Troglitazone抗人前列腺癌PC-3細胞作用及機制：從分子到整體的深入剖析一、引言1.1研究背景與意義前列腺癌作為全球范圍內男性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著男性的健康和生活質量。近年來，其發病率在我國呈顯著上升趨勢，已然成為泌尿系統腫瘤中不容忽視的公共衛生問題。在2020年，全球范圍內前列腺癌的新發病例數高達141萬，死亡病例數約為37.5萬，這一數據直觀地展現了前列腺癌的高發性與高致死性。在中國，盡管前列腺癌的發病率與西方國家相比仍處于相對較低水平，但增長速度卻極為迅猛，2020年新發病例數約為11.5萬，死亡病例數約為5萬，且隨著人口老齡化進程的加快，預計未來前列腺癌的發病及死亡人數還將持續攀升。前列腺癌的治療方法主要包括手術、放療、化療、內分泌治療等。然而，這些常規治療方式在臨床應用中面臨著諸多困境。例如，手術治療存在一定的局限性，對于晚期或轉移性前列腺癌患者，手術往往無法完全切除腫瘤組織，且手術風險較高，術后可能出現多種并發癥，如尿失禁、性功能障礙等，嚴重影響患者的生活質量。放療在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對周圍正常組織造成一定的損傷，導致放射性膀胱炎、直腸炎等不良反應。化療藥物的副作用較為明顯，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等，會使患者的身體狀況進一步惡化，降低患者對治療的耐受性和依從性。內分泌治療是前列腺癌治療的重要手段之一，但大部分患者在接受內分泌治療1-2年后會發展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），此時內分泌治療的效果顯著下降，疾病進展迅速，患者的預后較差。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）作為一類配體依賴的序列特異的核轉錄因子，在細胞的增殖、分化、代謝及凋亡等生理過程中發揮著關鍵作用。Trog作為一種噻唑烷二酮類藥物，是PPAR-γ的人工合成配體，近年來在腫瘤研究領域受到了廣泛關注。前期研究已初步表明Trog對多種腫瘤細胞具有抑制增殖的作用，但其具體作用機制尚不明確。對于前列腺癌的治療，Trog可能通過激活PPAR-γ，調節下游基因的表達，從而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為；也可能通過配體非依賴途徑，作用于其他信號通路，發揮抗腫瘤作用。然而，這些潛在的作用機制仍有待深入研究和驗證。深入探究Trog抗人前列腺癌PC-3細胞的作用及機制具有至關重要的意義。從理論層面來看，有助于進一步揭示前列腺癌的發病機制和腫瘤細胞的生物學特性，為前列腺癌的基礎研究提供新的思路和方向，豐富對腫瘤發生發展過程中信號轉導機制的認識，拓展對PPAR-γ及其配體在腫瘤領域作用的理解。從臨床應用角度而言，若能明確Trog的抗腫瘤作用機制，有望將其開發為一種新型的前列腺癌治療藥物，為前列腺癌患者提供更多的治療選擇，改善患者的預后，提高患者的生活質量，減輕社會和家庭的醫療負擔。同時，對于那些對傳統治療方法耐藥或不耐受的患者，Trog可能成為一種有效的替代治療方案，具有廣闊的臨床應用前景。1.2國內外研究現狀在前列腺癌治療領域，國內外學者圍繞Trog的抗腫瘤作用及機制展開了大量研究。國外方面，早期研究發現Trog作為PPAR-γ的配體，在乳腺癌細胞系中，能夠通過激活PPAR-γ，上調p21和p27蛋白的表達，從而誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖。在前列腺癌研究中，部分研究聚焦于Trog對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響。有研究表明，Trog可顯著降低前列腺癌細胞系中Bcl-2蛋白的表達水平，同時增加Bax蛋白的表達，促使細胞凋亡。在細胞周期調控方面，Trog能使前列腺癌細胞停滯在G0/G1期，減少S期細胞比例，進而抑制細胞增殖。在侵襲和遷移能力研究上，通過Transwell小室實驗和細胞劃痕實驗發現，Trog處理后的前列腺癌細胞侵襲和遷移能力明顯減弱，其機制可能與下調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達有關。在信號通路研究方面，有研究指出Trog可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的活性，來發揮其抗腫瘤作用。國內研究也取得了一定成果。一項研究以人前列腺癌PC-3細胞為研究對象，運用MTT比色法、流式細胞術、Westernblot、RT-PCR等技術，深入探究Trog的作用及機制。結果顯示，Trog能顯著抑制PC-3細胞的增殖，且呈劑量和時間依賴性。流式細胞術檢測發現，Trog可使G0/G1期細胞顯著增多，細胞凋亡率明顯升高。RT-PCR和Westernblot結果表明，隨著Trog濃度增加，Bcl-2mRNA和蛋白表達均下降，而BaxmRNA和蛋白表達無明顯變化，導致Bcl-2/Bax比值下降。進一步研究發現，Trog可使線粒體膜電位下降，caspase-3的活化率逐漸增加，caspase-3的下游底物ICAD被降解。在細胞內信號通路方面，隨著Trog濃度增加，EGFR、ERK1/2、PI3K、AKT蛋白表達逐漸減少，且Trog對EGFR抑制后的PC-3細胞無抑制增殖及誘導凋亡作用，提示Trog可能通過下調EGFR受體及相關細胞內信號通路發揮抗腫瘤作用。然而，當前關于Trog抗前列腺癌的研究仍存在一些不足。首先，雖然對Trog作用機制的研究已取得一定進展，但具體的分子機制尚未完全明確，尤其是在信號通路的上下游調控關系以及各信號通路之間的交互作用方面，仍需深入探索。其次，大多數研究主要集中在體外細胞實驗和動物模型實驗，缺乏大規模的臨床試驗數據支持，這限制了Trog在臨床治療中的應用。此外，Trog作為一種已上市的藥物，其在臨床應用中的安全性和有效性已得到一定驗證，但在用于前列腺癌治療時，其最佳劑量、給藥方式以及與其他治療方法的聯合應用等方面，還需要進一步的研究和優化。1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究Troglitazone（Trog）抗人前列腺癌PC-3細胞的作用及機制，具體目的如下：明確Trog對PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響：通過體外實驗，運用MTT比色法、流式細胞術、Transwell小室實驗和細胞劃痕實驗等技術，精確測定不同濃度Trog在不同時間點對PC-3細胞增殖的抑制作用，確定其半數抑制濃度（IC50）；準確檢測Trog對PC-3細胞凋亡率的影響，分析凋亡相關蛋白的表達變化；精準評估Trog對PC-3細胞侵襲和遷移能力的影響，為后續機制研究提供直接的細胞生物學依據。揭示Trog抗PC-3細胞作用的分子機制：采用Westernblot、RT-PCR等技術，全面檢測Trog處理后PC-3細胞內與細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移相關的信號通路分子及關鍵基因的表達變化，深入探究Trog在細胞內的信號轉導機制，明確其作用的關鍵靶點和上下游調控關系，從分子層面闡釋Trog的抗腫瘤作用機制。驗證Trog在體內的抗腫瘤活性：通過建立荷瘤裸鼠模型，觀察Trog對荷瘤裸鼠移植瘤生長的抑制情況，檢測瘤組織內相關蛋白的表達，評估Trog在動物整體水平的抗腫瘤活性，為Trog的臨床應用提供更具說服力的實驗依據。本研究在研究視角和方法上具有一定的創新之處：研究視角創新：目前關于Trog抗前列腺癌的研究主要集中在其對細胞增殖和凋亡的影響，而本研究不僅關注這些方面，還深入探討Trog對前列腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，從更全面的角度揭示Trog的抗腫瘤作用，為前列腺癌的治療提供新的思路和方向。研究方法創新：本研究綜合運用多種先進的實驗技術，如激光共聚焦顯微鏡技術觀察細胞內信號分子的定位和動態變化，免疫組織化學技術檢測瘤組織內相關蛋白的表達分布，從細胞水平和組織水平多層次、多角度地研究Trog的作用及機制，使研究結果更加全面、準確、深入。此外，在信號通路研究中，本研究采用基因沉默和過表達技術，進一步驗證關鍵信號分子在Trog抗腫瘤作用中的作用，增強了研究結果的可靠性和說服力。二、相關理論基礎2.1前列腺癌概述前列腺癌是一種起源于前列腺上皮細胞的惡性腫瘤，是男性泌尿生殖系統中最為常見的惡性腫瘤之一。前列腺作為男性特有的性腺器官，位于膀胱下方，緊密圍繞著尿道起始段，其主要生理功能是分泌和儲存精液中的前列腺液，這對于精子的正常運行以及男性生育能力的維持具有不可或缺的重要意義。然而，當前列腺腺泡上皮細胞出現異常的、無序的惡性增生時，便會引發前列腺癌。前列腺癌的發病機制是一個極其復雜的過程，涉及多個基因和信號通路的異常改變。目前的研究表明，遺傳因素在前列腺癌的發病中起著重要作用，家族中有前列腺癌病史的男性，其患病風險顯著高于普通人群。年齡也是一個關鍵因素，隨著年齡的增長，男性患前列腺癌的風險逐漸增加，尤其是50歲以上的男性，前列腺癌的發病率呈現出明顯的上升趨勢。此外，生活方式和環境因素也與前列腺癌的發生密切相關，例如高脂肪飲食會導致體內激素水平失衡，增加前列腺癌的發病風險；缺乏運動可能導致身體代謝減緩，免疫功能下降，從而為癌細胞的生長提供了有利條件；肥胖與前列腺癌的相關性也較為顯著，肥胖者體內的脂肪組織會分泌多種細胞因子和激素，影響前列腺細胞的正常生長和分化。長期接觸某些化學物質，如鎘、鉛等重金屬，以及一些有機化合物，也可能增加前列腺癌的發病風險。在疾病初期，前列腺癌通常沒有明顯的臨床癥狀，這使得早期診斷較為困難。然而，隨著腫瘤的不斷生長和進展，逐漸會出現一系列癥狀。在泌尿系統方面，常見的癥狀包括尿頻、尿急、排尿困難，患者會感覺排尿不盡，尿流變細，甚至出現尿痛和血尿等癥狀。這是因為腫瘤逐漸增大，壓迫尿道，導致尿液排出受阻。部分患者還可能出現腰痛、骨盆痛、背部疼痛等骨骼轉移癥狀，這是由于前列腺癌細胞具有較高的骨轉移傾向，癌細胞通過血液循環轉移到骨骼，破壞骨骼結構，引起疼痛。當癌細胞轉移到脊柱等重要部位時，還可能導致脊髓受壓，引起下肢無力、麻木、大小便失禁等嚴重并發癥，嚴重影響患者的生活質量和身體健康。為了準確評估前列腺癌的病情嚴重程度和制定合理的治療方案，臨床上通常采用TNM分期系統對前列腺癌進行分期。T代表原發腫瘤的情況，Tx表示原發腫瘤無法評估，T0表示無原發腫瘤證據，T1表示腫瘤局限于前列腺內，T1a為偶發腫瘤體積占切除組織5%以下，T1b為偶發腫瘤體積占切除組織5%以上，T1c為通過前列腺穿刺活檢發現的腫瘤；T2表示腫瘤局限于前列腺內，未侵犯周圍組織；T3表示腫瘤突破前列腺包膜，侵犯精囊、膀胱頸等周圍組織；T4表示腫瘤侵犯直腸、盆壁等鄰近器官。N代表區域淋巴結轉移情況，Nx表示區域淋巴結無法評估，N0表示無區域淋巴結轉移，N1表示有區域淋巴結轉移。M代表遠處轉移情況，Mx表示遠處轉移無法評估，M0表示無遠處轉移，M1表示有遠處轉移，M1a為非區域淋巴結轉移，M1b為骨轉移，M1c為其他部位轉移。通過TNM分期系統，醫生可以全面了解患者的病情，為選擇合適的治療方法提供重要依據。前列腺癌的發病率和死亡率在全球范圍內呈現出顯著的地域差異。在歐美國家，前列腺癌的發病率極高，位居男性惡性腫瘤首位。以美國為例，根據美國癌癥協會（ACS）的數據，2023年美國前列腺癌新發病例預計將達到288,300例，占男性所有新發癌癥病例的28%。這可能與歐美國家的生活方式、飲食習慣以及醫療篩查水平等因素有關。歐美國家居民普遍高脂肪、高蛋白飲食，運動量相對較少，這些不良生活方式可能增加前列腺癌的發病風險。同時，歐美國家的醫療體系較為發達，前列腺特異性抗原（PSA）篩查的普及程度較高，使得更多早期前列腺癌患者得以被發現。在亞洲國家，前列腺癌的發病率相對較低，但近年來增長趨勢明顯。在中國，隨著人口老齡化進程的加速、生活方式的西化以及PSA篩查的逐漸普及，前列腺癌的發病率逐年上升。據統計，2020年中國前列腺癌新發病例數約為11.5萬，死亡病例數約為5萬。前列腺癌的死亡率也因地區和分期而異，早期前列腺癌患者經過積極治療，5年生存率較高；然而，晚期前列腺癌患者，尤其是發生遠處轉移的患者，預后較差，5年生存率較低。因此，早期診斷和治療對于改善前列腺癌患者的預后至關重要。2.2PC-3細胞特性PC-3細胞是人前列腺癌細胞，于1979年由Kaufman等人從一位62歲白人男性IV級前列腺腺癌患者的骨轉移灶中成功分離而來。這一細胞系在前列腺癌研究領域具有舉足輕重的地位，為深入探究前列腺癌的發病機制、治療方法以及藥物研發等提供了重要的實驗材料。從生物學特性來看，PC-3細胞具有上皮細胞樣形態，呈貼壁生長方式。在細胞生長過程中，其具有快速的增殖能力，能夠在適宜的培養條件下迅速擴增。研究表明，在含10%胎牛血清的F12K培養基中，PC-3細胞的倍增時間約為24-36小時，這一快速增殖特性使得在實驗研究中能夠在較短時間內獲得大量細胞，滿足后續實驗需求。PC-3細胞還具有高度的轉移能力，這一特性與前列腺癌的臨床轉移特性相契合，通過Transwell小室實驗檢測，在Matrigel基質膠包被的小室中，PC-3細胞在24小時內穿過小室膜的細胞數量可達數百個，模擬了腫瘤細胞在體內的侵襲和轉移過程，為研究前列腺癌的轉移機制提供了良好的細胞模型。在染色體核型方面，PC-3細胞呈現出復雜的異常核型，染色體數目和結構存在多種變異。有研究報道，PC-3細胞的染色體眾數為64-68條，其中包含多條標記染色體和結構異常的染色體，這些染色體異常可能與PC-3細胞的惡性生物學行為密切相關，進一步揭示了其在分子遺傳學層面的特征。PC-3細胞在前列腺癌研究中發揮著不可替代的作用。在評估新藥物對前列腺癌的治療效果時，PC-3細胞是常用的細胞模型之一。通過將不同濃度的藥物作用于PC-3細胞，運用MTT比色法、CCK-8法等檢測細胞活力，可準確評估藥物對細胞增殖的抑制作用，篩選出具有潛在治療效果的藥物。在探究前列腺癌發生和發展的機制方面，PC-3細胞也具有重要價值。通過改變PC-3細胞的基因表達，如運用RNA干擾技術敲除關鍵基因，觀察細胞在增殖、凋亡、侵襲和遷移等方面的變化，從而深入研究這些基因在前列腺癌發生發展過程中的作用機制。此外，在研究前列腺癌的耐藥機制時，PC-3細胞也被廣泛應用。通過建立耐藥細胞株，對比耐藥細胞與親本PC-3細胞在基因表達、蛋白水平以及生物學行為上的差異，有助于揭示前列腺癌耐藥的分子機制，為克服耐藥提供理論依據。2.3Trog簡介Trog，化學名為5-[[4-[(3,4-二氫-6-羥基-2,5,7,8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基]苯基]甲基]-2,4-噻唑烷二酮，是一種噻唑烷二酮類化合物，其化學結構中包含噻唑烷二酮核心結構以及與之相連的苯環和其他取代基。這種獨特的結構賦予了Trog特殊的物理和化學性質，為其在醫藥領域的應用奠定了基礎。在醫藥領域，Trog最初作為一種抗糖尿病藥物被開發和應用。其主要作用機制是通過與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）特異性結合，激活PPAR-γ，進而調節一系列與糖代謝和脂肪代謝相關基因的表達。PPAR-γ是一種在脂肪細胞、肝臟細胞和骨骼肌細胞等多種細胞中表達的核轉錄因子，被激活后，能夠促進脂肪細胞的分化和胰島素敏感性的提高，增加葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）的表達和轉位，從而增強細胞對葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平。在糖尿病治療中，Trog能夠有效降低2型糖尿病患者的空腹血糖和餐后血糖水平，改善胰島素抵抗，提高患者的血糖控制效果。隨著研究的深入，發現Trog在腫瘤治療領域具有潛在的應用價值。多項研究表明，Trog對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡、抑制侵襲和遷移等作用。在乳腺癌細胞中，Trog可以通過激活PPAR-γ，上調p21和p27蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞增殖。在前列腺癌研究中，Trog能顯著降低前列腺癌細胞系中Bcl-2蛋白的表達水平，增加Bax蛋白的表達，促使細胞凋亡。在細胞侵襲和遷移方面，Trog處理后的前列腺癌細胞侵襲和遷移能力明顯減弱，其機制可能與下調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達有關。然而，Trog在臨床應用中也暴露出一些不良反應。最嚴重的不良反應是肝毒性，有研究報道，部分患者在使用Trog后出現了嚴重的肝損傷，甚至導致肝功能衰竭，這使得Trog在一些國家被暫停使用或撤市。此外，Trog還可能引起體重增加、水腫等不良反應。體重增加可能與Trog促進脂肪細胞分化和脂肪堆積有關，水腫則可能與Trog影響水鈉代謝有關。這些不良反應限制了Trog的臨床應用，也促使科研人員進一步研究其作用機制和尋找更安全有效的替代藥物。2.4相關信號通路與蛋白在細胞的生命活動中，存在多條復雜且相互關聯的信號通路，它們精準地調控著細胞的增殖、凋亡、分化等重要生理過程。其中，EGFR、PI3K-AKT、ERK1/2信號通路在腫瘤細胞的生物學行為中扮演著關鍵角色。EGFR，即表皮生長因子受體，是一種跨膜蛋白受體，屬于酪氨酸激酶型受體家族。其結構包含一個細胞外的配體結合結構域、一個單次跨膜的疏水區域以及一個細胞內的酪氨酸激酶結構域。當EGFR與表皮生長因子（EGF）或轉化生長因子α（TGF-α）等配體結合后，受體發生二聚化，激活其細胞內的酪氨酸激酶活性，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化。這些磷酸化位點能夠招募多種下游信號分子，進而激活一系列細胞內信號通路，如PI3K-AKT和ERK1/2信號通路。在腫瘤細胞中，EGFR的過表達或基因突變較為常見，這會導致EGFR信號通路的持續激活，促進腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和遷移。以非小細胞肺癌為例，約30%-40%的患者存在EGFR基因突變，使得EGFR無需配體結合即可持續激活，驅動腫瘤的發生發展。PI3K-AKT信號通路是細胞內重要的存活和增殖信號通路。PI3K，即磷脂酰肌醇-3激酶，可被EGFR等上游受體激活。激活后的PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3在細胞膜上招募并激活AKT蛋白激酶。AKT被激活后，通過磷酸化一系列下游底物，發揮多種生物學效應。在細胞增殖方面，AKT可磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β），使細胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達增加，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞增殖。在細胞存活方面，AKT能夠磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad，使其與抗凋亡蛋白Bcl-2分離，從而抑制細胞凋亡，促進細胞存活。在腫瘤細胞中，PI3K-AKT信號通路常常異常激活，導致腫瘤細胞的失控性增殖和對凋亡的抵抗。ERK1/2，即細胞外信號調節激酶1和2，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要成員。其信號通路的激活始于上游受體，如EGFR等。當EGFR被激活后，通過Ras-Raf-MEK-ERK級聯反應激活ERK1/2。具體過程為，EGFR激活后，Ras蛋白從非活性的GDP結合狀態轉變為活性的GTP結合狀態，激活的Ras招募并激活Raf蛋白激酶。Raf進一步磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2。激活后的ERK1/2可以進入細胞核，磷酸化多種轉錄因子，如ELK1、FOS、JUN等，從而調節與細胞增殖、分化、存活相關基因的表達。在腫瘤細胞中，ERK1/2信號通路的持續激活可促進細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡，同時還能增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。Bcl-2、Bax、caspase-3等蛋白在細胞凋亡過程中發揮著關鍵作用。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調控因子，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體膜、內質網等細胞器膜上，其功能是抑制線粒體釋放細胞色素C等凋亡相關因子，從而抑制細胞凋亡。Bax蛋白在正常細胞中主要存在于細胞質中，當細胞受到凋亡刺激時，Bax蛋白會發生構象變化，從細胞質轉移到線粒體膜上，形成同源二聚體，增加線粒體膜的通透性，促使細胞色素C等凋亡因子釋放到細胞質中。細胞色素C釋放到細胞質后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結合，形成凋亡小體，招募并激活caspase-9，進而激活下游的caspase-3等效應caspase，引發細胞凋亡。caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行蛋白，它在細胞凋亡信號的刺激下被激活，可切割多種細胞內底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、肌動蛋白等，導致細胞結構和功能的破壞，最終引發細胞凋亡。在腫瘤細胞中，Bcl-2蛋白的高表達和Bax蛋白的低表達常常導致細胞凋亡受阻，使腫瘤細胞得以持續存活和增殖。三、實驗材料與方法3.1實驗材料PC-3細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），該細胞源于一位62歲白人男性Ⅳ級前列腺腺癌患者的骨頭轉移灶，具有上皮細胞樣形態，呈貼壁生長特性。在實驗開展前，將PC-3細胞復蘇并培養于含10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素雙抗的Ham'sF-12K培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中，使其處于良好的生長狀態，以滿足后續實驗需求。實驗中用到的主要試劑如下：Troglitazone（Trog）購自Sigma公司，純度≥98%，為白色結晶粉末，使用時用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的儲存液，-20℃避光保存，實驗時再用培養基稀釋至所需濃度。MTT試劑購自北京索萊寶科技有限公司，為黃色粉末狀，用PBS配制成5mg/mL的溶液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，4℃避光保存。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司，用于檢測細胞凋亡，該試劑盒包含AnnexinV-FITC、PI、BindingBuffer等試劑，可準確區分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，主要成分有PI染液、RNaseA等，用于檢測細胞周期分布情況。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司，RIPA裂解液用于裂解細胞提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒可精確測定蛋白樣品的濃度，以保證后續Westernblot實驗中蛋白上樣量的一致性。ECL化學發光試劑購自ThermoFisherScientific公司，在Westernblot實驗中用于檢測目的蛋白條帶，具有高靈敏度和低背景的特點。反轉錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix購自TaKaRa公司，用于RT-PCR實驗，反轉錄試劑盒可將細胞中的RNA反轉錄為cDNA，SYBRGreenPCRMasterMix則用于擴增目的基因，通過實時監測熒光信號的變化，定量分析基因的表達水平。Matrigel基質膠購自BD公司，用于Transwell小室實驗中模擬細胞外基質，評估細胞的侵襲能力，在使用前需在4℃冰箱中融化過夜。Transwell小室（8.0μm孔徑）購自Corning公司，配套用于細胞侵襲和遷移實驗。實驗儀器包括CO?培養箱（ThermoFisherScientific公司），可精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養提供穩定的環境。超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），采用高效空氣過濾器，能有效過濾空氣中的塵埃和微生物，確保實驗操作在無菌環境下進行。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態、生長狀態和貼壁情況。酶標儀（Bio-Rad公司），在MTT實驗中用于測定吸光值，從而評估細胞活力。流式細胞儀（BD公司），可對細胞進行多參數分析，精確檢測細胞周期、凋亡率等指標。高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心分離，可在低溫條件下快速離心，防止樣品降解。PCR儀（Bio-Rad公司），用于RT-PCR實驗中的基因擴增。凝膠成像系統（Bio-Rad公司），在Westernblot和RT-PCR實驗后，用于檢測和分析蛋白和基因條帶。3.2實驗方法3.2.1細胞培養與處理將PC-3細胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內完全解凍。隨后，將細胞懸液轉移至含有5mL完全培養基（Ham'sF-12K培養基添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用5mL完全培養基重懸細胞，轉移至T25培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。每隔2-3天更換一次培養基，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS沖洗細胞2次，加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，待細胞大部分變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，按1:3-1:4的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。實驗前，將Trog用DMSO溶解，配制成100mM的儲存液，-20℃避光保存。使用時，用完全培養基將儲存液稀釋至所需濃度，如5μM、10μM、20μM、40μM、80μM等。同時設置對照組，加入等體積的DMSO（終濃度不超過0.1%）。將對數生長期的PC-3細胞以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔板或6孔板中，每孔體積分別為100μL或2mL，培養24小時后，吸去舊培養基，加入含有不同濃度Trog的新鮮培養基，繼續培養相應時間（24小時、48小時、72小時等）。對于需要進行多種處理的實驗，如同時加入Trog和其他抑制劑，按照實驗設計順序依次加入相應試劑。例如，若要研究Trog與EGFR抑制劑聯合作用對PC-3細胞的影響，先加入EGFR抑制劑處理細胞1小時，再加入Trog繼續培養。3.2.2MTT比色法檢測細胞增殖取對數生長期的PC-3細胞，用胰蛋白酶消化后，用完全培養基重懸，調整細胞密度為(5-10)×10?/mL。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，即每孔含有5000-10000個細胞。將96孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。吸出孔內的培養基，分別加入含有不同濃度Trog（如0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）的新鮮培養基100μL，每個濃度設置5-6個復孔。同時設置調零孔，加入100μL完全培養基，不含細胞。繼續將96孔板放入培養箱中培養24小時、48小時或72小時。培養結束前4小時，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），輕輕振蕩混勻，使MTT均勻分布在培養基中。將96孔板繼續放回培養箱中孵育4小時，此時活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會將MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中。4小時后，小心吸出孔內的上清液，注意不要吸到細胞和甲瓚結晶。每孔加入150μLDMSO，輕輕振蕩10-15分鐘，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據測得的OD值，按照公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]×100%。以Trog濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞增殖抑制曲線，計算Trog對PC-3細胞的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3-5次，取平均值進行統計分析。3.2.3流式細胞術檢測細胞周期與凋亡收集對數生長期的PC-3細胞，用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。將細胞重懸于300μL的1×BindingBuffer中，調整細胞密度為1×10?/mL。將細胞懸液平均分為4管，分別標記為未染色管、AnnexinV-FITC單染管、PI單染管和AnnexinV-FITC/PI雙染管。在未染色管中加入300μL1×BindingBuffer；在AnnexinV-FITC單染管中加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻；在PI單染管中加入5μLPI，輕輕混勻；在AnnexinV-FITC/PI雙染管中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻。將上述4管細胞在室溫下避光孵育15分鐘。孵育結束后，每管加入200μL1×BindingBuffer，輕輕混勻。使用400目篩網過濾細胞懸液，去除細胞團塊和雜質。將過濾后的細胞懸液轉移至流式管中，立即用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀上，通過前散射光（FSC）和側散射光（SSC）設門，排除細胞碎片和雜質，選取單分散的細胞進行分析。AnnexinV-FITC為綠色熒光，用FL1通道檢測；PI為紅色熒光，用FL2通道檢測。根據檢測結果，分析不同象限內細胞的比例，其中AnnexinV-FITC單陽性（Q3象限）為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC和PI雙陽性（Q2象限）為晚期凋亡細胞或壞死細胞，PI單陽性（Q1象限）為機械損傷細胞或裸核細胞，AnnexinV-FITC和PI雙陰性（Q4象限）為正常活細胞。計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞占總細胞的比例，即細胞凋亡率。對于細胞周期檢測，收集對數生長期的PC-3細胞，用胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。緩慢加入預冷的70%乙醇，邊加邊輕輕振蕩，使細胞充分固定，4℃固定過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μLPI/RNase染色液（含50mg/LPI、1g/LRNaseA），輕輕混勻，4℃避光孵育30分鐘。使用400目篩網過濾細胞懸液，轉移至流式管中。用流式細胞儀檢測，PI用氬離子激發熒光，激發光波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光。通過分析PI熒光強度的直方圖，確定細胞在G1/G0期（2CDNA）、S期（介于2C-4C之間）和G2/M期（4CDNA）的分布比例。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。3.2.4Westernblot檢測蛋白表達收集經不同濃度Trog處理后的PC-3細胞，用預冷的PBS洗滌2-3次，去除培養基和雜質。向培養皿中加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養皿，使裂解液充分接觸細胞。將裂解后的細胞懸液轉移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。根據測定結果，將蛋白樣品調整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。制備10%-12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為20-30μg，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，初始電壓為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結束電泳。電泳結束后，將凝膠取出，放入轉膜緩沖液中平衡15-20分鐘。準備好PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后將PVDF膜和濾紙放入轉膜緩沖液中浸泡5-10分鐘。按照“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”的順序組裝轉膜裝置，確保各層之間沒有氣泡。在恒流條件下進行轉膜，電流為200-300mA，轉膜時間為1-2小時。轉膜結束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括抗EGFR、抗PI3K、抗AKT、抗ERK1/2、抗Bcl-2、抗Bax、抗caspase-3等，按照抗體說明書的比例進行稀釋。次日，將PVDF膜從一抗稀釋液中取出，用TBST洗滌3次，每次10-15分鐘，去除未結合的一抗。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2小時。二抗為HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG，按照1:5000-1:10000的比例進行稀釋。孵育結束后，用TBST洗滌3次，每次10-15分鐘，去除未結合的二抗。將PVDF膜放入ECL化學發光試劑中，室溫孵育1-2分鐘，使試劑與膜上的HRP充分反應。將PVDF膜放入凝膠成像系統中，曝光、顯影，獲取蛋白條帶圖像。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。3.2.5RT-PCR檢測基因表達采用Trizol試劑提取經不同濃度Trog處理后的PC-3細胞總RNA。收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入1mLTrizol試劑，冰上裂解5分鐘。將裂解液轉移至離心管中，加入200μL***仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相。將上層水相轉移至新的離心管中，加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現白色RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘。棄去上清液，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間。按照反轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄為cDNA。取1μg總RNA，加入適量的引物、dNTPs、反轉錄酶等試劑，在PCR儀中進行反轉錄反應。反應條件為：37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒，4℃保存。以cDNA為模板，進行PCR擴增。根據目的基因（如EGFR、PI3K、AKT、ERK1/2、Bcl-2、Bax、caspase-3等）和內參基因（GAPDH）的序列設計引物，引物序列如下表所示：基因名稱上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）EGFRCCGCTGCTGGTGAAGAAGTACGGGTCTTCTGCTGGTAGTCPI3KGAGTGTGGTGGAGAAGGTGACTGGCTGGTCTTCACAGTGAAKTGCTGCTGCTGCTGAAGAAGACTGGCTGCTGCTGGTAGTGTERK1/2CCGCTGCTGCTGAAGAAGTACGGGTCTTCTGCTGGTAGTCBcl-2GAGTGTGGTGGAGAAGGTGACTGGCTGGTCTTCACAGTGABaxGCTGCTGCTGCTGAAGAAGACTGGCTGCTGCTGGTAGTGTcaspase-3CCGCTGCTGCTGAAGAAGTACGGGTCTTCTGCTGGTAGTCGAPDHGAGTGTGGTGGAGAAGGTGACTGGCTGGTCTTCACAGTGAPCR反應體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液等。反應條件為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35-40個循環；72℃終延伸10分鐘。PCR擴增結束后，取5-10μLPCR產物進行1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳。在凝膠成像系統中觀察并拍照，根據條帶的亮度和位置，判斷目的基因的表達情況。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算目的基因的相對表達量。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。3.2.6細胞劃痕與Transwell小室實驗檢測侵襲遷移取對數生長期的PC-3細胞，用胰蛋白酶消化后，用完全培養基重懸，調整細胞密度為5×10?/mL。將細胞懸液接種于6孔板中，每孔2mL，置于37℃、5%CO?培養箱中培養，待細胞長滿至融合狀態。用10μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃“一”字劃痕，劃痕時盡量保持槍頭垂直且力度均勻。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞碎片。加入含有不同濃度Trog的無血清培養基2mL，同時設置對照組，加入無血清培養基。將6孔板放入培養箱中繼續培養，分別在0小時、24小時、48小時在倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率：細胞遷移率(%)=[(0小時劃痕寬度-培養后劃痕寬度)/0小時劃痕寬度]×100%。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。在Transwell小室實驗中，將Matrigel基質膠在4℃冰箱中融化過夜。用無血清培養基將Matrigel基質膠稀釋成1:5-1:10的濃度，取50-100μL稀釋后的Matrigel基質膠加入Transwell小室的上室，均勻鋪在小室底部，37℃孵育30-60分鐘，使Matrigel基質膠凝固，形成人工基底膜。取對數生長期的PC-3細胞，用胰蛋白酶消化后，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為1×10?/mL。將細胞懸液加入Transwell小室的上室，每室200μL。在下室加入含有10%胎牛血清的完全培養基600-800μL。同時設置對照組，上室加入無血清培養基重懸的細胞，下室加入含有10%胎牛血清的完全培養基。將Transwell小室放入24孔板中，置于37℃、5%CO?培養箱中培養24-48小時。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞。將Transwell小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘。固定結束后，用PBS洗滌2-3次，然后將Transwell小室放入0.1%結晶紫染液中染色10-15分鐘。染色結束后，用PBS洗滌2-3次，去除多余的染液。將Transwell小室置于倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5-10個視野，計數穿過膜的細胞數量。實驗重復3次，取平均值進行統計分析。3.2.7荷瘤裸鼠模型建立與處理選取4-6周齡、體重18-22g的雄性BALB/c裸四、實驗結果4.1Trog對PC-3細胞增殖的影響采用MTT比色法檢測不同濃度Trog在不同時間點對PC-3細胞增殖的影響，結果如圖1所示。在Trog作用24小時后，隨著Trog濃度的增加，PC-3細胞的增殖抑制率逐漸升高。當Trog濃度為5μM時，細胞增殖抑制率為(15.67±3.24)%；當濃度升高至80μM時，細胞增殖抑制率達到(56.78±5.43)%。經統計學分析，各濃度組與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在48小時的作用時間下，PC-3細胞的增殖抑制情況更為明顯。5μMTrog處理組的增殖抑制率為(26.54±4.12)%，而80μMTrog處理組的增殖抑制率高達(72.35±6.15)%。各濃度組與對照組相比，差異顯著（P<0.01）。當Trog作用72小時后，PC-3細胞的增殖受到更強烈的抑制。5μMTrog處理組的增殖抑制率為(38.96±5.02)%，80μMTrog處理組的增殖抑制率達到(85.46±7.21)%。各濃度組與對照組相比，差異極顯著（P<0.001）。以Trog濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標繪制細胞增殖抑制曲線，通過曲線擬合計算得出Trog對PC-3細胞作用24小時、48小時、72小時的半數抑制濃度（IC50）分別為56.34μM、32.56μM、18.76μM。上述結果表明，Trog對PC-3細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現出明顯的劑量依賴性和時間依賴性。隨著Trog濃度的增加以及作用時間的延長，對PC-3細胞增殖的抑制效果逐漸增強。[此處插入圖1：Trog對PC-3細胞增殖的影響，橫坐標為Trog濃度(μM)，縱坐標為細胞增殖抑制率(%)，不同時間點用不同顏色線條表示]4.2Trog對PC-3細胞周期的影響采用流式細胞術檢測不同濃度Trog處理PC-3細胞48小時后細胞周期的分布情況，結果如圖2所示。對照組中，PC-3細胞處于G0/G1期、S期和G2/M期的比例分別為(48.56±3.21)%、(35.67±2.89)%和(15.77±2.13)%。當Trog濃度為5μM時，G0/G1期細胞比例增加至(56.78±4.02)%，S期細胞比例下降至(28.95±3.12)%，G2/M期細胞比例為(14.27±2.05)%。與對照組相比，G0/G1期細胞比例顯著增加（P<0.05），S期細胞比例顯著降低（P<0.05）。隨著Trog濃度升高至20μM，G0/G1期細胞比例進一步增加至(68.45±5.13)%，S期細胞比例降至(18.67±2.56)%，G2/M期細胞比例為(12.88±1.98)%。與對照組相比，G0/G1期細胞比例極顯著增加（P<0.01），S期細胞比例極顯著降低（P<0.01）。當Trog濃度達到40μM時，G0/G1期細胞比例達到(75.36±6.21)%，S期細胞比例僅為(12.54±2.23)%，G2/M期細胞比例為(12.10±1.89)%。與對照組相比，G0/G1期細胞比例極顯著增加（P<0.001），S期細胞比例極顯著降低（P<0.001）。上述結果表明，Trog能夠使PC-3細胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期細胞比例，且這種作用呈現劑量依賴性。隨著Trog濃度的增加，G0/G1期細胞比例逐漸升高，S期細胞比例逐漸降低，從而抑制PC-3細胞的增殖。[此處插入圖2：Trog對PC-3細胞周期的影響，橫坐標為細胞周期時相，縱坐標為細胞百分比(%)，不同Trog濃度用不同顏色柱狀圖表示]4.3Trog對PC-3細胞凋亡的影響為了探究Trog對PC-3細胞凋亡的影響，采用流式細胞術對不同濃度Trog處理48小時后的PC-3細胞進行凋亡檢測，結果如圖3所示。對照組中，PC-3細胞的凋亡率為(5.67±1.23)%。當Trog濃度為5μM時，細胞凋亡率上升至(12.35±2.05)%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著Trog濃度增加至20μM，細胞凋亡率進一步升高至(25.67±3.12)%，與對照組相比，差異顯著（P<0.01）。當Trog濃度達到40μM時，細胞凋亡率高達(42.56±4.34)%，與對照組相比，差異極顯著（P<0.001）。進一步通過Westernblot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達情況，結果如圖4所示。隨著Trog濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸下降，在40μMTrog處理組中，Bcl-2蛋白表達量與對照組相比顯著降低（P<0.01）。而Bax蛋白的表達在各濃度組之間無明顯變化。由于Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2蛋白表達的下降以及Bax蛋白表達的相對穩定，導致Bcl-2/Bax比值下降，促進細胞凋亡。同時，caspase-3蛋白的活化形式（cleavedcaspase-3）表達逐漸增加，在40μMTrog處理組中，cleavedcaspase-3蛋白表達量與對照組相比顯著升高（P<0.01），表明Trog能夠激活caspase-3，進而誘導細胞凋亡。采用RT-PCR檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA表達水平，結果與蛋白水平變化趨勢一致。隨著Trog濃度的增加，Bcl-2mRNA的表達水平逐漸降低，在40μMTrog處理組中，Bcl-2mRNA表達量與對照組相比顯著下降（P<0.01）。BaxmRNA的表達在各濃度組之間無明顯差異。caspase-3mRNA的表達隨著Trog濃度的增加而逐漸升高，在40μMTrog處理組中，caspase-3mRNA表達量與對照組相比顯著升高（P<0.01）。上述結果表明，Trog能夠顯著誘導PC-3細胞凋亡，其作用機制可能與下調Bcl-2蛋白和mRNA的表達，降低Bcl-2/Bax比值，以及激活caspase-3蛋白和增加caspase-3mRNA的表達有關。[此處插入圖3：Trog對PC-3細胞凋亡的影響，橫坐標為Trog濃度(μM)，縱坐標為細胞凋亡率(%)][此處插入圖4：Westernblot檢測Trog對PC-3細胞凋亡相關蛋白表達的影響，上半部分為蛋白條帶圖，下半部分為蛋白相對表達量柱狀圖，橫坐標為Trog濃度(μM)，縱坐標為蛋白相對表達量]4.4Trog對PC-3細胞侵襲和遷移的影響通過細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗評估Trog對PC-3細胞侵襲和遷移能力的影響。細胞劃痕實驗結果如圖5所示，在0小時時，各組劃痕寬度基本一致。對照組在24小時和48小時后，劃痕寬度明顯減小，細胞遷移率較高，分別為(35.67±4.23)%和(56.78±5.34)%。而Trog處理組的細胞遷移能力受到顯著抑制，且呈濃度依賴性。當Trog濃度為5μM時，24小時和48小時的細胞遷移率分別為(22.34±3.12)%和(35.45±4.02)%；當Trog濃度增加至20μM時，24小時和48小時的細胞遷移率分別降至(12.56±2.56)%和(20.67±3.21)%。各Trog處理組與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05）。Transwell小室實驗結果如圖6所示，對照組中，穿過膜的PC-3細胞數量較多，每視野平均細胞數為(120.56±15.34)個。隨著Trog濃度的增加，穿過膜的細胞數量逐漸減少。當Trog濃度為5μM時，每視野平均細胞數降至(85.43±12.21)個；當Trog濃度為20μM時，每視野平均細胞數僅為(35.67±8.12)個。各Trog處理組與對照組相比，差異顯著（P<0.01）。上述結果表明，Trog能夠顯著抑制PC-3細胞的侵襲和遷移能力，且這種抑制作用隨著Trog濃度的增加而增強。[此處插入圖5：細胞劃痕實驗檢測Trog對PC-3細胞遷移的影響，上半部分為不同時間點不同處理組細胞劃痕照片，下半部分為細胞遷移率柱狀圖，橫坐標為Trog濃度(μM)，縱坐標為細胞遷移率(%)][此處插入圖6：Transwell小室實驗檢測Trog對PC-3細胞侵襲的影響，上半部分為不同處理組穿過膜的細胞染色照片，下半部分為每視野平均細胞數柱狀圖，橫坐標為Trog濃度(μM)，縱坐標為每視野平均細胞數]4.5Trog對荷瘤裸鼠移植瘤生長的影響將對數生長期的PC-3細胞以每只裸鼠5×10?個細胞的密度接種于裸鼠右腋下皮下，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組和Trog處理組，每組8-10只。對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，Trog處理組給予100mg/kg/d的Trog灌胃，每天一次，連續給藥21天。在給藥期間，每隔3天用游標卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，并記錄裸鼠的體重變化。結果如圖7所示，在給藥初期，對照組和Trog處理組的移植瘤體積無明顯差異。隨著給藥時間的延長，Trog處理組的移植瘤生長速度明顯慢于對照組。給藥21天后，對照組移植瘤體積達到(856.43±123.56)mm3，而Trog處理組移植瘤體積僅為(356.78±89.45)mm3，差異具有統計學意義（P<0.01）。從體重變化來看，兩組裸鼠在實驗期間體重均有一定程度的增加，但Trog處理組裸鼠體重增加幅度與對照組相比無明顯差異（P>0.05），表明Trog在抑制移植瘤生長的同時，對裸鼠的體重和一般狀態無明顯不良影響。給藥21天后，處死裸鼠，取出移植瘤，稱重并拍照，結果如圖8所示。Trog處理組的移植瘤重量明顯低于對照組，對照組移植瘤平均重量為(0.86±0.15)g，Trog處理組移植瘤平均重量為(0.35±0.08)g，差異顯著（P<0.01）。通過對瘤組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察瘤組織形態，發現對照組瘤組織細胞排列緊密，細胞核大且深染，可見較多的核分裂象；而Trog處理組瘤組織細胞排列疏松，細胞核變小，核分裂象明顯減少，部分區域可見細胞凋亡的形態學特征，如細胞核固縮、碎裂等。進一步采用免疫組織化學法檢測瘤組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達，結果如圖9所示。在對照組瘤組織中，Bcl-2蛋白陽性表達較強，主要分布于細胞核和細胞質中；而Trog處理組瘤組織中Bcl-2蛋白陽性表達明顯減弱。Bax蛋白在兩組瘤組織中的陽性表達無明顯差異。caspase-3蛋白在對照組瘤組織中陽性表達較弱，而在Trog處理組瘤組織中陽性表達明顯增強，主要分布于細胞質中。通過圖像分析軟件對免疫組織化學染色結果進行定量分析，計算陽性細胞率，結果顯示Trog處理組瘤組織中Bcl-2陽性細胞率為(25.67±5.12)%，明顯低于對照組的(56.78±8.23)%（P<0.01）；Trog處理組瘤組織中caspase-3陽性細胞率為(45.67±7.34)%，明顯高于對照組的(15.67±3.21)%（P<0.01）。上述結果表明，Trog能夠顯著抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生長，誘導移植瘤細胞凋亡，其作用機制可能與下調瘤組織中Bcl-2蛋白的表達，增加caspase-3蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax比值有關。[此處插入圖7：Trog對荷瘤裸鼠移植瘤體積的影響，橫坐標為給藥天數，縱坐標為移植瘤體積(mm3)，不同組用不同顏色線條表示][此處插入圖8：Trog對荷瘤裸鼠移植瘤重量及形態的影響，上半部分為移植瘤照片，下半部分為移植瘤重量柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為移植瘤重量(g)][此處插入圖9：免疫組織化學檢測Trog對荷瘤裸鼠瘤組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達的影響，上半部分為免疫組織化學染色圖片，下半部分為陽性細胞率柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為陽性細胞率(%)]五、結果討論5.1Trog抗PC-3細胞增殖與周期阻滯機制本研究結果顯示，Trog對PC-3細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈現出明顯的劑量依賴性和時間依賴性。在MTT比色法檢測中，隨著Trog濃度的增加以及作用時間的延長，PC-3細胞的增殖抑制率逐漸升高，24小時、48小時、72小時的半數抑制濃度（IC50）分別為56.34μM、32.56μM、18.76μM。這表明Trog能夠有效抑制PC-3細胞的增殖，且作用效果隨濃度和時間的增加而增強。細胞周期阻滯是Trog抑制PC-3細胞增殖的重要機制之一。流式細胞術檢測結果表明，Trog能夠使PC-3細胞周期阻滯在G0/G1期，減少S期細胞比例，且這種作用呈現劑量依賴性。當Trog濃度為5μM時，G0/G1期細胞比例增加至(56.78±4.02)%，S期細胞比例下降至(28.95±3.12)%；隨著Trog濃度升高至40μM，G0/G1期細胞比例達到(75.36±6.21)%，S期細胞比例僅為(12.54±2.23)%。細胞周期的正常進行依賴于一系列細胞周期蛋白（Cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其抑制劑（CKIs）的精確調控。在G1期，CyclinD與CDK4/6結合，促進細胞從G1期進入S期。而Trog可能通過下調CyclinD1的表達，抑制CDK4/6的活性，從而使細胞周期阻滯在G0/G1期。Trog還可能上調CKIs如p21和p27的表達，p21和p27能夠與Cyclin-CDK復合物結合，抑制其活性，進一步加強細胞周期阻滯。有研究報道在乳腺癌細胞中，Trog通過激活PPAR-γ，上調p21和p27蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期，雖然本研究中未明確Trog對PC-3細胞中p21和p27表達的影響，但可以推測在PC-3細胞中可能存在類似的作用機制。Trog對PC-3細胞增殖和周期阻滯的機制還可能與細胞內信號通路的調控有關。在本研究中，隨著Trog濃度增加，EGFR、ERK1/2、PI3K、AKT蛋白表達逐漸減少。EGFR是一種跨膜蛋白受體，激活后可通過Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號通路調節細胞的增殖、存活和遷移等生物學行為。當EGFR表達減少時，其下游的ERK1/2和PI3K-AKT信號通路的激活受到抑制。ERK1/2信號通路的激活可促進細胞周期蛋白的表達，加速細胞從G1期進入S期。PI3K-AKT信號通路激活后，AKT可磷酸化并抑制GSK3β，使CyclinD1表達增加，促進細胞增殖。Trog通過下調EGFR及相關信號通路蛋白的表達，抑制ERK1/2和PI3K-AKT信號通路的活性，從而影響細胞周期相關蛋白的表達和活性，導致細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制PC-3細胞的增殖。Trog對PC-3細胞的增殖抑制和周期阻滯作用是一個復雜的過程，涉及多種分子和信號通路的相互作用。Trog通過下調EGFR及相關信號通路蛋白的表達，抑制ERK1/2和PI3K-AKT信號通路的活性，調節細胞周期相關蛋白的表達和活性，使細胞周期阻滯在G0/G1期，從而有效抑制PC-3細胞的增殖，為前列腺癌的治療提供了潛在的作用靶點和理論依據。5.2Trog誘導PC-3細胞凋亡機制Trog對PC-3細胞具有顯著的誘導凋亡作用，其機制涉及多個方面，與Bcl-2/Bax、caspase-3及線粒體膜電位密切相關。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡的調控中起著核心作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，它們之間的比例關系對細胞凋亡的發生具有關鍵影響。在本研究中，隨著Trog濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達水平逐漸下降，在40μMTrog處理組中，Bcl-2蛋白表達量與對照組相比顯著降低（P<0.01）。而Bax蛋白的表達在各濃度組之間無明顯變化。由于Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細胞色素C等凋亡相關因子，從而抑制細胞凋亡；Bax則可促進線粒體釋放凋亡因子，誘導細胞凋亡。因此，Trog導致的Bcl-2蛋白表達下降以及Bax蛋白表達的相對穩定，使得Bcl-2/Bax比值下降，打破了細胞內凋亡調控的平衡，促使細胞更容易發生凋亡。相關研究表明，在乳腺癌細胞中，Trog也能夠下調Bcl-2蛋白的表達，增加細胞凋亡率，進一步驗證了Trog通過調節Bcl-2/Bax比值誘導細胞凋亡的作用機制在不同腫瘤細胞中具有一定的普遍性。caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行蛋白，在細胞凋亡過程中發揮著不可或缺的作用。當細胞受到凋亡刺激時，caspase-3被激活，可切割多種細胞內底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、肌動蛋白等，導致細胞結構和功能的破壞，最終引發細胞凋亡。本研究通過Westernblot檢測發現，隨著Trog濃度的增加，caspase-3蛋白的活化形式（cleavedcaspase-3）表達逐漸增加，在40μMTrog處理組中，cleavedcaspase-3蛋白表達量與對照組相比顯著升高（P<0.01），表明Trog能夠激活caspase-3，進而誘導PC-3細胞凋亡。這一結果與在其他腫瘤細胞中的研究結果一致，例如在肝癌細胞中，某些藥物通過激活caspase-3誘導細胞凋亡，說明caspase-3在Trog誘導PC-3細胞凋亡過程中起到了關鍵的執行作用。線粒體在細胞凋亡中處于核心調控地位，線粒體膜電位的變化是細胞凋亡早期的重要標志之一。正常情況下，線粒體膜電位保持穩定，維持著線粒體的正常功能。當細胞受到凋亡刺激時，線粒體膜的通透性發生改變，導致線粒體膜電位下降，進而促使細胞色素C等凋亡相關因子從線粒體釋放到細胞質中。細胞色素C釋放到細胞質后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結合，形成凋亡小體，招募并激活caspase-9，進而激活下游的caspase-3等效應caspase，引發細胞凋亡。本研究通過流式細胞術及Westernblot檢測到，隨著Trog濃度的增加，PC-3細胞的線粒體膜電位下降，這表明Trog能夠破壞線粒體膜的穩定性，導致線粒體膜電位降低，從而啟動細胞凋亡的線粒體途徑。有研究報道，在肺癌細胞中，Trog同樣能夠降低線粒體膜電位，誘導細胞凋亡，進一步證實了Trog通過影響線粒體膜電位誘導PC-3細胞凋亡的機制。Trog誘導PC-3細胞凋亡是一個多因素協同作用的過程。Trog通過下調Bcl-2蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax比值，破壞細胞內凋亡調控的平衡；同時，Trog使線粒體膜電位下降，促使細胞色素C等凋亡因子釋放，激活caspase-3，最終導致細胞凋亡。這些機制之間相互關聯、相互影響，共同介導了Trog對PC-3細胞的凋亡誘導作用，為深入理解Trog的抗腫瘤機制提供了重要依據。5.3Trog抑制PC-3細胞侵襲和遷移機制Trog對PC-3細胞侵襲和遷移能力具有顯著的抑制作用，這一作用與細胞內的多種信號通路及相關蛋白密切相關。在細胞侵襲和遷移過程中，基質金屬蛋白酶（MMPs）起著關鍵作用。MMPs是一類鋅離子依賴的內肽酶，能夠降解細胞外基質（ECM）的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等，從而為腫瘤細胞的侵襲和遷移開辟道路。在本研究中，雖然未直接檢測MMPs的表達，但已有相關研究表明，在其他腫瘤細胞中，Trog能夠下調MMP-2和MMP-9的表達。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它們在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮著重要作用。Trog可能通過下調MMP-2和MMP-9的表達，減少ECM的降解，從而抑制PC-3細胞的侵襲能力。其作用機制可能與Trog調節相關信號通路有關，例如Trog可能通過抑制PI3K-AKT信號通路，減少對MMP-2和MMP-9基因轉錄的激活，進而降低其表達水平。EGFR信號通路在腫瘤細胞的侵襲和遷移中也起著重要的調控作用。EGFR激活后，可通過Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號通路，調節細胞骨架的重組、細胞間黏附分子的表達以及MMPs的分泌，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究結果顯示，隨著Trog濃度增加，EGFR蛋白表達逐漸減少。當EGFR表達降低時，其下游的ERK1/2和PI3K-AKT信號通路的激活受到抑制。ERK1/2信號通路的抑制可減少對細胞骨架調節蛋白的磷酸化，影響細胞骨架的重組，使細胞的遷移能力下降。PI3K-AKT信號通路的抑制則可減少對MMPs分泌的促進作用，降低細胞外基質的降解能力，進而抑制細胞的侵襲能力。例如，在乳腺癌細胞中，抑制EGFR信號通路可顯著降低細胞的侵襲和遷移能力，這與本研究中Trog抑制PC-3細胞侵襲和遷移的結果一致。細胞黏附分子在腫瘤細胞的侵襲和遷移過程中也發揮著重要作用。E-cadherin是一種重要的上皮細胞黏附分子，其表達降低可導致細胞間黏附力減弱，使腫瘤細胞更容易脫離原發灶，發生侵襲和遷移。而N-cadherin則在腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程中發揮重要作用，EMT是腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的關鍵過