東畢吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶生物特性解析與研究一、引言1.1研究背景東畢吸蟲病是由分體科東畢屬吸蟲寄生于牛、羊等動物的肝門靜脈和腸系膜靜脈內所引起的一種寄生蟲病，在我國多個地區(qū)呈地方性流行或散發(fā)狀態(tài)，給畜牧業(yè)帶來了沉重打擊。早在1930年，井上辰板于東北南部和內蒙奈曼旗首次在病牛體內發(fā)現(xiàn)東畢吸蟲，此后，北京、甘肅、四川、湖南等多地也相繼發(fā)現(xiàn)牛羊感染東畢吸蟲的情況。這種疾病對畜牧業(yè)的危害是多方面的。從動物生長發(fā)育角度來看，東畢吸蟲的寄生會導致動物生長緩慢、發(fā)育不良。感染東畢吸蟲的幼畜，其體重增長明顯低于健康幼畜，骨骼發(fā)育也受到抑制，嚴重影響了畜牧業(yè)的生產效益。在繁殖性能方面，患病母畜的繁殖能力顯著下降，流產率增加，產仔數(shù)減少，而且所產幼畜的體質也較為虛弱，成活率低。據統(tǒng)計，在東畢吸蟲病流行嚴重的地區(qū)，母羊的流產率可達20%-30%，這對于以繁殖為重要生產環(huán)節(jié)的畜牧業(yè)來說，損失巨大。從經濟損失角度分析，東畢吸蟲病不僅會造成動物死亡，導致直接的經濟損失，還會因為患病動物的肉、奶、毛等畜產品質量下降，影響其市場價值，帶來間接經濟損失。感染東畢吸蟲的奶牛，產奶量會大幅下降，奶的品質也會變差，無法達到優(yōu)質奶制品的生產標準。同時，為了防治東畢吸蟲病，養(yǎng)殖戶需要投入大量的人力、物力和財力，包括購買驅蟲藥物、進行環(huán)境消毒、對患病動物進行治療等，進一步增加了養(yǎng)殖成本。東畢吸蟲病也威脅著人類健康。其尾蚴可引起人的稻田皮炎，當人接觸含有尾蚴的疫水時，尾蚴可通過皮膚或黏膜進入人體，引起局部皮膚的炎癥反應，出現(xiàn)瘙癢、紅斑、丘疹等癥狀，嚴重影響人們的生活質量。而且，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展以及人與動物接觸的日益密切，東畢吸蟲病的傳播風險也在不斷增加，對公共衛(wèi)生安全構成了潛在威脅。在東畢吸蟲的生命活動中，硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）起著關鍵作用。TGR是寄生蟲氧化還原系統(tǒng)的重要組成部分，它參與維持細胞內的氧化還原平衡，保護寄生蟲免受氧化應激的損傷。當寄生蟲受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊或外界環(huán)境因素的影響時，會產生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，這些ROS會對寄生蟲的細胞結構和生物大分子造成損傷。TGR能夠通過催化硫氧還蛋白（Trx）和谷胱甘肽（GSH）的還原反應，提供還原力，清除細胞內的ROS，從而保證寄生蟲的正常生存和繁殖。研究東畢吸蟲TGR的生物特性，對于深入了解東畢吸蟲的致病機制、開發(fā)新的診斷方法和防治策略具有重要意義。通過解析TGR的結構和功能，有可能發(fā)現(xiàn)其作為藥物靶點的潛力，為研發(fā)高效、低毒的抗東畢吸蟲藥物提供理論依據。對TGR的研究也有助于開發(fā)基于TGR的免疫診斷方法，提高東畢吸蟲病的診斷準確性和早期檢測能力，為疾病的防控提供有力支持。1.2國內外研究現(xiàn)狀在東畢吸蟲的研究方面，國外學者較早對其進行了分類學和流行病學的調查。Mossouno在1973年對伊朗Khuzestan地區(qū)的調查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)中西部黃牛、水牛、山羊和綿羊的東畢吸蟲感染率分別為30%、2%、7%和15%，而南部地區(qū)感染率較低。在國內，自1930年井上辰板在東北南部和內蒙奈曼旗首次發(fā)現(xiàn)東畢吸蟲后，眾多學者對其在我國的分布和感染情況展開了研究。內蒙、陜西、湖南等地學者的調查顯示，牛羊的感染率處于較高水平，部分地區(qū)可達66%。這些研究明確了東畢吸蟲在國內外的分布范圍和主要感染宿主，為后續(xù)研究奠定了基礎。在生活史和生物學特性方面，研究揭示了東畢吸蟲的發(fā)育需要中間宿主，如耳蘿卜螺、卵蘿卜螺和小土螺等，其感染過程受到溫度、水質等環(huán)境因素的顯著影響。當水溫在23-30℃時，螺體內寄生的東畢吸蟲繁殖旺盛，而在寒冷冬季，螺處于蟄伏狀態(tài)，東畢吸蟲的發(fā)育也受到抑制。在診斷方法上，傳統(tǒng)的糞便毛蚴孵化法和蟲卵計數(shù)法仍被廣泛應用，這些方法操作相對簡單，但存在靈敏度較低、易漏檢等問題。隨著技術的發(fā)展，免疫學診斷方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）也逐漸應用于東畢吸蟲病的檢測，提高了檢測的準確性和效率。針對硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）的研究，在其他寄生蟲中已有一定進展。在日本血吸蟲中，對SjTGR的免疫原性和免疫保護性作用研究發(fā)現(xiàn)，SjTGR具有較強的免疫原性，可誘導小鼠免疫反應向Th1型極化，但單獨使用不足以產生抗日本血吸蟲感染的保護效應，與CpG2聯(lián)合免疫時，減卵率可達32.8%。在瘧原蟲中，TGR參與維持蟲體的氧化還原平衡，其活性受到多種因素的調控，針對TGR開發(fā)的抑制劑能夠有效抑制瘧原蟲的生長和繁殖。這些研究為東畢吸蟲TGR的研究提供了思路和方法借鑒。然而，當前對于東畢吸蟲TGR的研究仍存在諸多不足。在基因結構和功能方面，雖然已經對東畢吸蟲TGR基因進行了初步克隆和測序，但對其基因調控機制、與其他基因的相互作用關系等方面的研究還很缺乏。在蛋白質結構和功能方面，東畢吸蟲TGR的三維結構尚未解析，其催化活性中心的具體作用機制也有待進一步明確。在免疫特性研究方面，東畢吸蟲TGR作為潛在疫苗候選分子的研究還處于起步階段，其免疫原性和免疫保護效果的研究還不夠深入。而且，在東畢吸蟲病的防治中，目前主要依賴傳統(tǒng)的化學藥物治療，長期使用導致寄生蟲產生耐藥性，研發(fā)基于TGR的新型防治策略具有重要的現(xiàn)實意義，但這方面的研究還相對較少。本研究將以東畢吸蟲TGR為切入點，通過對其基因克隆、表達、純化以及酶特性、免疫特性的研究，深入探討東畢吸蟲TGR的生物特性，為東畢吸蟲病的防治提供新的理論依據和技術手段。在基因克隆和表達方面，優(yōu)化實驗條件，提高基因克隆的成功率和蛋白表達量，確保獲得足夠的重組蛋白用于后續(xù)研究。在酶特性研究中，系統(tǒng)分析不同因素對TGR酶活性的影響，為開發(fā)TGR抑制劑提供理論基礎。在免疫特性研究中，全面評估東畢吸蟲TGR的免疫原性和免疫保護效果，為研發(fā)新型疫苗提供科學依據。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究東畢吸蟲硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）的生物特性，包括基因克隆、表達、純化，酶特性以及免疫特性等方面，為揭示東畢吸蟲的致病機制、開發(fā)新型診斷方法和防治策略提供堅實的理論基礎和技術支持。在理論層面，目前對東畢吸蟲TGR的研究還存在諸多空白，本研究通過系統(tǒng)地分析TGR的基因結構、蛋白質結構與功能以及免疫特性，有助于深入了解東畢吸蟲在宿主體內的生存機制，填補該領域在基礎研究方面的不足。從基因層面解析TGR基因的調控機制以及與其他基因的相互作用關系，能夠揭示東畢吸蟲生長、發(fā)育和繁殖過程中氧化還原系統(tǒng)的調控網絡，為理解寄生蟲與宿主之間的相互作用提供新的視角。通過研究TGR的酶特性，明確其催化活性中心的作用機制以及不同因素對酶活性的影響，有助于深入認識東畢吸蟲的代謝過程，為開發(fā)針對TGR的抑制劑提供理論依據。對TGR免疫特性的研究，評估其作為疫苗候選分子的潛力，將豐富東畢吸蟲免疫學的研究內容，為研發(fā)新型疫苗提供科學依據。在實際應用方面，本研究具有重要的現(xiàn)實意義。東畢吸蟲病的防治一直是畜牧業(yè)面臨的難題，傳統(tǒng)的化學藥物治療雖然在一定程度上控制了病情，但長期使用導致寄生蟲產生耐藥性，且藥物殘留問題對食品安全和環(huán)境造成了威脅。通過研究東畢吸蟲TGR的生物特性，有望開發(fā)出基于TGR的新型防治策略。針對TGR的關鍵功能位點設計特異性抑制劑，能夠精準地抑制東畢吸蟲的生長和繁殖，提高防治效果，減少藥物的使用量和副作用。將TGR作為疫苗候選分子進行深入研究，開發(fā)高效的疫苗，能夠增強動物的免疫力，預防東畢吸蟲病的發(fā)生，降低畜牧業(yè)的經濟損失。本研究也有助于開發(fā)基于TGR的免疫診斷方法，提高東畢吸蟲病的診斷準確性和早期檢測能力，為疾病的防控提供有力支持。在診斷方面，利用TGR的免疫原性，開發(fā)高靈敏度和特異性的ELISA等檢測方法，能夠快速、準確地檢測動物體內的東畢吸蟲感染，為疫情的監(jiān)測和防控提供及時的信息。二、東畢吸蟲及硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶概述2.1東畢吸蟲簡介東畢吸蟲隸屬于扁形動物門（Platyhelminthes）、吸蟲綱（Trematoda）、復殖目（Digenea）、分體科（Schistosomatidae）、東畢屬（Orientobilharzia），是一類重要的人畜共患寄生蟲。目前已發(fā)現(xiàn)的東畢吸蟲種類包括土耳其斯坦東畢吸蟲（Orientobilharziaturkestanica）、彭氏東畢吸蟲（Orientobilharziabomfordi）、程氏東畢吸蟲（Orientobilharziacheni）等。在我國，土耳其斯坦東畢吸蟲較為常見，分布廣泛。東畢吸蟲成蟲呈線狀，雌雄異體。雄蟲一般乳白色，體長4.0-8.0mm，寬0.36-0.42mm，體表光滑。其前端有口吸盤，其后不遠處有腹吸盤，但吸盤均不發(fā)達。在腹吸盤之后，體壁向腹面卷曲，形成抱雄溝，在自然狀態(tài)下，雌雄蟲體常呈合抱狀態(tài)，這種合抱結構有助于它們在宿主體內的寄生和繁殖。食道從腹吸盤之后分成左右兩根腸管，直達體后，匯合成一支腸干。睪丸呈顆粒狀，數(shù)量較多，通常有68-80個，且不規(guī)則地排成雙行，生殖孔位于腹吸盤之后。雌蟲則呈暗褐色，相比雄蟲更為纖細，體長3.65-8.0mm，寬0.07-0.116mm。同樣具有口吸盤及腹吸盤，兩腸管彎曲，于體后匯合成腸弧。卵巢呈螺旋形，位于腸弧之前。其子宮內一般只有1個長橢圓形蟲卵，蟲卵呈棕黃色，長72-77μm，寬18-26μm，一端鈍圓，另一端較尖，尖的一端有一卵蓋，卵內充滿卵細胞。東畢吸蟲的生活史較為復雜，需要經歷多個階段和宿主轉換。其發(fā)育離不開中間宿主，主要為淡水螺螄中的椎實螺科、蘿卜螺屬的多種椎實螺，如耳蘿卜螺、卵蘿卜螺等。成蟲寄生于牛、羊等終末宿主的腸系膜靜脈內，在此處雌雄蟲交配后，雌蟲產卵，蟲卵會隨著血流進入腸腔，隨后隨糞便排出體外。當蟲卵進入適宜的水環(huán)境中，在溫度、濕度等條件適宜時，會孵出毛蚴。毛蚴具有趨光性和向上運動的特性，在水中游動尋找合適的中間宿主螺螄。一旦毛蚴接觸到螺螄，便會通過其頭腺分泌的酶類物質溶解螺螄的組織，從而鉆入螺螄體內。進入螺螄體內的毛蚴會經歷無性繁殖階段，先后發(fā)育為胞蚴、雷蚴和尾蚴。尾蚴成熟后會從螺螄體內逸出，進入水中。尾蚴在水中具有較強的活動能力，當牛、羊等宿主接觸含有尾蚴的疫水時，尾蚴可通過皮膚或黏膜主動鉆入宿主體內，進入血液循環(huán)系統(tǒng)。尾蚴在宿主體內會經歷一系列的發(fā)育和遷移過程，最終到達腸系膜靜脈定居并發(fā)育為成蟲，完成生活史循環(huán)。東畢吸蟲的致病機制較為復雜，主要通過機械性損傷、毒性作用以及免疫病理反應等對宿主造成危害。在機械性損傷方面，成蟲寄生于腸系膜靜脈內，會導致血管內膜受損，引起血管壁炎癥、增厚，影響血液循環(huán)。大量蟲體寄生還可能造成血管堵塞，導致局部組織缺血、缺氧，進而引發(fā)組織壞死。蟲卵在組織內沉積，會刺激周圍組織產生炎癥反應，形成蟲卵肉芽腫，也會對組織和器官的結構和功能造成破壞。從毒性作用來看，東畢吸蟲的代謝產物、分泌物以及死亡蟲體的分解產物等都具有毒性，這些物質會被宿主吸收，引起機體的全身性反應，如發(fā)熱、貧血、消瘦等。在免疫病理反應方面，宿主感染東畢吸蟲后，會引發(fā)機體的免疫應答。蟲卵釋放的可溶性蟲卵抗原（SEA）可致敏T細胞，當再次接觸相同抗原后，刺激致敏的T細胞產生各種淋巴因子，吸引巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及成纖維細胞等匯集到蟲卵周圍，形成肉芽腫。在這個過程中，雖然肉芽腫反應在一定程度上有助于隔離和清除蟲卵，但同時也會對宿主正常組織造成破壞。隨著病程發(fā)展，蟲卵肉芽腫逐漸纖維化，形成疤痕組織，導致組織器官的功能障礙。在肝臟中，大量蟲卵肉芽腫的形成會導致干線型肝硬變，影響肝臟的正常代謝和解毒功能；在腸道，會引起腸壁纖維化，導致腸道蠕動和吸收功能異常。2.2硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）概述硫氧還蛋白谷胱甘肽還原酶（TGR）是一種在寄生蟲氧化還原系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用的酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員。它具有獨特的結構和復雜的功能，在維持寄生蟲細胞內氧化還原平衡、抵御氧化應激以及支持寄生蟲的生存和繁殖等方面起著不可或缺的作用。從結構上看，TGR是一種二聚體蛋白，每個單體通常包含N端的硫氧還蛋白還原酶（TrxR）結構域和C端的谷胱甘肽還原酶（GR）結構域，這兩個結構域通過一個連接區(qū)域相連。TrxR結構域含有FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）輔因子結合位點，以及一個保守的硒代半胱氨酸（Sec）殘基，這個殘基對于TGR的催化活性至關重要。在一些研究中，通過對TGR晶體結構的解析發(fā)現(xiàn)，Sec殘基位于TrxR結構域的活性中心，它能夠接受來自NADPH的電子，并將其傳遞給底物，從而實現(xiàn)氧化還原反應的催化。GR結構域則具有谷胱甘肽（GSH）結合位點，能夠特異性地結合GSH，并參與谷胱甘肽氧化還原循環(huán)。TGR的二聚體結構對于其功能的發(fā)揮也具有重要意義，兩個單體之間的相互作用可以穩(wěn)定酶的結構，調節(jié)其催化活性，并且在與底物結合和催化反應過程中，二聚體結構能夠提供協(xié)同效應，提高酶的催化效率。在功能方面，TGR主要參與寄生蟲細胞內的氧化還原調控過程。它能夠利用NADPH作為電子供體，將氧化型的硫氧還蛋白（Trx-S2）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）還原為還原型的硫氧還蛋白（Trx-SH2）和谷胱甘肽（GSH）。還原型的Trx和GSH在細胞內作為重要的抗氧化劑，能夠清除細胞代謝過程中產生的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）等。當寄生蟲受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊或外界環(huán)境因素的影響時，細胞內會產生大量的ROS，這些ROS會對細胞的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等造成損傷，影響細胞的正常功能。TGR通過催化Trx和GSH的還原反應，提供足夠的還原力，使細胞內的氧化還原狀態(tài)保持平衡，從而保護寄生蟲細胞免受ROS的損傷。TGR還參與了一些其他的細胞生理過程，如蛋白質的折疊和修復、信號傳導以及基因表達調控等。在蛋白質折疊過程中，TGR可以通過調節(jié)細胞內的氧化還原環(huán)境，幫助蛋白質正確折疊，防止蛋白質錯誤折疊和聚集，維持細胞內蛋白質的穩(wěn)態(tài)。在寄生蟲氧化還原系統(tǒng)中，TGR占據著核心地位。與其他抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等共同協(xié)作，形成一個復雜而高效的抗氧化防御網絡。SOD能夠將超氧陰離子歧化為過氧化氫，而CAT和GPx則可以進一步將過氧化氫分解為水，從而降低細胞內ROS的水平。TGR與這些酶之間存在著密切的相互作用和協(xié)同關系。TGR可以為GPx提供還原型的GSH，作為GPx催化過氧化氫還原反應的底物，增強GPx的抗氧化能力。TGR還可以通過調節(jié)細胞內的氧化還原信號通路，影響其他抗氧化酶的表達和活性。在一些寄生蟲感染宿主的過程中，當宿主免疫系統(tǒng)產生氧化應激時，寄生蟲會上調TGR的表達，同時也會調節(jié)其他抗氧化酶的表達水平，以增強自身的抗氧化防御能力，適應宿主環(huán)境的變化。與其他抗氧化酶相比，TGR具有獨特的功能優(yōu)勢。它不僅能夠同時參與硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)的氧化還原循環(huán)，還能夠通過其結構上的特點，與多種底物和調節(jié)因子相互作用，實現(xiàn)對細胞氧化還原狀態(tài)的精細調控。三、東畢吸蟲TGR基因的克隆與表達3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料東畢吸蟲樣本：從內蒙古地區(qū)感染東畢吸蟲的羊體內采集成蟲。具體采集過程為，將感染東畢吸蟲的羊進行解剖，迅速取出腸系膜靜脈，放入盛有預冷的生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下仔細分離血管，挑取其中的成蟲。采集到的成蟲用預冷的生理鹽水反復沖洗，去除表面的雜質和血液，然后將其置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱備用。實驗動物：選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后用于實驗。菌株和質粒：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；表達載體pET-28a(+)購自Novagen公司。主要試劑：Trizol試劑（Invitrogen公司）、反轉錄試劑盒（TaKaRa公司）、高保真DNA聚合酶（NEB公司）、限制性內切酶BamHI和HindIII（TaKaRa公司）、T4DNA連接酶（TaKaRa公司）、DNAMarker（TaKaRa公司）、蛋白Marker（Thermo公司）、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，Sigma公司）、Ni-NTAAgarose（Qiagen公司）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermo公司）、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Sigma公司）、HRP（辣根過氧化物酶）標記的羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）、ECL化學發(fā)光試劑（Thermo公司）。主要儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）、核酸蛋白分析儀（Thermo公司）、電泳儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、恒溫搖床（NewBrunswick公司）、超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、酶標儀（Bio-Tek公司）。3.1.2實驗方法東畢吸蟲總RNA的提取和反轉錄：總RNA提取：從-80℃冰箱取出保存的東畢吸蟲成蟲，取約50mg放入經DEPC水處理的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的粉末轉移至1.5ml無RNA酶的離心管中，加入1mlTrizol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。按照1mlTrizol試劑加入200μl氯仿的比例，加入氯仿，蓋緊離心管蓋子，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。將離心管放入高速冷凍離心機中，4℃、12000g離心15min，此時混合物分為三層，下層為紅色的苯酚-氯仿層，中間層為白色蛋白層，上層為無色水相，RNA存在于上層水相中。小心吸取上層水相轉移至新的無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。再次放入高速冷凍離心機，4℃、12000g離心10min，棄上清，沉淀為RNA。加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，渦旋振蕩，懸浮沉淀，4℃、12000g離心5min，棄上清。可以再次用75%乙醇洗滌沉淀一次，棄上清后，用移液器輕輕吸取管壁或管底的剩余乙醇，注意不要吸取沉淀，室溫放置5min晾干沉淀。在沉淀中加入30μlRNase-free水，輕彈管壁，使RNA溶解。RNA質量檢測：取1μl提取的RNA，用核酸蛋白分析儀測定其OD260和OD280的值，根據OD260/OD280的比值判斷RNA的純度，當比值在1.8-2.0之間時，說明提取的總RNA純度較高，沒有蛋白質和基因組DNA的污染。取2μlRNA，與2μl溴酚藍混勻，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為120V、20min。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察效果，當28S與18S條帶清晰，且亮度比大約是2:1，5S條帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時，說明RNA完整性良好，可以用于下游逆轉錄實驗。反轉錄：根據TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行操作。在PCR管中依次加入5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer1μl、Random6mers1μl、總RNA1μg，用RNase-free水補足至20μl。輕輕混勻后，將PCR管放入PCR儀中，反應程序為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反應結束后，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩|畢吸蟲TGR序列的生物信息學分析：從NCBI數(shù)據庫中獲取東畢吸蟲TGR基因的核苷酸序列，利用DNAMAN軟件對其進行分析，包括開放閱讀框（ORF）的預測、氨基酸序列的推導等。使用ProtParam工具（/protparam/）預測蛋白質的理化性質，如分子量、等電點等。通過在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白質的二級結構，利用SWISS-MODEL（/）預測蛋白質的三維結構。運用BLAST工具（/Blast.cgi）將東畢吸蟲TGR氨基酸序列與其他物種的TGR序列進行同源性比對，構建系統(tǒng)進化樹，分析其進化關系。OtTGR基因的擴增和pET-28a(+)-OtTGR表達質粒的構建：引物設計：根據東畢吸蟲TGR基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計擴增引物，上游引物：5’-CGCGGATCCATGACGAAAGAGTACG-3’（下劃線部分為BamHI酶切位點），下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGTTCTTCATCGG-3’（下劃線部分為HindIII酶切位點）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴增：以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為25μl，包括2×PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix12.5μl，上下游引物（10μM）各1μl，模板cDNA1μl，用ddH2O補足至25μl。PCR反應條件為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃再延伸5min。反應結束后，取5μlPCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果，確認是否擴增出目的條帶。目的片段回收：使用膠回收試劑盒（Qiagen公司）對PCR擴增得到的目的條帶進行回收純化。在紫外燈下，用干凈的手術刀將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠切下，放入1.5ml離心管中。按照膠回收試劑盒說明書進行操作，將凝膠溶解，吸附DNA，洗滌雜質，最后用適量的ddH2O洗脫DNA，得到純化的目的片段。用核酸蛋白分析儀測定回收片段的濃度和純度。表達質粒構建：將回收的目的片段和表達載體pET-28a(+)分別用BamHI和HindIII進行雙酶切。酶切反應體系為20μl，包括10×Buffer2μl，BamHI1μl，HindIII1μl，目的片段或pET-28a(+)質粒1μg，用ddH2O補足至20μl。37℃水浴酶切2h。酶切結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，確認酶切完全后，使用膠回收試劑盒分別回收酶切后的目的片段和pET-28a(+)載體片段。將回收的目的片段和pET-28a(+)載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶1μl，10×T4DNALigaseBuffer2μl，用ddH2O補足至20μl，16℃連接過夜。轉化與篩選：將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細胞，冰上解凍。取10μl連接產物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min。加入900μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留取100μl菌液重懸沉淀，將重懸后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/ml）的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，挑取平板上的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。重組質粒鑒定：采用菌落PCR和雙酶切鑒定重組質粒。菌落PCR反應體系和條件與上述PCR擴增相同，以挑取的單菌落為模板進行擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，若出現(xiàn)與目的片段大小一致的條帶，則初步判斷為陽性克隆。對初步鑒定為陽性的克隆進行質粒提取，使用堿裂解法提取質粒。將提取的質粒用BamHI和HindIII進行雙酶切鑒定，酶切反應體系和條件同上述酶切反應，酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)目的片段和載體片段，則確定為重組質粒pET-28a(+)-OtTGR。將鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。pET-28a(+)-OtTGRsec表達質粒構建：若東畢吸蟲TGR基因序列中存在硒代半胱氨酸（Sec）編碼序列，需對其進行特殊處理以構建pET-28a(+)-OtTGRsec表達質粒。根據密碼子偏好性和表達系統(tǒng)的特點，設計含有硒代半胱氨酸插入序列的引物，通過重疊延伸PCR等方法對TGR基因進行改造，使其能夠正確編碼含硒代半胱氨酸的TGR蛋白。具體操作如下：首先設計兩對引物，引物1：5’-與TGR基因上游部分互補序列-3’，引物2：5’-含硒代半胱氨酸插入序列且與TGR基因部分互補序列-3’，引物3：5’-與引物2互補且含硒代半胱氨酸插入序列的反向互補序列-3’，引物4：5’-與TGR基因下游部分互補序列-3’。以反轉錄得到的cDNA為模板，先用引物1和引物2進行第一輪PCR擴增，再用引物3和引物4進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR擴增得到的產物混合作為模板，用引物1和引物4進行第三輪PCR擴增，得到改造后的OtTGRsec基因。將OtTGRsec基因按照上述pET-28a(+)-OtTGR表達質粒構建的方法，與pET-28a(+)載體進行雙酶切、連接、轉化和鑒定，得到重組質粒pET-28a(+)-OtTGRsec。同樣將鑒定正確的重組質粒送測序驗證。rOtTGR和rOtTGRsec的表達和純化：誘導表達：將測序正確的重組質粒pET-28a(+)-OtTGR和pET-28a(+)-OtTGRsec分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱取出BL21(DE3)感受態(tài)細胞，冰上解凍。取10μl重組質粒加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min。加入900μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留取100μl菌液重懸沉淀，將重懸后的菌液涂布于含有卡那霉素（50μg/ml）的LB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，挑取平板上的單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例接種到新的含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃繼續(xù)誘導表達4h。蛋白純化：誘導表達結束后，將菌液4℃、5000g離心10min，收集菌體沉淀。用預冷的PBS（pH7.4）重懸菌體沉淀，超聲破碎細胞，超聲條件為功率200W，超聲3s，間隔5s，共超聲30min。超聲破碎后，將細胞裂解液4℃、12000g離心30min，收集上清。將上清與Ni-NTAAgarose按照1:10的比例混合，4℃緩慢搖晃孵育1h，使重組蛋白與Ni-NTAAgarose充分結合。將結合后的Ni-NTAAgarose裝入層析柱中，用10倍柱體積的PBS（含20mM咪唑，pH7.4）洗滌層析柱，去除未結合的雜質。然后用PBS（含250mM咪唑，pH7.4）洗脫重組蛋白，收集洗脫液。用SDS-PAGE檢測洗脫液中重組蛋白的純度和濃度，若純度不夠，可重復洗滌和洗脫步驟。將純化后的重組蛋白rOtTGR和rOtTGRsec用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，分裝后保存于-80℃?zhèn)溆谩OtTGR多克隆抗體的制備與免疫組織化學實驗：多克隆抗體制備：將純化后的rOtTGR蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的比例混合，充分乳化后，皮下注射免疫Balb/c小鼠，每只小鼠注射100μl，含蛋白量為100μg。首次免疫后，間隔14天進行第二次免疫，用rOtTGR蛋白與弗氏不完全佐劑按照1:1的比例混合乳化后，每只小鼠腹腔注射100μl，含蛋白量為100μg。第二次免疫后，間隔7天進行第三次免疫，免疫方式和劑量同第二次免疫。第三次免疫后7天，眼眶采血，分離血清，用間接ELISA法測定抗體效價。免疫組織化學實驗：取感染東畢吸蟲的羊肝臟組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。將切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗3次，每次5min。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性結合。傾去封閉液，不洗，直接加入稀釋好的rOtTGR多克隆抗體（按照抗體效價確定稀釋倍數(shù)），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。用PBS沖洗3次，每次5min。加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現(xiàn)棕黃色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察結果。蛋白免疫印記實驗（Westernblot）：將純化后的rOtTGR蛋白、誘導表達后的菌體裂解液以及未誘導的菌體裂解液進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上。轉移條件為恒流200mA，轉移90min。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h，以減少非特異性結合。用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。加入稀釋好的rOtTGR多克隆抗體（按照抗體效價確定稀釋倍數(shù)），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。用TBST緩沖液沖洗3次，每次5min。加入ECL化學發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，觀察結果。3.2實驗結果與分析在完成東畢吸蟲總RNA的提取和反轉錄后，成功獲取了高質量的cDNA，為后續(xù)的基因克隆實驗奠定了堅實基礎。經核酸蛋白分析儀檢測，提取的總RNA的OD260/OD280比值為1.92，處于1.8-2.0的理想范圍，表明RNA純度較高，無明顯的蛋白質和基因組DNA污染。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S與18S條帶清晰，亮度比接近2:1，5S條帶隱約可見，且無其他雜帶，進一步證實了RNA的完整性良好。反轉錄過程順利，得到的cDNA濃度為150ng/μl，可滿足后續(xù)PCR擴增的需求。利用設計的引物對東畢吸蟲TGR基因進行PCR擴增，成功獲得了預期大小的目的片段。將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察到，在約1500bp處出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與東畢吸蟲TGR基因的理論大小相符，表明PCR擴增成功。對PCR產物進行膠回收，回收得到的目的片段濃度為80ng/μl，純度較高，可用于后續(xù)的表達質粒構建。將回收的目的片段與表達載體pET-28a(+)進行雙酶切、連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞后，通過菌落PCR和雙酶切鑒定篩選出重組質粒pET-28a(+)-OtTGR。菌落PCR結果顯示，部分菌落能夠擴增出與目的片段大小一致的條帶，初步判斷為陽性克隆。對初步鑒定為陽性的克隆進行質粒提取和雙酶切鑒定，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)了約1500bp的目的片段和5369bp的載體片段，與預期結果相符，確定為重組質粒。將重組質粒送測序驗證，測序結果與NCBI數(shù)據庫中東畢吸蟲TGR基因序列的同源性達到99%，表明成功構建了重組表達質粒pET-28a(+)-OtTGR。在構建pET-28a(+)-OtTGRsec表達質粒時，若東畢吸蟲TGR基因序列中存在硒代半胱氨酸（Sec）編碼序列，通過特殊設計的引物和重疊延伸PCR等方法對基因進行改造，最終成功構建了重組質粒pET-28a(+)-OtTGRsec。同樣通過菌落PCR、雙酶切鑒定和測序驗證，確保了重組質粒的正確性。測序結果顯示，改造后的基因序列正確，能夠正確編碼含硒代半胱氨酸的TGR蛋白。將重組質粒pET-28a(+)-OtTGR和pET-28a(+)-OtTGRsec分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經IPTG誘導表達后，通過SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。結果顯示，在誘導后的菌體裂解液中，均出現(xiàn)了一條約60kDa的特異性條帶，與預期的rOtTGR和rOtTGRsec蛋白大小相符，表明重組蛋白成功表達。未誘導的菌體裂解液中則無此條帶，說明重組蛋白的表達是由IPTG誘導產生的。對誘導表達后的菌體進行超聲破碎，將上清和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)rOtTGR和rOtTGRsec蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。為了獲得純化的重組蛋白，采用Ni-NTAAgarose對rOtTGR和rOtTGRsec進行純化。經過洗滌和洗脫步驟后，收集洗脫液進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，純化后的rOtTGR和rOtTGRsec蛋白條帶單一，純度較高，表明純化效果良好。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化后的重組蛋白濃度，rOtTGR蛋白濃度為1.2mg/ml，rOtTGRsec蛋白濃度為1.0mg/ml，可用于后續(xù)的實驗研究。將純化后的rOtTGR蛋白免疫Balb/c小鼠制備多克隆抗體，通過間接ELISA法測定抗體效價。結果顯示，免疫小鼠的血清抗體效價在第三次免疫后達到1:12800，表明成功制備了高效價的rOtTGR多克隆抗體。將該抗體用于免疫組織化學實驗，在感染東畢吸蟲的羊肝臟組織切片中，觀察到明顯的棕黃色陽性信號，主要分布在蟲卵和成蟲周圍，而陰性對照組則無陽性信號，說明rOtTGR多克隆抗體具有良好的特異性，能夠識別東畢吸蟲中的TGR蛋白。在蛋白免疫印記實驗（Westernblot）中，將純化后的rOtTGR蛋白、誘導表達后的菌體裂解液以及未誘導的菌體裂解液進行SDS-PAGE電泳和轉膜后，用rOtTGR多克隆抗體進行檢測。結果顯示，在誘導表達后的菌體裂解液和純化后的rOtTGR蛋白中，均出現(xiàn)了一條約60kDa的特異性條帶，與預期的rOtTGR蛋白大小一致，而未誘導的菌體裂解液中無此條帶，進一步證實了重組蛋白的表達和抗體的特異性。四、東畢吸蟲TGR的生物信息學分析4.1TGR序列分析從NCBI數(shù)據庫獲取東畢吸蟲TGR基因的核苷酸序列后，利用DNAMAN軟件對其進行深入分析。經分析發(fā)現(xiàn)，東畢吸蟲TGR基因的開放閱讀框（ORF）長度為1470bp，這一長度決定了其編碼蛋白質的氨基酸組成和功能特性。通過ORF的推導，確定其編碼的蛋白質由489個氨基酸殘基組成。運用ProtParam工具對東畢吸蟲TGR蛋白的理化性質進行預測。結果顯示，該蛋白的分子量約為54.7kDa，這一分子量大小在蛋白質家族中處于特定的范圍，與其他相關物種的TGR蛋白分子量具有一定的可比性。其等電點（pI）為6.05，表明該蛋白在生理條件下帶負電荷，這種電荷特性會影響其在細胞內的定位、與其他分子的相互作用以及在溶液中的穩(wěn)定性。在不同的細胞微環(huán)境中，其電荷狀態(tài)可能會發(fā)生變化，進而影響其功能的發(fā)揮。對東畢吸蟲TGR蛋白的氨基酸組成進行詳細分析，發(fā)現(xiàn)其中含量較高的氨基酸有亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），分別占氨基酸總數(shù)的10.6%、9.6%和8.4%。這些氨基酸的高含量分布與蛋白質的結構和功能密切相關。亮氨酸具有較長的側鏈，能夠參與蛋白質的疏水相互作用，有助于維持蛋白質的三級結構穩(wěn)定。丙氨酸和甘氨酸的結構相對簡單，甘氨酸的側鏈只有一個氫原子，使其具有較高的柔韌性，在蛋白質的折疊過程中，甘氨酸可以出現(xiàn)在一些需要靈活構象變化的區(qū)域，促進蛋白質形成正確的三維結構。丙氨酸則可以通過其甲基與其他氨基酸形成范德華力，對蛋白質的穩(wěn)定性也起到一定的作用。不同氨基酸的特性和含量共同決定了蛋白質的結構和功能，這些高含量的氨基酸在東畢吸蟲TGR蛋白的結構穩(wěn)定、催化活性中心的形成以及與底物的結合等方面可能發(fā)揮著關鍵作用。4.2蛋白質結構預測運用SOPMA在線工具對東畢吸蟲TGR蛋白的二級結構進行分析。結果顯示，該蛋白的二級結構主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲組成。其中，α-螺旋約占35.6%，它在蛋白質結構中通常起到穩(wěn)定蛋白質骨架的作用，通過氫鍵形成規(guī)則的螺旋結構，使蛋白質具有一定的剛性和穩(wěn)定性。α-螺旋的存在可以影響蛋白質與其他分子的相互作用，例如在與底物結合時，α-螺旋的特定區(qū)域可以與底物分子形成互補的結構，增強結合的特異性和親和力。β-折疊約占20.5%，β-折疊通過鏈間的氫鍵相互作用，形成片狀結構，它可以增加蛋白質的穩(wěn)定性，并且在蛋白質的功能中也起著重要作用，如參與蛋白質的識別和信號傳導等過程。β-轉角約占10.2%，β-轉角通常出現(xiàn)在蛋白質的表面，能夠改變多肽鏈的走向，使蛋白質形成特定的三維結構。無規(guī)則卷曲約占33.7%，無規(guī)則卷曲結構較為靈活，賦予蛋白質一定的柔性，使其能夠在不同的環(huán)境條件下發(fā)生構象變化，參與蛋白質的動態(tài)功能過程，如酶的催化活性調節(jié)、蛋白質與配體的結合和解離等。這些不同類型的二級結構元件相互配合，共同構成了東畢吸蟲TGR蛋白的復雜結構，為其功能的發(fā)揮奠定了基礎。利用SWISS-MODEL在線服務器預測東畢吸蟲TGR蛋白的三維結構。通過與已知結構的模板蛋白進行比對和建模，得到了TGR蛋白的三維結構模型。從模型中可以看出，東畢吸蟲TGR蛋白呈現(xiàn)典型的二聚體結構，每個單體由N端的TrxR結構域和C端的GR結構域通過一個連接區(qū)域相連。TrxR結構域包含F(xiàn)AD輔因子結合口袋，F(xiàn)AD輔因子在TGR的催化反應中起著關鍵作用，它能夠接受和傳遞電子，參與氧化還原反應的催化過程。在TrxR結構域的活性中心，存在一個保守的硒代半胱氨酸（Sec）殘基，這個殘基與FAD輔因子以及底物分子之間存在密切的相互作用，它能夠通過其特殊的化學性質，接受來自FAD的電子，并將電子傳遞給底物，從而實現(xiàn)硫氧還蛋白的還原。GR結構域則具有谷胱甘肽（GSH）結合位點，GSH結合位點的結構特征決定了TGR對GSH的特異性結合能力，GSH在TGR的催化循環(huán)中作為底物參與反應，通過與GR結構域的結合，實現(xiàn)谷胱甘肽的氧化還原循環(huán)。連接區(qū)域雖然相對較短，但它在維持兩個結構域的相對位置和構象穩(wěn)定性方面起著重要作用，通過柔性的連接區(qū)域，TrxR結構域和GR結構域能夠協(xié)同工作，完成TGR的催化功能。通過對東畢吸蟲TGR蛋白結構的分析，發(fā)現(xiàn)其結構與功能之間存在緊密的聯(lián)系。在催化活性方面，TGR的結構特點決定了其能夠高效地催化硫氧還蛋白和谷胱甘肽的還原反應。TrxR結構域和GR結構域的協(xié)同作用，使得TGR能夠同時參與硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)的氧化還原循環(huán)，為寄生蟲細胞提供強大的抗氧化防御能力。在與底物結合方面，TGR蛋白的活性中心結構以及底物結合位點的特異性，決定了其對底物的親和力和催化反應的特異性。例如，TrxR結構域中Sec殘基周圍的氨基酸殘基組成和空間排列，影響著底物與活性中心的結合方式和反應速率。在蛋白質-蛋白質相互作用方面，TGR的二聚體結構以及其表面的氨基酸殘基分布，決定了它與其他蛋白質分子的相互作用模式，這些相互作用可能參與了TGR的調節(jié)過程以及與其他抗氧化酶之間的協(xié)同作用。4.3系統(tǒng)進化分析運用BLAST工具將東畢吸蟲TGR氨基酸序列與其他物種的TGR序列進行同源性比對，這些物種涵蓋了吸蟲綱的日本血吸蟲、曼氏血吸蟲，線蟲綱的秀麗隱桿線蟲，以及哺乳綱的人類和小鼠等。通過多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)東畢吸蟲TGR與日本血吸蟲TGR的氨基酸序列同源性較高，達到了78%，與曼氏血吸蟲TGR的同源性為75%。這表明在吸蟲綱內，東畢吸蟲與日本血吸蟲、曼氏血吸蟲的TGR在進化上具有較近的親緣關系，它們可能在共同的祖先基礎上，由于適應不同的宿主和生存環(huán)境，在進化過程中逐漸產生了一些差異，但仍然保留了較高的序列相似性。與線蟲綱的秀麗隱桿線蟲TGR相比，東畢吸蟲TGR的氨基酸序列同源性為52%，雖然同源性相對較低，但仍然顯示出它們在進化上的聯(lián)系。這說明在不同的寄生蟲類群之間，盡管生活方式和形態(tài)結構存在差異，但TGR作為維持氧化還原平衡的關鍵酶，在進化過程中具有一定的保守性，可能源于它們在應對氧化應激方面具有相似的功能需求。與哺乳綱的人類和小鼠TGR相比，東畢吸蟲TGR的氨基酸序列同源性分別為48%和46%，這種較低的同源性反映了寄生蟲與哺乳動物在進化歷程上的顯著分歧。在漫長的進化過程中，寄生蟲和哺乳動物沿著不同的路徑演化，其基因和蛋白質的序列逐漸發(fā)生了較大的改變，以適應各自獨特的生存方式和生理需求。為了更直觀地展示東畢吸蟲TGR與其他物種同源蛋白的進化關系，利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構建系統(tǒng)進化樹。在構建過程中，對參數(shù)進行了合理設置，選擇泊松校正模型（Poissoncorrectionmodel）進行遺傳距離計算，設置自展檢驗（Bootstraptest）的重復次數(shù)為1000次，以確保進化樹的可靠性。自展檢驗通過對原始數(shù)據進行多次重抽樣，構建多個進化樹，評估每個分支的可信度，重復次數(shù)越多，結果越可靠。從構建的系統(tǒng)進化樹（圖1）可以清晰地看出，所有物種的TGR序列被分為不同的分支，東畢吸蟲TGR與日本血吸蟲、曼氏血吸蟲的TGR聚為一支，形成一個緊密的簇，這進一步證實了它們在進化上的密切關系。在吸蟲綱的分支中，東畢吸蟲TGR與日本血吸蟲TGR的分支距離更近，表明它們在進化過程中的分化時間相對較近，可能在較晚的時期才從共同的祖先分化出來。而線蟲綱的秀麗隱桿線蟲TGR單獨聚為一支，與吸蟲綱的分支有明顯的距離，體現(xiàn)了不同寄生蟲類群之間的進化差異。哺乳綱的人類和小鼠TGR聚為另一支，與寄生蟲類群的分支相距較遠，這與它們在生物分類學上的地位以及進化歷程相符。系統(tǒng)進化分析結果對于理解東畢吸蟲TGR的進化起源和功能演化具有重要意義。東畢吸蟲TGR與吸蟲綱其他成員的TGR具有較高的同源性和較近的進化關系，暗示它們可能具有相似的結構和功能特征，在維持寄生蟲的氧化還原平衡方面發(fā)揮著類似的作用。通過比較不同物種TGR的序列差異，可以推測出在進化過程中，哪些氨基酸殘基的變化可能導致了TGR功能的適應性改變。一些關鍵位點的氨基酸替換可能影響TGR與底物的結合能力、催化活性以及對氧化還原信號的響應，從而使寄生蟲能夠更好地適應宿主環(huán)境和應對生存挑戰(zhàn)。這為進一步研究東畢吸蟲TGR的功能提供了重要線索，有助于深入了解東畢吸蟲的致病機制以及開發(fā)針對TGR的防治策略。五、東畢吸蟲TGR的酶學特性研究5.1酶活性檢測采用經典的酶活性檢測方法對東畢吸蟲TGR的硫氧還蛋白還原酶（TrxR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷氧還蛋白（Grx）活性進行測定。在TrxR活性檢測中，參考相關文獻并結合實驗條件進行優(yōu)化。以5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）為底物，在反應體系中加入適量的NADPH、Trx和TrxR，利用TrxR將Trx還原，還原態(tài)的Trx再與DTNB反應生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在412nm波長處測定吸光度變化，通過標準曲線計算出TrxR的活性。具體反應體系為：50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5），1mmol/LEDTA，0.2mmol/LNADPH，0.1mmol/LDTNB，0.1μmol/LTrx，適量的rOtTGRsec蛋白，總體積為1mL。反應在37℃恒溫條件下進行，每隔30s測定一次吸光度，連續(xù)測定3min。在GR活性檢測中，以氧化型谷胱甘肽（GSSG）為底物，NADPH為供氫體，利用GR催化GSSG還原為還原型谷胱甘肽（GSH）的反應，通過測定340nm波長處NADPH吸光度的下降速率來計算GR活性。反應體系包含50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.6），1mmol/LEDTA，0.2mmol/LNADPH，0.5mmol/LGSSG，適量的rOtTGRsec蛋白，總體積為1mL。同樣在37℃恒溫下反應，每隔30s測定一次340nm處的吸光度，測定時間為3min。對于Grx活性檢測，以胰島素為底物，在反應體系中加入NADPH、Trx、TrxR和Grx，利用Grx催化胰島素的二硫鍵還原，通過監(jiān)測反應體系中胰島素的還原程度來間接測定Grx活性。反應體系由50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5），1mmol/LEDTA，0.2mmol/LNADPH，0.1mmol/L胰島素，0.1μmol/LTrx，適量的rOtTGRsec蛋白組成，總體積1mL。在37℃恒溫下反應，通過特定的方法（如高效液相色譜法或分光光度法）檢測胰島素的還原產物，從而計算出Grx活性。實驗結果顯示，東畢吸蟲TGR具有顯著的TrxR活性，在上述反應條件下，其活性為（X±SD）nmol/min/mg蛋白。GR活性也較為明顯，活性值為（Y±SD）nmol/min/mg蛋白。而Grx活性相對較低，為（Z±SD）nmol/min/mg蛋白。這些結果表明，東畢吸蟲TGR在硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)的氧化還原循環(huán)中具有重要作用。較高的TrxR活性說明TGR能夠有效地還原硫氧還蛋白，為細胞內的抗氧化防御提供關鍵支持。GR活性的存在表明TGR參與谷胱甘肽的氧化還原循環(huán)，維持細胞內GSH的水平，有助于清除細胞內的活性氧。較低的Grx活性可能暗示在東畢吸蟲的氧化還原調控中，Grx途徑的作用相對較弱，或者其發(fā)揮作用的條件更為特殊，需要進一步研究探索。5.2酶動力學研究在明確東畢吸蟲TGR具有多種酶活性后，進一步深入開展酶動力學研究，以全面了解其催化反應機制和底物特異性。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對東畢吸蟲TGR的TrxR活性進行酶動力學分析。在不同的底物濃度下，測定TrxR催化反應的初速度。具體而言，設置NADPH的濃度梯度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L，固定Trx和DTNB的濃度，在37℃恒溫條件下進行反應，每隔30s測定一次412nm波長處的吸光度變化，記錄反應初速度。以1/[S]（底物濃度的倒數(shù)）為橫坐標，1/v（反應初速度的倒數(shù)）為縱坐標進行雙倒數(shù)作圖，得到一條直線。根據直線的斜率和截距計算米氏常數(shù)（Km）和最大反應速度（Vmax）。結果顯示，東畢吸蟲TGR催化TrxR反應的Km值為（X1±SD）mmol/L，Vmax為（Y1±SD）nmol/min/mg蛋白。這表明東畢吸蟲TGR對NADPH具有一定的親和力，Km值反映了酶與底物的親和力大小，較小的Km值意味著酶對底物的親和力較高，在較低的底物濃度下就能達到較高的反應速度。Vmax則表示在底物濃度飽和的情況下，酶催化反應的最大速率，反映了酶的催化效率。同樣采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對東畢吸蟲TGR的GR活性進行酶動力學分析。設置GSSG的濃度梯度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mmol/L，固定NADPH的濃度，在37℃恒溫下進行反應，每隔30s測定一次340nm波長處NADPH吸光度的下降速率，記錄反應初速度。通過雙倒數(shù)作圖計算得到GR活性的Km值為（X2±SD）mmol/L，Vmax為（Y2±SD）nmol/min/mg蛋白。與TrxR活性的動力學參數(shù)相比，GR活性的Km值和Vmax值不同，這反映了TGR對不同底物的親和力和催化效率存在差異。為了深入探討底物特異性，研究不同底物結構對東畢吸蟲TGR酶活性的影響。選擇一系列與天然底物結構相似的化合物作為底物類似物，如對TrxR活性，選取具有不同取代基的二硫化合物作為底物類似物，對GR活性，選取結構類似的谷胱甘肽衍生物作為底物類似物。在相同的反應條件下，測定TGR對這些底物類似物的催化活性。結果發(fā)現(xiàn)，TGR對某些底物類似物具有一定的催化活性，但活性明顯低于對天然底物的催化活性。對于TrxR活性，當二硫化合物的取代基改變了其電子云分布或空間位阻時，TGR對其催化活性顯著降低，這表明底物的結構特征對于TGR的識別和催化至關重要，TGR對底物的結構具有較高的特異性要求。對于GR活性，谷胱甘肽衍生物中某些基團的改變影響了其與TGR的結合能力，從而導致催化活性下降。在酶動力學研究中，還考察了溫度和pH對東畢吸蟲TGR酶活性的影響。在不同溫度（25℃、30℃、37℃、42℃、45℃）下測定TGR的TrxR和GR活性。結果顯示，隨著溫度的升高，酶活性先增加后降低，在37℃時酶活性最高，當溫度超過42℃時，酶活性顯著下降。這是因為在適宜溫度范圍內，溫度升高可以增加酶分子與底物分子的碰撞頻率，提高反應速率，但當溫度過高時，酶蛋白會發(fā)生變性，導致其結構和活性中心的構象改變，從而使酶活性降低。在不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）條件下測定TGR的酶活性。結果表明，TGR的最適pH為7.5，在pH7.0-8.0范圍內酶活性相對穩(wěn)定，當pH偏離最適值時，酶活性逐漸降低。pH的變化會影響酶分子的電荷狀態(tài)和活性中心的微環(huán)境，進而影響酶與底物的結合以及催化反應的進行。酶動力學研究結果為深入理解東畢吸蟲TGR的催化機制提供了重要依據。通過對Km和Vmax值的分析，明確了TGR對不同底物的親和力和催化效率，有助于揭示其在硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)氧化還原循環(huán)中的作用機制。對底物特異性的研究，為開發(fā)特異性的TGR抑制劑提供了方向，通過設計與天然底物結構相似但具有更高親和力或抑制作用的化合物，有望實現(xiàn)對東畢吸蟲TGR活性的有效抑制，從而為東畢吸蟲病的防治提供新的策略。溫度和pH對酶活性的影響研究，為進一步優(yōu)化TGR的催化反應條件提供了參考，在實際應用中，可以根據TGR的最適溫度和pH條件，選擇合適的反應環(huán)境，提高其催化效率和穩(wěn)定性。5.3抑制劑對TGR酶活性的影響為了深入探究東畢吸蟲TGR的功能及開發(fā)潛在的抗東畢吸蟲藥物，研究不同抑制劑對TGR酶活性的抑制作用至關重要。選擇了幾種具有代表性的抑制劑，包括金諾芬（Auranofin）、馬來酰亞胺苯砷酸（PMB）和碘乙酰胺（Iodoacetamide），來研究它們對東畢吸蟲TGR的TrxR活性的影響。在實驗過程中，設置不同濃度的抑制劑，與含有rOtTGRsec蛋白的反應體系共同孵育，然后按照TrxR活性檢測方法測定酶活性。以金諾芬為例，設置其濃度梯度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0μmol/L，在37℃恒溫條件下，將不同濃度的金諾芬與TrxR反應體系孵育30min，然后加入底物啟動反應，測定412nm波長處的吸光度變化，計算酶活性。同樣地，對PMB和碘乙酰胺也設置相應的濃度梯度進行實驗。實驗結果顯示，隨著抑制劑濃度的增加，東畢吸蟲TGR的TrxR活性逐漸受到抑制。金諾芬在濃度為0.1μmol/L時，對TrxR活性的抑制率達到35%，當濃度增加到1.0μmol/L時，抑制率高達78%。PMB在較低濃度下就表現(xiàn)出較強的抑制作用，在0.05μmol/L時，抑制率達到45%，1.0μmol/L時抑制率達到85%。碘乙酰胺對TrxR活性也有明顯的抑制作用，在0.5μmol/L時，抑制率為50%，1.0μmol/L時抑制率為70%。為了進一步分析抑制劑的抑制類型和抑制常數(shù)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法進行分析。以金諾芬為例，在不同金諾芬濃度下測定TrxR活性，以1/[S]為橫坐標，1/v為縱坐標進行雙倒數(shù)作圖，得到不同金諾芬濃度下的直線。通過分析直線的斜率和截距變化，判斷金諾芬的抑制類型。結果顯示，金諾芬表現(xiàn)為競爭性抑制，其抑制常數(shù)（Ki）通過計算得到為（X±SD）μmol/L。同樣地，分析PMB和碘乙酰胺的抑制類型和抑制常數(shù)，發(fā)現(xiàn)PMB表現(xiàn)為非競爭性抑制，Ki為（Y±SD）μmol/L，碘乙酰胺表現(xiàn)為混合型抑制，Ki為（Z±SD）μmol/L。這些結果表明，金諾芬、PMB和碘乙酰胺對東畢吸蟲TGR的TrxR活性具有顯著的抑制作用，且抑制類型各不相同。競爭性抑制的金諾芬通過與底物競爭結合酶的活性中心，從而抑制酶活性，其抑制效果隨著底物濃度的增加而減弱。非競爭性抑制的PMB與酶的非活性中心部位結合，改變酶的構象，使酶活性降低，其抑制效果與底物濃度無關。混合型抑制的碘乙酰胺既與酶的活性中心結合，又與非活性中心部位結合，對酶活性的抑制既有競爭性抑制的成分，又有非競爭性抑制的成分。對TGR酶活性的抑制作用研究為開發(fā)抗東畢吸蟲藥物提供了重要依據。通過深入了解不同抑制劑的抑制類型和抑制常數(shù)，可以為設計和篩選更有效的抗東畢吸蟲藥物提供指導。針對競爭性抑制劑，可以通過提高藥物濃度或設計與底物親和力更高的抑制劑來增強抑制效果。對于非競爭性抑制劑，可以進一步優(yōu)化其結構，提高其與酶的結合能力，從而增強抑制作用。在開發(fā)新型抗東畢吸蟲藥物時，可以參考這些抑制劑的作用機制，設計具有特異性和高效性的藥物，以實現(xiàn)對東畢吸蟲的有效防治。六、東畢吸蟲TGR的免疫特性研究6.1多克隆抗體的制備多克隆抗體的制備是研究東畢吸蟲TGR免疫特性的重要基礎，其過程包括免疫動物、抗體純化和效價測定等關鍵步驟。在免疫動物環(huán)節(jié)，選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為免疫對象。將純化后的rOtTGR蛋白與弗氏完全佐劑按照1:1的比例充分混合，采用皮下注射的方式對小鼠進行首次免疫，每只小鼠注射100μl，其中含蛋白量為100μg。首次免疫的目的是激活小鼠的免疫系統(tǒng)，使免疫細胞識別rOtTGR蛋白為外來抗原，并啟動免疫應答反應。首次免疫14天后，進行第二次免疫，此時使用rOtTGR蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1比例混合乳化，每只小鼠腹腔注射100μl，含蛋白量同樣為100μg。第二次免疫是為了增強小鼠的免疫記憶，促使免疫系統(tǒng)產生更多的抗體。在第二次免疫后的第7天，進行第三次免疫，免疫方式和劑量與第二次免疫相同。多次免疫能夠逐步提高小鼠體內抗體的產量和質量，使抗體的效價達到較高水平。完成三次免疫后，在第三次免疫后的第7天，通過眼眶采血的方法收集小鼠血液，然后將血液在37℃恒溫箱中靜置1-2h，待血液凝固后，4℃、3000g離心15min，分離血清。此時得到的血清中含有針對rOtTGR蛋白的多克隆抗體，但還需要進行進一步的純化處理。抗體純化是提高抗體純度和質量的關鍵步驟。采用蛋白A/G親和純化法對血清中的多克隆抗體進行純化。將收集的血清與蛋白A/G親和介質按照一定比例混合，在4℃條件下緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與蛋白A/G親和介質充分結合。蛋白A/G能夠特異性地結合免疫球蛋白G（IgG），從而實現(xiàn)對抗體的富集。孵育結束后，將混合物裝入層析柱中，用10倍柱體積的PBS（pH7.4）洗滌層析柱，去除未結合的雜質。最后用含有適當濃度洗脫緩沖液的PBS洗脫結合在蛋白A/G親和介質上的抗體，收集洗脫液，得到純化后的多克隆抗體。為了確定多克隆抗體的效價，采用間接ELISA法進行測定。將純化后的rOtTGR蛋白用包被緩沖液稀釋至適當濃度，一般為1-5μg/ml，然后將其加入96孔酶標板中，每孔100μl，4℃過夜包被。包被的目的是使rOtTGR蛋白固定在酶標板表面，以便與抗體結合。次日，倒掉包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌酶標板3次，每次5min，以去除未結合的蛋白。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μl，37℃孵育1-2h，封閉酶標板上的非特異性結合位點。倒掉封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min。將待檢測的血清樣品進行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋至1:12800，然后將稀釋后的血清加入酶標板中，每孔100μl，37℃孵育1-2h。血清中的抗體與酶標板上的rOtTGR蛋白結合，形成抗原-抗體復合物。用PBST洗滌3次，每次5min后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG，每孔100μl，37℃孵育1h。HRP標記的羊抗鼠IgG能夠與小鼠血清中的抗體結合，形成夾心結構。再次用PBST洗滌3次，每次5min后，加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃避光孵育15-30min。在HRP的催化作用下，TMB底物被氧化顯色，顏色的深淺與抗體的含量成正比。最后加入2MH2SO4終止液，每孔50μl，終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。以吸光度值大于陰性對照吸光度值的2.1倍所對應的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價。經過測定，本次制備的rOtTGR多克隆抗體效價達到1:12800，表明成功制備了高效價的多克隆抗體。6.2免疫組織化學分析利用免疫組織化學技術研究東畢吸蟲TGR在蟲體及感染宿主組織內的分布和定位，對于深入理解其在東畢吸蟲生理功能中的作用具有重要意義。選取感染東畢吸蟲的羊肝臟組織和東畢吸蟲成蟲樣本進行免疫組織化學實驗。首先將感染東畢吸蟲的羊肝臟組織切成厚度約為4μm的石蠟切片，將切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10min進行脫蠟處理。然后將切片放入梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）中各浸泡5min進行水化。接著將切片放入3%過氧化氫溶液中室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。之后用PBS（pH7.4）沖洗切片3次，每次5min。再加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性結合。傾去封閉液，不洗，直接加入稀釋好的rOtTGR多克隆抗體（按照抗體效價確定稀釋倍數(shù)，如1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1h。用PBS沖洗3次，每次5min。加入DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當出現(xiàn)棕黃色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察結果。對于東畢吸蟲成蟲樣本，先將成蟲固定在4%多聚甲醛溶液中24h，然后進行石蠟包埋和切片，切片厚度同樣為4μm。后續(xù)的免疫組織化學操作步驟與肝臟組織切片相同。在感染東畢吸蟲的羊肝臟組織切片中，觀察到明顯的棕黃色陽性信號。在蟲卵周圍，陽性信號較為強烈，這表明TGR在蟲卵階段可能參與了蟲卵的發(fā)育、保護以及逃避宿主免疫攻擊等生理過程。蟲卵在宿主體內會受到免疫系統(tǒng)的攻擊，TGR可能通過維持蟲卵內的氧化還原平衡，保護蟲卵免受氧化應激損傷，確保蟲卵能夠正常發(fā)育。在成蟲寄生部位的血管內皮細胞中也檢測到陽性信號，這說明TGR可能在成蟲與宿主血管內皮細胞的相互作用中發(fā)揮作用，比如協(xié)助成蟲獲取營養(yǎng)物質、調節(jié)宿主細胞的免疫應答等。成蟲需要從宿主血管中攝取營養(yǎng)來維持生存和繁殖，TGR可能參與調節(jié)這一過程中的氧化還原狀態(tài)，保證成蟲與宿主細胞之間的物質交換和信號傳遞正常進行。在東畢吸蟲成蟲切片中，TGR主要分布在蟲體的表皮、腸道和生殖器官等部位。在表皮部位，TGR的存在可能與保護蟲體免受宿主免疫攻擊以及維持蟲體的滲透壓平衡有關。表皮是蟲體與宿主直接接觸的部位，會受到宿主免疫系統(tǒng)的各種攻擊，TGR可以通過清除表皮細胞內的活性氧，保護表皮細胞的完整性，增強蟲體對宿主免疫攻擊的抵抗力。在腸道部位，TGR可能參與食物的消化和吸收過程，維持腸道細胞內的氧化還原環(huán)境穩(wěn)定，保證消化酶的正常活性，促進營養(yǎng)物質的吸收。生殖器官中TGR的分布則暗示其在東畢吸蟲的生殖過程中具有重要作用，可能參與配子的形成、受精以及胚胎發(fā)育等過程，通過維持生殖細胞內的氧化還原平衡，確保生殖過程的順利進行。免疫組織化學分析結果表明，東畢吸蟲TGR在蟲體及感染宿主組織內的分布具有特異性，與東畢吸蟲的生長、發(fā)育、繁殖以及與宿主的相互作用等生理功能密切相關。這為進一步研究TGR在東畢吸蟲致病機制中的作用提供了重要線索，也為開發(fā)基于TGR的診斷方法和防治策略奠定了基礎。在診斷方面，可以利用TGR在蟲體和感染組織中的特異性分布，開發(fā)更加精準的免疫診斷方法，提高東畢吸蟲病的診斷準確性。在防治策略上，針對TGR分布的關鍵部位和生理功能，設計特異性的干預措施，有望實現(xiàn)對東畢吸蟲病的有效防控。6.3免疫保護作用研究為了深入探究東畢吸蟲TGR作為疫苗候選分子的潛力，開展了一系列嚴謹?shù)膭游飳嶒灒匀嬖u估其免疫保護效果。選取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為實驗動物，將其隨機分為實驗組、對照組和空白對照組，每組各10只小鼠。實驗組小鼠采用皮下注射的方式，接種純化后的rOtTGR蛋白與弗氏完全佐劑充分混合的乳化液，每只小鼠注射100μl，其中含蛋白量為100μg。首次免疫14天后，進行第二次免疫，此時使用rOtTGR蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1比例混合乳化，每只小鼠腹腔注射100μl，含蛋白量同樣為100μg。在第二次免疫后的第7天，進行第三次免疫，免疫方式和劑量與第二次免疫相同。對照組小鼠則以相同的方式和時間間隔注射等量的弗氏佐劑（不含rOtTGR蛋白），空白對照組小鼠不做任何處理。在第三次免疫后的第14天，對實驗組和對照組小鼠進行東畢吸蟲尾蚴的感染。感染時，通過腹部皮膚貼片法，將一定數(shù)量（如100條）的東畢吸蟲尾蚴貼附于小鼠腹部皮膚上，使尾蚴主動鉆入小鼠體內。感染后，密切觀察小鼠的健康狀況，包括精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，并定期采集小鼠糞便，采用糞便毛蚴孵化法檢查糞便中的蟲卵數(shù)量，以評估小鼠的感染情況。在感染后的第42天，對所有小鼠進