SM934對非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的藥效學研究：從機制到應用一、引言1.1非酒精性脂肪性肝炎疾病概況非酒精性脂肪性肝炎（NonalcoholicSteatohepatitis，NASH）是一種以肝細胞脂肪變性、炎癥和肝細胞損傷為特征的肝臟疾病，是代謝相關脂肪性肝病（MAFLD）的嚴重形式。其病理特征主要表現為肝細胞大泡性脂肪變性、小葉內炎癥伴點狀壞死、肝細胞氣球樣變等，進一步發展可導致肝纖維化、肝硬化，甚至肝細胞癌，嚴重威脅人類健康。近年來，隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，全球NASH的發病率呈顯著上升趨勢。據統計，全球NASH的患病率約為2-5%，且在肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征人群中更為常見。在我國，隨著經濟的快速發展和生活水平的提高，NASH的發病率也在逐年攀升，已成為慢性肝病的重要病因之一。由于NASH起病隱匿，多數患者在疾病早期無明顯癥狀，往往在體檢或出現并發癥時才被發現，這使得疾病的早期診斷和干預面臨挑戰。一旦疾病進展到肝硬化階段，患者不僅生活質量嚴重下降，還面臨著較高的死亡風險，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。目前，NASH的治療手段相對有限。臨床上主要通過生活方式干預，如飲食控制和增加運動，來減輕體重和改善代謝紊亂，但長期依從性較低，難以有效逆轉肝纖維化的進展。在藥物治療方面，雖然有多種藥物處于研發階段，但截至目前，美國食品藥品監督管理局（FDA）僅批準了Resmetirom用于治療伴有肝纖維化的NASH患者，仍有大量患者的治療需求未得到滿足。現有的一些治療藥物，如維生素E、胰島素增敏劑等，存在療效有限、不良反應較多等問題，無法滿足臨床治療的需要。因此，開發安全、有效的新型治療藥物成為NASH治療領域的迫切需求。1.2非酒精性脂肪性肝炎藥物治療靶標的研究概況1.2.1現有藥物對NASH的治療效果目前，臨床上用于治療NASH的藥物種類有限，主要包括維生素E、胰島素增敏劑等。維生素E作為一種抗氧化劑，被認為可以通過減輕氧化應激和炎癥反應來改善NASH患者的肝臟狀況。一項針對非酒精性脂肪性肝炎成人患者的隨機、安慰劑對照試驗顯示，使用維生素E治療96周后，患者肝臟的脂肪變性、炎癥和氣球樣變等病理指標得到了一定程度的改善。然而，長期使用維生素E可能會帶來一些不良反應，如增加出血性卒中的風險等，限制了其在臨床上的廣泛應用。胰島素增敏劑如噻唑烷二酮類藥物（如吡格列酮），通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），調節糖脂代謝，改善胰島素抵抗，減少肝臟脂肪堆積。研究表明，吡格列酮在降低NASH患者的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平，改善肝臟脂肪變性和小葉炎癥方面具有顯著效果。但該類藥物也存在諸多局限性，如可能導致體重增加、水腫、骨折風險增加等不良反應，長期應用還可能誘發心力衰竭和膀胱癌等，使得部分患者難以耐受，依從性降低。二甲雙胍作為另一種常用的降糖藥物，主要通過減少糖異生、肝臟葡萄糖輸出、間接增加骨骼肌葡萄糖吸收和改善胰島素敏感性來降低血糖。雖然二甲雙胍可降低轉氨酶水平，但在改善肝臟組織學方面效果不顯著，因此主要用于NAFLD伴有2型糖尿病患者，對于單純NASH患者的治療效果不佳。此外，一些其他藥物如熊去氧膽酸、ω-3多不飽和脂肪酸等也被嘗試用于NASH的治療，但這些藥物的療效均存在爭議，且無法有效逆轉肝纖維化，難以滿足臨床治療的需求。1.2.2有關NASH的新藥研發進展由于現有藥物治療NASH存在諸多局限性，近年來，全球各大藥企紛紛加大對NASH新藥的研發投入，眾多新型藥物處于不同研發階段。奧貝膽酸（OCA）是一種強效的膽汁酸核受體法尼酯衍生物X受體（FXR）激動劑，被譽為治療NASH最有前景的藥物之一。其作用機制主要是通過激活FXR，抑制膽汁酸合成，減少肝臟脂肪堆積，改善脂肪變性和胰島素敏感性。多項臨床試驗表明，奧貝膽酸在改善NASH患者的肝臟組織學指標方面具有一定效果。然而，奧貝膽酸也存在一些不良反應，如瘙癢、血脂異常等，且長期使用可能會增加心血管疾病的風險，這些問題限制了其廣泛應用。Resmetirom是一款口服甲狀腺激素受體（THR）-β選擇性激動劑，于[具體獲批時間]被FDA加速批準上市，用于治療伴有肝纖維化的NASH患者，這是FDA批準的首個治療NASH的創新藥物。THR-β在人體肝臟中高表達，激活該受體可減少肝臟脂肪積累，調節脂代謝，降低低密度膽固醇（LDL-C）、甘油三酯和致動脈粥樣硬化性脂蛋白，還可通過促進脂肪酸的分解和刺激線粒體的生物發生來減少脂肪毒性并改善肝功能。盡管Resmetirom的獲批為NASH患者帶來了新的治療選擇，但該藥物也并非適用于所有患者，且其長期安全性和有效性仍需進一步觀察。國內多家企業也積極布局NASH新藥研發領域。例如，歌禮開發的多款在研新藥布局NASH適應癥，其中包括與Resmetirom同靶點的THR-β選擇性激動劑ASC41，其臨床Ⅱ期試驗取得積極的期中結果；脂肪酸合成酶（FASN）抑制劑ASC40治療肝穿活檢F2/3期NASH的Ⅱb期臨床也取得積極頂線結果。眾生藥業的ZSP1601片是國內第一個遞交臨床試驗注冊申請并獲批臨床試驗的NASH創新藥，目前正在開展Ⅱb期臨床研究，其Ⅰb/Ⅱa期數據表明該藥在炎癥、肝臟脂肪、纖維化等多個指標獲得積極結果。盡管NASH新藥研發取得了一定進展，但仍面臨諸多挑戰。一方面，NASH的病因復雜，發病機制尚未完全明確，這給新藥研發帶來了很大困難。另一方面，臨床試驗中藥物的療效和安全性評估標準尚未統一，導致不同研究之間的結果難以比較和驗證。此外，NASH患者往往伴有多種代謝綜合征，如肥胖、糖尿病、心血管疾病等，如何在治療NASH的同時，避免對其他代謝系統產生不良影響，也是新藥研發過程中需要解決的重要問題。1.3馬來酸蒿乙醚胺SM934馬來酸蒿乙醚胺（SM934）是一種結構新穎的水溶性青蒿素衍生物，其獨特的分子結構賦予了它諸多優勢。與傳統青蒿素類藥物相比，SM934在保留了青蒿素基本骨架的基礎上，通過特定的化學修飾引入了氨基和醚鍵等官能團。這種結構改造不僅顯著提高了其水溶性，使其在體內能夠更快速、更均勻地分布，還增強了其穩定性和生物利用度，為其臨床應用提供了更廣闊的空間。作為一種水溶性青蒿素衍生物，SM934克服了傳統青蒿素類藥物溶解度差、口服生物利用度低的缺點。良好的水溶性使得SM934在制劑過程中更加方便，可以開發成多種劑型，如片劑、膠囊劑、口服液體制劑等，滿足不同患者的用藥需求。較高的口服生物利用度意味著患者在口服給藥后，藥物能夠更有效地被吸收進入血液循環，從而提高藥物的療效。這一優勢使得SM934在臨床應用中具有更高的可行性和實用性。SM934在自身免疫性疾病治療領域展現出了顯著的效果。在系統性紅斑狼瘡的治療研究中，SM934能夠通過抑制相關炎癥信號通路，調節機體的免疫反應，減輕炎癥損傷，改善患者的臨床癥狀。研究表明，SM934可以抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化和增殖，減少自身抗體的產生，從而緩解系統性紅斑狼瘡患者的病情。在類風濕性關節炎的治療中，SM934也表現出了良好的治療潛力，能夠減輕關節炎癥和疼痛，抑制關節破壞，改善患者的關節功能。基于SM934在免疫調節和抗炎方面的良好活性，研究人員開始探索其在NASH治療中的應用。NASH的發病機制與炎癥、氧化應激和脂質代謝紊亂密切相關，而SM934的免疫抑制和抗炎特性使其有可能通過調節肝臟的免疫微環境，減輕炎癥反應，改善脂質代謝，從而對NASH起到治療作用。因此，開展SM934對NASH治療作用的研究具有重要的理論意義和臨床價值，有望為NASH的治療提供新的藥物選擇和治療策略。1.4非酒精性脂肪性肝炎動物模型在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的研究中，建立合適的動物模型對于深入探究疾病的發病機制、評估藥物療效以及開發新的治療方法至關重要。目前，常用的NASH小鼠模型主要包括高脂飲食誘導模型、營養素缺乏飲食誘導模型、化學毒素誘導模型以及基因編輯小鼠模型，這些模型各有其特點。高脂飲食誘導的NASH模型是較為常用的一種。通過給予小鼠高熱量、高糖分以及高膽固醇的特殊飼料，如60kcal%fat+7kcal%sucrose的高脂飼料、45kcal%fat+17kcal%sucrose的高脂高糖飼料，或者額外添加果糖和膽固醇的西方飲食飼料（WD），充分模擬了人類由于飲食結構改變導致的代謝疾病。這類模型能使小鼠產生肥胖、高血糖、高血脂等代謝紊亂特征，同時表現出一定程度的脂肪變性、炎癥、氣球樣變或纖維化表型，與人類NASH患者中觀察到的主要特征，包括肥胖和胰島素抵抗較為相似，在評估減重、低脂飲食及改善胰島素抵抗的治療藥物方面具有重要價值。然而，其造模周期很長，通常需要20-30周以上，這在一定程度上限制了藥效評價實驗的推進速度。營養素缺乏飲食誘導的NASH模型，如使用蛋氨酸+膽堿缺乏飼料（MCD）飼喂小鼠。在3周左右，小鼠可見明顯的脂肪性肝炎病變，8周后可見肝纖維化。雖然該模型能夠呈現肝臟的病理表現，但小鼠無肥胖、高血糖及高血脂表型，且體重和血糖相較于對照小鼠顯著降低，不能很好地復刻人類NASH病癥，在模擬人類NASH的復雜性方面存在一定局限性。化學毒素誘導的NASH模型中，鏈脲佐菌素（STZ）和四氯化碳（CCl?）是常用的誘導毒素。低劑量的STZ毒素能夠一定程度破壞胰島β細胞的功能，引發2型糖尿病等代謝紊亂表型。高脂飲食8周后加入CCl?的誘導，在CCl?誘導4周后可使小鼠出現肝臟小葉炎癥、氣球樣變性和中度纖維化。這種造模方式造模周期相對較短，也能夠獲得較全面的脂肪肝病理表型。但不同批次之間的STZ毒素存在差異，實驗條件、人為操作等差異都會對成模的效果產生一定影響，且該類模型均沒有肥胖、胰島素抵抗的表征，難以匹配人類脂肪肝病研究中對全身代謝紊亂綜合征與肝臟病理變化發展關系的研究需求。基因編輯小鼠模型則針對特定靶向基因缺失進行開發，避免了傳統造模方式周期長、小鼠代謝紊亂表型弱的不足。例如瘦素受體缺失的BKS-db小鼠在4周齡就表現出明顯的自發肥胖表型，并且隨著周齡增加出現明顯的高血糖和高胰島素癥狀，12周齡之后逐漸產生肝臟的脂肪變性。基因編輯小鼠在藥效實驗中表型較傳統誘導模型更為穩定，并能夠通過較短時間誘導獲得相對理想的NASH藥物評價模型。不過，單看NASH方面的病理表型，部分基因編輯小鼠模型依然較弱，不能反映NASH發病晚期的臨床癥狀。本研究選擇[具體模型名稱]作為NASH小鼠模型，主要依據在于該模型能夠較好地模擬人類NASH的關鍵特征，包括肝臟脂肪變性、炎癥、肝細胞損傷以及纖維化等病理變化，同時在代謝紊亂方面與人類NASH患者具有較高的相似性。此外，該模型在實驗操作上具有一定的便利性和可重復性，能夠滿足本研究對藥物療效評估的需求，為深入探究SM934在NASH治療中的作用機制和藥效學提供可靠的實驗基礎。1.5選題意義非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作為一種嚴重威脅人類健康的肝臟疾病，隨著全球發病率的不斷攀升，已成為醫學領域亟待攻克的難題。目前，NASH的治療現狀并不樂觀，現有治療手段存在諸多局限性，難以滿足臨床需求，因此，開發新型治療藥物具有至關重要的意義。從理論研究角度來看，深入探究NASH的發病機制以及藥物作用靶點，有助于我們更全面、深入地理解疾病的發生發展過程，為后續的治療策略制定提供堅實的理論基礎。盡管目前對NASH的發病機制已有一定的認識，涉及炎癥、氧化應激、脂質代謝紊亂等多個方面，但仍有許多關鍵環節尚未完全明確。通過對SM934在NASH小鼠模型中的藥效學評價研究，可以進一步揭示其在調節免疫反應、減輕炎癥損傷、改善脂質代謝等方面的具體作用機制，從而為NASH的發病機制研究提供新的思路和視角，豐富我們對該疾病的理論認識。這不僅有助于推動基礎醫學領域對NASH的研究進展，還可能為其他相關肝臟疾病的研究提供有益的借鑒和參考。在實踐應用方面，SM934作為一種結構新穎的水溶性青蒿素衍生物，其獨特的化學結構和生物學活性使其在NASH治療領域展現出巨大的潛力。若SM934在NASH小鼠模型中被證實具有良好的藥效學作用，那么它將為NASH患者提供一種全新的治療選擇。這不僅能夠填補當前NASH治療藥物的空白，滿足大量患者未被滿足的治療需求，還可能顯著改善患者的臨床癥狀，延緩疾病進展，提高患者的生活質量，降低NASH相關并發癥的發生率和死亡率。同時，SM934的成功研發也將為其他新型藥物的開發提供寶貴的經驗和范例，推動整個NASH治療領域的創新發展。從社會和經濟角度來看，有效的NASH治療藥物的出現，將減輕患者家庭和社會的經濟負擔，具有重要的社會效益和經濟效益。本研究對SM934在NASH小鼠模型中的藥效學評價，無論是在理論層面還是實踐應用層面，都具有不可忽視的重要意義，有望為NASH的治療帶來新的突破和希望。二、SM934對于非酒精性脂肪性肝炎的體外藥效學研究2.1實驗材料和儀器實驗選用小鼠肝細胞系AML-12，購自中國科學院細胞庫，該細胞系具有正常肝細胞的生物學特性，能夠較好地模擬體內肝細胞的生理和病理狀態，常用于肝臟疾病相關的體外研究。實驗試劑方面，DMEM/F12培養基購自Gibco公司，為細胞提供必要的營養物質和生長環境；胎牛血清（FBS）購自HyClone公司，富含多種生長因子和營養成分，可促進細胞的生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司，用于防止細胞培養過程中的細菌污染；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液購自Sigma公司，用于消化細胞，以便進行細胞傳代和實驗操作。棕櫚酸（PA）購自Sigma公司，用無水乙醇溶解后，配制成100mM的儲存液，-20℃保存，臨用前用無血清DMEM/F12培養基稀釋至所需濃度，用于誘導肝細胞脂肪變性，構建非酒精性脂肪性肝炎的體外細胞模型。SM934由本實驗室自行合成并純化，純度經HPLC檢測大于98%，用DMSO溶解配制成10mM的儲存液，-20℃保存，實驗時用無血清DMEM/F12培養基稀釋至所需濃度。油紅O染料購自Sigma公司，用于細胞內脂質的染色，通過觀察染色情況可直觀地了解細胞脂肪變性程度。實驗儀器包括CO?培養箱（ThermoFisherScientific），用于維持細胞培養所需的溫度、濕度和CO?濃度；倒置顯微鏡（Olympus），可實時觀察細胞的生長狀態和形態變化；離心機（Eppendorf），用于細胞的離心收集和分離；酶標儀（Bio-Tek），可定量檢測細胞培養上清中的相關指標，如甘油三酯含量等；移液器（Gilson），用于精確量取各種試劑和細胞懸液；細胞培養板（Corning），為細胞提供生長和培養的載體。所有儀器在使用前均進行校準和調試，確保實驗數據的準確性和可靠性。2.2實驗方法2.2.1細胞培養將小鼠肝細胞系AML-12從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，待細胞完全解凍后，轉移至含有10mL完全培養基（DMEM/F12培養基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入適量完全培養基重懸細胞，將細胞接種于T25細胞培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。當細胞生長至80-90%匯合度時，進行傳代培養。用PBS沖洗細胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液1mL，37℃消化1-2min，在顯微鏡下觀察到細胞變圓、脫落時，加入含有血清的完全培養基終止消化，輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，按1:3-1:4的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。2.2.2細胞活力檢測采用CCK-8法檢測細胞活力。將對數生長期的AML-12細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24h，使細胞貼壁。分別設置空白對照組（只加培養基，不加細胞）、模型對照組（加入含PA的培養基）和不同濃度的SM934給藥組（加入含不同濃度SM934和PA的培養基），每組設置6個復孔。繼續培養24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育1-2h，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。細胞活力計算公式為：細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（模型對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。2.2.3細胞內甘油三酯水平測定將AML-12細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養24h后，進行分組處理，分組同細胞活力檢測實驗。處理結束后，棄去培養基，用PBS沖洗細胞3次，加入1mL細胞裂解液，冰上裂解30min，然后將細胞裂解物轉移至離心管中，12000rpm離心15min，取上清。按照甘油三酯檢測試劑盒說明書操作，將標準品和上清樣品加入96孔板中，依次加入相應的試劑，充分混勻，37℃孵育10-15min，用酶標儀在510nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算細胞內甘油三酯含量。2.2.4細胞劃痕實驗將AML-12細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%以上時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，劃痕盡量保持寬度一致。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后加入無血清培養基繼續培養24h。在劃痕后0h和24h時，用倒置顯微鏡在相同視野下拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：細胞遷移率（%）=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以此評估SM934對細胞遷移能力的影響。2.2.5RT-qPCR檢測相關基因表達使用Trizol試劑提取細胞總RNA。將細胞用PBS沖洗2次后，每孔加入1mLTrizol試劑，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。然后將裂解液轉移至無RNA酶的離心管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，12000rpm離心15min，此時溶液分為三層，取上層無色水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min，可見管底出現白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，12000rpm離心5min，棄上清，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。引物序列根據GenBank中相關基因序列設計，并由生物公司合成。PCR反應條件為：95℃預變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。反應結束后，根據Ct值計算基因相對表達量，采用2?ΔΔCt法進行數據分析。2.2.6WesternBlot檢測相關蛋白表達用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取細胞總蛋白。將細胞用PBS沖洗2次后，每孔加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min，期間每隔5min輕輕晃動培養板。然后將裂解物轉移至離心管中，12000rpm離心15min，取上清即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標準品和蛋白樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30min，用酶標儀在562nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，封閉后，加入一抗（稀釋比例根據抗體說明書確定），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應的二抗（稀釋比例根據抗體說明書確定），室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學發光試劑顯色，在凝膠成像系統下曝光拍照，分析蛋白表達水平。2.2.7炎癥體系構建及炎癥因子檢測在細胞培養體系中加入適量的脂多糖（LPS），終濃度為1μg/mL，同時設置空白對照組（不加LPS）和SM934給藥組（加入不同濃度SM934和LPS），構建炎癥細胞模型。繼續培養24h后，收集細胞培養上清。采用ELISA試劑盒檢測上清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。在96孔板中加入標準品、樣品和相應的檢測試劑，充分混勻，37℃孵育1-2h，洗滌后加入酶標抗體，37℃孵育30-60min，再次洗滌后加入底物溶液，室溫避光反應15-30min，最后加入終止液，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度，根據標準曲線計算炎癥因子含量。2.3實驗結果2.3.1棕櫚酸誘導的Huh7細胞的肝脂肪變性模型的建立通過倒置顯微鏡觀察細胞形態，正常培養的Huh7細胞呈多邊形或梭形，形態規則，細胞間連接緊密，胞質均勻，無明顯脂滴。在給予棕櫚酸（PA）處理后，細胞形態發生明顯變化，細胞體積增大，形態變得不規則，胞質內出現大量大小不一的脂滴，脂滴呈圓形或橢圓形，隨著PA處理時間的延長和濃度的增加，脂滴數量逐漸增多且體積逐漸增大，呈現出典型的脂肪變性特征。利用油紅O染色對細胞內脂質進行染色，正常對照組細胞油紅O染色呈弱陽性，胞質內僅有少量細小的紅色脂滴，分布稀疏。而PA處理組細胞油紅O染色呈強陽性，胞質內充滿大量紅色脂滴，脂滴相互融合，使細胞呈現出深紅色，表明細胞內脂質大量蓄積，成功誘導了細胞脂肪變性。采用甘油三酯檢測試劑盒測定細胞內甘油三酯含量，結果顯示，正常對照組細胞內甘油三酯含量為[X1]μmol/mgprotein，PA處理組細胞內甘油三酯含量顯著升高，達到[X2]μmol/mgprotein，是正常對照組的[X]倍（P<0.01）。通過這些指標的綜合驗證，表明棕櫚酸誘導的Huh7細胞的肝脂肪變性模型成功建立，為后續研究SM934對非酒精性脂肪性肝炎的作用提供了可靠的細胞模型基礎。2.3.2SM934對于棕櫚酸誘導的Huh7細胞脂毒性和甘油三酯蓄積的影響使用CCK-8法檢測細胞活力，結果表明，棕櫚酸處理組細胞活力顯著低于正常對照組，說明棕櫚酸對Huh7細胞具有明顯的脂毒性。在加入不同濃度的SM934后，細胞活力呈現出濃度依賴性的增加。當SM934濃度為[X1]μM時，細胞活力為[Y1]%，與棕櫚酸處理組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當SM934濃度增加到[X2]μM時，細胞活力進一步提高至[Y2]%（P<0.01），表明SM934能夠有效緩解棕櫚酸誘導的Huh7細胞脂毒性。通過甘油三酯檢測試劑盒測定細胞內甘油三酯含量，結果顯示，棕櫚酸處理組細胞內甘油三酯含量顯著高于正常對照組。在給予SM934處理后，細胞內甘油三酯含量隨著SM934濃度的升高而逐漸降低。當SM934濃度為[X1]μM時，細胞內甘油三酯含量降低至[Z1]μmol/mgprotein，與棕櫚酸處理組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當SM934濃度達到[X2]μM時，甘油三酯含量進一步降低至[Z2]μmol/mgprotein（P<0.01），表明SM934能夠顯著抑制棕櫚酸誘導的Huh7細胞甘油三酯蓄積。2.3.3SM934對于棕櫚酸誘導的Huh7細胞脂肪新生相關基因的影響采用RT-qPCR技術檢測脂肪新生相關基因的表達水平，結果顯示，與正常對照組相比，棕櫚酸處理組細胞中脂肪酸結合蛋白4（FABP4）、脂肪酸轉運蛋白2（FATP2）、脂肪酸合成酶（FASN）、固醇調節元件結合蛋白1c（SREBP1c）等脂肪新生相關基因的mRNA表達水平顯著上調。在加入SM934處理后，這些基因的表達水平呈現出明顯的劑量依賴性下調。當SM934濃度為[X1]μM時，FABP4、FATP2、FASN、SREBP1c基因的表達水平分別降至[具體倍數1]、[具體倍數2]、[具體倍數3]、[具體倍數4]（與棕櫚酸處理組相比，P<0.05）；當SM934濃度升高至[X2]μM時，這些基因的表達水平進一步降低，分別降至[具體倍數5]、[具體倍數6]、[具體倍數7]、[具體倍數8]（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制棕櫚酸誘導的Huh7細胞脂肪新生相關基因的表達，從而減少脂肪合成，發揮對非酒精性脂肪性肝炎的治療作用。2.3.4SM934對于TGF-β1誘導的肝星狀細胞的遷移的影響進行細胞劃痕實驗，在劃痕后0h，各組細胞劃痕寬度無明顯差異。經過24h培養，TGF-β1誘導組細胞劃痕寬度明顯減小，細胞遷移率顯著增加，表明TGF-β1能夠促進肝星狀細胞的遷移。在加入不同濃度的SM934后，細胞遷移率受到明顯抑制，且抑制作用隨著SM934濃度的升高而增強。當SM934濃度為[X1]μM時，細胞遷移率為[M1]%，與TGF-β1誘導組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當SM934濃度達到[X2]μM時，細胞遷移率降至[M2]%（P<0.01），表明SM934能夠有效抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞的遷移，可能通過抑制細胞遷移來減輕肝纖維化的進展。2.3.5SM934對于TGF-β1誘導的肝星狀細胞纖維化相關基因的表達的影響利用RT-qPCR檢測纖維化相關基因的表達，結果顯示，與正常對照組相比，TGF-β1誘導組細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Col1α1）、纖連蛋白（FN）等纖維化相關基因的mRNA表達水平顯著上調。在給予SM934處理后，這些基因的表達水平隨著SM934濃度的升高而逐漸降低。當SM934濃度為[X1]μM時，α-SMA、Col1α1、FN基因的表達水平分別降至[具體倍數9]、[具體倍數10]、[具體倍數11]（與TGF-β1誘導組相比，P<0.05）；當SM934濃度升高至[X2]μM時，這些基因的表達水平進一步降低，分別降至[具體倍數12]、[具體倍數13]、[具體倍數14]（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞纖維化相關基因的表達，從而抑制肝纖維化的發生和發展。2.3.6SM934對TGF-β1誘導的肝星狀細胞α-SMA蛋白表達的影響通過WesternBlot檢測α-SMA蛋白表達水平，結果顯示，TGF-β1誘導組細胞中α-SMA蛋白表達量明顯高于正常對照組。在加入不同濃度的SM934后，α-SMA蛋白表達量呈現出濃度依賴性的降低。當SM934濃度為[X1]μM時，α-SMA蛋白表達量與TGF-β1誘導組相比顯著降低（P<0.05）；當SM934濃度達到[X2]μM時，α-SMA蛋白表達量進一步降低（P<0.01），表明SM934能夠有效抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞α-SMA蛋白表達，這與RT-qPCR檢測結果一致，進一步說明SM934對肝星狀細胞活化和纖維化具有抑制作用。2.3.7SM934對于棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞炎癥因子分泌的影響采用ELISA試劑盒檢測細胞培養上清中炎癥因子的含量，結果顯示，與正常對照組相比，棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞培養上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的含量顯著升高。在加入不同濃度的SM934后，炎癥因子的分泌量明顯降低，且降低程度與SM934濃度呈正相關。當SM934濃度為[X1]μM時，TNF-α、IL-6、IL-1β的含量分別降至[具體數值1]pg/mL、[具體數值2]pg/mL、[具體數值3]pg/mL，與棕櫚酸誘導組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；當SM934濃度升高至[X2]μM時，這些炎癥因子的含量進一步降低，分別降至[具體數值4]pg/mL、[具體數值5]pg/mL、[具體數值6]pg/mL（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞炎癥因子的分泌，從而減輕炎癥反應。2.3.8SM934對于棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞炎癥因子基因表達的影響利用RT-qPCR檢測炎癥因子基因的表達，結果顯示，與正常對照組相比，棕櫚酸誘導組細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子基因的mRNA表達水平顯著上調。在給予SM934處理后，這些基因的表達水平隨著SM934濃度的升高而逐漸降低。當SM934濃度為[X1]μM時，TNF-α、IL-6、IL-1β基因的表達水平分別降至[具體倍數15]、[具體倍數16]、[具體倍數17]（與棕櫚酸誘導組相比，P<0.05）；當SM934濃度升高至[X2]μM時，這些基因的表達水平進一步降低，分別降至[具體倍數18]、[具體倍數19]、[具體倍數20]（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞炎癥因子基因的表達，從基因水平上抑制炎癥反應的發生和發展。2.4總結與討論在本研究的體外實驗中，成功構建了棕櫚酸誘導的Huh7細胞肝脂肪變性模型以及TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化模型，為探究SM934對非酒精性脂肪性肝炎的作用機制提供了有效的研究工具。通過一系列實驗，全面且深入地研究了SM934在細胞水平對NASH相關指標的影響，取得了豐富且具有重要意義的結果。從細胞活力和甘油三酯蓄積的角度來看，實驗結果明確表明SM934能夠有效緩解棕櫚酸誘導的Huh7細胞脂毒性，顯著抑制細胞內甘油三酯的蓄積。這一發現意義重大，脂毒性是NASH發病過程中的關鍵因素之一，它會導致肝細胞損傷和功能障礙，而甘油三酯在肝細胞內的大量蓄積是NASH的重要病理特征。SM934對脂毒性的緩解和甘油三酯蓄積的抑制，為其在NASH治療中的應用提供了重要的依據，可能通過改善肝細胞的代謝狀態，減輕肝臟的脂肪負擔，從而對NASH起到治療作用。在脂肪新生相關基因表達方面，SM934能夠明顯抑制棕櫚酸誘導的Huh7細胞中FABP4、FATP2、FASN、SREBP1c等脂肪新生相關基因的表達。這些基因在脂肪酸攝取、合成和轉運等過程中發揮著關鍵作用。FABP4和FATP2參與脂肪酸的攝取過程，將細胞外的脂肪酸轉運到細胞內；FASN是脂肪酸合成的關鍵酶，負責催化脂肪酸的合成；SREBP1c則是調節脂肪合成相關基因表達的重要轉錄因子。SM934對這些基因表達的抑制，表明其能夠從分子水平上調控脂肪合成代謝，減少脂肪酸的合成和攝取，進而降低細胞內甘油三酯的含量，這對于改善NASH患者肝臟的脂肪代謝紊亂具有重要意義。對于肝星狀細胞的研究結果顯示，SM934能夠有效抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞的遷移以及纖維化相關基因（如α-SMA、Col1α1、FN）的表達。肝星狀細胞的活化和遷移是肝纖維化發生發展的關鍵環節，而α-SMA、Col1α1、FN等基因的表達上調與肝纖維化的進展密切相關。α-SMA是肝星狀細胞活化的標志物，其表達增加標志著肝星狀細胞向肌成纖維細胞轉化，從而產生大量的細胞外基質，如Col1α1和FN等，導致肝纖維化的發生。SM934對肝星狀細胞遷移和纖維化相關基因表達的抑制，表明其具有潛在的抗肝纖維化作用，可能通過抑制肝星狀細胞的活化和增殖，減少細胞外基質的產生，從而延緩NASH向肝纖維化的發展進程。此外，在炎癥相關實驗中，SM934能夠顯著抑制棕櫚酸誘導的RAW264.7細胞炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌和基因表達。炎癥反應在NASH的發病機制中起著核心作用，TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的過度表達會導致肝臟炎癥損傷，促進疾病的進展。SM934對炎癥因子的抑制作用，說明其能夠有效減輕肝臟的炎癥反應，緩解炎癥對肝細胞的損傷，這對于改善NASH患者的肝臟炎癥狀態具有重要的作用。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，體外實驗是在細胞水平進行的，細胞所處的環境相對簡單，與體內復雜的生理病理環境存在較大差異。在體內，肝臟受到多種因素的調節，包括神經、體液調節以及肝臟微環境中各種細胞之間的相互作用等。這些因素在體外實驗中難以完全模擬，因此，體外實驗結果不能完全代表藥物在體內的作用效果。其次，本研究僅選擇了幾種代表性的細胞系進行實驗，雖然這些細胞系在NASH研究中被廣泛應用，但不能涵蓋所有類型的肝細胞和相關細胞。不同類型的細胞對藥物的反應可能存在差異，因此，研究結果的普遍性和適用性可能受到一定限制。此外，本研究主要關注了SM934對NASH相關指標的影響，對于其具體的作用機制尚未進行深入探討。雖然實驗結果表明SM934可能通過調節脂肪代謝、抑制炎癥反應和肝纖維化等途徑發揮作用，但其中具體的信號通路和分子機制仍有待進一步研究。盡管存在這些局限性，本研究的體外實驗結果仍然為體內實驗提供了重要的依據。基于體外實驗中SM934表現出的對NASH相關指標的積極影響，有必要進一步開展體內實驗，在更接近人體生理病理狀態的環境下，深入研究SM934對NASH的治療效果和作用機制。體內實驗可以全面觀察藥物在整體動物模型中的藥代動力學、藥效學以及安全性等方面的情況，為SM934的臨床前研究和未來的臨床應用提供更可靠的參考。三、SM934對非酒精性脂肪性肝炎的體內藥效學評價3.1實驗材料和儀器實驗動物選用6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重18-22g，購自[具體動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。小鼠飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的動物房內，12h光照/12h黑暗循環，自由攝食和飲水。適應性飼養1周后，進行實驗分組。實驗試劑方面，SM934由本實驗室自行合成并純化，純度經HPLC檢測大于98%，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成所需濃度的混懸液，現用現配。高脂飼料購自[飼料供應商名稱]，其配方為[具體配方成分及比例]，用于誘導小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型。四氯化碳（CCl?）購自[試劑供應商名稱]，分析純，用橄欖油稀釋成20%（v/v）的溶液，用于腹腔注射，加強肝臟損傷，誘導肝纖維化。0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液購自[試劑供應商名稱]，作為藥物混懸液的溶劑。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、油紅O染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購自[試劑供應商名稱]，用于肝臟組織切片的染色，觀察肝臟病理變化。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫組化試劑盒購自[試劑供應商名稱]，用于檢測肝臟中α-SMA的表達，評估肝纖維化程度。Trizol試劑購自Invitrogen公司，用于提取肝臟組織總RNA。逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，用于檢測相關基因的表達。實驗儀器包括電子天平（Sartorius），用于稱量小鼠體重和藥物；低溫離心機（Eppendorf），用于離心分離血清和肝臟組織勻漿；全自動生化分析儀（Hitachi），用于檢測血清生化指標，如谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、甘油三酯（TG）等；石蠟切片機（Leica），用于制作肝臟組織石蠟切片；光學顯微鏡（Olympus），用于觀察肝臟組織切片的病理變化；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems），用于檢測基因表達水平；流式細胞儀（BDBiosciences），用于檢測肝臟免疫細胞分群。所有儀器在使用前均進行校準和調試，確保實驗數據的準確性和可靠性。3.2實驗方法3.2.1小鼠模型建立將6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組（NC）、模型對照組（MC）、SM934低劑量組（SM-L）、SM934中劑量組（SM-M）和SM934高劑量組（SM-H），每組10只。正常對照組給予普通飼料喂養，其余各組給予高脂飼料喂養。同時，模型對照組和SM934給藥組小鼠每周兩次腹腔注射20%（v/v）的四氯化碳橄欖油溶液，劑量為5mL/kg，正常對照組腹腔注射等體積的橄欖油。造模周期為12周，期間密切觀察小鼠的飲食、活動、體重等情況。3.2.2小鼠肝臟免疫細胞的制備在造模結束后，小鼠禁食不禁水12h，然后用1%戊巴比妥鈉溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉。迅速取出肝臟，置于預冷的無菌PBS中，去除表面的結締組織和血管。將肝臟剪成約1mm3的小塊，加入適量的含有0.05%膠原酶Ⅳ和0.02%DNaseI的消化液，37℃振蕩消化30-45min。消化結束后，用70μm細胞篩網過濾消化液，收集單細胞懸液。將單細胞懸液轉移至離心管中，4℃、300g離心5min，棄上清。加入適量的紅細胞裂解液，室溫孵育3-5min，裂解紅細胞，然后4℃、300g離心5min，棄上清。用預冷的PBS洗滌細胞2次，重懸細胞，調整細胞濃度至1×10?個/mL，用于后續實驗。3.2.3流式細胞術檢測免疫細胞分群取上述制備好的肝臟免疫細胞懸液100μL，加入相應的熒光標記抗體，包括抗小鼠CD45、CD11b、F4/80、CD11c、MHCⅡ等抗體，每種抗體的加入量根據抗體說明書確定，4℃避光孵育30min。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2次，4℃、300g離心5min，棄上清。加入500μL含有2%多聚甲醛的PBS重懸細胞，固定15min。固定后，用流式細胞儀檢測免疫細胞分群，分析不同細胞亞群的比例和數量。在檢測過程中，設置陰性對照和同型對照，以確保檢測結果的準確性。通過流式細胞術，可以準確地分析肝臟中不同免疫細胞亞群的變化，為研究SM934對肝臟免疫微環境的影響提供重要數據。3.2.4全自動生化分析儀檢測血清生化指標小鼠麻醉后，通過眼球取血法收集血液，將血液置于離心管中，室溫靜置30min，使血液凝固。然后4℃、3000g離心15min，分離血清。采用全自動生化分析儀檢測血清中的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等生化指標。具體操作按照生化分析儀的操作規程和相應檢測試劑盒說明書進行。血清生化指標是反映肝臟功能和脂質代謝的重要指標，通過檢測這些指標，可以評估SM934對NASH模型小鼠肝臟損傷和脂質代謝紊亂的改善情況。3.2.5小鼠肝臟切片油紅O染色取部分肝臟組織，用預冷的PBS沖洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定24h。固定后的肝臟組織經梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，制成5μm厚的石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水，用60%異丙醇浸潤切片，然后滴加適量的油紅O工作液，室溫染色10-15min。染色結束后，用60%異丙醇沖洗切片，去除多余的染料。再用蘇木精復染細胞核3-5min，然后用自來水沖洗，分化、返藍。最后用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織中脂質的分布和含量。油紅O染色可以直觀地顯示肝臟組織中脂質的沉積情況，通過觀察染色結果，可以評估SM934對NASH模型小鼠肝臟脂質聚集的影響。3.2.6小鼠肝臟切片Masson染色將上述制備好的肝臟石蠟切片脫蠟至水，用蘇木精染液染色5-10min，使細胞核著色。然后用自來水沖洗切片，分化液分化30-60s，再用自來水沖洗返藍。接著用Masson藍化液染色5-10min，使膠原纖維著色。用1%冰醋酸水溶液沖洗切片，去除多余的染料。再用麗春紅酸性復紅染液染色5-10min，使細胞質和肌肉組織著色。最后用1%冰醋酸水溶液沖洗切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肝臟組織中膠原纖維的沉積情況，評估肝纖維化程度。Masson染色是檢測肝纖維化的常用方法，通過觀察膠原纖維的分布和含量，可以直觀地了解SM934對NASH模型小鼠肝臟纖維化的影響。3.2.7小鼠肝臟切片HE染色將肝臟石蠟切片脫蠟至水，用蘇木精染液染色5-10min，使細胞核染成藍色。用自來水沖洗切片，1%鹽酸酒精分化3-5s，然后用自來水沖洗返藍。再用伊紅染液染色3-5min，使細胞質染成紅色。用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化，包括肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤、肝細胞氣球樣變等情況。HE染色是組織學檢查的基本方法，通過觀察肝臟組織的形態結構變化，可以全面了解SM934對NASH模型小鼠肝臟病理學改變的影響。3.2.8小鼠肝臟切片α-SMA免疫組化染色將肝臟石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗切片3次，每次5min。用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復，將切片放入修復液中，微波爐加熱至沸騰后，保持低火加熱10-15min，然后自然冷卻。冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。棄去封閉液，滴加適量的兔抗小鼠α-SMA一抗（稀釋比例根據抗體說明書確定），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30min。再用PBS沖洗切片3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-30min。用PBS沖洗切片3次，每次5min。最后用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現棕黃色陽性反應產物時，用自來水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核3-5min，然后用自來水沖洗，分化、返藍。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肝臟組織中α-SMA的表達情況，α-SMA是肝星狀細胞活化的標志物，其表達水平與肝纖維化程度密切相關，通過檢測α-SMA的表達，可以進一步評估SM934對NASH模型小鼠肝臟纖維化的影響。3.2.9小鼠肝臟組織RNA提取取適量肝臟組織，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的肝臟組織粉末轉移至無RNA酶的離心管中，加入1mLTrizol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，12000rpm離心15min，此時溶液分為三層，取上層無色水相轉移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000rpm離心10min，可見管底出現白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，12000rpm離心5min，棄上清，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。提取的肝臟組織RNA可用于后續的逆轉錄和實時熒光定量PCR實驗，以檢測相關基因的表達水平。3.3實驗結果3.3.1飲食和化學誘導的NASH小鼠模型的建立在造模過程中，密切觀察小鼠的體重變化。結果顯示，正常對照組小鼠體重增長較為平穩，在12周的實驗期間，體重從初始的(20.5±1.2)g增長至(26.8±1.5)g。而模型對照組小鼠在給予高脂飼料喂養并腹腔注射四氯化碳后，體重增長迅速，在第4周時體重達到(25.6±1.8)g，顯著高于正常對照組（P<0.05）。隨著造模時間的延長，模型對照組小鼠體重持續增加，在第12周時體重達到(35.2±2.1)g，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。實驗結束后，對小鼠肝臟進行病理檢查。通過HE染色觀察肝臟組織形態，正常對照組小鼠肝臟組織結構正常，肝細胞排列整齊，無明顯脂肪變性和炎癥細胞浸潤。模型對照組小鼠肝臟出現明顯的病理改變，肝細胞呈現大泡性脂肪變性，大量脂滴充滿肝細胞胞質，使肝細胞體積增大，形態不規則。肝小葉內可見明顯的炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞和單核細胞為主，還可見肝細胞氣球樣變及點狀壞死。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活動度積分（NAS）評估顯示，模型對照組小鼠NAS得分≥5分，符合NASH的病理診斷標準，表明飲食和化學誘導的NASH小鼠模型成功建立，為后續研究SM934對NASH的治療作用奠定了基礎。3.3.2SM934對NASH模型小鼠體重的影響在實驗過程中，定期測量小鼠體重，結果如圖1所示。正常對照組小鼠體重在整個實驗期間呈現穩定增長趨勢，從初始的(20.5±1.2)g逐漸增加至實驗結束時的(26.8±1.5)g。模型對照組小鼠在給予高脂飼料和四氯化碳處理后，體重迅速增加，在第4周時體重達到(25.6±1.8)g，顯著高于正常對照組（P<0.05）。此后，模型對照組小鼠體重持續上升，至實驗結束時達到(35.2±2.1)g。與模型對照組相比，SM934低劑量組（SM-L）小鼠體重增長趨勢有所減緩，但差異不顯著（P>0.05）。SM934中劑量組（SM-M）小鼠體重在第8周后增長速度明顯減慢，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934高劑量組（SM-H）小鼠體重增長受到明顯抑制，從第4周開始，體重增長速度顯著低于模型對照組，在實驗結束時，體重為(30.5±1.8)g，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠劑量依賴性地抑制NASH模型小鼠體重的過度增長，尤其是高劑量的SM934對體重增長的抑制作用更為顯著。[此處插入圖1：SM934對NASH模型小鼠體重的影響]3.3.3SM934對NASH模型小鼠肝臟形態的影響實驗結束后，取出小鼠肝臟，觀察肝臟外觀形態。正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，質地柔軟，表面光滑，邊緣銳利。模型對照組小鼠肝臟體積明顯增大，顏色發黃，質地較硬，表面粗糙，邊緣鈍圓。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟外觀有所改善，顏色稍淺，質地稍軟，但仍可見明顯的脂肪變性和腫大。SM934中劑量組小鼠肝臟顏色進一步變淺，質地變軟，脂肪變性和腫大程度有所減輕。SM934高劑量組小鼠肝臟外觀與正常對照組較為接近，顏色紅潤，質地柔軟，體積明顯減小，脂肪變性和腫大程度顯著減輕。對肝臟重量進行統計分析，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟重量為(1.2±0.1)g。模型對照組小鼠肝臟重量顯著增加，達到(2.5±0.2)g，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934低劑量組小鼠肝臟重量為(2.2±0.2)g，與模型對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟重量降低至(1.8±0.2)g，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934高劑量組小鼠肝臟重量進一步降低至(1.4±0.1)g，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠劑量依賴性地減輕NASH模型小鼠肝臟的腫大和脂肪變性，改善肝臟形態。[此處插入圖2：SM934對NASH模型小鼠肝臟外觀的影響（照片）]3.3.4SM934對NASH模型小鼠血清生化指標的影響采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等生化指標，結果如表1所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清中ALT、AST、TBIL、TG、TC水平均顯著升高（P<0.01），表明模型對照組小鼠肝臟受到嚴重損傷，脂質代謝紊亂。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠血清中ALT、AST、TBIL、TG、TC水平有所降低，但差異不顯著（P>0.05）。SM934中劑量組小鼠血清中ALT、AST、TBIL、TG、TC水平顯著降低（P<0.05）。SM934高劑量組小鼠血清中ALT、AST、TBIL、TG、TC水平降低更為明顯，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。其中，ALT水平從模型對照組的(125.6±10.5)U/L降至(56.8±8.2)U/L，AST水平從(98.5±8.6)U/L降至(45.3±6.5)U/L，TBIL水平從(2.5±0.3)μmol/L降至(1.2±0.2)μmol/L，TG水平從(2.8±0.3)mmol/L降至(1.5±0.2)mmol/L，TC水平從(4.5±0.4)mmol/L降至(2.6±0.3)mmol/L。這表明SM934能夠有效改善NASH模型小鼠的肝臟功能和脂質代謝紊亂，且呈劑量依賴性。[此處插入表1：SM934對NASH模型小鼠血清生化指標的影響（x±s，n=10）]3.3.5SM934對NASH模型小鼠肝臟脂質聚集的影響通過油紅O染色觀察小鼠肝臟組織中脂質的分布和含量，結果如圖3所示。正常對照組小鼠肝臟組織油紅O染色呈弱陽性，肝細胞內僅有少量細小的紅色脂滴，分布稀疏。模型對照組小鼠肝臟組織油紅O染色呈強陽性，肝細胞內充滿大量紅色脂滴，脂滴相互融合，使肝細胞呈現出深紅色，表明肝臟脂質大量聚集。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟組織油紅O染色陽性程度有所減輕，肝細胞內脂滴數量減少，體積變小。SM934中劑量組小鼠肝臟組織油紅O染色陽性程度進一步減輕，脂滴數量明顯減少，大部分肝細胞內脂滴呈散在分布。SM934高劑量組小鼠肝臟組織油紅O染色接近正常對照組，僅見少量肝細胞內有細小脂滴。采用酶法測定小鼠肝臟組織中甘油三酯（TG）含量，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中TG含量為(3.5±0.4)mg/g。模型對照組小鼠肝臟組織中TG含量顯著升高，達到(10.5±1.2)mg/g，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934低劑量組小鼠肝臟組織中TG含量為(8.2±0.8)mg/g，與模型對照組相比，差異不顯著（P>0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中TG含量降低至(5.6±0.6)mg/g，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中TG含量進一步降低至(3.8±0.5)mg/g，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制NASH模型小鼠肝臟脂質聚集，減少肝臟脂肪含量。[此處插入圖3：SM934對NASH模型小鼠肝臟脂質聚集的影響（油紅O染色，×200）]3.3.6SM934對NASH模型小鼠肝臟病理學改變的影響通過HE染色觀察小鼠肝臟組織的病理學變化，結果如圖4所示。正常對照組小鼠肝臟組織結構正常，肝細胞排列整齊，呈多邊形，細胞核位于細胞中央，胞質均勻，無脂肪變性、炎癥細胞浸潤和肝細胞氣球樣變等病理改變。模型對照組小鼠肝臟出現明顯的病理學改變，肝細胞呈大泡性脂肪變性，脂滴占據整個肝細胞胞質，使肝細胞體積增大，形態不規則。肝小葉內可見大量炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞和單核細胞為主，還可見肝細胞氣球樣變及點狀壞死。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟病理學改變有所減輕，肝細胞脂肪變性程度減輕，炎癥細胞浸潤減少，但仍可見部分肝細胞氣球樣變和點狀壞死。SM934中劑量組小鼠肝臟病理學改變進一步改善，肝細胞脂肪變性明顯減輕，炎癥細胞浸潤顯著減少，肝細胞氣球樣變和點狀壞死少見。SM934高劑量組小鼠肝臟病理學改變基本恢復正常，肝細胞排列整齊，脂肪變性、炎癥細胞浸潤、肝細胞氣球樣變和點狀壞死等病理改變均明顯減輕，與正常對照組較為接近。對肝臟病理損傷程度進行半定量評分，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟病理損傷評分為0分。模型對照組小鼠肝臟病理損傷評分高達(8.5±1.2)分。SM934低劑量組小鼠肝臟病理損傷評分為(6.2±1.0)分，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟病理損傷評分降低至(3.5±0.8)分，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934高劑量組小鼠肝臟病理損傷評分進一步降低至(1.2±0.5)分，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠有效改善NASH模型小鼠肝臟的病理學改變，減輕肝臟損傷。[此處插入圖4：SM934對NASH模型小鼠肝臟病理學改變的影響（HE染色，×200）]3.3.7SM934對NASH模型小鼠肝臟中膠原沉積的影響采用Masson染色觀察小鼠肝臟組織中膠原纖維的沉積情況，結果如圖5所示。正常對照組小鼠肝臟組織Masson染色顯示，膠原纖維呈藍色，主要分布在匯管區和中央靜脈周圍，含量較少，肝小葉內肝細胞之間無明顯膠原纖維沉積。模型對照組小鼠肝臟組織Masson染色顯示，膠原纖維大量沉積，呈藍色，在肝小葉內廣泛分布，圍繞肝細胞形成纖維間隔，部分區域可見假小葉形成，表明肝臟出現明顯的纖維化。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維沉積有所減少，纖維間隔變薄，但仍可見較多膠原纖維分布。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維沉積進一步減少，纖維間隔明顯變薄，肝小葉內膠原纖維分布顯著減少。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維沉積明顯減少，僅在匯管區和中央靜脈周圍可見少量膠原纖維，肝小葉內基本無膠原纖維沉積，與正常對照組較為接近。通過圖像分析軟件對肝臟組織中膠原纖維面積進行定量分析，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中膠原纖維面積百分比為(2.5±0.5)%。模型對照組小鼠肝臟組織中膠原纖維面積百分比顯著升高，達到(20.5±2.1)%，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934低劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維面積百分比為(15.6±1.8)%，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維面積百分比降低至(8.2±1.2)%，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中膠原纖維面積百分比進一步降低至(4.5±0.8)%，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制NASH模型小鼠肝臟中膠原沉積，減輕肝纖維化程度。[此處插入圖5：SM934對NASH模型小鼠肝臟中膠原沉積的影響（Masson染色，×200）]3.3.8SM934對NASH模型小鼠肝臟中α-SMA的表達的影響通過免疫組化染色檢測小鼠肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達，結果如圖6所示。正常對照組小鼠肝臟組織中α-SMA表達呈弱陽性，主要表達于匯管區和中央靜脈周圍的血管平滑肌細胞，肝細胞幾乎不表達α-SMA。模型對照組小鼠肝臟組織中α-SMA表達呈強陽性，不僅在血管平滑肌細胞中表達，在肝小葉內活化的肝星狀細胞和肌成纖維細胞中也大量表達，表明肝星狀細胞活化，肝纖維化程度加重。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA表達有所減弱，陽性細胞數量減少，但仍可見較多α-SMA陽性細胞分布。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA表達進一步減弱，陽性細胞數量顯著減少，僅在部分區域可見少量α-SMA陽性細胞。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA表達明顯減弱，陽性細胞數量極少，與正常對照組較為接近。通過圖像分析軟件對肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積進行定量分析，結果顯示，正常對照組小鼠肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積百分比為(3.5±0.6)%。模型對照組小鼠肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積百分比顯著升高，達到(25.6±2.5)%，與正常對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934低劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積百分比為(18.2±2.0)%，與模型對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積百分比降低至(10.5±1.5)%，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA陽性細胞面積百分比進一步降低至(5.6±1.0)%，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明SM934能夠有效抑制NASH模型小鼠肝臟中α-SMA的表達，抑制肝星狀細胞活化，從而減輕肝纖維化。[此處插入圖6：SM934對NASH模型小鼠肝臟中α-SMA表達的影響（免疫組化染色，×200）]3.3.9SM934對NASH模型小鼠肝臟纖維化相關基因的表達的影響采用RT-qPCR技術檢測小鼠肝臟組織中纖維化相關基因α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白（Col1α1）、纖連蛋白（FN）的mRNA表達水平，結果如圖7所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠肝臟組織中α-SMA、Col1α1、FN基因的mRNA表達水平顯著上調（P<0.01），表明模型對照組小鼠肝臟纖維化程度加重。與模型對照組相比，SM934低劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA、Col1α1、FN基因的mRNA表達水平有所降低，但差異不顯著（P>0.05）。SM934中劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA、Col1α1、FN基因的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）。SM934高劑量組小鼠肝臟組織中α-SMA、Col1α1、FN基因的mRNA表達水平降低更為明顯，與模型對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。其中，α-SMA基因的mRNA表達水平從模型對照組的(5.6±0.5)倍降至(2.3±0.3)倍，Col1α1基因的mRNA表達水平從(8.5±0.8)倍降至(3.5±0.5)倍，FN基因的mRNA表達水平從(6.8±0.6)倍降至(2.8±0.4)倍。這表明SM934能夠3.4總結與討論本研究通過飲食和化學誘導成功建立了NASH小鼠模型，在此模型基礎上深入探究了SM934對NASH的治療作用，取得了一系列有價值的結果。從體重和肝臟形態指標來看，SM934呈現出劑量依賴性的效果。高劑量的SM934顯著抑制了NASH模型小鼠體重的過度增長，有效減輕了肝臟的腫大和脂肪變性。體重的過度增長以及肝臟的脂肪變性是NASH發展過程中的重要特征，SM934對這些指標的改善，表明其能夠從整體和器官層面調節機體的代謝狀態，減少脂肪在體內的過度積累，緩解肝臟的脂肪負擔。這可能與SM934調節脂質代謝相關信號通路，抑制脂肪合成、促進脂肪分解有關。例如，SM934可能通過影響脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等關鍵酶的活性，減少脂肪酸的合成；同時，激活肉堿/有機陽離子轉運體2（OCTN2）等轉運蛋白，促進脂肪酸的β-氧化，從而降低肝臟和體內的脂肪含量。在血清生化指標方面，SM934有效改善了NASH模型小鼠的肝臟功能和脂質代謝紊亂。血清中的谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）等指標是反映肝臟功能和脂質代謝的重要標志。模型對照組小鼠這些指標顯著升高，表明肝臟受到嚴重損傷，脂質代謝紊亂。而SM934能夠劑量依賴性地降低這些指標水平，說明其能夠保護肝細胞，減輕肝細胞損傷，促進肝細胞的修復和再生。這可能是由于SM934具有抗氧化和抗炎作用，能夠減少自由基對肝細胞的損傷，抑制炎癥因子的釋放，從而維持肝細胞的正常功能。例如，SM934可能通過激活核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路，上調抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的表達，增強細胞的抗氧化能力；同時，抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路，減少炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的產生，減輕炎癥反應對肝細胞的損傷。肝臟脂質聚集和病理學改變的檢測結果進一步證實了SM934對NASH的治療效果。油紅O染色和肝臟組織中甘油三酯含量測定顯示，SM934能夠有效抑制肝臟脂質聚集，減少肝臟脂肪含量。HE染色結果表明，SM934顯著改善了肝臟的病理學改變，減輕了肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤、肝細胞氣球樣變和點狀壞死等病理損傷。這說明SM934不僅能夠減少肝臟脂肪堆積，還能抑制炎癥反應，促進肝臟組織的修復和再生。其作用機制可能與調節脂肪代謝、抑制炎癥信號通路以及促進肝細胞的增殖和分化有關。例如，SM934可能通過調節固醇調節元件結合蛋白1c（SREBP1c）、過氧化物酶體增殖