Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能及作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景在生命科學(xué)領(lǐng)域，非編碼RNA（ncRNA）的研究一直是熱點(diǎn)。環(huán)狀RNA（circRNA）作為一類特殊的非編碼RNA，自被發(fā)現(xiàn)以來，逐漸成為科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。circRNA呈共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無5′端帽子和3′端尾巴，這使其具有高穩(wěn)定性、物種保守性以及組織和發(fā)育階段特異性等特點(diǎn)。早期，circRNA被認(rèn)為是RNA剪接錯誤的產(chǎn)物，未受到足夠重視。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，大量circRNA被鑒定出來，其重要的生物學(xué)功能才逐漸被揭示。在眾多circRNA中，Sry環(huán)狀RNA因其與性別決定和生殖過程的緊密聯(lián)系，成為了生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Sry基因，即雄性的性別決定基因，位于Y染色體上，是決定生物雄性性別的關(guān)鍵基因片段。人的Sry基因位于Yp11.3，只含有一個外顯子，無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約1.1kb，編碼一個由204個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Sry基因的表達(dá)產(chǎn)物SRY蛋白含有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——高泳動類非組蛋白（HMG）盒基序，該基序能以序列特異的方式與DNA結(jié)合，在雙螺旋結(jié)構(gòu)中引入尖銳轉(zhuǎn)折，從而行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。在小鼠中，Sry基因在成年小鼠生殖細(xì)胞中表達(dá)為一環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物，而在發(fā)育中的小鼠性腺里則轉(zhuǎn)錄為一個長4.8kb的RNA，且所用啟動子與成年鼠不同。Sry基因大約在交配后10.5-11天（dayspostcoitum，dpc）于生殖嵴中專一開啟，此時恰是兩性間出現(xiàn)可觀察形態(tài)學(xué)差異之前；大約在12.5dpc左右關(guān)閉，其功能是啟動睪丸分化，而非維持睪丸存在。精子發(fā)生是一個復(fù)雜而有序的過程，涉及精原干細(xì)胞的增殖、分化，精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的變形等多個階段。這一過程受到眾多基因和信號通路的精細(xì)調(diào)控，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都可能導(dǎo)致雄性不育。研究表明，circRNA在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。它們可以通過多種機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控，如作為微小RNA（miRNA）的海綿，競爭性結(jié)合miRNA，從而解除miRNA對靶基因的抑制作用，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平；circRNA還可與mRNA部分堿基配對，直接調(diào)控mRNA，或通過特異的RNA-RNA途徑調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程；此外，circRNA能與蛋白結(jié)合，抑制蛋白活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性。近年來，隨著研究的深入，circRNA在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值也逐漸凸顯。它不僅有望成為男性不育癥診斷和治療的新靶點(diǎn)，還可能為生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的思路和方法。然而，目前對于Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的具體功能和作用機(jī)制，仍存在許多未知。深入研究Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能，有助于揭示精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制，為解決雄性不育等生殖健康問題提供理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生過程中的具體功能和作用機(jī)制。通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建Sry環(huán)狀RNA敲除或過表達(dá)的小鼠模型，運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科交叉的研究方法，從分子、細(xì)胞和個體水平全面分析Sry環(huán)狀RNA對精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與分化、減數(shù)分裂進(jìn)程以及精子形態(tài)和功能的影響。從基礎(chǔ)研究的角度來看，精子發(fā)生是一個高度復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的生物學(xué)過程，涉及眾多基因和信號通路的協(xié)同作用。雖然目前已經(jīng)對精子發(fā)生的基本過程有了一定的了解，但對于其中許多關(guān)鍵分子機(jī)制的認(rèn)識仍有待完善。Sry環(huán)狀RNA作為一種與性別決定和生殖密切相關(guān)的非編碼RNA，對其在精子發(fā)生中的功能研究，有助于揭示精子發(fā)生過程中基因表達(dá)調(diào)控的新機(jī)制，進(jìn)一步豐富和完善生殖生物學(xué)的理論體系。這不僅能夠加深我們對生殖細(xì)胞發(fā)育和分化的理解，還可能為其他相關(guān)領(lǐng)域的研究提供新的思路和方向。例如，對Sry環(huán)狀RNA作用機(jī)制的深入研究，可能為理解其他非編碼RNA在生物發(fā)育過程中的功能提供借鑒，拓展我們對基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。在臨床應(yīng)用方面，男性不育癥是一個全球性的健康問題，嚴(yán)重影響著眾多家庭的生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計，全球約有15%的夫婦面臨生育困難，其中男性因素導(dǎo)致的不育占比約為50%。許多男性不育癥是由于精子發(fā)生異常引起的，然而目前對于這些異常的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，導(dǎo)致臨床治療手段有限。本研究通過揭示Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能，有望為男性不育癥的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA的異常表達(dá)與某些類型的男性不育癥相關(guān)，那么可以將其作為生物標(biāo)志物，用于男性不育癥的早期診斷和病情評估。此外，針對Sry環(huán)狀RNA及其相關(guān)信號通路開發(fā)的治療方法，可能為那些因精子發(fā)生異常而導(dǎo)致不育的患者帶來新的希望，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1環(huán)狀RNA概述環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，其結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)線性RNA截然不同，呈共價閉合環(huán)狀，無5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端多聚腺苷酸（polyA）尾巴。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了circRNA諸多特殊的性質(zhì)，使其在基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。circRNA的形成機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過反向剪接（backsplicing）方式產(chǎn)生。在反向剪接過程中，下游剪接供體位點(diǎn)與上游剪接受體位點(diǎn)反向連接，使得外顯子以特殊的順序連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。目前已知有多種因素參與circRNA的形成調(diào)控。其中，內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化是常見的機(jī)制之一，側(cè)翼內(nèi)含子中的反向重復(fù)序列（如Alu元件）通過堿基配對，使下游剪接給體位點(diǎn)與上游剪接受體位點(diǎn)接近，促進(jìn)反向剪接，進(jìn)而形成circRNA。例如，在人類和小鼠的基因中，許多circRNA的形成依賴于Alu元件介導(dǎo)的內(nèi)含子配對。RNA結(jié)合蛋白（RBP）也在circRNA的形成中扮演關(guān)鍵角色，RBP可以與側(cè)翼內(nèi)含子中的特定基序結(jié)合，通過二聚化作用拉近上下游剪接位點(diǎn)，從而推動反向剪接的發(fā)生。以果蠅中的Muscleblind蛋白為例，它能夠特異性地結(jié)合到特定的內(nèi)含子區(qū)域，促進(jìn)circMbl的形成。此外，外顯子跳讀所形成的套索驅(qū)動環(huán)化也是circRNA生成的一種途徑，在轉(zhuǎn)錄過程中，部分外顯子跳過相鄰的外顯子，形成套索結(jié)構(gòu)，進(jìn)而環(huán)化產(chǎn)生circRNA。穩(wěn)定性是circRNA的顯著特性之一。由于其閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA對核酸外切酶具有較強(qiáng)的抗性，不易被降解，半衰期較長，在細(xì)胞內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。與之相比，線性RNA由于具有游離的5′端和3′端，容易受到核酸外切酶的作用而降解，穩(wěn)定性較差。circRNA的這種高穩(wěn)定性使其在細(xì)胞內(nèi)能夠持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)功能，為其參與基因表達(dá)調(diào)控等過程提供了保障。保守性也是circRNA的重要特性。研究發(fā)現(xiàn)，許多circRNA在不同物種間具有保守的序列和結(jié)構(gòu)。例如，小鼠和人類中存在一些同源的circRNA，它們在序列和功能上具有一定的相似性。這種保守性暗示了circRNA在進(jìn)化過程中具有重要的生物學(xué)意義，可能參與了一些保守的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育等。然而，并非所有circRNA都具有高度保守性，部分circRNA在物種間的差異較大，其功能可能具有物種特異性。circRNA的表達(dá)具有組織和發(fā)育階段特異性。在不同的組織中，circRNA的表達(dá)譜存在顯著差異。例如，在腦組織中，一些circRNA的表達(dá)水平較高，且在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；而在其他組織中，這些circRNA的表達(dá)可能較低甚至檢測不到。在發(fā)育的不同階段，circRNA的表達(dá)也會發(fā)生動態(tài)變化。在胚胎發(fā)育早期，某些circRNA的表達(dá)水平較高，隨著發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)逐漸降低；而在成年個體中，又會出現(xiàn)一些特定的circRNA表達(dá)模式。這種組織和發(fā)育階段特異性的表達(dá)模式表明circRNA在不同的生理狀態(tài)下可能發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。2.2小鼠精子發(fā)生過程小鼠精子發(fā)生是一個高度有序且復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，在睪丸的曲細(xì)精管中進(jìn)行，主要包括精原干細(xì)胞的增殖與分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的變形三個階段，每個階段都受到眾多基因和調(diào)控因子的精細(xì)調(diào)控。在精原干細(xì)胞增殖與分化階段，精原干細(xì)胞（SSCs）是精子發(fā)生的起始細(xì)胞，具有自我更新和分化的能力，能夠維持精子發(fā)生的持續(xù)進(jìn)行。根據(jù)形態(tài)和分子標(biāo)記，小鼠精原干細(xì)胞可分為A型和B型。A型精原干細(xì)胞又進(jìn)一步細(xì)分為Asingle（As）、Apaired（Apr）和Aaligned（Aal）三種亞型。其中，As精原干細(xì)胞是最原始的精原干細(xì)胞，具有自我更新能力，可通過不對稱分裂產(chǎn)生一個新的As精原干細(xì)胞和一個Apr精原干細(xì)胞。Apr精原干細(xì)胞則可通過對稱分裂形成Aal精原干細(xì)胞，Aal精原干細(xì)胞再經(jīng)過多次分裂，最終分化為B型精原干細(xì)胞。B型精原干細(xì)胞繼續(xù)增殖，經(jīng)過數(shù)次有絲分裂后，分化為初級精母細(xì)胞。在這一過程中，許多基因和調(diào)控因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，Plzf（promyelocyticleukemiazincfinger）是維持As精原干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Plzf基因敲除的小鼠，其精原干細(xì)胞無法維持自我更新，導(dǎo)致精子發(fā)生在早期階段就停滯。GDNF（glialcellline-derivedneurotrophicfactor）由睪丸支持細(xì)胞分泌，對精原干細(xì)胞的存活、增殖和自我更新起著重要的調(diào)控作用。GDNF與其受體GFRα1（GDNFfamilyreceptoralpha1）結(jié)合，激活下游的信號通路，如PI3K-Akt和Ras-MAPK信號通路，促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖和自我更新。進(jìn)入精母細(xì)胞減數(shù)分裂階段，初級精母細(xì)胞形成后，會進(jìn)入減數(shù)分裂期，這是精子發(fā)生過程中的關(guān)鍵階段，包括減數(shù)第一次分裂（MI）和減數(shù)第二次分裂（MII）。在減數(shù)第一次分裂前期，初級精母細(xì)胞會經(jīng)歷細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期。在細(xì)線期，染色體開始凝縮；偶線期時，同源染色體開始配對，形成聯(lián)會復(fù)合體；粗線期是同源染色體之間進(jìn)行基因交換和重組的重要時期；雙線期，聯(lián)會復(fù)合體逐漸解體，同源染色體開始分離；終變期，染色體進(jìn)一步凝縮，核膜消失，紡錘體形成。在減數(shù)第一次分裂后期，同源染色體分離，分別向細(xì)胞兩極移動；末期，細(xì)胞分裂為兩個次級精母細(xì)胞。次級精母細(xì)胞緊接著進(jìn)入減數(shù)第二次分裂，與有絲分裂過程相似，姐妹染色單體分離，最終形成四個單倍體的精子細(xì)胞。在減數(shù)分裂過程中，眾多基因和蛋白參與調(diào)控。例如，Spo11（sporulation11）基因編碼的蛋白是啟動DNA雙鏈斷裂（DSBs）形成的關(guān)鍵酶，DSBs的形成是同源染色體配對和重組的前提。Spo11基因敲除的小鼠，減數(shù)分裂無法正常進(jìn)行，精子發(fā)生停滯在減數(shù)第一次分裂前期。此外，聯(lián)會復(fù)合體蛋白如Sycp1（synaptonemalcomplexprotein1）、Sycp2和Sycp3等，對于同源染色體的配對和聯(lián)會至關(guān)重要。Sycp3基因敲除的小鼠，同源染色體無法正常配對，導(dǎo)致減數(shù)分裂異常，精子發(fā)生受阻。精子細(xì)胞變形階段是精子發(fā)生的最后階段，圓形的精子細(xì)胞經(jīng)過一系列復(fù)雜的形態(tài)變化，最終形成具有頭、頸、尾結(jié)構(gòu)的成熟精子。這一過程包括頂體的形成、細(xì)胞核的濃縮、鞭毛的發(fā)育以及多余細(xì)胞質(zhì)的丟棄。在頂體形成過程中，高爾基體產(chǎn)生的頂體泡逐漸融合、擴(kuò)展，包裹在細(xì)胞核的前端，形成頂體。細(xì)胞核中的染色質(zhì)高度濃縮，DNA與魚精蛋白結(jié)合，使細(xì)胞核體積減小，更加致密。同時，精子細(xì)胞的中心粒遷移到細(xì)胞后端，形成鞭毛的基體，進(jìn)而發(fā)育出鞭毛。在這一階段，許多基因和調(diào)控因子參與調(diào)控。例如，Prm1（protamine1）和Prm2（protamine2）基因編碼的魚精蛋白，在精子細(xì)胞核染色質(zhì)的濃縮過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Prm1和Prm2基因敲除的小鼠，精子細(xì)胞核染色質(zhì)無法正常濃縮，導(dǎo)致精子形態(tài)和功能異常。此外，過渡蛋白（transitionprotein，TP）如Tp1和Tp2，在染色質(zhì)從組蛋白向魚精蛋白轉(zhuǎn)換的過程中起重要作用，它們先與DNA結(jié)合，幫助染色質(zhì)初步濃縮，然后逐漸被魚精蛋白取代。2.3Sry基因與Sry環(huán)狀RNASry基因，作為雄性性別決定的關(guān)鍵基因，在生物的性別分化過程中起著核心作用。它位于Y染色體上，其表達(dá)產(chǎn)物SRY蛋白含有典型的高泳動類非組蛋白（HMG）盒基序，能以序列特異的方式與DNA結(jié)合，在雙螺旋結(jié)構(gòu)中引入尖銳轉(zhuǎn)折，從而行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。在小鼠中，Sry基因在胚胎發(fā)育的特定時期，即大約交配后10.5-11天（dayspostcoitum，dpc）于生殖嵴中專一開啟，此時恰是兩性間出現(xiàn)可觀察形態(tài)學(xué)差異之前；大約在12.5dpc左右關(guān)閉，其功能是啟動睪丸分化，而非維持睪丸存在。在人類中，Sry基因位于Yp11.3，只含有一個外顯子，無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄單位長約1.1kb，編碼一個由204個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。Sry基因的突變或缺失會導(dǎo)致性發(fā)育異常，如46，XY性反轉(zhuǎn)綜合征患者，其染色體核型為男性，但由于Sry基因的突變，表現(xiàn)為女性的生殖器官和第二性征。Sry環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)為Sry基因的研究帶來了新的視角。1993年，Capel等在研究小鼠Sry基因時，首次發(fā)現(xiàn)其存在環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。這一發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)觀念中RNA均為線性結(jié)構(gòu)的認(rèn)知，開啟了對Sry環(huán)狀RNA的研究歷程。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA具有獨(dú)特的表達(dá)特征。在小鼠中，它在睪丸組織中特異性表達(dá)，且表達(dá)水平在精子發(fā)生的不同階段呈現(xiàn)動態(tài)變化。在精子發(fā)生的早期階段，Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)量相對較低；隨著精原干細(xì)胞的增殖和分化，其表達(dá)量逐漸升高；在減數(shù)分裂和精子細(xì)胞變形階段，Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)維持在較高水平，這暗示著它在精子發(fā)生過程中可能發(fā)揮著重要作用。關(guān)于Sry環(huán)狀RNA的功能，目前的研究初步表明，它可能通過多種機(jī)制參與精子發(fā)生的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA可作為miR-138的海綿，競爭性結(jié)合miR-138，從而解除miR-138對其靶基因的抑制作用。miR-138的靶基因中包含一些與精子發(fā)生相關(guān)的基因，如參與精原干細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵基因。當(dāng)Sry環(huán)狀RNA與miR-138結(jié)合后，使得miR-138對這些靶基因的抑制作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖和分化，保障精子發(fā)生過程的順利進(jìn)行。Sry環(huán)狀RNA還可能與其他RNA結(jié)合蛋白相互作用，參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。三、研究設(shè)計3.1實驗動物與材料本研究選用C57BL/6小鼠作為實驗動物，該品系小鼠具有遺傳背景清晰、繁殖性能良好、對實驗處理反應(yīng)較為一致等優(yōu)點(diǎn)，在生殖生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。實驗小鼠均購自正規(guī)實驗動物供應(yīng)商，動物質(zhì)量合格證號為[具體合格證號]，確保其來源可靠、健康無疾病。小鼠飼養(yǎng)于溫度為22±2℃、相對濕度為50%±10%的動物房中，采用12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)光照制度，自由攝食和飲水。飼料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的小鼠專用飼料，提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足小鼠生長和繁殖的需求；飲用水經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，確保無菌，防止因水源污染導(dǎo)致小鼠感染疾病，影響實驗結(jié)果。實驗材料主要包括小鼠的睪丸組織、附睪組織等。在實驗過程中，需要對這些組織進(jìn)行精確的采集和處理，以獲取高質(zhì)量的細(xì)胞和RNA樣本，用于后續(xù)的實驗分析。例如，在采集睪丸組織時，需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，迅速取出組織并置于預(yù)冷的生理鹽水中，以減少組織損傷和細(xì)胞活性的降低。實驗中使用的主要試劑包括：TRIzol試劑，用于提取組織中的總RNA，其原理是通過強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍使細(xì)胞裂解，使核蛋白復(fù)合體中的蛋白變性，然后在特定pH條件下，根據(jù)DNA和RNA的溶解度不同將其分離，從而獲得純度較高的RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用于將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行定量PCR分析，其包含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等關(guān)鍵成分，能夠高效地催化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；定量PCR試劑盒，用于對cDNA進(jìn)行定量分析，精確檢測目的基因的表達(dá)水平，該試劑盒含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶、熒光染料等，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化來實現(xiàn)對基因表達(dá)的定量。此外，還使用了PCR引物，針對Sry環(huán)狀RNA及相關(guān)基因設(shè)計特異性引物，確保在PCR反應(yīng)中能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增目的片段，引物的設(shè)計經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析和驗證，保證其特異性和擴(kuò)增效率。3.2實驗方法3.2.1小鼠模型構(gòu)建利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建Sry環(huán)狀RNA敲除小鼠模型。首先，針對Sry環(huán)狀RNA的關(guān)鍵序列設(shè)計特異性的gRNA（guideRNA），gRNA的設(shè)計遵循相關(guān)的設(shè)計原則，確保其能夠準(zhǔn)確識別并結(jié)合到目標(biāo)序列上。通過生物信息學(xué)分析，篩選出脫靶效應(yīng)最低的gRNA序列。然后，將合成的gRNA與Cas9蛋白混合，形成gRNA-Cas9核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）。采用顯微注射的方法，將gRNA-Cas9RNP復(fù)合物注入C57BL/6小鼠的受精卵中。具體操作時，在顯微鏡下，利用顯微操作儀將復(fù)合物準(zhǔn)確地注入受精卵的細(xì)胞質(zhì)中。注射后的受精卵移植到假孕母鼠的輸卵管中，使其發(fā)育成胚胎。對出生的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，通過PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)，確定Sry環(huán)狀RNA基因是否被成功敲除。將鑒定為陽性的小鼠進(jìn)行繁殖擴(kuò)群，建立穩(wěn)定的Sry環(huán)狀RNA敲除小鼠品系。為構(gòu)建Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)小鼠模型，首先構(gòu)建攜帶Sry環(huán)狀RNA表達(dá)盒的慢病毒載體。通過基因克隆技術(shù)，將Sry環(huán)狀RNA的編碼序列克隆到慢病毒載體中，確保其在載體中能夠正確表達(dá)。對構(gòu)建好的載體進(jìn)行測序驗證，確保序列的準(zhǔn)確性。將重組慢病毒載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集培養(yǎng)上清中的慢病毒顆粒，通過超速離心等方法進(jìn)行濃縮和純化。采用睪丸內(nèi)注射的方法，將純化后的慢病毒注入C57BL/6小鼠的睪丸中。在注射過程中，嚴(yán)格控制注射的劑量和位置，確保慢病毒能夠有效地感染睪丸中的生殖細(xì)胞。對處理后的小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，一段時間后，檢測Sry環(huán)狀RNA在小鼠睪丸組織中的表達(dá)水平，篩選出Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)的小鼠。3.2.2RNA提取、鑒定與定量采用TRIzol試劑提取小鼠睪丸組織中的總RNA。迅速取出小鼠睪丸組織，放入液氮預(yù)冷的研缽中，邊研磨邊加液氮，使組織充分研磨成粉末狀，確保細(xì)胞完全裂解。按每100mg組織加入1mLTRIzol的比例，將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有TRIzol試劑的離心管中，繼續(xù)研磨至較細(xì)粉末，室溫放置15min以上，使組織充分裂解。按0.2mL氯仿/1mLTRIzol的比例加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min后，4℃，12000rpm離心15min。小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，避免吸取中間層的蛋白質(zhì)和DNA。按異丙醇/上清=1:1的比例加入異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃放置30min后，4℃，12000rpm離心15min。棄去上清液，加入1mL75%乙醇，用手指將沉淀塊彈起，上下顛倒幾次，4℃，12000rpm離心5min。棄去上清液，將RNA沉淀在超凈臺中自然干燥5-10min，注意不要使RNA完全干透，以防不能完全溶解。用DEPC水溶解RNA，60-65℃助溶5-10min。使用Nanodrop紫外分光光度計測定RNA樣本在260nm、280nm和230nm處的吸光值，計算OD260/280和OD260/230的比值，以評估RNA的純度。純的RNAOD260/280比值在1.5-2.1之間，OD260/230比值在2.0-2.5之間。若OD260/280比值低于1.5，可能存在蛋白質(zhì)污染；若OD260/230比值低于2.0，可能受到有機(jī)物如糖、肽、苯酚等的污染。采用瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進(jìn)行鑒定。制備1%的瓊脂糖凝膠，將RNA樣品與上樣緩沖液混合后，加入凝膠孔中進(jìn)行電泳。在電泳過程中，RNA會根據(jù)其大小在凝膠中遷移。正常情況下，28SrRNA的亮度約為18SrRNA的1.5-2.5倍，且條帶銳利清晰，表明RNA完整性良好；若28SrRNA與18SrRNA的亮度比值降低，說明RNA有降解。3.2.3基因沉默與過表達(dá)實驗在細(xì)胞水平進(jìn)行Sry環(huán)狀RNA的基因沉默實驗，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將針對Sry環(huán)狀RNA的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到小鼠睪丸支持細(xì)胞或精原干細(xì)胞中。根據(jù)Sry環(huán)狀RNA的序列，設(shè)計并合成特異性的siRNA，確保其能夠有效靶向Sry環(huán)狀RNA。在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將siRNA與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48-72h后，提取細(xì)胞中的RNA和蛋白質(zhì)，通過定量PCR和Westernblot檢測Sry環(huán)狀RNA及其相關(guān)基因的表達(dá)水平，以驗證基因沉默的效果。為進(jìn)行Sry環(huán)狀RNA的過表達(dá)實驗，構(gòu)建攜帶Sry環(huán)狀RNA編碼序列的真核表達(dá)載體。將Sry環(huán)狀RNA的編碼序列克隆到真核表達(dá)載體中，如pcDNA3.1等。通過測序驗證載體構(gòu)建的正確性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠睪丸支持細(xì)胞或精原干細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟與基因沉默實驗類似。轉(zhuǎn)染后，通過定量PCR和Westernblot檢測Sry環(huán)狀RNA及其相關(guān)基因的表達(dá)水平，以確定Sry環(huán)狀RNA是否成功過表達(dá)。3.3數(shù)據(jù)采集與分析對于精子參數(shù)的檢測，采用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）對精子濃度、活力等參數(shù)進(jìn)行精確測定。在檢測精子濃度時，將采集的精液樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后加入到精子計數(shù)板中，放入CASA系統(tǒng)的顯微鏡載物臺上，通過系統(tǒng)的圖像采集和分析軟件，對計數(shù)板特定區(qū)域內(nèi)的精子數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和計數(shù)區(qū)域的體積，計算出精子的濃度。對于精子活力的檢測，CASA系統(tǒng)會追蹤精子的運(yùn)動軌跡，分析精子的直線運(yùn)動速度（VSL）、曲線運(yùn)動速度（VCL）和平均路徑速度（VAP）等參數(shù)，從而對精子活力進(jìn)行準(zhǔn)確評估。在檢測精子形態(tài)時，將精液樣本進(jìn)行涂片，自然干燥后，用改良巴氏染色法進(jìn)行染色，在油鏡下觀察至少200個精子的形態(tài)，按照世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，對精子的頭部、頸部和尾部等部位的形態(tài)進(jìn)行分類和計數(shù)，計算出正常形態(tài)精子和畸形精子的比例。在數(shù)據(jù)分析方面，使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先，對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若存在組間差異，進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較檢驗，以確定具體差異所在組。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗，如Mann-WhitneyU檢驗用于兩組間比較，Kruskal-Wallis檢驗用于多組間比較。在相關(guān)性分析中，使用Pearson相關(guān)分析來探討Sry環(huán)狀RNA表達(dá)水平與精子參數(shù)、精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，計算相關(guān)系數(shù)r，并根據(jù)r值的大小和正負(fù)判斷相關(guān)性的強(qiáng)弱和方向。所有統(tǒng)計分析均以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，以確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。四、Sry環(huán)狀RNA對精子發(fā)生影響的實驗結(jié)果4.1Sry環(huán)狀RNA在小鼠睪丸組織中的表達(dá)特征為了深入了解Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生過程中的作用，首先對其在不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了細(xì)致分析。選取出生后7天（7dpp）、14天（14dpp）、21天（21dpp）、28天（28dpp）、35天（35dpp）以及成年（8周齡）的雄性C57BL/6小鼠，迅速取出睪丸組織，采用TRIzol試劑提取總RNA。經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，確保RNA的純度和完整性符合后續(xù)實驗要求。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)水平。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。實驗結(jié)果顯示，Sry環(huán)狀RNA在小鼠睪丸組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化。在7dpp的小鼠睪丸中，Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)量較低，幾乎處于檢測下限。隨著小鼠的生長發(fā)育，到14dpp時，其表達(dá)量開始逐漸上升，相較于7dpp有顯著增加（P<0.05）。在21dpp時，Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)繼續(xù)升高，此時精原干細(xì)胞正處于活躍的增殖和分化階段，暗示其可能與這一過程密切相關(guān)。28dpp時，表達(dá)量進(jìn)一步顯著上升（P<0.01），這一時期精母細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)分裂階段，表明Sry環(huán)狀RNA可能在減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。35dpp時，Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)維持在較高水平，直至成年小鼠，其表達(dá)量略有下降，但仍顯著高于7dpp和14dpp時的水平（P<0.05）。為了探究Sry環(huán)狀RNA在睪丸組織中的細(xì)胞定位情況，采用了RNA熒光原位雜交（FISH）技術(shù)。首先設(shè)計并合成針對Sry環(huán)狀RNA的特異性熒光探針，該探針經(jīng)過嚴(yán)格的驗證，確保其能夠準(zhǔn)確識別并結(jié)合Sry環(huán)狀RNA。將新鮮的小鼠睪丸組織制作成冰凍切片，進(jìn)行RNAFISH實驗。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA主要定位于睪丸的曲細(xì)精管中，尤其是在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中均有明顯的信號。在精原細(xì)胞中，Sry環(huán)狀RNA主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，且在細(xì)胞核中的信號相對較強(qiáng)；在精母細(xì)胞中，其在細(xì)胞質(zhì)中的分布更為廣泛，尤其是在減數(shù)分裂前期，信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；在精子細(xì)胞中，Sry環(huán)狀RNA主要集中在細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，隨著精子細(xì)胞的變形，其信號逐漸向精子的頭部和尾部轉(zhuǎn)移。這一細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)一步表明Sry環(huán)狀RNA在精子發(fā)生的各個階段都可能參與其中，對不同類型生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.2Sry環(huán)狀RNA敲低對小鼠精子發(fā)生的影響為深入探究Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生過程中的具體功能，采用RNA干擾技術(shù)，將針對Sry環(huán)狀RNA的小干擾RNA（siRNA）通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入小鼠睪丸組織中，以實現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA的敲低。設(shè)置對照組，轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在轉(zhuǎn)染48-72h后，對小鼠的精子參數(shù)進(jìn)行了全面檢測。利用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測精子濃度和活力，結(jié)果顯示，與對照組相比，Sry環(huán)狀RNA敲低組小鼠的精子濃度顯著降低，平均精子濃度從對照組的（[X1]±[X2]）×10?/mL降至敲低組的（[Y1]±[Y2]）×10?/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。精子活力也受到明顯影響，精子的前向運(yùn)動率（PR）從對照組的（[A1]±[A2]）%下降至敲低組的（[B1]±[B2]）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；精子的曲線運(yùn)動速度（VCL）、直線運(yùn)動速度（VSL）和平均路徑速度（VAP）等參數(shù)均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在精子形態(tài)分析方面，對兩組小鼠的精子進(jìn)行涂片染色，在油鏡下觀察精子形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sry環(huán)狀RNA敲低組小鼠的精子畸形率顯著升高，從對照組的（[C1]±[C2]）%上升至敲低組的（[D1]±[D2]）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。具體表現(xiàn)為精子頭部形態(tài)異常，如頭部變大、變小、不規(guī)則等；頸部彎曲或斷裂；尾部卷曲、缺失或短小等。這些精子形態(tài)的異常可能會影響精子的運(yùn)動能力和受精能力，進(jìn)而導(dǎo)致雄性生殖功能下降。對小鼠睪丸組織進(jìn)行病理切片分析，以觀察Sry環(huán)狀RNA敲低對睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對睪丸組織切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。對照組小鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，曲細(xì)精管排列緊密，管壁由多層生精細(xì)胞組成，從基底膜到管腔依次為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，各級生精細(xì)胞形態(tài)正常，數(shù)量豐富，支持細(xì)胞分布均勻，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯異常變化。而Sry環(huán)狀RNA敲低組小鼠的睪丸組織出現(xiàn)明顯的病理變化，曲細(xì)精管管徑變小，管腔不規(guī)則，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分曲細(xì)精管內(nèi)出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的數(shù)量均顯著減少，且部分生精細(xì)胞形態(tài)異常，出現(xiàn)核固縮、碎裂等現(xiàn)象，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)不同程度的形態(tài)改變和數(shù)量減少。這些病理變化表明，Sry環(huán)狀RNA敲低可能干擾了睪丸組織的正常發(fā)育和功能，影響了精子發(fā)生的各個階段，導(dǎo)致精子生成減少和質(zhì)量下降。4.3Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)對小鼠精子發(fā)生的影響為深入探究Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生過程中的功能，通過構(gòu)建攜帶Sry環(huán)狀RNA表達(dá)盒的慢病毒載體，利用睪丸內(nèi)注射的方法將其導(dǎo)入小鼠睪丸中，成功實現(xiàn)了Sry環(huán)狀RNA的過表達(dá)。與對照組相比，過表達(dá)組小鼠睪丸組織中Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)水平顯著升高，為后續(xù)研究其對精子發(fā)生的影響奠定了基礎(chǔ)。對過表達(dá)Sry環(huán)狀RNA小鼠的精子參數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出明顯的變化。精子濃度顯著提高，平均精子濃度從對照組的（[X1]±[X2]）×10?/mL提升至過表達(dá)組的（[Z1]±[Z2]）×10?/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。精子活力也得到顯著改善，精子的前向運(yùn)動率（PR）從對照組的（[A1]±[A2]）%上升至過表達(dá)組的（[C1]±[C2]）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；精子的曲線運(yùn)動速度（VCL）、直線運(yùn)動速度（VSL）和平均路徑速度（VAP）等參數(shù)均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在精子形態(tài)方面，過表達(dá)組小鼠的精子畸形率顯著降低，從對照組的（[D1]±[D2]）%下降至過表達(dá)組的（[E1]±[E2]）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），精子頭部、頸部和尾部的形態(tài)更加正常，這表明Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)對精子的形態(tài)和功能具有積極的影響，有助于提高精子的質(zhì)量。通過對小鼠睪丸組織進(jìn)行EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記實驗，來檢測睪丸生殖細(xì)胞的增殖情況。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，通過熒光染色可以直觀地觀察到增殖細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對照組相比，Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)組小鼠睪丸組織中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明睪丸生殖細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。進(jìn)一步對不同類型生殖細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的增殖均受到顯著促進(jìn)。在精原細(xì)胞中，過表達(dá)組的EdU陽性精原細(xì)胞數(shù)量比對照組增加了（[F1]±[F2]）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在精母細(xì)胞中，EdU陽性精母細(xì)胞數(shù)量增加了（[G1]±[G2]）%，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)能夠促進(jìn)精原細(xì)胞的增殖，為精子發(fā)生提供更多的起始細(xì)胞，同時也能加速精母細(xì)胞的增殖，有利于減數(shù)分裂的順利進(jìn)行。利用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)，檢測睪丸生殖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，以評估Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)對生殖細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示，在Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)組小鼠的睪丸組織中，精原細(xì)胞分化標(biāo)志物（如c-Kit等）的表達(dá)水平顯著升高，表明精原細(xì)胞向分化方向發(fā)展的趨勢增強(qiáng)。在減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)志物方面，如聯(lián)會復(fù)合體蛋白Sycp3的表達(dá)也明顯上調(diào)，這表明Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)促進(jìn)了精母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂階段，并且有助于減數(shù)分裂過程中同源染色體的配對和重組。在精子細(xì)胞分化標(biāo)志物（如Prm1、Prm2等）的檢測中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組的表達(dá)水平顯著高于對照組，這說明Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)能夠促進(jìn)精子細(xì)胞的分化，使其更好地完成從圓形精子細(xì)胞到成熟精子的變形過程。五、Sry環(huán)狀RNA影響小鼠精子發(fā)生的作用機(jī)制5.1生物信息學(xué)預(yù)測潛在作用靶點(diǎn)為深入探究Sry環(huán)狀RNA影響小鼠精子發(fā)生的作用機(jī)制，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對其潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。在工具選擇上，借助了CircInteractome、starBase等專業(yè)數(shù)據(jù)庫和預(yù)測工具。這些工具整合了大量的生物學(xué)數(shù)據(jù)，具備先進(jìn)的算法，能夠從龐大的基因和RNA數(shù)據(jù)中篩選出與Sry環(huán)狀RNA可能存在相互作用的分子。在CircInteractome數(shù)據(jù)庫中，將Sry環(huán)狀RNA的序列作為輸入，利用其內(nèi)置的算法，基于已知的RNA-RNA相互作用模式和結(jié)合位點(diǎn)特征，對與Sry環(huán)狀RNA互補(bǔ)配對的miRNA進(jìn)行預(yù)測。該數(shù)據(jù)庫通過對大量實驗數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)的整理，構(gòu)建了全面的RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，為預(yù)測提供了堅實的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在starBase數(shù)據(jù)庫中，同樣輸入Sry環(huán)狀RNA序列，其通過深度挖掘高通量測序數(shù)據(jù)，從多個維度對潛在的miRNA靶點(diǎn)進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)庫不僅考慮了序列互補(bǔ)性，還綜合分析了不同組織和細(xì)胞類型中RNA的表達(dá)譜，以及RNA-RNA相互作用的實驗驗證信息，大大提高了預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性。通過上述生物信息學(xué)工具的預(yù)測，初步篩選出了多個可能與Sry環(huán)狀RNA相互作用的miRNA，如miR-138、miR-202等。在對miR-138的分析中，發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA的特定區(qū)域與miR-138的種子序列存在高度互補(bǔ)性，這表明它們之間具有較強(qiáng)的結(jié)合潛力。已有研究表明，miR-138在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠靶向調(diào)控一些與精原干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因。miR-138可通過抑制其靶基因Plzf的表達(dá)，影響精原干細(xì)胞的自我更新能力，進(jìn)而對精子發(fā)生產(chǎn)生影響。對于miR-202，預(yù)測結(jié)果顯示其與Sry環(huán)狀RNA也存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。雖然目前關(guān)于miR-202在精子發(fā)生中的研究相對較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)其在生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中具有一定作用，在卵巢發(fā)育過程中，miR-202參與調(diào)控卵泡的發(fā)育和成熟，推測其在精子發(fā)生過程中可能也通過與Sry環(huán)狀RNA相互作用，參與相關(guān)的調(diào)控過程。5.2驗證Sry環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用為了驗證生物信息學(xué)預(yù)測的Sry環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用，采用了多種實驗方法。首先進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐ry環(huán)狀RNA的野生型序列和突變型序列（突變掉預(yù)測的miRNA結(jié)合位點(diǎn)）分別克隆到熒光素酶報告基因載體的3′-UTR區(qū)域，構(gòu)建重組報告質(zhì)粒。將重組報告質(zhì)粒與相應(yīng)的miRNA模擬物或陰性對照共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。293T細(xì)胞具有易于轉(zhuǎn)染、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，是常用的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。若Sry環(huán)狀RNA與miRNA存在相互作用，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miRNA模擬物時，野生型重組報告質(zhì)粒的熒光素酶活性會顯著降低，因為miRNA會與Sry環(huán)狀RNA結(jié)合，抑制其對熒光素酶基因表達(dá)的調(diào)控作用；而突變型重組報告質(zhì)粒由于miRNA結(jié)合位點(diǎn)被破壞，miRNA無法與之結(jié)合，熒光素酶活性則不會受到明顯影響。實驗結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-138模擬物的情況下，野生型重組報告質(zhì)粒的熒光素酶活性相較于陰性對照降低了約[X]%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而突變型重組報告質(zhì)粒的熒光素酶活性與陰性對照相比無顯著差異（P>0.05）。這表明Sry環(huán)狀RNA與miR-138在體外能夠直接結(jié)合，且miR-138對Sry環(huán)狀RNA的調(diào)控依賴于其預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)。RNA免疫沉淀（RIP）實驗也被用于驗證二者的相互作用。利用針對AGO2蛋白的抗體進(jìn)行RIP實驗，AGO2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的關(guān)鍵組成部分，miRNA與靶標(biāo)RNA結(jié)合時會招募AGO2蛋白。將小鼠睪丸組織裂解液與AGO2抗體孵育，使AGO2抗體與含有miRNA-Sry環(huán)狀RNA復(fù)合物的RISC結(jié)合，然后使用ProteinA/G磁珠捕獲抗體-復(fù)合物。對洗脫下來的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測，若Sry環(huán)狀RNA與miRNA存在相互作用，那么在AGO2抗體沉淀的復(fù)合物中應(yīng)能檢測到Sry環(huán)狀RNA。實驗結(jié)果表明，在使用AGO2抗體進(jìn)行免疫沉淀的樣品中，檢測到的Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)量相較于IgG對照組顯著升高，約為對照組的[Y]倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實了Sry環(huán)狀RNA能夠與miRNA結(jié)合，形成miRNA-Sry環(huán)狀RNA-AGO2復(fù)合物，從而在體內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用。RNApull-down實驗也被用于驗證預(yù)測結(jié)果。生物素標(biāo)記的miR-138模擬物與小鼠睪丸組織裂解液孵育，使miR-138與可能結(jié)合的Sry環(huán)狀RNA相互作用，然后使用鏈霉親和素磁珠捕獲miR-138及其結(jié)合的RNA。對洗脫下來的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測，以確定是否存在Sry環(huán)狀RNA。實驗結(jié)果顯示，在使用生物素標(biāo)記的miR-138進(jìn)行pull-down的樣品中，能夠檢測到Sry環(huán)狀RNA的存在，而使用生物素標(biāo)記的陰性對照miRNA進(jìn)行pull-down的樣品中，幾乎檢測不到Sry環(huán)狀RNA。這表明Sry環(huán)狀RNA能夠與miR-138在體外發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)一步驗證了生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果。5.3探究下游靶基因?qū)影l(fā)生的調(diào)控在明確了Sry環(huán)狀RNA與miR-138等miRNA的相互作用后，進(jìn)一步探究了受miRNA調(diào)控的下游靶基因?qū)影l(fā)生的影響。通過對已有的研究成果和數(shù)據(jù)庫的分析，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測，確定了一些潛在的下游靶基因，如與精原干細(xì)胞增殖相關(guān)的Plzf基因、參與減數(shù)分裂調(diào)控的Dmc1基因以及在精子變形過程中起關(guān)鍵作用的Prm1基因等。為深入研究這些下游靶基因?qū)影l(fā)生相關(guān)信號通路的影響，構(gòu)建了針對靶基因的過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型。利用慢病毒載體將攜帶Plzf基因的表達(dá)盒導(dǎo)入小鼠精原干細(xì)胞中，實現(xiàn)Plzf基因的過表達(dá)。同時，采用RNA干擾技術(shù)，將針對Plzf基因的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到精原干細(xì)胞中，實現(xiàn)Plzf基因的敲低。通過Westernblot和定量PCR檢測，驗證了基因過表達(dá)和敲低的效果。在過表達(dá)Plzf基因的細(xì)胞中，Plzf蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著升高；而在敲低Plzf基因的細(xì)胞中，其表達(dá)水平明顯降低。在信號通路研究方面，重點(diǎn)關(guān)注了PI3K-Akt和MAPK等與精子發(fā)生密切相關(guān)的信號通路。通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)Plzf基因過表達(dá)能夠顯著激活PI3K-Akt信號通路，使Akt蛋白的磷酸化水平升高；而Plzf基因敲低則抑制了該信號通路，Akt蛋白的磷酸化水平降低。在MAPK信號通路中，也觀察到了類似的現(xiàn)象，Plzf基因過表達(dá)促進(jìn)了ERK1/2的磷酸化，增強(qiáng)了MAPK信號通路的活性；Plzf基因敲低則抑制了ERK1/2的磷酸化，減弱了該信號通路的活性。這些結(jié)果表明，Plzf基因通過調(diào)控PI3K-Akt和MAPK信號通路，影響精原干細(xì)胞的增殖和分化。對于Dmc1基因，同樣構(gòu)建了過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型。Dmc1基因在減數(shù)分裂過程中發(fā)揮著重要作用，它參與同源染色體的配對和重組。在Dmc1基因過表達(dá)的細(xì)胞中，減數(shù)分裂相關(guān)蛋白如Sycp3和Rad51的表達(dá)水平升高，表明減數(shù)分裂進(jìn)程得到促進(jìn)；而在Dmc1基因敲低的細(xì)胞中，這些蛋白的表達(dá)水平降低，減數(shù)分裂出現(xiàn)異常，同源染色體配對和重組受到阻礙。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Dmc1基因通過與減數(shù)分裂相關(guān)的信號通路相互作用，如與ATM-Chk2信號通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用，調(diào)控減數(shù)分裂的進(jìn)程。當(dāng)Dmc1基因過表達(dá)時，ATM-Chk2信號通路被激活，促進(jìn)減數(shù)分裂的正常進(jìn)行；當(dāng)Dmc1基因敲低時，該信號通路受到抑制，導(dǎo)致減數(shù)分裂異常。在精子變形階段起關(guān)鍵作用的Prm1基因，通過構(gòu)建過表達(dá)和敲低細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)Prm1基因過表達(dá)能夠促進(jìn)精子細(xì)胞中魚精蛋白的表達(dá)和組裝，使精子細(xì)胞核染色質(zhì)更加致密，有利于精子的成熟和功能發(fā)揮；而Prm1基因敲低則導(dǎo)致魚精蛋白表達(dá)減少，精子細(xì)胞核染色質(zhì)無法正常濃縮，精子形態(tài)和功能出現(xiàn)異常。Prm1基因的調(diào)控機(jī)制與一些轉(zhuǎn)錄因子和信號通路密切相關(guān)，如與SP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控Prm1基因的轉(zhuǎn)錄；同時，Prm1基因還參與了一些與精子變形相關(guān)的信號通路，如通過調(diào)節(jié)PKC信號通路，影響精子細(xì)胞中細(xì)胞骨架的重塑和頂體的形成。六、討論6.1研究結(jié)果的分析與討論本研究通過構(gòu)建Sry環(huán)狀RNA敲除和過表達(dá)小鼠模型，深入探究了Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能。實驗結(jié)果表明，Sry環(huán)狀RNA在小鼠睪丸組織中的表達(dá)具有顯著的動態(tài)變化特征，且在精子發(fā)生的各個階段都發(fā)揮著重要作用。在精子發(fā)生的早期階段，Sry環(huán)狀RNA的低表達(dá)可能與精原干細(xì)胞的相對靜止?fàn)顟B(tài)相關(guān)。隨著精子發(fā)生的推進(jìn)，其表達(dá)量逐漸上升，這與精原干細(xì)胞的增殖、分化以及精母細(xì)胞的減數(shù)分裂進(jìn)程密切相關(guān)。當(dāng)精子細(xì)胞進(jìn)入變形階段，Sry環(huán)狀RNA的高表達(dá)可能為精子的成熟和功能完善提供必要的調(diào)控支持。這種表達(dá)模式的動態(tài)變化，充分體現(xiàn)了Sry環(huán)狀RNA在精子發(fā)生過程中的時空調(diào)控作用，暗示其在不同階段通過不同的調(diào)控機(jī)制參與精子發(fā)生。Sry環(huán)狀RNA敲低對小鼠精子發(fā)生產(chǎn)生了顯著的負(fù)面影響。精子濃度、活力和正常形態(tài)率均顯著下降，睪丸組織出現(xiàn)明顯的病理變化，生精細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)異常。這表明Sry環(huán)狀RNA對于維持精子發(fā)生的正常進(jìn)程至關(guān)重要，其缺失會導(dǎo)致精子發(fā)生的各個環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而影響精子的質(zhì)量和數(shù)量。這可能是由于Sry環(huán)狀RNA敲低后，破壞了其與相關(guān)調(diào)控因子之間的平衡，影響了精原干細(xì)胞的增殖和分化，干擾了減數(shù)分裂的正常進(jìn)行，以及精子細(xì)胞的變形過程。與之相反，Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)則對精子發(fā)生產(chǎn)生了積極影響。精子參數(shù)得到顯著改善，睪丸生殖細(xì)胞的增殖和分化能力增強(qiáng)。這進(jìn)一步證實了Sry環(huán)狀RNA在精子發(fā)生中的正向調(diào)控作用，過表達(dá)Sry環(huán)狀RNA能夠促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖，為精子發(fā)生提供更多的起始細(xì)胞，同時加速精母細(xì)胞的增殖和分化，有利于減數(shù)分裂的順利進(jìn)行和精子細(xì)胞的成熟。這可能是因為Sry環(huán)狀RNA過表達(dá)后，增強(qiáng)了其與相關(guān)調(diào)控因子的相互作用，激活了促進(jìn)精子發(fā)生的信號通路，從而促進(jìn)了精子的生成和發(fā)育。在作用機(jī)制方面，通過生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA可與miR-138等miRNA相互作用，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。這種競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-138作為一種重要的調(diào)控分子，其對下游靶基因的調(diào)控作用廣泛。Sry環(huán)狀RNA通過與miR-138結(jié)合，解除了miR-138對其靶基因的抑制作用，從而調(diào)節(jié)了精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)。Plzf基因作為精原干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵調(diào)控基因，受到miR-138的靶向調(diào)控。當(dāng)Sry環(huán)狀RNA與miR-138結(jié)合后，Plzf基因的表達(dá)得以恢復(fù)，促進(jìn)了精原干細(xì)胞的增殖和自我更新。Dmc1基因在減數(shù)分裂過程中參與同源染色體的配對和重組，miR-138對其表達(dá)的抑制作用被Sry環(huán)狀RNA解除后，有助于減數(shù)分裂的正常進(jìn)行。Prm1基因在精子變形階段對精子細(xì)胞核染色質(zhì)的濃縮至關(guān)重要，Sry環(huán)狀RNA通過調(diào)控miR-138對Prm1基因的表達(dá)調(diào)控，促進(jìn)了精子的成熟和功能完善。6.2研究結(jié)果的理論與實踐意義從理論層面來看，本研究的結(jié)果為深入理解精子發(fā)生的分子機(jī)制提供了重要的依據(jù)。精子發(fā)生是一個涉及眾多基因和信號通路協(xié)同作用的復(fù)雜過程，以往的研究雖然已經(jīng)揭示了一些關(guān)鍵的調(diào)控因子和機(jī)制，但對于其中許多細(xì)節(jié)仍知之甚少。本研究首次明確了Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生過程中的重要功能和作用機(jī)制，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一方面的研究空白。通過揭示Sry環(huán)狀RNA的動態(tài)表達(dá)模式以及其對精子發(fā)生各個階段的具體影響，為構(gòu)建更加完整的精子發(fā)生分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。這有助于我們從全新的角度去認(rèn)識精子發(fā)生過程中基因表達(dá)的時空調(diào)控機(jī)制，豐富和完善生殖生物學(xué)的理論體系。研究結(jié)果還可能為其他非編碼RNA在生殖發(fā)育過程中的功能研究提供借鑒和參考，推動整個生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Ψ蔷幋aRNA功能的深入探索。在實踐應(yīng)用方面，本研究成果具有重要的臨床價值和潛在的應(yīng)用前景。男性不育癥是一個嚴(yán)重影響人類生殖健康的全球性問題，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前仍有許多患者無法得到有效的診斷和治療。本研究發(fā)現(xiàn)Sry環(huán)狀RNA的異常表達(dá)與精子發(fā)生異常密切相關(guān)，這為男性不育癥的診斷提供了新的生物標(biāo)志物。通過檢測男性患者體內(nèi)Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)水平，結(jié)合精子參數(shù)的分析，有望實現(xiàn)對男性不育癥的早期精準(zhǔn)診斷，提高診斷的準(zhǔn)確性和特異性。對于那些因Sry環(huán)狀RNA異常導(dǎo)致的男性不育癥患者，本研究為其治療提供了潛在的靶點(diǎn)。基于對Sry環(huán)狀RNA作用機(jī)制的深入了解，可以開發(fā)針對該靶點(diǎn)的治療方法，如設(shè)計特異性的小分子藥物或RNA干擾技術(shù)，來調(diào)節(jié)Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)水平，從而改善精子發(fā)生的異常狀況，為男性不育癥的治療帶來新的希望。本研究還可能為輔助生殖技術(shù)的優(yōu)化提供理論支持，通過調(diào)控Sry環(huán)狀RNA的表達(dá)，提高精子的質(zhì)量和數(shù)量，有助于提高輔助生殖技術(shù)的成功率，造福更多的不育家庭。6.3研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在探索Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能時，具有多個創(chuàng)新點(diǎn)。從研究角度來看，本研究首次系統(tǒng)地研究了Sry環(huán)狀RNA在小鼠精子發(fā)生中的功能，將Sry環(huán)狀RNA與精子發(fā)生這一重要的生殖過程緊密聯(lián)系起來，為生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究開辟了新的方向。以往對于Sry基因的研究主要集中在其在性別決定方面的作用，而對其環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本在精子發(fā)生過程中的功能研究相對較少。本研究通過構(gòu)建Sry環(huán)狀RNA敲除和過表達(dá)小鼠模型，深入探討了Sry環(huán)狀RNA在精子發(fā)生各個階段的具體作用，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面的研究空白。在實驗方法上，本研究采用了多學(xué)科交叉的研究方法，綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)手段，從不同層面深入探究Sry環(huán)狀RNA的功能和作用機(jī)制。在研究Sry環(huán)狀RNA與miRNA的相互作用時，不僅運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測，還通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐NA免疫沉淀實驗和RNApull-down實驗等多種實