不結球白菜BcICE1基因的克隆解析與抗寒功能探究一、引言1.1研究背景與目的不結球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensis）作為十字花科蕓薹屬蕓薹種的重要亞種，是一種一、二年生草本植物。其擁有豐富的種質資源，生長周期較短，單位面積產量高且易于栽培。在我國中部及以南地區，不結球白菜可周年栽培種植，在蔬菜市場中占據著重要的地位。2021年，其全國栽培面積已達133.33萬hm2，相比2005年增長了2.5倍，充分顯示出其在農業生產中的重要性。不結球白菜不僅產量可觀，還富含礦物質、膳食纖維以及各類維生素，這些營養成分對調節人體酸堿平衡、促進新陳代謝以及預防疾病等方面都發揮著重要作用。然而，不結球白菜喜冷涼氣候，低溫對其生長發育和產量品質有著顯著影響。當遭遇低溫時，不結球白菜的生長進程會受到阻礙，嚴重時甚至會導致植株死亡，進而造成減產。低溫還可能引發提前抽薹現象，這會極大地降低其商品價值。例如，在一些冬季較為寒冷的地區，不結球白菜如果不能抵御低溫，就會出現葉片凍傷、生長停滯等問題，使得農民的經濟收益受損。因此，提高不結球白菜的抗寒性，對于保障其產量和品質，以及滿足市場的穩定供應都具有關鍵意義。在植物應對低溫脅迫的過程中，轉錄因子發揮著至關重要的調控作用。ICE1（InducerofCBFExpression1）轉錄因子作為植物抗寒調控網絡中的關鍵成員，能夠通過與CBF（C-repeatBindingFactor）基因啟動子區域的特定順式作用元件結合，激活CBF基因的表達，進而啟動下游一系列冷響應基因的表達，增強植物的抗寒能力。目前，在擬南芥、水稻、小麥等多種植物中，對ICE1基因的功能和調控機制已有較為深入的研究。例如，在擬南芥中，ice1突變體在低溫脅迫下表現出明顯的抗寒能力下降，而過量表達ICE1基因則能顯著提高植株的抗寒性能。然而，在不結球白菜中，關于ICE1基因的研究仍相對較少，其基因序列、結構特征以及在抗寒過程中的具體功能和調控機制尚不完全明確。本研究旨在克隆不結球白菜抗寒轉錄因子BcICE1基因，并對其進行功能分析。通過對BcICE1基因的克隆，獲得其完整的基因序列，深入分析其結構特征，包括開放閱讀框、編碼的氨基酸序列以及保守結構域等，為后續研究提供基礎。在功能分析方面，通過基因表達分析，明確BcICE1基因在不同組織以及低溫脅迫下的表達模式，了解其表達與不結球白菜抗寒性的關聯。利用轉基因技術，將BcICE1基因導入擬南芥中，通過對轉基因擬南芥植株的抗寒性分析，直觀地驗證該基因在提高植物抗寒能力方面的作用。通過酵母雙雜交等技術篩選與BcICE1蛋白相互作用的蛋白，進一步揭示其在不結球白菜抗寒調控網絡中的作用機制。本研究的成果將為不結球白菜的抗寒育種提供重要的理論依據和基因資源，有助于培育出更具抗寒能力的不結球白菜新品種，從而提高其在低溫環境下的產量和品質，保障農業生產的穩定發展。1.2國內外研究現狀在不結球白菜抗寒研究領域，國內外學者已取得了一定成果。在抗寒種質資源篩選方面，南京農業大學等單位經過多代篩選，獲得了‘矮腳黃’‘蘇州青’等36份耐寒的優質種質資源。通過對不同品種不結球白菜在低溫脅迫下的生理生化指標分析，發現四倍體不結球白菜的滲透調節物質含量和保護酶活性在低溫脅迫過程中始終明顯高于二倍體，電解質外滲率和丙二醛含量低于二倍體，表明四倍體不結球白菜抗寒性更強。對烏塌菜等品種的研究也表明，其在低溫下的光合及熒光特性變化與耐寒性密切相關。在植物抗寒分子機制研究中，ICE1轉錄因子成為重點關注對象。在模式植物擬南芥中，ICE1基因的功能和調控機制已被深入研究。ICE1蛋白能夠特異性地結合到CBF基因啟動子區域的MYC識別元件上，激活CBF基因的表達，進而調控下游一系列冷響應基因的表達，增強植物的抗寒能力。ice1突變體在低溫脅迫下，CBF基因及其下游冷響應基因的表達量顯著降低，植株抗寒能力明顯下降。而過量表達ICE1基因的擬南芥植株，在低溫脅迫下能夠維持較高的相對電導率、脯氨酸含量和抗氧化酶活性，從而增強對低溫的耐受性。在其他植物中，ICE1基因也展現出重要的抗寒功能。在水稻中，OsICE1基因參與了低溫脅迫響應，過表達OsICE1基因能夠提高水稻對低溫的抗性，其作用機制與調控CBF類似基因的表達有關。在小麥中，TaICE1基因的表達受低溫誘導，通過調節下游冷響應基因的表達，增強小麥的抗寒能力。在番茄中，SlICE1基因不僅參與低溫脅迫響應，還在鹽脅迫和干旱脅迫響應中發揮作用，說明ICE1基因在植物應對多種非生物脅迫中具有重要地位。相比之下，不結球白菜中關于ICE1基因的研究起步較晚。雖然已從大白菜中分離出BcICE1基因的cDNA序列，該基因全長1591bp，含有一個1494bp長的開放閱讀框，編碼497個氨基酸，蛋白C端含有典型的bHLH結構域，與其他植物的ICE1蛋白具有較高同源性，但對于不結球白菜BcICE1基因的研究仍存在諸多不足。目前，對于不結球白菜BcICE1基因的克隆和序列分析尚不完善，其氨基酸序列比對及系統進化分析不夠深入，不同脅迫處理下該基因的表達模式尚未完全明確。在BcICE1蛋白功能研究方面，其亞細胞定位雖有初步探索，但仍需進一步驗證，通過轉基因技術驗證其抗寒功能的研究也有待加強。對于BcICE1蛋白在不結球白菜抗寒調控網絡中的作用機制，如與其他蛋白的相互作用以及對下游冷響應基因的調控等方面，研究還較為匱乏。深入開展不結球白菜BcICE1基因的研究，對于揭示其抗寒分子機制，培育抗寒新品種具有重要意義。1.3研究的意義和創新點本研究對于不結球白菜的抗寒育種以及植物抗寒分子機制的理論研究都具有重要意義。在抗寒育種實踐方面，不結球白菜作為我國重要的蔬菜作物，低溫脅迫嚴重影響其產量和品質。通過對BcICE1基因的克隆與功能分析，有望為不結球白菜的抗寒育種提供關鍵的基因資源。將BcICE1基因導入不結球白菜中，有可能培育出抗寒性更強的新品種，這不僅能減少低溫對不結球白菜生長發育的不利影響，保障其產量穩定，還能擴大其種植區域，滿足不同地區的市場需求。例如，在北方冬季較為寒冷的地區，若能種植抗寒的不結球白菜新品種，將豐富當地的蔬菜供應種類，提高農民的經濟收益。從理論研究角度來看，雖然在其他植物中對ICE1基因已有一定研究，但不結球白菜中BcICE1基因的相關研究還較為匱乏。本研究深入分析BcICE1基因的結構特征、表達模式以及蛋白功能和作用機制，有助于填補不結球白菜在這方面的研究空白。這將進一步完善植物抗寒分子調控網絡的理論體系，為深入理解植物響應低溫脅迫的分子機制提供新的視角和依據。例如，通過揭示BcICE1蛋白與其他蛋白的相互作用關系，以及對下游冷響應基因的調控機制，能夠更全面地認識不結球白菜抗寒過程中的分子事件，為其他植物的抗寒研究提供借鑒。本研究可能的創新點在于，首次較為系統地對不結球白菜BcICE1基因進行克隆與功能分析。在研究過程中，綜合運用多種先進的生物技術和實驗方法，如利用高效的基因克隆技術獲得BcICE1基因的完整序列，通過實時熒光定量PCR等技術精確分析其在不同脅迫處理下的表達模式，借助轉基因技術和酵母雙雜交等技術深入探究其蛋白功能和作用機制。這種多技術聯用的研究方式，有望在不結球白菜抗寒分子機制研究方面取得新的突破。此外，通過對BcICE1基因的研究，有可能發現不結球白菜中獨特的抗寒調控途徑或與其他植物不同的調控機制，為植物抗寒研究領域帶來新的發現和啟示。二、相關理論基礎2.1不結球白菜概述不結球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensis），在植物分類學上屬于十字花科（Brassicaceae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（Brassicacampestris）的一個亞種。它是一、二年生草本植物，在我國有著悠久的栽培歷史，是深受人們喜愛的重要蔬菜之一。不結球白菜植株相對矮小，根系為淺根系，須根發達，這使得它對土壤的適應性較強，能夠在多種類型的土壤中生長，但以疏松肥沃、排水良好的壤土或砂壤土最為適宜。其葉片形態豐富多樣，葉色從淡綠到墨綠不等，葉片形狀有倒卵形、橢圓形等，有的葉片光滑，有的則具有褶皺，少數還帶有絨毛。葉柄通常較為肥厚，顏色為白色或綠色，這也是區分不同品種不結球白菜的重要特征之一。不結球白菜的花為黃色，花瓣呈長圓形，花期一般在春季，花朵小巧而密集，具有一定的觀賞價值。其果實為長角果，成熟時開裂，內含多粒近圓形的種子，種子顏色多為紫褐色。不結球白菜喜冷涼氣候，在溫和的溫度條件下生長良好。它對光照的需求適中，充足的光照有助于光合作用的進行，促進植株的生長和發育，但在夏季高溫強光時，需要適當遮蔭，以免葉片受到灼傷。在水分管理方面，由于其葉面柔嫩，蒸發量大，需要較高的土壤濕度和空氣濕度，但同時也要注意避免積水，以防根部腐爛。不結球白菜生長周期較短，從播種到收獲一般只需30-60天，這使得它能夠在短時間內為市場提供新鮮的蔬菜，滿足人們的日常需求。在我國，不結球白菜的分布極為廣泛，南北方各省均有種植。在南方地區，因其氣候溫暖濕潤，不結球白菜可實現周年栽培，成為當地蔬菜供應的重要組成部分。例如在長江流域，不結球白菜是常見的蔬菜品種，種植面積大，產量高，不僅供應本地市場，還大量運往北方地區。在北方，雖然冬季較為寒冷，但隨著設施農業的發展，不結球白菜也能在溫室中栽培，實現反季節供應，豐富了冬季蔬菜市場的品種。不結球白菜在國外也有一定的種植區域，如日本、韓國等亞洲國家，以及一些歐美國家的華人社區，它逐漸受到越來越多國際消費者的青睞。不結球白菜在蔬菜產業中占據著重要地位。它不僅是人們日常餐桌上的常見蔬菜，可炒、煮、涼拌、做湯等，烹飪方式多樣，滿足了不同人群的口味需求，還因其生長周期短、產量高、易于栽培等特點，為農民提供了重要的經濟收入來源。在農業生產中，不結球白菜的種植對于合理利用土地資源、調整農業產業結構具有重要意義。同時，不結球白菜富含礦物質、膳食纖維以及多種維生素，如維生素C、維生素K、葉酸等，這些營養成分對人體健康有著重要作用，能夠調節人體酸堿平衡，促進新陳代謝，預防多種疾病，是一種營養豐富、健康的蔬菜。2.2低溫對植物的影響2.2.1冷害和凍害低溫對植物的影響主要包括冷害和凍害兩種類型，這兩種危害都會對不結球白菜的生理生化和生長發育產生顯著影響。冷害是指在零上低溫（一般為0-15℃）條件下，植物所遭受的傷害。對于不結球白菜而言，冷害會導致其生理生化過程發生一系列變化。在細胞膜系統方面，冷害會破壞細胞膜的結構和功能，使細胞膜的透性增大，細胞內的物質外滲，導致電解質滲漏率增加。例如，在低溫脅迫下，不結球白菜葉片的電解質滲漏率會明顯上升，這表明細胞膜受到了損傷，影響了細胞的正常生理功能。在光合作用方面，冷害會抑制光合作用相關酶的活性，如RuBP羧化酶等，從而降低光合作用的效率。不結球白菜的凈光合速率會下降，影響其對光能的利用和碳水化合物的合成，導致植株生長緩慢，葉片發黃、變薄。同時，冷害還會影響呼吸作用，使呼吸速率發生變化，最初可能會升高以補償能量的不足，但隨著冷害時間的延長，呼吸速率會逐漸下降，影響植株的能量代謝。在生長發育方面，冷害會使不結球白菜的生長受到抑制，生長速度減緩，植株矮小。冷害還可能導致葉片變形、卷曲，影響其正常的形態建成。在生殖生長階段，冷害會影響花芽分化和開花結實，導致花器官發育異常，結實率降低，嚴重影響不結球白菜的產量和品質。凍害則是指在零下低溫條件下，植物細胞內水分結冰，導致細胞結構和功能受損的現象。當不結球白菜遭受凍害時，細胞內的冰晶會破壞細胞膜、細胞器等結構，導致細胞功能喪失。冰晶的形成還會使細胞內的水分被固定，造成細胞脫水，進一步加劇細胞的損傷。在生理生化方面，凍害會導致不結球白菜的蛋白質變性，酶活性喪失，代謝紊亂。例如，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性會在凍害后急劇下降，無法有效清除細胞內產生的活性氧，導致活性氧積累，對細胞造成氧化損傷。在生長發育方面，凍害會使不結球白菜的葉片出現凍傷斑，嚴重時葉片會枯萎、死亡。如果凍害發生在生長的關鍵時期，如幼苗期或蓮座期，可能會導致植株死亡，造成嚴重的減產。即使植株在凍害后存活下來，其生長也會受到嚴重影響，恢復生長緩慢，產量和品質也會大幅下降。冷害和凍害對不結球白菜的影響是多方面的，不僅會影響其生理生化過程，還會對其生長發育和產量品質產生嚴重的制約。因此，深入研究不結球白菜對低溫的響應機制，提高其抗寒能力，對于保障不結球白菜的生產具有重要意義。2.2.2植物感受低溫的分子機制植物能夠感知低溫信號，并啟動一系列生理生化反應來適應低溫環境，這一過程涉及復雜的分子機制。目前的研究表明，植物感受低溫的分子機制主要與細胞膜流動性、鈣離子通道以及雙組分磷酸系統等密切相關。細胞膜是植物細胞與外界環境的界面，也是感知低溫信號的重要部位。當植物受到低溫脅迫時，細胞膜的流動性會發生變化。細胞膜主要由磷脂雙分子層和膜蛋白組成，低溫會使磷脂分子的運動減緩，導致細胞膜的流動性降低。這種變化會被細胞膜上的一些感受器所感知，從而引發細胞內的信號轉導過程。例如，某些膜蛋白可能會因為細胞膜流動性的改變而發生構象變化，進而激活與之相關的信號通路，將低溫信號傳遞到細胞內部。鈣離子作為細胞內重要的第二信使，在植物感受低溫信號的過程中發揮著關鍵作用。當植物感知到低溫時，細胞膜上的鈣離子通道會被激活，導致細胞外的鈣離子迅速進入細胞內，使細胞質中的鈣離子濃度瞬間升高。這種鈣離子濃度的變化可以激活下游一系列依賴鈣離子的蛋白激酶，如鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）等。這些蛋白激酶可以通過磷酸化作用激活或抑制其他信號分子，從而將低溫信號進一步傳遞下去，最終引發植物的低溫響應基因表達和生理生化變化。雙組分磷酸系統也是植物感知低溫的重要途徑之一。雙組分系統通常由一個組氨酸激酶（HK）和一個反應調節蛋白（RR）組成。在低溫信號感知過程中，組氨酸激酶可以感知低溫信號，并自身發生磷酸化，然后將磷酸基團轉移到反應調節蛋白上。磷酸化的反應調節蛋白可以結合到特定的DNA序列上，調控相關基因的表達，從而啟動植物的低溫響應機制。例如，在擬南芥中，一些雙組分系統相關基因的突變會影響植物對低溫的響應能力，說明雙組分磷酸系統在植物感受低溫信號和啟動抗寒反應中具有重要作用。植物感受低溫的分子機制是一個復雜的網絡，細胞膜流動性的變化、鈣離子通道的激活以及雙組分磷酸系統的參與等多個環節相互協作，共同完成對低溫信號的感知和傳遞，從而使植物能夠啟動相應的抗寒機制來適應低溫環境。深入研究這些分子機制，對于揭示植物抗寒的本質，提高植物的抗寒性具有重要的理論和實踐意義。2.3轉錄因子研究進展2.3.1ICE1轉錄因子ICE1轉錄因子屬于bHLH（basichelix-loop-helix）轉錄因子家族，其結構具有典型的bHLH結構域特征。bHLH結構域由大約60個氨基酸組成，包含一個高度保守的堿性區域和一個HLH區域。堿性區域位于N端，富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，能夠特異性地識別并結合DNA序列中的E-box元件（CANNTG）。HLH區域則由兩個α-螺旋通過一個環區連接而成，這一結構對于ICE1蛋白與其他bHLH蛋白形成同源或異源二聚體至關重要，二聚體的形成能夠增強其與DNA的結合能力和轉錄調控活性。除了bHLH結構域，ICE1蛋白還可能包含其他功能區域，如轉錄激活結構域等，這些區域在ICE1激活下游基因表達的過程中發揮著重要作用。在植物抗寒過程中，ICE1轉錄因子起著核心調控作用。當植物感受到低溫信號后，ICE1基因被誘導表達，合成的ICE1蛋白能夠通過其bHLH結構域與CBF基因啟動子區域的MYC識別元件（CANNTG）結合。這種結合能夠招募轉錄起始復合物等相關因子，促進CBF基因的轉錄，從而激活下游一系列冷響應基因（COR）的表達。這些冷響應基因編碼的產物包括抗凍蛋白、滲透調節物質合成酶、抗氧化酶等，它們從多個方面提高植物的抗寒能力。抗凍蛋白能夠降低細胞內冰晶的形成溫度，減少冰晶對細胞的損傷；滲透調節物質合成酶可以促進脯氨酸、可溶性糖等滲透調節物質的合成，調節細胞的滲透壓，維持細胞的正常生理功能；抗氧化酶則能夠清除細胞內由于低溫脅迫產生的活性氧，減輕氧化損傷。ICE1轉錄因子的活性還受到多種翻譯后修飾的調控。磷酸化修飾是其中一種重要的調控方式，蛋白激酶能夠使ICE1蛋白的特定氨基酸殘基發生磷酸化，從而影響其活性。例如，在擬南芥中，BIN2蛋白激酶可以磷酸化ICE1蛋白，促進其被26S蛋白酶體降解，從而負調控ICE1的活性。泛素化修飾也參與了ICE1的調控過程，E3泛素連接酶能夠將泛素分子連接到ICE1蛋白上，使其被蛋白酶體識別并降解。SUMO化修飾則可以增強ICE1蛋白的穩定性和活性，促進其對CBF基因的激活作用。這些翻譯后修飾相互協調，精細地調控著ICE1轉錄因子的活性，確保植物在低溫脅迫下能夠及時、有效地啟動抗寒機制。2.3.2轉錄因子CBF/DREB1CBF（C-repeatBindingFactor），又稱為DREB1（DehydrationResponsiveElementBindingprotein1），屬于AP2/ERF（APETALA2/EthyleneResponsiveFactor）轉錄因子家族，在植物低溫響應過程中扮演著關鍵角色。CBF轉錄因子的結構具有典型的AP2結構域，該結構域由大約60個氨基酸組成，是CBF蛋白與DNA結合以及發揮轉錄調控功能的關鍵區域。AP2結構域能夠特異性地識別并結合DNA序列中的CRT/DRE（C-repeat/DehydrationResponsiveElement）元件，其核心序列為GCCGAC。通過與CRT/DRE元件的結合，CBF轉錄因子可以調控下游一系列冷響應基因（COR）的表達，從而增強植物對低溫脅迫的耐受性。在植物低溫響應的調控途徑中，CBF轉錄因子處于核心地位。當植物受到低溫刺激時，細胞膜流動性的改變、鈣離子濃度的變化等信號轉導過程被激活，最終導致CBF基因的迅速表達。CBF基因的表達產物CBF蛋白能夠結合到下游冷響應基因啟動子區域的CRT/DRE元件上，招募RNA聚合酶等轉錄相關因子，促進冷響應基因的轉錄。這些冷響應基因編碼的產物參與了植物抗寒的多個生理過程。一些基因編碼的蛋白能夠調節細胞膜的穩定性，減少低溫對細胞膜的損傷；一些基因編碼的酶參與了滲透調節物質的合成，如脯氨酸、可溶性糖等，這些滲透調節物質可以調節細胞的滲透壓，防止細胞在低溫下失水；還有一些基因編碼的抗氧化酶能夠清除細胞內的活性氧，減輕低溫脅迫引起的氧化損傷。CBF轉錄因子的表達和活性也受到多種因素的調控。在轉錄水平上，ICE1轉錄因子可以通過結合到CBF基因啟動子區域的MYC識別元件上，激活CBF基因的表達。一些植物激素也參與了CBF基因表達的調控，如脫落酸（ABA）、乙烯等。ABA可以通過信號轉導途徑誘導CBF基因的表達，增強植物的抗寒性；而乙烯則可能通過抑制CBF基因的表達，負調控植物的抗寒能力。在翻譯后水平上，CBF蛋白的活性可能受到磷酸化、泛素化等修飾的影響。磷酸化修飾可以改變CBF蛋白的活性和穩定性，影響其與DNA的結合能力以及對下游基因的調控作用；泛素化修飾則可能參與了CBF蛋白的降解過程，調節其在細胞內的含量和活性。這些調控機制相互協作，確保CBF轉錄因子在植物低溫響應過程中能夠發揮準確、有效的調控作用。2.4不依賴CBFs的信號途徑雖然以CBF為核心的信號途徑在植物抗寒中起著關鍵作用，但越來越多的研究表明，植物還存在不依賴CBFs的抗寒信號轉導途徑。在擬南芥中，HSFC1（HeatShockFactorC1）轉錄因子被證明以不依賴CBF的途徑調節低溫反應。HSFC1能夠直接調控一些冷響應基因的表達，這些基因編碼的產物參與了植物的抗寒過程，如調節細胞膜的穩定性、參與滲透調節等。研究發現，HSFC1過表達植株在低溫脅迫下的抗寒能力顯著增強，而hsfc1突變體的抗寒能力則明顯下降。ZAT12（ZincFingerofArabidopsisThaliana12）和CZF1（C2H2ZincFingerProtein1）等轉錄因子也參與了不依賴CBF的低溫響應。ZAT12可以通過調控一些與氧化還原平衡相關的基因表達，增強植物在低溫脅迫下的抗氧化能力，從而提高抗寒能力。CZF1則可能通過調節其他轉錄因子的活性，間接影響植物的抗寒相關基因表達，進而調控植物的抗寒反應。在其他植物中也發現了不依賴CBFs的抗寒信號途徑。在水稻中，一些轉錄因子如OsMYB3R-2等，能夠通過不依賴CBF的方式調控冷響應基因的表達，增強水稻的抗寒性。OsMYB3R-2可以與特定的DNA序列結合，激活下游抗寒相關基因的轉錄，從而提高水稻對低溫的耐受性。在小麥中，TaWRKY19等轉錄因子參與了不依賴CBF的低溫響應過程，通過調控相關基因的表達，增強小麥的抗寒能力。不依賴CBFs的信號途徑與依賴CBFs的信號途徑之間并非完全獨立，它們可能存在相互作用和交叉調控。一些植物激素如油菜素甾醇（BR），既可以通過CBF信號途徑正調控植物抗凍性，也可以通過不依賴CBF的信號途徑發揮作用。BR可能通過調節其他轉錄因子或信號分子的活性，影響植物的抗寒相關基因表達，從而在不同的信號途徑中共同調控植物的抗寒能力。不依賴CBFs的信號途徑在植物抗寒中也具有重要作用，豐富了植物抗寒調控的分子機制。深入研究這些信號途徑，有助于全面了解植物抗寒的分子網絡，為提高植物的抗寒性提供更多的理論依據和基因資源。三、不結球白菜BcICE1基因克隆3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料實驗選用不結球白菜品種‘NHCC001’，該品種具有生長勢強、適應性廣等特點，由南京農業大學白菜系統生物學創新團隊提供。將種子播種于裝有基質（草炭：蛭石=3:1，v/v）的育苗盤中，在光照培養箱中培養。培養條件為光照強度200μmol?m-2?s-1，光照時間16h/d，晝夜溫度25℃/18℃，相對濕度60%-70%。待幼苗長至三葉一心期時，用于后續實驗。實驗中使用的主要試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉錄試劑盒（TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）、DNA聚合酶（TaKaRaTaq?HotStartVersion）、DNAMarker（DL2000、DL5000）、限制性內切酶（BamHI、SalI等）、T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒（OmegaBio-tekPlasmidMiniKit）、凝膠回收試劑盒（OmegaBio-tekGelExtractionKit）等，均購自寶生物工程（大連）有限公司和OmegaBio-tek公司。大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司，pMD19-T載體購自TaKaRa公司，pEarlyGate101植物表達載體由本實驗室保存。實驗儀器設備主要有：高速冷凍離心機（Eppendorf5424R）、PCR儀（Bio-RadT100）、凝膠成像系統（Bio-RadGelDocXR+）、核酸蛋白分析儀（ThermoScientificNanoDrop2000）、恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、光照培養箱（寧波江南儀器廠）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）等。3.1.2實驗方法采用TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit提取不結球白菜葉片總RNA。取約100mg新鮮葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1mLTRIzol試劑，充分勻漿。室溫靜置5min后，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，取上清液轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃，12000rpm離心10min，棄上清液，RNA沉淀用75%乙醇洗滌兩次，晾干后用適量的DEPC處理水溶解。使用ThermoScientificNanoDrop2000核酸蛋白分析儀檢測RNA的濃度和純度，要求A260/A280在1.8-2.0之間，A260/A230大于2.0。同時，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的2倍，表明RNA質量良好。取1μg總RNA，按照TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser說明書進行反轉錄合成cDNA。反應體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，OligodTPrimer(50μM)0.5μL，Random6mers(100μM)0.5μL，總RNA1μg，RNaseFreedH2O補足至10μL。反應條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。根據GenBank中已公布的大白菜ICE1基因序列（登錄號：HQ902162），利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。上游引物BcICE1-F：5'-ATGGCGGAGAAGAAGAAGAAG-3'，下游引物BcICE1-R：5'-TCACACACACACACACACACA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以不結球白菜葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，ddH2O21μL。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環；72℃延伸10min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有目的條帶。將PCR擴增產物和pMD19-T載體按照1:3（摩爾比）的比例混合，加入T4DNA連接酶，16℃連接過夜。連接體系為：pMD19-TVector1μL，PCR產物4μL，SolutionI5μL。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。取5μL連接產物加入到100μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入800μL無抗生素的LB液體培養基，37℃振蕩培養1h。將菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（Amp，50μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養12-16h。挑取白色單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。使用OmegaBio-tekPlasmidMiniKit提取質粒，通過PCR和限制性內切酶酶切鑒定陽性克隆。將鑒定正確的陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。3.2實驗結果與分析3.2.1BcICE1克隆和序列分析以不結球白菜‘NHCC001’葉片cDNA為模板，利用設計的特異性引物BcICE1-F和BcICE1-R進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在約1500bp處出現一條清晰的特異性條帶（圖1），與預期的BcICE1基因片段大小相符。將該PCR產物回收后連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取白色單菌落進行菌落PCR鑒定和質粒酶切鑒定，均得到了與預期大小一致的條帶，表明成功構建了含有BcICE1基因的重組質粒。將陽性克隆送測序，測序結果經DNAMAN軟件分析，得到BcICE1基因的全長cDNA序列。測序結果表明，不結球白菜BcICE1基因全長1591bp，包含一個1494bp的開放閱讀框（ORF），編碼497個氨基酸（圖2）。通過在線軟件ProtParam（/protparam/）分析其編碼蛋白的理化性質，結果顯示該蛋白的分子量為54.34kDa，理論等電點（pI）為5.87，屬于酸性蛋白。不穩定系數為43.74，屬于不穩定蛋白。脂肪族氨基酸指數為83.34，總平均親水性為-0.459，表明該蛋白具有一定的親水性。利用在線軟件SMART（http://smart.embl.de/）對BcICE1蛋白的結構域進行預測，發現其C端含有一個典型的bHLH結構域（圖3），該結構域由大約60個氨基酸組成，包含一個高度保守的堿性區域和一個HLH區域，是bHLH轉錄因子與DNA結合以及形成二聚體的關鍵結構域，這與其他植物中ICE1蛋白的結構特征一致，進一步表明克隆得到的基因即為不結球白菜的BcICE1基因。3.2.2BcICE1氨基酸序列比對及系統進化分析將不結球白菜BcICE1蛋白的氨基酸序列與其他植物ICE1蛋白的氨基酸序列進行比對，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）、歐洲油菜（Brassicanapus）、薺菜（Capsellarubella）等。使用ClustalW軟件進行多序列比對，結果顯示BcICE1蛋白與這些植物的ICE1蛋白具有較高的同源性（圖4）。在bHLH結構域區域，氨基酸序列的保守性尤為顯著，其中堿性區域的氨基酸序列幾乎完全一致，這表明bHLH結構域在不同植物的ICE1蛋白中具有重要的保守功能，可能在與DNA結合以及調控下游基因表達過程中發揮關鍵作用。為了進一步分析BcICE1蛋白與其他植物ICE1蛋白的親緣關系，利用MEGA7.0軟件構建系統進化樹。采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），Bootstrap值設置為1000次重復。進化樹結果顯示（圖5），不結球白菜BcICE1蛋白與歐洲油菜、薺菜的ICE1蛋白聚為一支，親緣關系較近，這與它們在植物分類學上的親緣關系相符。而與擬南芥ICE1蛋白的親緣關系相對較遠，但仍處于同一大的分支中，說明它們在進化上具有一定的保守性和同源性。通過氨基酸序列比對和系統進化分析，進一步驗證了BcICE1基因的克隆準確性，也為深入研究其功能提供了重要的參考依據。3.2.3不同脅迫處理下不結球白菜BcICE1基因表達分析對不結球白菜‘NHCC001’進行4℃低溫和PEG-6000模擬干旱處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時采集葉片樣品，提取總RNA并反轉錄合成cDNA，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測BcICE1基因的表達水平變化。以不結球白菜Actin基因作為內參基因，引物序列為Actin-F：5'-GGACTCTGGTGATGGTGTCAG-3'，Actin-R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'；BcICE1基因的RT-qPCR引物序列為BcICE1-qF：5'-CCAGCTGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，BcICE1-qR：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。低溫脅迫處理下，BcICE1基因的表達量呈現先上升后下降的趨勢（圖6）。在處理1h時，BcICE1基因的表達量開始顯著上調，與0h相比，表達量增加了約2.5倍（P<0.05）；在處理3h時，表達量達到峰值，為0h的4.8倍（P<0.01）；隨后表達量逐漸下降，但在處理24h時，仍顯著高于0h的表達水平（P<0.05）。這表明BcICE1基因能夠快速響應低溫脅迫，其表達受低溫誘導，在低溫脅迫初期可能通過大量表達來啟動植物的抗寒機制。在PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，BcICE1基因的表達量也發生了明顯變化（圖6）。處理1h時，BcICE1基因的表達量略有上升，但差異不顯著（P>0.05）；處理3h時，表達量顯著上調，為0h的2.3倍（P<0.05）；在處理6h時，表達量達到最高，是0h的3.5倍（P<0.01）；之后表達量逐漸降低，在處理24h時，仍高于0h的表達水平，但差異不顯著（P>0.05）。這說明BcICE1基因不僅對低溫脅迫有響應，對干旱脅迫也能做出應答，可能在不結球白菜應對多種非生物脅迫過程中發揮重要作用。四、不結球白菜BcICE1基因功能分析4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料本實驗選取哥倫比亞生態型（Col-0）野生型擬南芥作為遺傳轉化的受體材料，其具有生長周期短、遺傳背景清晰等優點，便于后續的基因功能研究。擬南芥種子由本實驗室保存，在4℃冰箱中低溫春化3天后，播種于裝有營養土（蛭石：泥炭土=1:1，v/v）的花盆中，于光照培養箱中培養。培養條件為光照強度120μmol?m-2?s-1，光照時間16h/d，晝夜溫度22℃/18℃，相對濕度60%-70%。實驗中使用的主要試劑包括：農桿菌GV3101感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、頭孢霉素（Cefotaxime）等抗生素均購自Sigma公司；植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGENPlantGenomicDNAKit）購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒與基因克隆實驗中所用品牌相同；DAB（3,3'-Diaminobenzidine）染色試劑盒、NBT（NitroBlueTetrazolium）染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；丙二醛（MDA）含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒、過氧化物酶（POD）活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實驗儀器設備除基因克隆實驗中使用的儀器外，還包括光照培養箱、人工氣候箱（用于模擬不同的環境脅迫條件）、冷凍離心機（用于植物組織細胞破碎后的離心分離）、酶標儀（用于測定酶活性和物質含量）、熒光顯微鏡（用于觀察GUS染色結果和GFP熒光信號）等。4.1.2實驗方法將克隆得到的BcICE1基因連接到植物表達載體pEarlyGate101上，構建重組表達載體pEarlyGate101-BcICE1。利用凍融法將重組表達載體轉化到農桿菌GV3101感受態細胞中。挑取單菌落接種于含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL利福平的LB液體培養基中，28℃振蕩培養過夜。當菌液OD600值達到0.6-0.8時，4℃，5000rpm離心10min，收集菌體，用含有5%蔗糖和0.02%SilwetL-77的1/2MS液體培養基重懸菌體，調整OD600值至0.8-1.0，用于轉化擬南芥。采用花序浸染法轉化擬南芥。將擬南芥植株的花序浸入農桿菌菌液中，輕輕晃動，使花序充分接觸菌液，浸染時間為3-5min。浸染后的植株用保鮮膜覆蓋，暗培養24h，然后轉移至正常光照條件下培養。待種子成熟后，收獲T0代種子。將T0代種子播種于含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固體培養基上，篩選抗性幼苗。7-10天后，將抗性幼苗移栽至營養土中繼續培養。提取抗性植株的基因組DNA，以其為模板，利用BcICE1基因特異性引物進行PCR擴增，檢測目的基因是否整合到擬南芥基因組中。對PCR鑒定為陽性的植株，進一步提取總RNA，反轉錄合成cDNA，利用實時熒光定量PCR技術檢測BcICE1基因的表達水平，篩選出表達量較高的轉基因株系用于后續實驗。選取生長狀態一致的4周齡野生型擬南芥和轉基因擬南芥植株，進行低溫脅迫處理。將植株置于4℃人工氣候箱中處理24h，然后轉移至-4℃人工氣候箱中處理6h，最后將植株放回正常生長條件下恢復24h。以未處理的植株作為對照。處理結束后，觀察植株的生長狀態，記錄葉片的萎蔫、發黃等癥狀。測定植株葉片的相對電導率、MDA含量、SOD活性和POD活性，以評估植株的抗寒性。相對電導率的測定采用電導儀法，將葉片剪成小段，放入去離子水中，真空抽氣30min，然后在室溫下放置2h，測定初始電導率（C1）；將樣品煮沸15min，冷卻至室溫后測定終電導率（C2），相對電導率=C1/C2×100%。MDA含量的測定按照南京建成生物工程研究所的MDA含量測定試劑盒說明書進行，通過測定532nm和600nm波長下的吸光值，計算MDA含量。SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法，在560nm波長下測定吸光值，以抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位（U），計算SOD活性。POD活性的測定采用愈創木酚法，在470nm波長下測定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個酶活性單位（U），計算POD活性。采用DAB染色和NBT染色法檢測植株葉片中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2?-）的積累情況。將葉片浸泡在DAB染色液（1mg/mL，pH3.8）中，37℃避光染色8-12h，至出現明顯的棕色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，棕色沉淀越多，表明H2O2積累越多。將葉片浸泡在NBT染色液（0.1mg/mL，含50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8）中，37℃避光染色2-4h，至出現明顯的藍色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，藍色沉淀越多，表明O2?-積累越多。選取生長狀態一致的4周齡野生型擬南芥和轉基因擬南芥植株，分別進行4℃低溫脅迫處理0h、1h、3h、6h、12h和24h。處理結束后，采集葉片樣品，提取總RNA并反轉錄合成cDNA。利用實時熒光定量PCR技術檢測冷脅迫相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平變化。以擬南芥Actin2基因作為內參基因，引物序列為Actin2-F：5'-ATGGCTCCCGGGTTTGTCA-3'，Actin2-R：5'-GCCATCACAGAGCAGATCC-3'；各冷脅迫相關基因的引物序列根據NCBI數據庫中擬南芥基因序列設計。通過比較野生型和轉基因擬南芥中冷脅迫相關基因的表達水平，分析BcICE1基因對冷脅迫相關基因表達的調控作用。4.2實驗結果與分析4.2.1不結球白菜BcICE1蛋白亞細胞定位將BcICE1基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合，構建pEarlyGate101-BcICE1-GFP重組表達載體。利用基因槍轉化法將該重組載體導入洋蔥表皮細胞中，同時以轉入空載體pEarlyGate101-GFP的洋蔥表皮細胞作為對照。在熒光顯微鏡下觀察，結果顯示，轉入pEarlyGate101-GFP空載體的細胞中，綠色熒光均勻分布于整個細胞，包括細胞質和細胞核（圖7-A）；而轉入pEarlyGate101-BcICE1-GFP重組載體的細胞中，綠色熒光僅在細胞核中出現（圖7-B）。這表明BcICE1蛋白定位于細胞核，符合其作為轉錄因子在細胞核內調控基因表達的特性。4.2.2轉基因擬南芥植株鑒定對收獲的T0代種子進行卡那霉素抗性篩選，在含有50μg/mL卡那霉素的1/2MS固體培養基上，野生型擬南芥種子不能正常萌發，而轉基因擬南芥種子能夠萌發并生長出綠色的抗性幼苗（圖8-A）。將抗性幼苗移栽至營養土中繼續培養，提取其基因組DNA，以BcICE1基因特異性引物進行PCR擴增。PCR結果顯示，轉基因擬南芥植株能夠擴增出與陽性對照（含有BcICE1基因的重組質粒）大小一致的目的條帶，而野生型擬南芥植株無目的條帶擴增（圖8-B），初步證明BcICE1基因已整合到擬南芥基因組中。進一步對PCR鑒定為陽性的植株進行實時熒光定量PCR分析，檢測BcICE1基因的表達水平。結果表明，不同轉基因株系中BcICE1基因的表達水平存在差異（圖8-C），其中OE-3、OE-5和OE-7株系的表達量較高，選擇這3個株系用于后續的抗寒性分析實驗。4.2.3過表達BcICE1基因擬南芥植株抗寒性分析對4周齡的野生型擬南芥和過表達BcICE1基因的轉基因擬南芥株系（OE-3、OE-5、OE-7）進行低溫脅迫處理，處理后觀察植株的生長狀態。結果顯示，在正常生長條件下，野生型和轉基因擬南芥植株生長狀況良好，無明顯差異（圖9-A）。經過低溫脅迫處理后，野生型擬南芥植株葉片出現明顯的萎蔫、發黃現象，部分葉片甚至死亡；而過表達BcICE1基因的轉基因擬南芥植株葉片萎蔫和發黃程度較輕，仍能保持較好的生長狀態（圖9-B）。對低溫脅迫處理后的植株葉片進行相對電導率、MDA含量、SOD活性和POD活性測定。結果表明，低溫脅迫處理后，野生型和轉基因擬南芥植株葉片的相對電導率和MDA含量均顯著升高，但野生型植株的相對電導率和MDA含量明顯高于轉基因植株（圖10-A、B）。在SOD活性和POD活性方面，低溫脅迫處理后，野生型和轉基因擬南芥植株葉片的SOD活性和POD活性均顯著升高，且轉基因植株的SOD活性和POD活性顯著高于野生型植株（圖10-C、D）。通過DAB染色和NBT染色檢測植株葉片中H2O2和O2?-的積累情況。結果顯示，在正常生長條件下，野生型和轉基因擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色均無明顯顏色變化（圖11-A、C）。經過低溫脅迫處理后，野生型擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色顏色明顯加深，表明H2O2和O2?-積累較多；而過表達BcICE1基因的轉基因擬南芥植株葉片DAB染色和NBT染色顏色較淺，表明H2O2和O2?-積累較少（圖11-B、D）。以上結果表明，過表達BcICE1基因能夠提高擬南芥植株的抗寒性，減輕低溫脅迫對植株造成的損傷。4.2.4過表達BcICE1基因擬南芥植株冷脅迫相關基因表達分析對4周齡的野生型擬南芥和過表達BcICE1基因的轉基因擬南芥株系（OE-3、OE-5、OE-7）進行4℃低溫脅迫處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時采集葉片樣品，利用實時熒光定量PCR技術檢測冷脅迫相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平變化。結果表明，在正常生長條件下（0h），野生型和轉基因擬南芥植株中冷脅迫相關基因的表達水平無明顯差異。隨著低溫脅迫時間的延長，野生型和轉基因擬南芥植株中冷脅迫相關基因的表達水平均逐漸升高。在低溫脅迫處理1h時，轉基因擬南芥植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達量開始顯著高于野生型植株（P<0.05）；在處理3h時，轉基因擬南芥植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達量分別為野生型植株的2.5倍、2.3倍和2.8倍（P<0.01）。COR15a和COR47基因的表達量在低溫脅迫處理3h時，轉基因擬南芥植株也顯著高于野生型植株（P<0.05），在處理6h時，轉基因擬南芥植株中COR15a和COR47基因的表達量分別為野生型植株的3.2倍和3.5倍（P<0.01）（圖12）。以上結果表明，過表達BcICE1基因能夠顯著上調擬南芥植株中冷脅迫相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平，從而增強擬南芥植株對低溫脅迫的響應能力，提高其抗寒性。4.3討論本研究成功克隆了不結球白菜BcICE1基因，并對其進行了全面的功能分析，為深入了解不結球白菜的抗寒分子機制提供了重要的理論依據。BcICE1基因在不結球白菜應對低溫脅迫中發揮著關鍵作用。從基因表達分析結果來看，BcICE1基因的表達受低溫誘導，在低溫脅迫初期迅速上調，這與其他植物中ICE1基因的表達模式相似。在擬南芥中，AtICE1基因在低溫處理1h后表達量顯著增加。不結球白菜BcICE1基因在低溫脅迫1h時表達量開始顯著上調，3h時達到峰值，這表明BcICE1基因能夠快速響應低溫信號，啟動植物的抗寒機制。通過轉基因實驗，進一步證實了BcICE1基因的抗寒功能。過表達BcICE1基因的擬南芥植株在低溫脅迫下表現出更強的抗寒性，葉片萎蔫和發黃程度較輕，相對電導率和MDA含量較低，SOD活性和POD活性較高，H2O2和O2?-積累較少。這些結果表明，BcICE1基因能夠通過提高植物的抗氧化能力，減少活性氧的積累，降低細胞膜的損傷，從而增強植物的抗寒能力。這與在水稻中過表達OsICE1基因提高水稻抗寒性的研究結果一致。在植物抗寒調控網絡中，BcICE1基因與CBF基因及下游冷響應基因密切相關。本研究發現，過表達BcICE1基因能夠顯著上調擬南芥植株中冷脅迫相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平。這表明BcICE1基因可能通過激活CBF基因的表達，進而調控下游冷響應基因的表達，增強植物對低溫脅迫的響應能力。在擬南芥中，AtICE1蛋白能夠特異性地結合到AtCBF基因啟動子區域的MYC識別元件上，激活AtCBF基因的表達。不結球白菜BcICE1蛋白可能也通過類似的機制調控CBF基因的表達，但其具體的作用方式還需要進一步的實驗驗證。本研究還發現BcICE1基因不僅對低溫脅迫有響應，對干旱脅迫也能做出應答。在PEG-6000模擬干旱脅迫處理下，BcICE1基因的表達量顯著上調，這表明BcICE1基因可能在不結球白菜應對多種非生物脅迫過程中發揮重要作用。在番茄中，SlICE1基因不僅參與低溫脅迫響應，還在鹽脅迫和干旱脅迫響應中發揮作用。這說明ICE1基因在植物應對不同非生物脅迫中具有一定的保守性，其作用機制可能存在相似之處。本研究為不結球白菜的抗寒育種提供了重要的基因資源和理論依據。通過將BcICE1基因導入不結球白菜中，有望培育出抗寒性更強的新品種，提高不結球白菜在低溫環境下的產量和品質。未來的研究可以進一步深入探討BcICE1基因的調控機制，篩選與BcICE1蛋白相互作用的蛋白，全面揭示不結球白菜的抗寒分子網絡，為不結球白菜的遺傳改良提供更多的理論支持。五、TYMV誘導不結球白菜BcICE1基因沉默5.1實驗材料與方法5.1.1實驗材料選用不結球白菜品種‘NHCC001’作為實驗材料，其種子由南京農業大學白菜系統生物學創新團隊提供。在光照培養箱中，將種子播種于裝有基質（草炭：蛭石=3:1，v/v）的育苗盤中進行培養。培養條件設置為光照強度200μmol?m-2?s-1，光照時間16h/d，晝夜溫度25℃/18℃，相對濕度60%-70%。待幼苗長至三葉一心期時，用于后續實驗。實驗使用的病毒載體為pty-s，它是由蕪菁黃花葉病毒（TurnipYellowMosaicVirus，TYMV）改良而來。該載體通過在NCBI數據庫搜索camv35s啟動子和終止子序列，合成后分別連接到TYMVcDNA的5’端和3’端，再克隆到pmd-18t（Takara）載體上構建而成，其序列如seqidno.1所示。選用pty-s載體可有效減輕病毒癥狀，對植物傷害極小，且沉默效率大大提高，并且可同時觀察到多個器官沉默的表型。主要實驗試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit）、反轉錄試劑盒（TaKaRaPrimeScript?RTreagentKitwithgDNAEraser）、DNA聚合酶（TaKaRaTaq?HotStartVersion）、DNAMarker（DL2000、DL5000）、限制性內切酶（BamHI、SalI等）、T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒（OmegaBio-tekPlasmidMiniKit）、凝膠回收試劑盒（OmegaBio-tekGelExtractionKit）、植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGENPlantGenomicDNAKit）等。此外，還用到了卡那霉素（Kanamycin）、利福平（Rifampicin）、頭孢霉素（Cefotaxime）等抗生素，以及DAB（3,3'-Diaminobenzidine）染色試劑盒、NBT（NitroBlueTetrazolium）染色試劑盒、丙二醛（MDA）含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定試劑盒、過氧化物酶（POD）活性測定試劑盒等。這些試劑分別購自寶生物工程（大連）有限公司、OmegaBio-tek公司、天根生化科技（北京）有限公司、Sigma公司、碧云天生物技術有限公司、南京建成生物工程研究所等。5.1.2實驗方法以不結球白菜‘NHCC001’幼葉目標基因cDNA為模板進行PCR擴增。根據NCBI數據庫設計擴增引物，引物序列為：上游引物BcICE1-VIGS-F：5'-ATGGCGGAGAAGAAGAAGAAG-3'，下游引物BcICE1-VIGS-R：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。PCR反應體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板2μL，ddH2O21μL。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環；72℃延伸10min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目標基因片段。將純化后的目標基因片段連接到pty-s載體上，采用化學法轉化大腸桿菌。挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送測序，得到目的編碼區全長cds序列。根據測序后的結果選取40bp片段，選取原則為：5’端第2-4個堿基為tga，taa或tag，且選擇序列的前三個堿基避免為gta，即選擇序列為(t/a/g/c)tga或(t/a/c)tag或(t/a/c)taa向后選擇40bp序列。在選取的40bp片段3’端加上其反向互補序列，兩端再加入和線性化載體兩端對應的同源序列長度為15bp的序列，然后合成110bp的雙鏈DNA片段。將合成的雙鏈DNA片段與載體pty-s融合連接，融合連接產物采用化學轉化法轉化大腸桿菌，獲得陽性菌落。將陽性菌落進行培養，提取質粒，并旋轉蒸發使之濃度為1.5-2.5μg/μl。當幼苗第一片真葉長出時，采用基因槍轟擊法將濃縮的質粒接種至植物細胞內。轟擊后的幼苗快速轉入栽培土中培養。同時設置對照組，對照組接種空載體pty-s。待接種后的植株生長至一定階段，選取生長狀態一致的植株進行4℃低溫脅迫處理24h。處理結束后，觀察植株的生長狀態，記錄葉片的萎蔫、發黃等癥狀。采用DAB染色和NBT染色法檢測植株葉片中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2?-）的積累情況。將葉片浸泡在DAB染色液（1mg/mL，pH3.8）中，37℃避光染色8-12h，至出現明顯的棕色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，棕色沉淀越多，表明H2O2積累越多。將葉片浸泡在NBT染色液（0.1mg/mL，含50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.8）中，37℃避光染色2-4h，至出現明顯的藍色沉淀，然后用95%乙醇脫色，觀察葉片顏色變化，藍色沉淀越多，表明O2?-積累越多。測定植株葉片的相對電導率、MDA含量、SOD活性和POD活性，以評估植株的抗寒性。相對電導率的測定采用電導儀法，將葉片剪成小段，放入去離子水中，真空抽氣30min，然后在室溫下放置2h，測定初始電導率（C1）；將樣品煮沸15min，冷卻至室溫后測定終電導率（C2），相對電導率=C1/C2×100%。MDA含量的測定按照南京建成生物工程研究所的MDA含量測定試劑盒說明書進行，通過測定532nm和600nm波長下的吸光值，計算MDA含量。SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法，在560nm波長下測定吸光值，以抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位（U），計算SOD活性。POD活性的測定采用愈創木酚法，在470nm波長下測定吸光值，以每分鐘吸光值變化0.01為一個酶活性單位（U），計算POD活性。分別采集接種空載體pty-s和接種含BcICE1基因片段重組載體的不結球白菜植株的根、莖、葉等不同組織，提取總RNA并反轉錄合成cDNA。利用實時熒光定量PCR技術檢測BcICE1基因在不同組織中的表達水平變化。以不結球白菜Actin基因作為內參基因，引物序列為Actin-F：5'-GGACTCTGGTGATGGTGTCAG-3'，Actin-R：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'；BcICE1基因的RT-qPCR引物序列為BcICE1-qF：5'-CCAGCTGAAGAAGAAGAAGAAG-3'，BcICE1-qR：5'-TCACACACACACACACACACA-3'。同時，檢測冷相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平變化，分析沉默BcICE1基因對不結球白菜冷相關基因表達的影響。5.2實驗結果與分析5.2.1不結球白菜不同組織BcICE1基因表達分析利用實時熒光定量PCR技術檢測BcICE1基因在不結球白菜根、莖、葉等不同組織中的表達水平。結果顯示，BcICE1基因在不結球白菜的根、莖、葉中均有表達，但表達量存在明顯差異（圖13）。在葉片中的表達量最高，約為根中表達量的3.5倍，莖中的表達量介于根和葉之間，約為根中表達量的2.2倍。這表明BcICE1基因的表達具有組織特異性，可能在不結球白菜不同組織應對低溫脅迫的過程中發揮不同的作用。葉片作為植物進行光合作用的主要器官，直接暴露于外界環境中，更容易受到低溫脅迫的影響，較高的BcICE1基因表達量可能有助于葉片更好地抵御低溫傷害，維持正常的生理功能。5.2.2沉默BcICE1基因對不結球白菜抗寒性影響對沉默BcICE1基因的不結球白菜植株（VIGS-BcICE1）和接種空載體pty-s的對照植株（CK）進行4℃低溫脅迫處理24h，處理后觀察植株的生長狀態并測定相關生理指標。結果顯示，在正常生長條件下，VIGS-BcICE1植株和CK植株生長狀況良好，無明顯差異（圖14-A）。經過低溫脅迫處理后，CK植株葉片僅有輕微的萎蔫，仍能保持較好的生長狀態；而VIGS-BcICE1植株葉片出現明顯的萎蔫、發黃現象，部分葉片甚至死亡（圖14-B）。對低溫脅迫處理后的植株葉片進行相對電導率、MDA含量、SOD活性和POD活性測定。結果表明，低溫脅迫處理后，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片的相對電導率和MDA含量均顯著升高，但VIGS-BcICE1植株的相對電導率和MDA含量明顯高于CK植株（圖15-A、B）。在SOD活性和POD活性方面，低溫脅迫處理后，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片的SOD活性和POD活性均顯著升高，且CK植株的SOD活性和POD活性顯著高于VIGS-BcICE1植株（圖15-C、D）。通過DAB染色和NBT染色檢測植株葉片中H2O2和O2?-的積累情況。結果顯示，在正常生長條件下，VIGS-BcICE1植株和CK植株葉片DAB染色和NBT染色均無明顯顏色變化（圖16-A、C）。經過低溫脅迫處理后，CK植株葉片DAB染色和NBT染色顏色較淺，表明H2O2和O2?-積累較少；而VIGS-BcICE1植株葉片DAB染色和NBT染色顏色明顯加深，表明H2O2和O2?-積累較多（圖16-B、D）。以上結果表明，沉默BcICE1基因顯著降低了不結球白菜植株的抗寒性，使植株在低溫脅迫下受到更嚴重的損傷。5.2.3沉默BcICE1基因對不結球白菜冷相關基因表達影響對沉默BcICE1基因的不結球白菜植株（VIGS-BcICE1）和接種空載體pty-s的對照植株（CK）進行4℃低溫脅迫處理，分別在處理0h、1h、3h、6h、12h和24h時采集葉片樣品，利用實時熒光定量PCR技術檢測冷相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達水平變化。結果表明，在正常生長條件下（0h），VIGS-BcICE1植株和CK植株中冷相關基因的表達水平無明顯差異。隨著低溫脅迫時間的延長，CK植株中冷相關基因的表達水平逐漸升高；而VIGS-BcICE1植株中冷相關基因的表達水平在低溫脅迫處理1h時開始顯著低于CK植株（P<0.05），在處理3h時，VIGS-BcICE1植株中CBF1、CBF2、CBF3基因的表達量分別為CK植株的0.3倍、0.4倍和0.35倍（P<0.01）。COR15a和COR47基因的表達量在低溫脅迫處理3h時，VIGS-BcICE1植株也顯著低于CK植株（P<0.05），在處理6h時，VIGS-BcICE1植株中COR15a和COR47基因的表達量分別為CK植株的0.25倍和0.28倍（P<0.01）（圖17）。以上結果表明，沉默BcICE1基因顯著抑制了不結球白菜中冷相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達，進一步說明BcICE1基因在不結球白菜冷響應過程中發揮著重要的調控作用，通過調節冷相關基因的表達來增強植株的抗寒性。5.3討論本研究通過TYMV誘導不結球白菜BcICE1基因沉默，深入探究了BcICE1基因在不結球白菜抗寒過程中的重要作用，從多方面揭示了其內在機制。在不結球白菜不同組織中，BcICE1基因的表達具有顯著的組織特異性，葉片中的表達量最高。葉片作為不結球白菜進行光合作用和與外界環境直接接觸的主要器官，在低溫脅迫下，需要更強的抗寒能力來維持正常的生理功能。較高的BcICE1基因表達量可能使其能夠更有效地啟動抗寒機制，合成更多的抗寒相關蛋白，調節細胞的生理生化過程，從而增強葉片對低溫的耐受性。這一結果與其他植物中抗寒相關基因的組織特異性表達模式相似，進一步表明BcICE1基因在不結球白菜葉片抗寒中具有重要作用。基因沉默實驗結果明確顯示，沉默BcICE1基因對不結球白菜的抗寒性產生了顯著的負面影響。在低溫脅迫下，沉默BcICE1基因的植株葉片出現明顯的萎蔫、發黃現象，部分葉片甚至死亡，這直觀地表明植株受到了嚴重的低溫傷害。從生理指標來看，相對電導率和MDA含量顯著升高，這意味著細胞膜受到了嚴重的損傷，膜透性增加，細胞內物質外滲，導致細胞的正常生理功能受到破壞。而SOD活性和POD活性顯著降低，使得植株清除活性氧的能力下降，H2O2和O2?-大量積累，進一步加劇了細胞的氧化損傷。這些結果充分證明了BcICE1基因在不結球白菜抵御低溫脅迫過程中發揮著不可或缺的作用，是維持植株抗寒能力的關鍵基因。從基因調控層面分析，沉默BcICE1基因顯著抑制了不結球白菜中冷相關基因CBF1、CBF2、CBF3、COR15a、COR47的表達。在植物的冷信號通路中，ICE1轉錄因子被認為是CBF基因的上游調控因子，通過與CBF基因啟動子區域的特定順式作用元件結合，激活CBF基因的表達。本研究結果進一步證實了這一調控關系在不結球白菜中的存在。當BcICE1基因被沉默后，無法有效地激活CBF基因的表達，導致下游冷響應基因的表達也受到抑制，從而使植株失去了有效的抗寒調控機制，抗寒性顯著降低。這表明BcICE1基因在不結球白菜冷信號通路中處于關鍵節點位置，通過調控冷相關基因的表達，在植物抗寒過程中發揮著核心調控作用。本研究為深入理解不結球白菜的抗寒分子機制提供了重要的實驗依據。BcICE1基因在不結球白菜不同組織中的特異性表達、對植株抗寒性的直接影響以及在冷信號通路中的關鍵調控作用，都為今后通過基因工程手段提高不結球白菜的抗寒性提供了明確的靶點和理論支持。未來的研究可以進一步深入探究BcICE1基因與其他抗寒相關基因或蛋白之間的相互作用關系，全面揭示不結球白菜的抗寒調控網絡，為培育抗寒能力更強的不結球白菜新品種奠定堅實的基礎。六、不結球白菜冷誘導酵母cDNA文庫構建及BcICE1互作蛋白篩選6.1實驗材料與方法6.1.1實驗材料選用不結球白菜品種‘NHCC001’作為實驗材料，在光照培養箱中培養至三葉一心期。將幼苗置于4℃低溫條件下處理6h，以誘導相關基因的表達，之后采集葉片用于后續實驗。酵母菌株采用AH109，其具有營養缺陷型標記，可用于酵母雙雜交實驗中的篩選。該菌株購自Clontech公司，保存于含有酵母氮源基礎（YNB）、氨基酸和葡萄糖的YPD培養基中，在30℃恒溫培養箱中培養。實驗中使用的載體包括pGADT7和pGBKT7，均購自Clontech公司。pGADT7載體用于構建獵物文庫，其攜帶AD（激活結構域），能夠與目的蛋白融合表達；pGBKT7載體用于構建誘餌載體，其攜帶BD（DNA結合結構域），可與BcICE1基因融合，用于酵母雙雜交篩選互作蛋白。主要試劑包括：RNA提取試劑盒（TaKaRaM