內液體仍成混濁狀態。但如放

置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反映。

3.實驗管應自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小圓片狀邊

沿不整潔凝集物，上清則澄清透明或不同限度混濁。凝集強弱可用“+”

號表達如下：

“++++”凝集很強，管內液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底；

“+++”凝集強，管內液體不完全澄清稍有輕度混濁，凝集塊沉于管底;

“++”凝集中檔強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；

“+”凝集弱，管內液體混濁，少量凝集塊沉于管底；

“一”不凝集，管內液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。

4.輕輕振蕩各管，觀測凝集塊狀態，對照管細菌在振蕩時呈煙霧狀上

升，隨后消散，細菌分散仍呈混濁狀態。“H”菌液凝集塊疏松呈棉狀，大

片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎。“O”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于

管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。

5.記錄觀測成果并制定凝集效價。普通以能產生明顯凝集（++）血

清大稀釋倍數作為該血清凝集效價。如血清最低稀釋度（即第1管1：40）

仍無凝集應報告為低于1：40。如血清最高稀釋度（即第6管1：1280），乃

顯完全凝集現象。，應報該血清效價高于1：1280。

二.間接凝集反映

將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關顆粒載體上，然后與相應抗體

結合，也可浮現顆粒載體凝集現象，稱為間接凝集反映。間接凝集反映

比直接凝集反映敏感性為高，可用于微量抗體或抗原檢查。

（一）間接血球凝集實驗

間接血球凝集實驗是依照紅血球表面吸附作用而建立起來。將細菌可

溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血球

這種致敏紅血球具各細菌抗原性，與相應抗血清相遇可產生凝集現象。

間接血凝抗原制備可用加堿或加熱辦法使菌體中多糖物質浸出，去除

類脂以免干擾紅血球吸附作用。但如系蛋白質時則用來吸附紅血球需先用

糅酸予以解決。

材料：

I.抗原一傷寒桿菌O抗原

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等

辦法：

1.抗原制備：

將每毫升100億傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離心

沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。

2.致敏紅血球懸液制備：

取一定稀釋度抗原加等量2.5%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱

中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經2小時。然后取出，用生理鹽水洗滌

3次，而配制成0.5%懸液即成。

3.實驗環節：

（1）小試管9只標好號碼于試管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理鹽水，別的各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加熱滅菌免疫血清0.1毫升加入第1管，混勻后吸

取0.5毫升注入第2管，同樣第2管血清與鹽水混勻后吸取0.5毫升注入第

3管。如此依次稀釋直至第8管。自第8管吸出0.5毫升棄去。第9管不加

血清作對照。

（4）于每管加入0.5毫升己經致敏0.5%綿羊紅血球懸液，混勻后放

入37℃水浴中2小時后觀測成果。凡最高血清稀釋度免疫血清試管中呈現

完全血凝者，即為該血清間接血清效價。

（二）間接凝集抑制實驗

若使可溶性抗原與相應抗體先混合，充分作用后再加入關于免疫微球,

因抗體已被可溶性抗原結合，不再浮現免疫微球被動凝集現象，叫間接凝

集抑制實驗，臨床化驗檢查中慣用免疫妊娠實驗就是一種間接凝集抑制實

驗。

妊娠實驗：

孕婦尿中絨毛膜促性腺激素含量比正常尿高。因而當往尿中加入抗絨

毛膜促性腺激素抗體時，由于發生抗原抗體反映成果，抗體被消耗，此時

再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素聚苯乙烯乳膠顆

粒）。不發生反映，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠實驗陽性。反之，被檢尿

中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）局限性以把加入抗體消耗，當

膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結合發生反映。浮現均勻細小顆粒，妊娠

實驗為陰性。

材料:

I.抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素聚苯乙烯抗原

2.抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清

3.被檢材料：孕婦尿

4.正常尿作對照用

5.黑反映板1塊

6.滴管3只

辦法：

1.用清潔滴管在反映板上滴加一滴被檢尿。

2.再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。

3.滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀測成

果。浮現均勻一致細小顆粒為陰性反映，懷孕。

注意事項：

1.實驗材料用品用前使溫度接近室溫（20℃左右）

2.被檢尿太混濁，需要小心過濾。

3.尿中有蛋白及血液時，不適當進行此實驗。

（三）協同凝集實驗

金黃色葡萄球菌細胞壁成分中A蛋白能與人及各種哺乳動物（豬、兔、

羊、鼠等）血清中IgG類抗體Fc段結合。IgGFe段與SpA結合后，兩個

Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其與特異性抗

原相遇時，也浮現特異凝集現象。在以凝集反映中，金黃色葡萄球菌菌體

成了IgG抗體載體，稱為協同凝集反映.本反映也可用于檢測微量抗原.

A.材料:

1.抗原:可溶性傷寒桿菌0抗原

2.免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清

3.10%CoWan1株金黃色葡萄球菌(含大量蛋白A)菌液

4.PBS0.5%甲醛PBS,吸管、滴管、玻片等

B.辦法：

1.1()%葡萄球菌菌懸液制備：CoWan1株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37c

培養18-24小時，用PBS洗下菌苔,每分鐘2500轉速度離心20分鐘。沉

淀菌用PBS洗兩次后，用0.5%甲醛(用PBS配備)在室溫中固定3小時。

置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體自源性分解酶。再用PBS洗滌2次后

配成1()%菌懸液。

2.致敏葡萄球菌：

1亳升1()%菌懸液加().1亳升傷寒O抗血清充分混合放入37℃水浴中

30分鐘(中間需搖動兩次)。取出后經每分鐘2500轉速度離心后分鐘,

棄去上清液，沉淀茵用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。

3.協同凝集實臉

①取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上

混勻，觀測約2分鐘。普通在幾秒鐘內即可發生凝集。

②滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片匕用接種環取傷寒O菌培養物少

量置于懸液中使成均勻孔狀，觀測約2分鐘，記錄有無凝集。

③用傷寒“O”桿菌培養物與未致敏葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養物

與致敏葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反映，不浮現凝集。

三.凝集吸取

腸道桿菌中許多細菌均有某些相似抗原構造。因之一種細菌可與另一

種細菌相應抗血清發生交叉凝集反映。用一種過量細菌抗原與發生交又凝

集反映抗血清相結合。可將其共同抗體吸去，剩余抗體只能與特異性抗原

起反映，這種實驗即稱凝集吸取實驗。

運用凝集吸取實驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原構造分析及

鑒定菌型。

材料：

1.免疫血清：1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清。

2.菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液，

3.試管、吸管、毛細吸管。

辦法：

1.1/10稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進行玻片

凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，闡明二菌具備共同抗原構造,

故發生交叉凝集反映。

2.將一定量腸炎桿菌菌液加入1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清中，放

37c水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。

3.將吸取過上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀測成果。如

仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進行吸取，辦法如上。

4.重復吸取過上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進行玻片

凝集。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表達傷寒桿菌免疫血清中抗腸

炎抗體已被完全吸取。

實驗四溶血反映和補體結合實驗

一.溶血反映

免疫血清與其相應抗原細胞（血球、細菌及其組織細胞相遇，并在補

體參加下可浮現溶細胞反映。依抗原、抗體種類不同可有溶血反映、溶菌

反映等。

溶菌反映只在某些細菌中浮現（如霍亂弧菌）。應用溶血反映是補體結

合反映中不可少因素。溶血反映是由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）

進行特異性結合，并吸著了補體，而使紅血球在補體作用下被溶解，于是

產生了溶血現象。

材料:

1.抗原：2%綿羊紅血球。

2.抗體：溶血素

3.補體：取健康豚鼠血清作為補體。

4.小試管、生理鹽水、水浴箱。

辦法：

1.取小試管3只，按下表加入各物（容量單位為毫升）

試管2%紅血球溶血素（2單位）補體（2單位）生理鹽水成果

10.5().50.5().5

20.4().5—1.0

3().5—().51.()

2.將上述3試管放在37℃水浴箱內15—30分鐘觀測有無凝血現象。

二.補體結合反映

當抗原與其相應抗體結合時，所生成抗原抗體復合物能從溶液中將補

體吸著此即謂補體結合。參加補體結合反映抗原是透明溶液，故補體結合

現象不能被肉眼看巴來，因而必要借助溶血系統（溶血素及相相應羊血球）

作為批示劑，來鑒定媒質中有無游離補體，近而推定媒質中未知抗原（或

抗體）和已知抗體（或抗原）與否進行了特異性結合。本反映具備很高敏

感性及特異性，因之常應用于傳染病診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。

由于參加本反映各種成分間有著一定量關系，因而在作本實驗之前,

必要通過一系列預各實驗來擬定各成分使用量，故本反映實驗辦法較為復

雜。

本次實驗以傷寒桿菌免疫血清與其相相應抗原補體結合實驗為例。

材料：

1.抗原：傷寒抽出液

2.抗體：傷寒桿菌免疫血清

3.補體：豚鼠血清

4.溶血素：抗綿羊血細胞兔血清

5.2%綿羊紅血球

6.小試管、試管架、水浴鍋。

辦法：

（一）預備實驗（示教闡明）

預備實驗涉及溶血素效價滴定，補體效價滴定，抗原效價滴定及被檢

血清解決。

（1）溶血素效價滴定

按照下表加入各物

管號溶血素溶血素1：2（）生理2%羊血假定成果

（ml）稀釋倍數補體（ml）鹽水（ml）球（ml）

10.51：3000.31.70.5搖全溶解

20.51：5000.31.70.5勻全溶解

30.51：8000.31.70.5后全溶解

40.51：10000.31.70.5置全溶解

37

50.51：12000.31.70.5全溶解

℃

60.51：16000.31.70.5全溶解

水

70.51：0.31.70.5全溶解

浴

80.51：24000.31.70.5全溶解

90.51：3200().31.70.5全溶解

小

100.51：40000.31.70.5

時

110.51：48000.31.70.5

120.51：60000.31.70.5

對照10.32.20.5

凡最高稀釋度溶血素可呈現完全溶血者為一種單位。依上表成果第10

管(即1：4000倍稀釋)0.5毫升溶血素為一種單位，在溶血反映中慣用

0.5毫升中具有2個溶血素單位溶液，因此實驗時應取1：倍稀釋溶液。

(2)補體單位滴定

依下表加入各試劑:

補體生理置溶血素2%羊血置

管抗原

(1：20)鹽水于(2單位)球懸液于成果

號(ml)

(ml)(ml)37(ml)(ml)37

10.200.51.30℃0.50.5℃不溶血

20.250.51.25水0.50.5水稍溶血

30.300.51.20浴0.50.5浴全溶血

40.350.51.15450.50.515全溶血

50.400.51.10分0.50.5分全溶血

60.450.51.05鐘0.50.5鐘全溶血

70.500.51.000.50.5全溶血

8—0.51.500.50.5不溶血

能引起完全溶Itl最小補體量稱為精確單位，上表中第3管（即0.3毫

升），但因補體效價也許有某些損失，故普通稍高一管為實用單位，實際實

驗時須用兩個實用單位。

上表成果為：

補體原則單位：0.3毫升

補體實用單位：0.35毫升

補體兩個實用單位：0.70毫升

因實驗時是兩個實用單位補體0.5毫升，可依下列比例關系換算:

20：0.7=x：（）.5

x=14.3

即須將補體稀釋14.3倍，用（）.5毫升則具有兩個實用單位。

（3）抗原滴定

在用已知抗原測定未知抗體時，必要先滴定抗原效價以決定本實驗時

所需抗原最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效價）

管號

123456

1：5稀釋血清0.50.50.5———

傷寒抗原2U0.5——0.5——

痢疾抗原1：80—0.5————

補體2U0.50.50.50.50.50.5

生理鹽水——0.50.51.01.5

搖勻放置37℃水浴中30min

溶血素2U0.50.50.50.50.5—

2%羊血球0.50.5().50.50.50.5

搖勻放置37℃水浴中15min

特異性血清抗原溶血素羊血球

闡明實驗管

對照對照對照對照對照

如血清對照管呈完全或某些不溶血是為抗補體現象。血清嚴重污染細

菌，混有淋巴液或明顯溶血時，常產生很強抗外體作用。又如試管、吸管

不清潔，也可浮現抗補體。若有抗補體發生，應抽血重實驗。

實驗五T、B淋巴細胞分離實驗

淋巴細胞重要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具備不同特

性和功能，為此在進行某些免疫學實驗時，一方面需分離出純T淋巴細胞

和B淋巴細胞。本實驗原理為：淋巴細胞與用浪花二氨基異硫氨化物（簡

稱AET）解決綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中所有T淋巴細胞均能吸

附AET—SRBC,形成牢固穩定而巨大E—花環，較正常未解決SRBC形

成E一花環比例為高，并且形成迅速，不易脫落，重復性好。再經淋巴細

胞分層液分離時，AET—E花環易沉于管底，而未形成E一花環T淋巴細

胞，用低滲液解花環周邊AET-SRBC,便可獲得純T淋巴細胞，而B

淋巴細胞可直接取自分層液界面。

材料及試劑：

a）新鮮豚鼠血

b）兔紅細胞（RRBC）

c）溟花二氨基異硫氫化物（AET）

d）淋巴細胞分層液

e）其他Hanks液，含小牛血清199培養液，無菌生理鹽水，3.5%氯

化鈉溶液，離心機等。

辦法：

1.AET—RRBC制備

（1）.AET溶液制備

稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸儲水中，使成為0.143M溶

液，用4NNaOH溶液調pH9.0。該溶液必要新鮮配制，不適當久存。

（2）.AET解決RRBC

取洗滌好壓積RRBC,按一份壓積AET-RRBC加入4份新鮮配制

PH9.0AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出

加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉/分離心5分鐘。持續

洗滌3—5次，每洗一次，必要充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團,

并觀測有無溶血。若有溶血現象，則用含小牛血清199培養基再洗一次，

最后配成10%AET-RRBC懸液，置4c保存，不得超過5天。

(3).1%AET—RRBC配制：

將預先配制并保存于4c冰箱1()%濃度AET—RRBC,以含1()%小牛

血清199培養液稀釋至1%。

2.從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后實驗。

3.AET—E花環實驗：

將分離單個核細胞(2x1(戶/亳升)與等量1%AET—RRBC混合，置

37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數管，每管2—3毫升，低

速離心(100()轉/分鐘)5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

4.T淋巴細胞和B淋巴細胞分離

將形成E一花環細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧

狀細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底E—花環，用Hanks液洗一

次后，加雙蒸水3毫升解決3分鐘，低滲裂解E—花環周邊RRBC,及時

加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋

巴細胞群。

實驗六豚鼠T淋巴細胞測定

——兔紅細胞玫瑰花環實驗

玫瑰花環實驗，又稱為花結實驗。是測定淋巴細胞數量和功能一種辦

法。

人類T和B淋巴細胞表面具備不同受體。由于人類T淋巴細胞表面具

備與綿羊紅細胞結合受體，能與綿羊紅細胞非特異性結合，形成E花環，

因而，T細胞也成為紅細胞花瓣形成細胞。依照E—玫瑰花環形成率，可

以間接判斷機體細胞免疫力。當前，已廣泛應用于臨床，作為測定人群免

疫狀態一種指標。

材料：

1.肝素（100單位/亳升）

2.0.5%兔紅細胞懸液（用Hanks液配制）

3.吸取過胎牛血清：

取經56℃30分鐘加熱滅活后胎牛血清加半量壓積兔紅細胞混合后，

37c水浴20分鐘，轉/分離心10分鐘，取上清液即成。

4.Hanks液

5.豚鼠抗凝血

6.淋巴細胞分層液

7.滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。

辦法：

1.淋巴細胞提取

（1）取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3

毫升淋巴細胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。

（2）轉/分離心30分鐘，吸淋巴細胞層到另一試管中加5倍體積

Hanks液洗1—2次，（1500轉/分離心10分鐘）棄上清即成。

__血漿

三一淋巴細胞層、單核細胞層（白膜層）

一一分層液

-一粒細胞、紅細胞

圖8用分層液離心后血細胞層

2.加吸取過胎牛血清0.1毫升，0.5%兔紅細胞懸液0.2毫升，于淋

巴細胞中。混合后，37℃水浴5分鐘。

3.500轉/分離心5分鐘，放4℃冰箱中2小時后，棄大某些上清

4.染色及觀測

輕輕懸浮沉積細胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合，10分鐘后取一滴

放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。

高倍鏡或油鏡下計數200個淋巴細胞，凡結合3個或3個以上兔紅細

胞者為陽性，計算花環形成細胞百分率。

實驗七酶聯免疫吸附實驗

（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體

酶聯免疫吸附實驗是用酶標記抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體辦

法。此法敏感性高，特異性強。慣用是ELISA辦法，間接法，雙抗體法和

抗原法。本次實驗簡介，酶聯葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理

如下，見圖9

1.加抗原使之吸附于固相載體（如塑料反映板）

2.洗滌加待測血清

3.洗滌加酶標記SpA

4.洗滌加酶底物。經酶催化產生有色產物。

材料：

1.聚乙烯塑料反映板（PH9.6時可吸附蛋白Ag）

2.抗原：傷寒桿菌0901煮沸或超聲波粉碎抗原

3.待測血清

4.凍干酶聯葡萄球菌A蛋白(HRD—proteinA)純品

5.鄰苯二胺(OPD)

6.包被液：0.05M碳酸鈉一碳酸氫鈉溶液PH9.6

7.稀釋液：10%免疫血清PBS一吐溫20,防止非特異性吸附

8.洗滌液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特異性吸附

9.底物溶液：0.02M磷酸氫二鈉25.7毫升

().1M檸檬酸24.3毫升

蒸播水5()毫升

臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入

3()%雙氧水().15亳升，底物對光敏感，需要避光并立雖然用。

10.終結液；2M硫酸

辦法：

1.抗原包被

取干凈聚苯乙烯微量反映板，于每孔內加傷寒抗原0.1毫升(用包被

緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升)，置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌

液3次每次3分鐘。

2.加待測血清

于每孔內分別加不同稀釋度(如1：5,1：10,1：20-1：80)待測

血清，PBS空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各0.1毫升。置37℃30

分鐘，洗滌3次。

3.加酶聯A蛋白

于每孔加酶聯A蛋白各0.1毫升，置37C20分鐘，洗滌3次。

4.加暫時配制底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2M碳酸1

滴終結反映。

5.成果判斷：（肉眼判斷）

若顏色于陰性對照相似則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，依照顏

色深淺以（+）表達。

綜杳段訐衽實驗

實驗一抗體產生細胞檢測一一溶血空斑實驗

（綜合性實驗）

取綿羊細胞免疫小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，與一定量批示細胞（綿

羊細胞）和補體結合，注入自制小室內，經37c孵育后，單個散在抗體形

成釋放抗體，抗體與周邊綿羊紅細胞（抗原）結合，并在補體參加下，使

綿羊細胞溶解，成昊在抗體形成細胞周邊形成肉眼可見圓形透明溶血區一

一溶血空斑。計算溶血空斑數目，則可推算脾內存在抗體產生細胞總數。

材料：

1.20—22克健康小鼠

2.解剖那械

3.注射潛，平皿，漏斗，紗布，研缽

4.20%綿羊紅細胞懸液

5.干凈脫脂載玻片（75x25毫米），蓋玻片（22x22毫米）。

6.Ph7.2Hanks液，凡士林油。

7.微量加樣器

8.批示細胞懸液，配制辦法如下：

10%綿羊紅細胞0.5毫升

補體（新鮮豚鼠血清）（）.5毫升

含5%小牛血清Hanks液2亳升混合后水浴備用

辦法：

1.免疫動物

取25%綿羊紅細胞懸液1亳升，無菌操作注入小鼠腹腔中

2.脾細胞液制備

（1）小鼠免疫4天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平

皿內，用冷Hanks液洗1—2次。

（2）取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管重復吹打

多次，使細胞分散。將此細胞懸液經4—8層紗布過濾，1500轉/分離心5

分鐘，棄上清。

如細胞太多，可加蒸儲水4毫升迅速混勻，半分鐘后及時加入等量

Hanks液混勻1000轉/分離心10分鐘，棄上清。

（3）沉淀細胞用Hanks液洗1—2次，棄上清后，加Hanks液使總量

達5毫升。用乳頭吸管吹打使沉淀細胞懸起混勻,此即為50倍稀釋脾細胞。

（4）取此懸液0.1毫升放另一小試管中然后加0.9毫升Hanks液使成

500倍稀釋脾細胞懸液。

*脾細胞懸液制備過程中應在冰水浴中進行。

3.玻片小室制作

取干凈（無油）載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層

凡士林（勿涂到小室內），然后用鐐子取兩個蓋片，分別放在其上，制成兩

個小室。用鐐子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。用凡士林將蓋

片底端（其中任i端）封住，頂端作為注入細胞混合液。

圖10玻片小室示意圖

4.細胞混合液配制

取小試管一只，用1毫升吸管吸取（）.2毫升批示細胞懸液，用另一吸

管吸取0.2毫升500倍稀釋脾細胞懸液，混勻即為被檢細胞混合懸液。

5.混合細胞灌注

用100ul微量加樣器吸取被檢細胞混合懸液，于小室開口一端輕輕將

液體注滿小室（勿使氣泡產生，勿使液體外溢），記錄實際注入細胞懸液微

升數（約703）

每個樣品注2人小室，取其平均值。

6.用牙簽粘取少量凡士林益封小室開口。

7.將作好標本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘

8.溶血空斑計數

肉眼觀測空斑并計數兩個小室浮現溶血空斑數。對模糊不清空斑可在

低倍鏡下檢查，真正溶血空斑必要中心有一種淋巴細胞，周邊為透明區。

全脾臟中抗體產生細胞總數可依下述公式計算:

脾細胞懸液總量（50ml）xl（）3

抗體產生細胞總數=x標本出現的空斑數x2

注入小室內脾細胞總體積（ul）

實驗二抗原和免疫血清制備

（設計性實驗）

抗體是機體接受抗原刺激后產生一種具備免疫特異性球蛋白。在免疫

學實踐，為制備抗體常以抗原性物質（細菌、病毒、類毒素、血清及其她

蛋白質）給動物注射。通過一定期間后，動物血清中可以產生大量特異性

抗體。這種具有特異性抗體血清稱為免疫血清。免疫血清不但對傳染病診

斷、防止和治療有意要意義，并且對器官移植，腫瘤以及某些科研工作也

有重要意義。

抗體產生普通與抗原質和量、動物種類以及接種途徑有密切關系。因

而在制備免疫血清時要依照抗原不同選取適當動物種類和免疫辦法。

一.抗菌血清制備

材料：

1.動物：家兔

2.菌種：傷寒桿菌H90I,傷寒桿菌09（）1

3.培養基：普通培養基

4.其他：（）.5%甲醛鹽水，（）.5%石灰酸鹽水，無菌生理鹽水，原則比

濁管，離心機。

辦法：