15I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：張月梅、趙世華、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、張帆、楊斌、劉1間接ELISA方法檢測羊溶血性曼氏桿菌抗體本文件規(guī)定了應用間接ELISA檢測羊溶血性曼氏桿菌抗本文件適用于羊溶血性曼氏桿菌PlpE蛋白3.1或抗原與相應的抗原或抗體形成酶標記的抗原-抗體復合物，在一定底物參與下，復合物上的酶催化底3.2辣根過氧化物酶horseradish與堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）常被用于免疫酶技術中的抗體或抗抗體的標記，而3.33.423.53.63.73.84.2陽性血清分離鑒定并經(jīng)測序確定為溶血性曼氏桿菌的菌液制備全菌滅活抗原，并用其免疫3月齡羔羊制備標4.3陰性血清4,4酶結合物4.5碳酸鹽包被液4,6磷酸鹽緩沖溶液調整pH值為7.4，超純水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅4.7封閉液稱取脫脂乳5.0g，溶于100mL磷酸鹽34.8洗滌液4.9稀釋液4.10底物液A稱取TMB200.0mg，無水乙醇（或二甲基亞砜）100mL，加超純水至10004.11底物液B4.12終止液量取5.6mL濃硫酸（18mol/L）與94.4mL超純水混合，冷卻至室4.13TSA稱取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化鈉5.0g，超純水1000mL，混合，微熱溶解，調節(jié)pH值為7.3，加入15.0g瓊脂，加熱融化后，121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至約60℃,在無菌操作條件下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃4,14TSB稱取胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化鈉5.0g，超純水1000mL，混合解，調節(jié)pH值為7.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。4.15LB液體培養(yǎng)基值為7.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。求下傾注約20mL至無菌平皿中。加蓋后在室溫放至凝固。制備好的培養(yǎng)基宜在2℃~8℃保存。5.3天平：稱量范圍0g~500g，讀數(shù)精確度0.01g。5.5低溫離心機。45.10冰箱。采血器室溫靜置2h，待血液凝固后，將其放入冰箱2℃~8℃3h后，4000r/min離心10min，用移6.2樣本存放及運送血清樣本若在一周內進行檢測，可在冰箱中2℃~8℃保存，落接種于含5%馬血清TSB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12h~16h后，用細菌DNA提取試劑盒提取全菌DNA。28b原核表達載體分別用NdeI和XhoI限制性內切酶酶切，經(jīng)連接酶連接并轉化于大腸桿菌感受態(tài)細胞將含有質粒PlpE-pET-28b的大腸桿菌原核表達載體在含有終濃度為100振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心收集57.2ELISA檢測100μL/孔加入至酶聯(lián)反應板，置4℃冰箱過夜，次日甩掉包被液，用PBST洗滌酶聯(lián)反應板3次。7.3判定標準的確定在已經(jīng)確定的間接ELISA條件下，對經(jīng)間接血凝試驗檢測抗體陰性的20份羊血清，用重組PlpE抗原S/P=(樣品血清A值－陰性血清A值)/(陽