第三章細胞生物學研究辦法顯微技術生物化學與分子生物學技術細胞培養(yǎng)放大倍數(shù)：成像大小與原物體大小比值。分辨率（分辨力）：指分辨物體最小間隔的能力。樣品的反差狀況：被觀察構造與其背景對光吸取的差別程度。一、顯微觀察中的幾個參數(shù)光的干涉分辨率——取決于光源波長λ、物鏡鏡口角α和介質折射率N不同光線的波長Magnificationandresolution

細胞大小和觀察人眼0.2mm；光鏡0.2μm；電鏡0.2nm

二、光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。1.普通光學顯微鏡構成：照明系統(tǒng)：可見光光學放大系統(tǒng)；光能夠透過樣品放大倍數(shù)：1000-1400樣品制備固定樣品保持在原始狀態(tài)。包埋石蠟或樹脂包埋切片制成薄片染色提高對比度。2.活細胞觀察相差顯微鏡（P.Zernike，1932）：物鏡后裝有相差板，根據(jù)細胞內容物的折射率不同來增加樣品反差。微分干涉顯微鏡(1952,nomarski）：平面偏振光，增加樣品反差。將直射光和物體衍射的光分開；使兩束光互相干涉，使物體呈現(xiàn)明暗對比，因而能夠識別無色透明物體。

聚光鏡中央有擋光片，照明光不直接進入物鏡(散射光），只有標本反射或衍射光才干進入，視野背景是暗的，樣品是亮的。暗視野顯微鏡Bright-fieldMicroscopyPhase-contrastMicroscopyNomarskidifferential-interference-contrastMicroscopyDark-fieldMicroscopy能夠觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞（顯微錄像技術）

3熒光顯微鏡

(1941,Coons）

fluorescencemicroscope光源和樣品之間加上激發(fā)濾光片。物鏡和目鏡之間裝有阻斷濾片。用于特定核酸序列在染色體上的定位，使DNA雜交技術和熒光染色技術的結合。

FluorescenceInSituHybridisation免疫熒光染色及熒光放大技術用于特異蛋白在細胞中的定位研究；根據(jù)抗原抗體的特異性結合特性。多熒光染色技術綠色:紡錘體紅色:著絲點藍色:DNA4激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope用激光作光源；能顯示細胞樣品的立體構造。分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。藍色為細胞核，綠色為微管5倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細胞，普通含有相差物鏡。

三、電子顯微鏡

以電子束為光源。用于觀察超微構造（不大于0.2μm），又稱亞顯微構造。

scanningelectronmicroscope,SEM1掃描電子顯微鏡用來觀察標本的表面構造；高真空系統(tǒng)；電子束為光源；電磁透鏡聚焦；通過電子束掃描樣品表面產生二次電子成像；有效放大倍率20000；樣品切片后需金屬鍍膜。系統(tǒng)與SEM相似；實際放大倍數(shù)可達幾十萬倍；光源穿過樣品，因此切片規(guī)定非常薄（40-50nm)。用重金屬鹽染色。1.原理2透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM光學顯微鏡照片×1000掃描電鏡照片×4000透射電鏡照片（×20000）三維立體圖像的構建樣品在不同的角度切片和觀察拍照，然后通過電腦重構。

UseoftheElectronMicroscopetoproducea3Dimage

第二節(jié)生物化學與分子

生物學技術一、離心技術涉及細胞組分分離和生物大分子分離，分離后的成分能夠用于進一步的研究1差速離心

Differentialcentrifugation根據(jù)被分離物質的體積差別，采用逐步提高離心速度的辦法分離不同大小的細胞器。介質密度均一；速度由低向高，逐級離心；體積越小，需要離心速度越高，。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation2密度離心在離心管內形成一密度梯度，通過離心力作用使不同密度的顆粒懸浮到對應的介質密度區(qū)。慣用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。速度沉降分離密度相近而大小形狀不同的細胞組分；密度梯度較小；各細胞組分在不同速度下沉降，形成不同沉降帶。等密度沉降分離不同密度的細胞組分；介質為高密度持續(xù)梯度；組分在相似離心力下長時間沉降到與本身密度相等的位置。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation層析法-分離蛋白質等生物大分子物質，根據(jù)待分離組分的形態(tài)、大小、電荷的不同進行分離辦法。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質和DNA等；根據(jù)樣品大小、形狀、電荷分布不同所引發(fā)在電場中遷移速率不同達成分開的目的。TheFluorescentActivatedCellSorter二、分子雜交技術

分子雜交（molecularhybridization）指含有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則雜交，形成異質雙鏈的過程。

人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片1原位雜交（insituhybridization）2Southern雜交3菌落雜交第三節(jié)細胞培養(yǎng)

可獲得大量的細胞；在離體條件下觀察和研究細胞生命活動的規(guī)律，涉及細胞的運動、信號轉到，合成代謝等群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

一、動物細胞培養(yǎng)原代細胞（primaryculture）從有機體取出后立刻培養(yǎng)的細胞，普通指1～10代體外培養(yǎng)細胞。傳代細胞（subculture）適應在體外培養(yǎng)傳代的細胞。細胞系（cellline）：可傳代40～50次的傳代細胞。持續(xù)細胞系：原代培養(yǎng)細胞成功傳代即為細胞系,可能無限制的傳下去。動物細胞培養(yǎng)過程二、植物細胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產生愈傷組織。

原生質體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞。

單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉