RNA干擾靶向抑制PI3Kp85α表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響研究一、引言1.1研究背景大腸癌，作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，尤其在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)和老齡化社會(huì)中更為顯著。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬(wàn)，死亡病例數(shù)達(dá)93.5萬(wàn)，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。在我國(guó)，隨著居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌的發(fā)病率也逐年攀升，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。以上海為例，近30年來(lái)大腸癌發(fā)病率增加了4倍，年均增長(zhǎng)4%，已成為上海市發(fā)病率第二高的惡性腫瘤。大腸癌不僅發(fā)病率高，其預(yù)后情況也不容樂(lè)觀。盡管目前臨床上采用手術(shù)、化療、放療等綜合治療手段，但仍有許多患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致5年生存率較低。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌患者治療失敗和死亡的主要原因。一旦癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，它們會(huì)突破原發(fā)腫瘤的邊界，侵入周圍組織和血管、淋巴管，進(jìn)而擴(kuò)散到身體的其他部位，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。這些轉(zhuǎn)移灶不僅難以徹底清除，還會(huì)對(duì)身體的重要器官造成損害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過(guò)程中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K是一種可使肌醇環(huán)第三位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其家族成員屬于原癌基因。IA型PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成異二聚體，其中p85α是表達(dá)最多的調(diào)節(jié)亞基。研究表明，PI3Kp85α在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移、粘附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。PI3Kp85α突變可以引起PI3K/Akt通路的激活，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在多種腫瘤組織中，包括大腸癌，PI3Kp85α的表達(dá)水平明顯升高，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力和不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，深入研究PI3Kp85α在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，對(duì)于尋找有效的治療靶點(diǎn)和改善患者預(yù)后具有重要意義。RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種新興的基因沉默技術(shù)，為研究基因功能和腫瘤治療提供了新的策略。RNAi是由雙鏈RNA（dsRNA）引起的與其同源的mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象。該技術(shù)具有高度的特異性和高效性，能夠精準(zhǔn)地抑制靶基因的表達(dá)，且操作相對(duì)簡(jiǎn)便。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)PI3Kp85α基因的RNA干擾載體，將其導(dǎo)入大腸癌細(xì)胞中，可以特異性地降低PI3Kp85α蛋白的表達(dá)水平，從而研究其對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。這不僅有助于深入揭示大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，還為開發(fā)基于RNAi技術(shù)的大腸癌靶向治療方法提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，特異性地抑制大腸癌細(xì)胞中PI3Kp85α基因的表達(dá)，深入探究其對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)而揭示PI3Kp85α在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制。通過(guò)這一研究，期望能夠?yàn)榇竽c癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為改善大腸癌患者的預(yù)后帶來(lái)新的希望。從理論意義來(lái)看，目前對(duì)于大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全明確，深入研究PI3Kp85α在其中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步完善對(duì)大腸癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，填補(bǔ)該領(lǐng)域在分子生物學(xué)層面的部分空白，為后續(xù)相關(guān)研究提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)RNA干擾技術(shù)在大腸癌治療中的應(yīng)用研究，也能夠拓展該技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，為其他腫瘤的研究提供新的思路和方法借鑒。在臨床實(shí)踐意義方面，大腸癌的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存率，現(xiàn)有的治療手段存在一定的局限性。若能證實(shí)PI3Kp85α是大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)，那么基于RNA干擾技術(shù)的靶向治療策略將有可能成為一種新的、有效的治療方法，為臨床醫(yī)生提供更多的治療選擇，有望提高大腸癌患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。此外，該研究結(jié)果還有助于開發(fā)新的診斷標(biāo)志物，用于早期檢測(cè)大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，實(shí)現(xiàn)對(duì)高?；颊叩木珳?zhǔn)篩選和個(gè)性化治療，從而推動(dòng)整個(gè)大腸癌診療領(lǐng)域的發(fā)展。二、RNA干擾技術(shù)與PI3Kp85α相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RNA干擾技術(shù)原理及應(yīng)用2.1.1RNA干擾技術(shù)原理RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)降解具有同源序列的靶mRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，它是真核生物中普遍存在的一種高度保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。其具體作用過(guò)程主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：dsRNA的引入：dsRNA可以通過(guò)多種方式進(jìn)入細(xì)胞，例如病毒感染、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、人工合成等。在生物體正常生理狀態(tài)下，一些內(nèi)源性的dsRNA也會(huì)自然產(chǎn)生，比如細(xì)胞內(nèi)某些基因轉(zhuǎn)錄形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA，經(jīng)過(guò)加工后可形成dsRNA。siRNA的生成：進(jìn)入細(xì)胞的長(zhǎng)鏈dsRNA會(huì)被一種名為Dicer的核酸酶識(shí)別并切割。Dicer屬于RNaseⅢ家族，它具有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域。在催化過(guò)程中，Dicer以二聚體形式存在，其兩個(gè)活性位點(diǎn)在相距約22bp的距離將dsRNA切斷，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA（siRNA）。siRNA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，它是雙鏈RNA，5'端帶有單磷酸基團(tuán)，3'端為羥基，并且互補(bǔ)雙鏈的3'端均有一個(gè)2-3nt的單鏈突出。RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的形成：生成的siRNA會(huì)與一系列特異性蛋白結(jié)合，形成RISC。在這個(gè)過(guò)程中，ATP發(fā)揮著重要作用，依賴ATP的解旋酶將siRNA的雙鏈解開，其中的反義鏈則與RISC緊密結(jié)合，形成具有活性的RISC-siRNA復(fù)合體。此時(shí)，RISC處于激活狀態(tài)，準(zhǔn)備對(duì)靶mRNA進(jìn)行識(shí)別和降解。靶mRNA的降解：激活后的RISC-siRNA復(fù)合體憑借siRNA反義鏈與靶mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合到靶mRNA的特定序列上。隨后，RISC中的核酸酶活性被激活，在與siRNA反義鏈配對(duì)區(qū)域的中部切斷靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的沉默。值得注意的是，RNAi效應(yīng)具有高效性，這是因?yàn)樵赗NAi過(guò)程中存在信號(hào)放大機(jī)制。當(dāng)siRNA反義鏈識(shí)別并結(jié)合靶mRNA后，可作為引物，以靶mRNA為模板，在依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRP）催化下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再被Dicer切割產(chǎn)生更多的siRNA，這些新產(chǎn)生的siRNA又可以繼續(xù)識(shí)別并降解新的靶mRNA，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，使得RNAi的沉默信號(hào)不斷放大。2.1.2RNA干擾技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域RNA干擾技術(shù)憑借其高度的特異性和高效性，在眾多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，為相關(guān)研究和疾病治療提供了有力的工具。基因功能研究：在功能基因組學(xué)研究中，RNAi技術(shù)是探索基因功能的重要手段。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的dsRNA或siRNA，導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，特異性地抑制該基因的表達(dá)，觀察由此引起的細(xì)胞表型或生物體性狀的變化，從而推斷基因的功能。例如，在研究線蟲的發(fā)育過(guò)程中，利用RNAi技術(shù)沉默某些與發(fā)育相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)這些基因被抑制后，線蟲的發(fā)育出現(xiàn)了明顯異常，進(jìn)而確定了這些基因在發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵作用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于一些難以進(jìn)行基因敲除的物種或細(xì)胞系。此外，對(duì)于一些敲除后會(huì)導(dǎo)致胚胎致死的基因，RNAi技術(shù)可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行研究，為深入了解基因功能提供了可能?；蛑委煟篟NAi技術(shù)為基因治療帶來(lái)了新的希望，在多種疾病的治療研究中展現(xiàn)出巨大潛力。在抗病毒治療方面，針對(duì)病毒基因設(shè)計(jì)的siRNA能夠特異性地降解病毒mRNA，抑制病毒的復(fù)制和傳播。例如，在乙型肝炎病毒感染的治療研究中，通過(guò)將靶向乙肝病毒基因的siRNA導(dǎo)入感染細(xì)胞，有效降低了病毒的載量，減少了病毒對(duì)肝臟細(xì)胞的損害。在腫瘤治療領(lǐng)域，RNAi技術(shù)可以通過(guò)沉默腫瘤相關(guān)基因，如癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明，針對(duì)乳腺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的HER2基因，利用RNAi技術(shù)降低其表達(dá)水平后，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。此外，RNAi技術(shù)還在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等的治療研究中取得了一定進(jìn)展，為這些疾病的治療提供了新的策略。藥物靶標(biāo)確認(rèn)：在藥物研發(fā)過(guò)程中，確定有效的藥物靶標(biāo)至關(guān)重要。RNAi文庫(kù)可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模處理，通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞表型的變化來(lái)篩選出與特定疾病相關(guān)的功能性基因，從而為藥物靶標(biāo)的確認(rèn)提供依據(jù)。例如，生物技術(shù)與制藥公司利用RNAi文庫(kù)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)某些基因被沉默后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，這些基因就有可能成為潛在的藥物靶標(biāo)。通過(guò)進(jìn)一步研究這些靶標(biāo)的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，可以開發(fā)出更具針對(duì)性的藥物，提高藥物治療的效果和安全性。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：在農(nóng)業(yè)育種中，RNAi技術(shù)可用于培育新型作物品種和抗病品種。通過(guò)沉默植物中的某些基因，可以改良植物的性狀，如提高植物的抗逆性、改善作物品質(zhì)等。例如，通過(guò)RNAi技術(shù)沉默水稻中與稻瘟病易感性相關(guān)的基因，培育出了對(duì)稻瘟病具有更強(qiáng)抗性的水稻品種。此外，RNAi技術(shù)還可以用于控制害蟲和雜草，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)害蟲或雜草關(guān)鍵基因的dsRNA，使其攝入后基因表達(dá)受到抑制，從而達(dá)到防治的目的，這種方法相較于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥具有環(huán)境友好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。2.2PI3Kp85α概述2.2.1PI3Kp85α結(jié)構(gòu)與功能磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一類在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)、底物特異性和調(diào)節(jié)方式的不同，可分為I型、II型和III型。其中，I型PI3K又進(jìn)一步分為IA型和IB型，IA型PI3K是研究最為廣泛且與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的亞型之一。PI3Kp85α屬于IA型PI3K的調(diào)節(jié)亞基，它與催化亞基p110共同組成異二聚體，在PI3K信號(hào)通路的激活和調(diào)控中起著不可或缺的作用。PI3Kp85α蛋白由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域賦予了其獨(dú)特的功能。其N端含有兩個(gè)Src同源3（SH3）結(jié)構(gòu)域，SH3結(jié)構(gòu)域主要參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，能夠識(shí)別并結(jié)合富含脯氨酸的基序，通過(guò)與其他含有相應(yīng)基序的蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)PI3Kp85α與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子的結(jié)合，從而參與信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物的形成。在兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域之間，存在一個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域，該區(qū)域也在蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。C端則包含一個(gè)Src同源2（SH2）結(jié)構(gòu)域和一個(gè)nSH結(jié)構(gòu)域、一個(gè)cSH結(jié)構(gòu)域。SH2結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，當(dāng)細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶（RTKs）被激活后，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化，PI3Kp85α的SH2結(jié)構(gòu)域可以與這些磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，從而將PI3K招募到細(xì)胞膜附近，同時(shí)引發(fā)催化亞基p110的激活。這種結(jié)合不僅使PI3K定位到特定的信號(hào)傳導(dǎo)位點(diǎn)，還通過(guò)構(gòu)象變化激活p110的催化活性，使其能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化，生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，能夠招募并激活下游含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白，如蛋白激酶B（Akt）等，進(jìn)而啟動(dòng)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。此外，PI3Kp85α的nSH結(jié)構(gòu)域和cSH結(jié)構(gòu)域也參與了其與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及對(duì)PI3K活性的調(diào)節(jié)，但它們的具體作用機(jī)制目前尚未完全明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。2.2.2PI3Kp85α與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系大量研究表明，PI3Kp85α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著極為重要的角色，其異常表達(dá)或激活往往與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PI3Kp85α主要通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在正常生理狀態(tài)下，PI3K/Akt信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和代謝等過(guò)程。然而，在腫瘤細(xì)胞中，由于多種因素的影響，如基因突變、染色體異常、生長(zhǎng)因子及其受體的過(guò)表達(dá)等，PI3Kp85α常常發(fā)生異常激活，導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路過(guò)度活化。當(dāng)PI3Kp85α被激活后，它與催化亞基p110結(jié)合形成的異二聚體能夠催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，PIP3的積累使得Akt被招募到細(xì)胞膜上，并在磷脂酰肌醇依賴性激酶1（PDK1）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）的作用下，其Thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而被完全激活。激活后的Akt作為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，能夠磷酸化多種下游靶蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，激活的Akt可以通過(guò)磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），激活mTOR信號(hào)通路。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝等過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。激活的mTOR能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、核糖體生物發(fā)生和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，Akt還可以通過(guò)磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，使得β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞存活方面，Akt可以通過(guò)磷酸化多種促凋亡蛋白來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。例如，Akt能夠磷酸化Bad蛋白，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而阻止Bad與Bcl-2或Bcl-XL形成異二聚體，抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Akt還可以磷酸化并激活核因子κB（NF-κB），NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)多種抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-XL、IAPs等，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。此外，Akt還可以通過(guò)抑制半胱天冬酶（Caspase）家族成員的活性，如Caspase-9等，來(lái)阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，PI3Kp85α通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附和細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過(guò)程。Akt可以磷酸化多種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如paxillin、FAK等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移。同時(shí)，Akt還可以調(diào)節(jié)整合素等細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和功能，影響腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力。此外，PI3Kp85α激活后還能通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。在腫瘤血管生成方面，PI3Kp85α通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)和分泌。VEGF是一種重要的促血管生成因子，它能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。激活的Akt可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的穩(wěn)定性和活性，促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，PI3Kp85α還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路等，間接影響腫瘤血管生成。三、大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制3.1大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一般方式大腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，其侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程極為復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移一般通過(guò)多種方式進(jìn)行，包括直接侵犯、血行轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移，每種方式都有其獨(dú)特的過(guò)程和特點(diǎn)。直接侵犯：隨著腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，體積逐漸增大，當(dāng)癌細(xì)胞增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)脫落，并直接向鄰近組織浸潤(rùn)蔓延。例如，當(dāng)大腸癌病灶位于直腸時(shí)，癌細(xì)胞可能會(huì)直接侵犯膀胱、前列腺等泌尿系統(tǒng)器官；若病灶位于女性的結(jié)腸部位，癌細(xì)胞還可能侵犯陰道等生殖系統(tǒng)器官。這些鄰近組織一旦被癌細(xì)胞侵犯，就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如侵犯膀胱可能導(dǎo)致尿頻、尿急、尿痛等泌尿系統(tǒng)癥狀；侵犯前列腺可能引起排尿困難、血尿等；侵犯陰道則可能出現(xiàn)陰道異常出血、分泌物增多等。直接侵犯是大腸癌局部擴(kuò)散的重要方式，它使得腫瘤在原發(fā)部位附近不斷擴(kuò)大，增加了手術(shù)切除的難度，也容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。血行轉(zhuǎn)移：癌細(xì)胞會(huì)侵入血管，隨著血液循環(huán)到達(dá)身體的其他部位，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到肝、腦、腎等重要臟器。這一過(guò)程中，癌細(xì)胞首先要突破血管壁進(jìn)入血液循環(huán)，然后在循環(huán)系統(tǒng)中存活并逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。當(dāng)癌細(xì)胞到達(dá)遠(yuǎn)處器官的毛細(xì)血管床時(shí)，它們會(huì)穿出血管壁，在新的組織中定植并形成轉(zhuǎn)移灶。其中，肝臟是大腸癌血行轉(zhuǎn)移最常見的靶器官，這是因?yàn)楦闻K接受門靜脈系統(tǒng)的血液供應(yīng)，而大腸的血液主要通過(guò)門靜脈回流至肝臟，使得癌細(xì)胞更容易在肝臟中停留和生長(zhǎng)。一旦癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肝臟，會(huì)在肝臟內(nèi)不斷增殖，破壞肝臟的正常組織結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝功能受損，出現(xiàn)黃疸、腹水、肝功能異常等癥狀。此外，癌細(xì)胞也可轉(zhuǎn)移至肺部、骨骼、腦部等部位，轉(zhuǎn)移到肺部可引起咳嗽、咯血、胸痛等癥狀；轉(zhuǎn)移到骨骼可導(dǎo)致骨痛、病理性骨折等；轉(zhuǎn)移到腦部則可能引發(fā)頭痛、嘔吐、癲癇、肢體功能障礙等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。血行轉(zhuǎn)移使得腫瘤擴(kuò)散范圍更廣，病情更加嚴(yán)重，治療難度也顯著增加。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移到區(qū)域淋巴結(jié)，如腸系膜淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)等，進(jìn)而轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)，如腹股溝、鎖骨上淋巴結(jié)等。在這一過(guò)程中，癌細(xì)胞首先進(jìn)入淋巴管，隨著淋巴液的流動(dòng)到達(dá)局部淋巴結(jié)。癌細(xì)胞在淋巴結(jié)內(nèi)不斷增殖，導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，當(dāng)淋巴結(jié)內(nèi)的癌細(xì)胞突破淋巴結(jié)包膜時(shí)，就會(huì)繼續(xù)向遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌常見的轉(zhuǎn)移方式之一，它不僅反映了腫瘤的擴(kuò)散程度，還對(duì)臨床分期和治療方案的選擇具有重要影響。一般來(lái)說(shuō)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量越多、范圍越廣，患者的預(yù)后越差。醫(yī)生在評(píng)估大腸癌患者的病情時(shí)，會(huì)重點(diǎn)關(guān)注淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況，通過(guò)手術(shù)切除淋巴結(jié)進(jìn)行病理檢查，以確定是否存在轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的程度，從而制定合理的治療方案。種植轉(zhuǎn)移：種植轉(zhuǎn)移可分為腹腔種植、腸腔種植和醫(yī)源種植等類型。當(dāng)癌細(xì)胞侵犯至大腸漿膜外時(shí)，會(huì)脫落至腹腔內(nèi)其他器官表面，引起腹腔種植播散。腹腔內(nèi)的環(huán)境，如溫度、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，適宜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，這些脫落的癌細(xì)胞會(huì)在腹膜、大網(wǎng)膜、腸系膜以及腹腔內(nèi)其他臟器表面著床生長(zhǎng)，形成多個(gè)種植性小病灶。腸腔種植則是指大腸癌灶附近的腸腔內(nèi)常有脫落的癌細(xì)胞附著，在腸粘膜完整時(shí)，癌細(xì)胞一般不會(huì)種植生長(zhǎng)，但當(dāng)腸粘膜出現(xiàn)損傷時(shí)，癌細(xì)胞就可在破損處發(fā)生種植。醫(yī)源種植多發(fā)生在手術(shù)過(guò)程中，手術(shù)操作可能導(dǎo)致癌細(xì)胞脫落并種植于吻合口和腹壁切口等部位。種植轉(zhuǎn)移使得腫瘤在腹腔內(nèi)廣泛擴(kuò)散，增加了治療的復(fù)雜性和難度，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。3.2影響大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素3.2.1腸道菌群對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響近年來(lái)，隨著微生物組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，腸道菌群與大腸癌的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。大量研究表明，腸道菌群在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，尤其是在大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移方面，其作用機(jī)制復(fù)雜且多樣。腸道菌群失衡是導(dǎo)致大腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的重要因素之一。正常情況下，腸道菌群處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，有益菌如雙歧桿菌、乳酸菌等在維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定、保護(hù)腸道屏障功能、抑制有害菌生長(zhǎng)以及調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，當(dāng)腸道菌群失衡時(shí)，有害菌數(shù)量增多，有益菌數(shù)量減少，這種失衡狀態(tài)可通過(guò)多種途徑影響大腸癌的轉(zhuǎn)移。腸道菌群可通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性程度來(lái)促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移。一些致病菌，如具核梭桿菌（Fusobacteriumnucleatum）、脆弱擬桿菌（Bacteroidesfragilis）及大腸桿菌（Escherichiacoli）等，被發(fā)現(xiàn)與大腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。具核梭桿菌能夠釋放炎癥因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡變，使其更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性。研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌感染大腸癌細(xì)胞后，能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的c-Myc、CyclinD1等癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，致病菌還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的自我更新能力，使腫瘤干細(xì)胞樣特性增強(qiáng)，從而增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。研究表明，脆弱擬桿菌分泌的毒素（BFT）可以誘導(dǎo)腸道上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移性和侵襲性，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)大腸癌的轉(zhuǎn)移。腸道菌群還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力。致病細(xì)菌可通過(guò)分泌黏附素、毒素、外泌體物質(zhì)等多種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)這一作用。具核梭桿菌能夠分泌黏附素FadA，它可以與大腸癌細(xì)胞表面的E-鈣粘蛋白結(jié)合，破壞細(xì)胞間的黏附連接，使癌細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫落并發(fā)生遷移。此外，細(xì)菌分泌的外泌體也在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌分泌的外泌體可以攜帶多種miRNA和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入大腸癌細(xì)胞后，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)DNA損傷，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的播散能力。具體來(lái)說(shuō)，外泌體中的某些miRNA可以靶向抑制細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因，如miR-1246可以通過(guò)靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。腸道菌群還可通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移。紊亂的腸道菌群可以調(diào)節(jié)遠(yuǎn)端器官中的免疫細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞，塑造有利于腫瘤細(xì)胞定植的微環(huán)境。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞需要在遠(yuǎn)端器官中成功定植才能形成轉(zhuǎn)移灶。腸道菌群失衡可導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂，使免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷能力減弱。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失衡時(shí)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）會(huì)向M2型極化，M2型TAM具有免疫抑制功能，能夠分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解以及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，腸道菌群還可以調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞的功能，如成纖維細(xì)胞等，使其分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)成分和生長(zhǎng)因子，為腫瘤細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供有利條件。3.2.2EMT相關(guān)蛋白在大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。在這一過(guò)程中，細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生顯著改變，上皮細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間黏附力減弱，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。EMT相關(guān)蛋白在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-鈣粘蛋白（E-cadherin）是一種重要的細(xì)胞粘附蛋白，對(duì)于維持上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。在EMT過(guò)程中，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，這是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志之一。E-cadherin主要通過(guò)其胞外結(jié)構(gòu)域與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成鈣依賴性的細(xì)胞間粘附連接，從而維持上皮細(xì)胞的緊密排列和極性。當(dāng)E-cadherin表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞間的粘附力減弱，上皮細(xì)胞的完整性遭到破壞，細(xì)胞更容易從上皮層脫離，獲得遷移和侵襲的能力。研究表明，在大腸癌組織中，E-cadherin的低表達(dá)與腫瘤分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)101例大腸癌原發(fā)灶、10例腺瘤及20例正常大腸黏膜組織中E-cadherin蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，E-cadherin的低表達(dá)與腫瘤分期、分化，有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），這充分說(shuō)明了E-cadherin表達(dá)下調(diào)在大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用。一些轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug、Twist和ZEB家族轉(zhuǎn)錄因子等，在EMT過(guò)程中起到?jīng)Q定性的作用。這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表達(dá)，從而促使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，它可以直接結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box序列上，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，Snail還可以激活N-cadherin和vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，使細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，Snail的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等均有關(guān)聯(lián)，其高表達(dá)往往預(yù)示著腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，多種信號(hào)通路可以調(diào)控Snail的表達(dá)，如Wnt、TGF-β和Notch等信號(hào)通路。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活Snail基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。N-鈣粘蛋白和波形蛋白是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在EMT過(guò)程中其表達(dá)增加。N-鈣粘蛋白主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，它可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附作用。在EMT過(guò)程中，N-鈣粘蛋白的上調(diào)可以促進(jìn)癌細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究表明，在大腸癌中，高N-鈣粘蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，其表達(dá)調(diào)控不僅促進(jìn)了EMT的發(fā)生，并且還能促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。波形蛋白是一種中間纖維蛋白，它在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮重要作用。在大腸癌中，波形蛋白的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，常常被用來(lái)評(píng)估大腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力。一些轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Twist和Zeb等，可以上調(diào)波形蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。此外，有的研究表明，上調(diào)波形蛋白的表達(dá)可能與一些miRNA，如miR-34a和miR-200a等的下調(diào)有關(guān)。這些miRNA可以通過(guò)靶向抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或直接作用于波形蛋白基因的mRNA，來(lái)調(diào)節(jié)波形蛋白的表達(dá)水平。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人大腸癌細(xì)胞株LoVo，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞株于1971年從診斷為結(jié)腸腺癌的56歲白人男性的一個(gè)左鎖骨上區(qū)的轉(zhuǎn)移灶建系，具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb和fos的表達(dá)呈陽(yáng)性，未檢測(cè)到sis和N-myc的表達(dá)，在裸鼠中能成瘤，并表達(dá)腫瘤特異的核基質(zhì)蛋白蛋白CC-3和CC-4。在實(shí)驗(yàn)前，將LoVo細(xì)胞復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的F12K培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。干擾載體：針對(duì)PI3Kp85α基因設(shè)計(jì)4條短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾載體（shRNA/1、shRNA/2、shRNA/3、shRNA/4）及1條陰性對(duì)照載體（NC）。這些干擾載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建，其構(gòu)建過(guò)程基于RNA干擾原理，通過(guò)將特定的shRNA序列克隆到表達(dá)載體中，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮干擾作用。干擾載體中shRNA序列的設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，以確保其能夠特異性地靶向PI3Kp85α基因的mRNA，并且盡量避免脫靶效應(yīng)。陰性對(duì)照載體則包含與目的基因無(wú)同源性的隨機(jī)序列，用于排除非特異性干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在實(shí)驗(yàn)前，將構(gòu)建好的干擾載體和陰性對(duì)照載體進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化，采用質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行提取，確保其純度和濃度滿足后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求。主要試劑：F12K培養(yǎng)基（Gibco公司），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類、無(wú)機(jī)鹽等，其配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化，適合多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其是上皮細(xì)胞。胎牛血清（FBS，Gibco公司），含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和未知的促生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司），用于消化細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫離，以便進(jìn)行細(xì)胞傳代和轉(zhuǎn)染等操作。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），是一種高效的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⒑怂岱肿樱ㄈ绺蓴_載體）高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。其作用原理是通過(guò)脂質(zhì)體與核酸分子形成復(fù)合物，然后通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，釋放出核酸分子，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)染。RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，其含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），基于BCA法原理，通過(guò)與蛋白中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下將二價(jià)銅離子還原為一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子與BCA試劑結(jié)合形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白濃度成正比，從而可以準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度。SDS凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），提供了配制SDS凝膠所需的各種試劑，包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS等，使用該試劑盒可以方便快捷地配制不同濃度的SDS凝膠，用于蛋白電泳分離。PVDF膜（Millipore公司），具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，能夠高效地吸附蛋白，并且在后續(xù)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)中能夠與抗體特異性結(jié)合，是蛋白轉(zhuǎn)膜的常用材料。ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司），在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)HRP標(biāo)記的二抗與PVDF膜上的目的蛋白結(jié)合后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，HRP會(huì)催化試劑中的發(fā)光底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)曝光顯影可以檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)情況。Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司），是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的基質(zhì)成分，主要由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖等組成，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中用于包被Transwell小室的上室面，形成人工基底膜，以評(píng)估細(xì)胞穿過(guò)基底膜的侵襲能力。結(jié)晶紫染液（0.1%，Sigma公司），用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中，染色后的細(xì)胞可以在顯微鏡下清晰觀察和計(jì)數(shù)，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲和遷移能力。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、CO?濃度和濕度，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過(guò)過(guò)濾空氣，提供一個(gè)無(wú)菌的操作環(huán)境，防止微生物污染，確保細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌性。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果等，能夠在不破壞細(xì)胞培養(yǎng)體系的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞離心、蛋白樣品離心等操作，通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力，使細(xì)胞、蛋白等物質(zhì)在離心管中分層，以便進(jìn)行后續(xù)的分離和提取。電泳儀（Bio-Rad公司），用于蛋白電泳分離，通過(guò)在電場(chǎng)作用下，使蛋白在SDS凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），將電泳分離后的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以便進(jìn)行后續(xù)的免疫印跡檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)對(duì)發(fā)光信號(hào)的捕捉和分析，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），在CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的吸光度值，從而間接反映細(xì)胞的增殖情況。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人大腸癌細(xì)胞株LoVo復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）的F12K培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次傳代，傳代時(shí)，先吸去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，加入適量0.25%胰蛋白酶（含EDTA），37℃孵育1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%FBS的F12K培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的F12K培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。具體步驟如下：首先，在無(wú)菌離心管中分別加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后向其中一管中加入5μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；向另一管中加入4μg干擾載體（shRNA/1、shRNA/2、shRNA/3、shRNA/4或NC），輕輕混勻。5分鐘后，將含有Lipofectamine3000試劑的溶液逐滴加入到含有干擾載體的溶液中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使形成脂質(zhì)體-干擾載體復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，每孔加入1.8mLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后將孵育好的脂質(zhì)體-干擾載體復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的F12K培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。4.2.2RNA干擾靶向抑制PI3Kp85α表達(dá)效果檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞。首先，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后，向每孔中加入150μL預(yù)冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細(xì)胞。裂解結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。具體操作如下：將BCA工作液按照A液：B液=50:1的比例混合均勻，配制適量的BCA工作液。取96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔中分別加入0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（濃度為2mg/mL），再加入相應(yīng)體積的PBS，使總體積均為20μL；樣品孔中加入20μL蛋白樣品。然后，向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將各組蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入適量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。然后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。制備10%的分離膠和5%的濃縮膠，將變性后的蛋白樣品上樣，每孔上樣量為30μg，同時(shí)加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時(shí)，先在80V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：300mA恒流，轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶（用TBST配制）中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（兔抗人PI3Kp85α多克隆抗體，1:1000稀釋）的TBST溶液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜取出，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜放入含有二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋）的TBST溶液中，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)PI3Kp85α蛋白的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量，公式為：PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量=PI3Kp85α蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。選擇PI3Kp85α蛋白表達(dá)抑制率最高的干擾載體轉(zhuǎn)染組作為有效干擾組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PI3Kp85α蛋白表達(dá)抑制率計(jì)算公式為：抑制率（%）=（1-干擾組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量/對(duì)照組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量）×100%。4.2.3細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力檢測(cè)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將有效干擾組和陰性對(duì)照組細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種3×10?個(gè)細(xì)胞，加入2mL含10%FBS的F12K培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用20μL無(wú)菌槍頭垂直于孔板底部，在細(xì)胞單層上均勻劃出一道劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。劃痕完成后，用PBS輕輕清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后加入無(wú)血清的F12K培養(yǎng)基。在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)，分別在倒置顯微鏡下觀察并拍照，選取相同視野進(jìn)行記錄。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率（%）=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。Transwell實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室（8μm孔徑，Corning公司），小室上室預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠（1:8稀釋）包被，每孔加入50μL，37℃孵育30-60分鐘，使基質(zhì)膠凝固，模擬細(xì)胞外基質(zhì)。將有效干擾組和陰性對(duì)照組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清的F12K培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%FBS的F12K培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Transwell板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用PBS清洗3次。用0.1%結(jié)晶紫染液染色15-20分鐘，再用PBS清洗3次。在倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，但Transwell小室上室無(wú)需包被Matrigel基質(zhì)膠。將調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含20%FBS的F12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照上述方法固定、染色和計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1RNA干擾對(duì)PI3Kp85α表達(dá)的抑制效果利用蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）對(duì)轉(zhuǎn)染不同干擾載體（shRNA/1、shRNA/2、shRNA/3、shRNA/4）及陰性對(duì)照載體（NC）的人大腸癌細(xì)胞株LoVo中PI3Kp85α蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組以及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照載體NC的細(xì)胞中，PI3Kp85α蛋白均呈現(xiàn)出較高水平的表達(dá)；而在轉(zhuǎn)染了不同shRNA干擾載體的細(xì)胞組中，PI3Kp85α蛋白的表達(dá)水平則出現(xiàn)了不同程度的降低。具體而言，對(duì)各條帶灰度值進(jìn)行分析后，計(jì)算得出PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量及抑制率。其中，shRNA/1轉(zhuǎn)染組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.65±0.05，抑制率約為35%；shRNA/2轉(zhuǎn)染組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.52±0.04，抑制率約為48%；shRNA/3轉(zhuǎn)染組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.23±0.03，抑制率高達(dá)77%；shRNA/4轉(zhuǎn)染組PI3Kp85α蛋白相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.48±0.05，抑制率約為52%。由此可見，shRNA/3干擾載體對(duì)PI3Kp85α蛋白表達(dá)的抑制效果最為顯著，抑制率達(dá)77%，因此選擇該組細(xì)胞作為有效干擾組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以深入探究PI3Kp85α表達(dá)被抑制后對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。5.2細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力變化通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，對(duì)有效干擾組（轉(zhuǎn)染shRNA/3干擾載體）和陰性對(duì)照組人大腸癌細(xì)胞株LoVo的侵襲與轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力方面存在顯著差異。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，于劃痕后0小時(shí)和24小時(shí)對(duì)兩組細(xì)胞的劃痕愈合情況進(jìn)行觀察并拍照記錄。利用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率，結(jié)果表明，陰性對(duì)照組細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)劃痕愈合明顯，細(xì)胞遷移率為（56.23±4.56）%；而有效干擾組細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯低于陰性對(duì)照組，細(xì)胞遷移率僅為（23.45±3.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這直觀地表明PI3Kp85α表達(dá)被抑制后，大腸癌細(xì)胞的遷移能力顯著減弱。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯著。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室上室預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠包被以模擬細(xì)胞外基質(zhì)。經(jīng)過(guò)24-48小時(shí)孵育后，對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行固定、染色并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)較多，平均為（186.5±15.3）個(gè)；而有效干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，平均僅為（78.2±8.5）個(gè)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明PI3Kp85α表達(dá)降低后，大腸癌細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的侵襲能力受到明顯抑制。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中（Transwell小室上室不包被Matrigel基質(zhì)膠），陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（152.3±12.4）個(gè)，有效干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為（65.8±7.6）個(gè)，干擾組細(xì)胞遷移能力同樣顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。六、結(jié)果討論6.1RNA干擾靶向抑制PI3Kp85α表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制探討本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)靶向抑制大腸癌細(xì)胞中PI3Kp85α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低。深入探究其影響機(jī)制，PI3Kp85α作為PI3K/Akt信號(hào)通路的重要組成部分，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)PI3Kp85α表達(dá)被抑制時(shí)，PI3K的活性受到顯著影響。PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成異二聚體，p85α作為表達(dá)最多的調(diào)節(jié)亞基，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致PI3K的催化活性下降，進(jìn)而影響下游信號(hào)分子的激活。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶（RTKs）被激活后，會(huì)招募PI3K，使p85α的SH2結(jié)構(gòu)域與RTKs磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，從而激活PI3K，促使催化亞基p110將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。然而，在PI3Kp85α表達(dá)被抑制的情況下，PI3K被招募到細(xì)胞膜附近并激活的過(guò)程受阻，PIP3的生成量減少，導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的激活受到抑制。PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制對(duì)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)產(chǎn)生重要影響。Akt作為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子，其激活需要PIP3的招募和PDK1、mTORC2的磷酸化。當(dāng)PI3Kp85α表達(dá)被抑制，PIP3生成減少，Akt無(wú)法正常激活，進(jìn)而影響其對(duì)下游多種靶蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)。在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Akt的激活能夠調(diào)節(jié)多種與細(xì)胞遷移、粘附和細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的蛋白。例如，Akt可以磷酸化并激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。當(dāng)PI3Kp85α表達(dá)被抑制，Akt活性降低，MMP-2和MMP-9等的表達(dá)和活性也隨之下降，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力減弱，腫瘤細(xì)胞難以突破細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，從而抑制了細(xì)胞的侵襲能力。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性降低，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。PI3Kp85α表達(dá)抑制還可能通過(guò)影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)上調(diào)。PI3Kp85α通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，能夠調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug、Twist和ZEB家族轉(zhuǎn)錄因子等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合到E-鈣粘蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致E-鈣粘蛋白表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，它們還能激活N-鈣粘蛋白和波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。當(dāng)PI3Kp85α表達(dá)被抑制，PI3K/Akt信號(hào)通路活性降低，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到抑制，進(jìn)而抑制了EMT過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌細(xì)胞中，抑制PI3Kp85α表達(dá)后，E-鈣粘蛋白表達(dá)上調(diào)，N-鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的EMT過(guò)程受到抑制，侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低。6.2研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與潛在價(jià)值本研究結(jié)果具有廣闊的臨床應(yīng)用前景與潛在價(jià)值，為大腸癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和治療思路。PI3Kp85α作為PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)亞基，在大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)能夠顯著降低大腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這表明PI3Kp85α有望成為大腸癌治療的潛在靶點(diǎn)?；赗NA干擾技術(shù)靶向抑制PI3Kp85α表達(dá)的策略，為開發(fā)新型大腸癌靶向治療藥物提供了理論依據(jù)。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性針對(duì)PI3Kp85α基因的RNA干擾載體，如shRNA或siRNA，可以精準(zhǔn)地抑制PI3Kp85α的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的目的。相較于傳統(tǒng)的化療藥物，這種靶向治療方法具有更高的特異性，能夠減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，降低藥物的毒副作用。例如，在乳腺癌的治療研究中，針對(duì)HER2基因的RNA干擾治療藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，取得了一定的療效，這為大腸癌的RNA干擾靶向治療提供了成功的范例和借鑒經(jīng)驗(yàn)。在臨床實(shí)踐中，將RNA干擾技術(shù)與現(xiàn)有的治療手段相結(jié)合，有望提高大腸癌的治療效果。例如，在手術(shù)前使用RNA干擾靶向抑制PI3Kp85α表達(dá)，可能會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，減少手術(shù)過(guò)程中癌細(xì)胞的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)；在化療過(guò)程中聯(lián)合應(yīng)用RNA干擾治療，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果。研究表明，在結(jié)直腸癌的治療中，將RNA干擾與化療藥物聯(lián)合使用，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。此外，本研