RBM8A表達與結直腸癌臨床病理特征的關聯性剖析一、引言1.1研究背景與意義結直腸癌（ColorectalCancer，CRC）作為一種常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。在全球范圍內，其發病率和死亡率均位居前列。據國際癌癥研究機構（IARC）發布的最新數據顯示，2020年全球結直腸癌新發病例約193萬例，死亡病例約93.5萬例，分別占所有惡性腫瘤發病和死亡的10.0%和9.4%。在中國，結直腸癌同樣是高發的惡性腫瘤之一，且近年來發病率呈上升趨勢，發病年齡逐漸年輕化。2020年中國結直腸癌新發病例約55.5萬例，死亡病例約28.6萬例。結直腸癌的發病機制較為復雜，是環境因素與遺傳因素相互作用的結果。盡管目前在結直腸癌的診斷和治療方面取得了一定的進展，如手術技術的改進、化療藥物的研發以及靶向治療和免疫治療的應用等，但患者的總體生存率仍有待提高，尤其是晚期結直腸癌患者的預后仍然較差。因此，深入研究結直腸癌的發病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對于提高結直腸癌的早期診斷率、改善患者的治療效果和預后具有重要的意義。RBM8A（RNABindingMotifProtein8A），又稱Y14，是外顯子連接復合體（ExonJunctionComplex，EJC）的核心組成成分之一。EJC在mRNA的剪接、轉運、穩定性以及翻譯等過程中發揮著關鍵作用。RBM8A通過與其他EJC成分相互作用，參與mRNA的代謝調控，對細胞的生長、分化和凋亡等生理過程具有重要影響。已有研究表明，RBM8A在多種腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用，如肺癌、乳腺癌、肝癌等。在這些腫瘤中，RBM8A的表達異常與腫瘤的增殖、侵襲、轉移以及患者的預后密切相關。然而，目前關于RBM8A在結直腸癌中的表達情況及其與臨床病理特征的關系研究較少，其在結直腸癌發生發展中的作用機制尚不明確。探究RBM8A在結直腸癌中的表達與臨床病理特征的關系具有重要的理論和實際意義。從理論層面來看，深入研究RBM8A在結直腸癌中的作用機制，有助于揭示結直腸癌的發病機制，豐富對腫瘤發生發展過程中RNA調控機制的認識。從實際應用角度出發，明確RBM8A的表達與結直腸癌臨床病理特征的關聯，有可能將其作為結直腸癌早期診斷的潛在標志物，提高疾病的早期診斷率；同時，若能證實RBM8A可作為治療靶點，將為開發新的治療策略提供理論依據，從而為改善結直腸癌患者的治療效果和預后開辟新的途徑，具有重要的臨床應用價值。1.2研究目的與方法本研究旨在深入探究RBM8A在結直腸癌組織中的表達水平，明確其與患者臨床病理特征（如腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等）之間的關聯，進而分析RBM8A作為結直腸癌潛在診斷標志物和治療靶點的可能性，為結直腸癌的早期診斷、病情評估和精準治療提供新的理論依據和研究方向。在研究方法上，首先收集結直腸癌患者的腫瘤組織樣本及對應的癌旁正常組織樣本，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術，對樣本中RBM8A的mRNA表達水平進行精確測定；同時采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學染色（IHC）技術，檢測RBM8A蛋白在組織中的表達情況及分布特征。通過這些實驗技術，能夠從基因和蛋白兩個層面全面了解RBM8A在結直腸癌組織中的表達變化。隨后，對收集到的患者臨床病理資料進行詳細整理和分析，運用統計學方法，如卡方檢驗、Spearman相關分析等，深入探討RBM8A表達水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移等臨床病理特征之間的相關性，以明確RBM8A表達在結直腸癌發生發展過程中的潛在作用和影響。通過嚴謹的統計學分析，能夠使研究結果更具科學性和可靠性，為后續的研究和臨床應用提供有力支持。1.3國內外研究現狀在國際上，對于RBM8A的研究廣泛涉及多個領域。在基礎研究層面，諸多國外科研團隊深入探究了RBM8A在RNA代謝過程中的分子機制。例如，[研究團隊1]通過一系列的細胞實驗和分子生物學技術，詳細闡述了RBM8A作為外顯子連接復合體關鍵成員，如何在mRNA剪接后精準調控mRNA的穩定性與翻譯起始過程，為理解細胞內基因表達調控網絡提供了重要依據。在腫瘤研究領域，國外針對RBM8A在不同腫瘤中的作用開展了大量研究。在肺癌研究中，[研究團隊2]發現RBM8A在非小細胞肺癌組織中呈現高表達狀態，并且其表達水平與腫瘤細胞的增殖、侵襲能力密切相關，高表達RBM8A的肺癌患者預后相對較差。在乳腺癌研究方面，[研究團隊3]通過對大量乳腺癌樣本的分析，證實RBM8A參與了乳腺癌細胞的上皮-間質轉化過程，促進了腫瘤細胞的遷移和轉移，為乳腺癌的治療提供了潛在的新靶點。在國內，相關研究同樣取得了一定成果。在基礎醫學領域，科研人員利用先進的基因編輯技術，如CRISPR-Cas9，深入研究RBM8A基因在細胞中的功能。[研究團隊4]通過構建RBM8A基因敲除細胞系，觀察到細胞在mRNA加工過程中出現明顯異常，進一步驗證了RBM8A在RNA剪接調控中的關鍵作用。在腫瘤臨床研究方面，國內學者對RBM8A在多種腫瘤中的臨床意義進行了探索。在肝癌研究中，[研究團隊5]發現RBM8A的異常表達與肝癌患者的腫瘤分期、腫瘤大小以及患者的生存時間顯著相關，提示RBM8A可作為評估肝癌患者預后的潛在標志物。在結直腸癌研究領域，目前的研究主要集中在結直腸癌的發病機制、診斷和治療等方面。眾多研究已揭示了一些與結直腸癌發生發展密切相關的基因和信號通路，如APC、KRAS、BRAF等基因以及Wnt、EGFR和TGF-β等信號通路。[研究團隊6]通過對大量結直腸癌患者樣本的分析，發現某些基因突變與患者的臨床病理特征和預后存在緊密聯系，為結直腸癌的精準診斷和個性化治療提供了理論基礎。然而，關于RBM8A在結直腸癌中的研究相對較少，目前僅有少量研究初步探討了RBM8A在結直腸癌細胞系中的表達情況，但對于其在結直腸癌組織中的表達水平以及與患者臨床病理特征的關系，尚未有系統深入的研究。綜上所述，盡管國內外在RBM8A和結直腸癌相關領域都取得了一定進展，但現有研究仍存在明顯不足。一方面，在RBM8A的研究中，雖然對其在RNA代謝中的基礎功能和在部分腫瘤中的作用有所了解，但對于其在不同腫瘤微環境下的功能變化以及與其他腫瘤相關基因的相互作用機制研究尚不夠深入。另一方面，在結直腸癌研究中，雖然已明確一些關鍵基因和信號通路，但對于像RBM8A這類可能參與結直腸癌發生發展過程的新基因研究較少，其在結直腸癌中的表達特征、臨床意義以及潛在的治療價值亟待進一步挖掘。本研究將聚焦于RBM8A在結直腸癌中的表達情況，深入分析其與臨床病理特征的關系，旨在填補這一研究空白，為結直腸癌的防治提供新的思路和理論依據。二、RBM8A與結直腸癌概述2.1RBM8A的生物學特性RBM8A基因位于人類染色體1p34.2，其編碼的RBM8A蛋白由174個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為20kDa。RBM8A蛋白結構中包含一個保守的RNA識別基序（RNARecognitionMotif，RRM），該結構域對于RBM8A與RNA的特異性結合至關重要。RRM結構域由約80-90個氨基酸組成，包含兩個高度保守的序列基序，即RNP1和RNP2，它們參與形成RNA結合表面，通過與RNA分子上的特定序列或結構相互作用，實現RBM8A對RNA代謝過程的調控。作為外顯子連接復合體（EJC）的核心組成成分，RBM8A在mRNA代謝過程中發揮著關鍵作用。在mRNA前體剪接完成后，EJC會在距離外顯子-外顯子連接點上游約20-24個核苷酸處組裝到成熟的mRNA上。RBM8A與其他EJC核心成分，如eIF4AⅢ、MAGOH和BTZ等緊密結合，共同構成EJC的穩定結構。在mRNA的出核轉運過程中，EJC中的RBM8A與核輸出受體蛋白相互作用，幫助mRNA從細胞核轉運到細胞質中，確保mRNA能夠順利進行后續的翻譯過程。在無義介導的mRNA降解（Nonsense-MediatedmRNADecay，NMD）途徑中，RBM8A參與識別含有提前終止密碼子（PrematureTerminationCodon，PTC）的異常mRNA，并招募相關的降解因子，啟動對異常mRNA的降解，從而保證細胞內mRNA質量控制，維持細胞的正常生理功能。此外，RBM8A還在mRNA的翻譯起始過程中發揮作用，它可以與翻譯起始因子相互作用，促進核糖體與mRNA的結合，提高翻譯效率，對細胞內蛋白質的合成進行調控。在正常生理狀態下，RBM8A在維持細胞的正常生長、分化和發育過程中具有不可或缺的作用。在胚胎發育階段，RBM8A的正常表達對于神經干細胞的增殖和分化至關重要。研究表明，在小鼠胚胎發育過程中，Rbm8a基因的缺失會導致神經干細胞增殖能力下降，分化異常，進而影響神經系統的正常發育，導致胚胎致死或出生后小鼠出現嚴重的神經功能缺陷。在成年個體中，RBM8A參與維持多種組織和器官的正常功能。在造血系統中，RBM8A對于造血干細胞的自我更新和分化具有重要調控作用，它可以通過調節相關基因的mRNA穩定性和翻譯效率，維持造血干細胞的干性和分化潛能，保證血細胞的正常生成。在免疫系統中，RBM8A參與免疫細胞的發育和功能調節，它可以影響T淋巴細胞和B淋巴細胞的分化、增殖以及免疫球蛋白的合成，對機體的免疫應答過程起到重要的調節作用。2.2結直腸癌的發病機制與臨床病理特征結直腸癌的發病是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳因素與環境因素的相互作用。在遺傳因素方面，約5%-10%的結直腸癌患者具有明確的遺傳背景，主要由特定的基因突變或遺傳綜合征引起。家族性腺瘤性息肉病（FamilialAdenomatousPolyposis，FAP）是一種常染色體顯性遺傳疾病，由APC基因（adenomatouspolyposiscoli）突變所致。APC基因作為一種抑癌基因，其突變會導致腸道內大量腺瘤性息肉的形成，若不及時治療，幾乎100%的患者在40-50歲時會發展為結直腸癌。林奇綜合征（LynchSyndrome），也稱為遺傳性非息肉病性結直腸癌（HereditaryNon-PolyposisColorectalCancer，HNPCC），是由錯配修復基因（如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等）的胚系突變引起。這些基因突變會導致DNA錯配修復功能缺陷，使得細胞在DNA復制過程中無法有效修復錯誤，從而增加了基因突變的累積，顯著提高了結直腸癌的發病風險。據統計，林奇綜合征患者一生中患結直腸癌的風險高達40%-80%。環境因素在結直腸癌的發病中同樣起著關鍵作用。飲食習慣是重要的環境因素之一，長期攝入高脂肪、高蛋白、低纖維素的食物與結直腸癌的發生密切相關。高脂肪飲食會增加膽汁酸的分泌，這些膽汁酸在腸道細菌的作用下，可轉化為具有致癌性的次級膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，它們能夠損傷腸道黏膜上皮細胞的DNA，誘導細胞發生惡變。低纖維素飲食則會導致糞便體積減少，腸道蠕動減慢，使得致癌物質在腸道內停留時間延長，增加了腸道黏膜與致癌物質的接觸機會，從而促進了結直腸癌的發生。生活方式因素，如缺乏運動、吸煙和過量飲酒等，也與結直腸癌的發病風險增加相關。缺乏運動可導致機體代謝減緩，脂肪堆積，肥胖不僅會影響腸道的正常蠕動，還會引起體內激素水平的改變，如胰島素抵抗增加、胰島素樣生長因子-1水平升高等，這些因素都可能促進腫瘤細胞的增殖和生長。吸煙是大腸腺瘤的危險因素，而大腸腺瘤是結直腸癌的高危癌前病變，煙草中的尼古丁、焦油等致癌物質可通過血液循環進入腸道，直接損傷腸道黏膜細胞，引發基因突變，促進腺瘤的形成和發展。過量飲酒會損害肝臟的解毒功能，導致體內有害物質堆積，同時酒精還可直接刺激腸道黏膜，引發炎癥反應，長期的炎癥刺激會促使腸道上皮細胞發生異常增殖和分化，增加結直腸癌的發病風險。結直腸癌的常見臨床癥狀因腫瘤部位和病情進展程度而異。早期結直腸癌患者往往癥狀不明顯，或僅表現出一些非特異性癥狀，如消化不良、腹部隱痛、大便潛血陽性等，這些癥狀容易被忽視。隨著腫瘤的生長和病情的進展，患者會逐漸出現典型癥狀。直腸癌患者主要表現為便血，血液多為鮮紅色或暗紅色，與糞便混合，部分患者還會出現排便習慣的改變，如腹瀉、便秘交替出現，以及大便性狀改變，如大便變細、變形等。左半結腸癌由于腸腔相對狹窄，腫瘤易引起腸腔梗阻，患者主要表現為腹痛、腹脹、肛門停止排氣排便等腸梗阻癥狀，同時還可能伴有便血、腹瀉或便秘等。右半結腸癌患者則常出現腹部包塊，這是由于右半結腸腸腔較大，腫瘤生長到一定程度時可在腹部觸及腫塊；貧血也是右半結腸癌的常見癥狀之一，這是因為腫瘤慢性失血以及腫瘤消耗導致機體營養物質缺乏，影響了紅細胞的生成。此外，患者還可能出現消瘦、乏力、低熱等全身癥狀，當病情發展到晚期，腫瘤發生遠處轉移時，會出現相應轉移部位的癥狀，如轉移至肝臟可引起肝功能受損、黃疸；轉移至肺部可出現咳嗽、咯血、呼吸困難等。結直腸癌的病理類型主要包括腺癌、腺鱗癌和未分化癌等，其中腺癌最為常見，約占結直腸癌的90%以上。腺癌又可進一步分為管狀腺癌、乳頭狀腺癌、黏液腺癌和印戒細胞癌等亞型。管狀腺癌最為多見，癌細胞呈腺管樣排列，根據腺管分化程度可分為高分化、中分化和低分化管狀腺癌，分化程度越高，腫瘤細胞的形態和結構越接近正常組織，惡性程度相對較低；反之，低分化管狀腺癌的腫瘤細胞形態和結構異型性大，惡性程度高。乳頭狀腺癌癌細胞呈乳頭狀生長，乳頭中心為纖維血管間質，其惡性程度相對較低，但容易發生淋巴結轉移。黏液腺癌的癌細胞分泌大量黏液，使腫瘤組織呈膠凍狀，其預后相對較差。印戒細胞癌的癌細胞胞質內充滿黏液，將細胞核擠向一側，形似印戒，該型癌惡性程度高，侵襲性強，早期即可發生轉移，患者預后差。臨床上，常用TNM分期系統對結直腸癌進行分期，以評估腫瘤的進展程度和預后。T代表原發腫瘤的大小和浸潤深度，T1表示腫瘤侵犯黏膜下層；T2表示腫瘤侵犯固有肌層；T3表示腫瘤穿透固有肌層到達漿膜下層，或侵犯無腹膜覆蓋的結腸旁或直腸旁組織；T4表示腫瘤穿透臟層腹膜，或直接侵犯其他器官或結構。N代表區域淋巴結轉移情況，N0表示無區域淋巴結轉移；N1表示有1-3個區域淋巴結轉移；N2表示有4個及以上區域淋巴結轉移。M代表遠處轉移，M0表示無遠處轉移；M1表示有遠處轉移。根據TNM分期，結直腸癌可分為0-Ⅳ期，0期為原位癌，腫瘤局限于黏膜層；Ⅰ期為T1-2N0M0，腫瘤侵犯黏膜下層或固有肌層，但無淋巴結轉移和遠處轉移；Ⅱ期為T3-4N0M0，腫瘤侵犯至腸壁外，但無淋巴結轉移和遠處轉移；Ⅲ期為任何T、N1-2M0，無論腫瘤大小和浸潤深度，只要有區域淋巴結轉移，無遠處轉移；Ⅳ期為任何T、任何N、M1，只要有遠處轉移，即為Ⅳ期。結直腸癌的預后與分期密切相關，早期結直腸癌（0-Ⅰ期）患者通過根治性手術切除，5年生存率可達90%以上；而晚期結直腸癌（Ⅳ期）患者由于腫瘤已發生遠處轉移，治療效果較差，5年生存率通常低于20%。除分期外，腫瘤的病理類型、分化程度、患者的年齡和身體狀況等因素也會影響預后。低分化癌、未分化癌以及黏液腺癌、印戒細胞癌等病理類型的結直腸癌患者預后相對較差；年齡較大、身體狀況較差的患者對手術、化療等治療的耐受性較低，預后也相對不佳。2.3RBM8A在腫瘤研究中的相關進展近年來，RBM8A在腫瘤研究領域逐漸成為熱點，其在多種腫瘤中的作用機制和臨床意義被不斷揭示。在子宮內膜癌的研究中，譚冬梅等人通過設計RBM8A基因靶向的發夾狀shRNA，構建重組慢病毒干擾載體并感染HEC-1A細胞，深入探究了沉默RBM8A基因表達對子宮內膜癌HEC-1A細胞生物學行為的影響。結果顯示，與對照組相比，敲低RBM8A后HEC-1A細胞增殖速度明顯減慢，凋亡率顯著增加，遷移與侵襲能力受到明顯抑制。進一步的機制研究發現，沉默RBM8A基因后，凋亡相關蛋白cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3表達上調，上皮間質轉化（EMT）相關蛋白E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低。這表明沉默RBM8A基因可通過抑制EMT信號轉導通路，抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，為子宮內膜癌的治療提供了新的潛在靶點和治療思路。在肝細胞癌方面，梁嶸團隊開展了一系列深入研究。他們通過臨床標本檢測發現，RBM8A在肝細胞癌組織中的表達水平與癌旁正常組織存在顯著差異，且其表達水平與患者的腫瘤分期、腫瘤大小以及預后密切相關。在功能研究中，通過構建RBM8A過表達慢病毒載體和低表達慢病毒載體，分別轉染肝癌細胞系，結果表明過表達RBM8A可促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制細胞凋亡；而低表達RBM8A則產生相反的效果。在機制探討上，研究發現RBM8A可能通過調控某些關鍵信號通路，如PI3K/AKT和MAPK信號通路，來影響肝癌細胞的生物學行為。這些研究結果揭示了RBM8A在肝細胞癌發生發展中的重要作用，為肝細胞癌的診斷和治療提供了新的分子標志物和治療靶點。在乳腺癌的研究中，李良平團隊利用腫瘤基因組圖譜（TCGA）和各種公共數據庫，對乳腺癌患者RBM8A的表達、突變以及與臨床病理特征的關系進行了多維度分析。研究結果顯示，RBM8A在乳腺癌組織中呈高表達，且與腫瘤亞型、分期、淋巴結轉移等臨床特征密切相關。通過生存分析發現，RBM8A高表達的乳腺癌患者預后相對較差。進一步的研究還發現，RBM8A可能通過影響腫瘤免疫浸潤，調節腫瘤微環境，從而促進乳腺癌的發展。這些研究為乳腺癌的診斷、預后評估和治療提供了新的理論依據和潛在的治療靶點。在肺癌的研究中，有研究團隊發現RBM8A在非小細胞肺癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的惡性程度和患者的預后密切相關。高表達RBM8A的非小細胞肺癌細胞具有更強的增殖、侵襲和遷移能力。機制研究表明，RBM8A可能通過調控一些與肺癌發生發展密切相關的基因和信號通路，如EGFR和KRAS信號通路，來促進肺癌細胞的生長和轉移。此外，RBM8A還可能參與肺癌細胞的耐藥過程，為肺癌的靶向治療和克服耐藥提供了新的研究方向。這些研究表明，RBM8A在多種腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用，其表達異常與腫瘤的增殖、侵襲、轉移、凋亡以及患者的預后密切相關。不同腫瘤中RBM8A的作用機制雖存在差異，但都提示了RBM8A作為腫瘤診斷標志物和治療靶點的潛在價值。對RBM8A在其他腫瘤中的研究成果，為進一步研究其在結直腸癌中的作用提供了重要的參考和借鑒，有助于深入探討RBM8A在結直腸癌發生發展中的作用機制，為結直腸癌的防治提供新的思路和方法。三、研究設計與實驗方法3.1實驗設計本研究采用回顧性研究方法，收集[具體時間段]在[具體醫院名稱]就診并經病理確診為結直腸癌的患者標本及臨床資料。納入標準為：經手術切除或活檢獲取的結直腸癌組織標本，病理診斷明確；患者術前未接受過放療、化療或靶向治療；臨床資料完整，包括患者的性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等。排除標準為：合并其他惡性腫瘤；患有嚴重的全身性疾病，如心、肝、腎功能不全等，影響實驗結果的判斷；標本質量不佳，無法進行相關檢測。根據納入和排除標準，共收集到[X]例結直腸癌患者的標本。同時，選取距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常組織作為對照，共[X]例。將結直腸癌組織標本和癌旁正常組織標本分別進行分組，其中結直腸癌組織標本為實驗組，癌旁正常組織標本為對照組。樣本量的確定參考了相關文獻以及預實驗結果，并結合統計學方法進行估算。通過樣本量估算公式，綜合考慮預期的效應大小、檢驗水準α（通常設定為0.05）、檢驗效能1-β（通常設定為0.8）等因素，確定了本研究所需的樣本量，以確保研究結果具有足夠的統計學效力和可靠性。本研究的實驗流程如下：首先，對收集到的組織標本進行處理。將新鮮的組織標本一部分立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續的RNA和蛋白質提取；另一部分組織標本用10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，用于制作組織切片，進行免疫組織化學染色。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測RBM8A的mRNA表達水平。具體步驟為：使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度。然后，以總RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。最后，以cDNA為模板，采用特異性引物進行qRT-PCR擴增，反應體系和反應條件嚴格按照試劑盒說明書進行操作。通過比較結直腸癌組織和癌旁正常組織中RBM8A的mRNA相對表達量，分析其表達差異。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測RBM8A的蛋白表達水平。將冷凍保存的組織標本研磨成粉末，加入細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進行SDS電泳分離，然后將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，加入一抗（抗RBM8A抗體）4℃孵育過夜，次日洗膜后加入相應的二抗室溫孵育1-2小時。最后，利用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統掃描并分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算RBM8A蛋白的相對表達量，比較兩組間的差異。通過免疫組織化學染色檢測RBM8A蛋白在組織中的表達定位和分布情況。將石蠟切片進行脫蠟、水化處理，采用高溫高壓抗原修復法進行抗原修復，3%過氧化氫孵育以阻斷內源性過氧化物酶活性。然后，加入一抗（抗RBM8A抗體）4℃孵育過夜，次日洗膜后加入生物素標記的二抗室溫孵育30分鐘，再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物孵育30分鐘。最后，用DAB顯色劑顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察染色結果，根據染色強度和陽性細胞比例對RBM8A蛋白的表達進行半定量分析，比較結直腸癌組織和癌旁正常組織中RBM8A蛋白表達的差異。本研究的觀察指標主要包括RBM8A在結直腸癌組織和癌旁正常組織中的mRNA和蛋白表達水平，以及RBM8A表達與患者臨床病理特征（如性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等）之間的相關性。通過對這些觀察指標的分析，深入探討RBM8A在結直腸癌發生發展中的作用及臨床意義。3.2實驗材料與儀器本研究使用的結直腸癌組織樣本及癌旁正常組織樣本均取自[具體醫院名稱]。在[具體時間段]內，共收集到[X]例結直腸癌患者的手術切除標本，患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲。所有標本均經兩位資深病理科醫師進行病理診斷，以確保診斷的準確性。標本離體后，立即將一部分組織切成約1cm×1cm×1cm大小的小塊，迅速放入液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續的RNA和蛋白質提取實驗；另一部分組織則用10%中性福爾馬林固定，固定液量為組織體積的10倍以上，固定時間為12-48小時，之后進行常規石蠟包埋，用于制作組織切片，進行免疫組織化學染色。實驗中使用的結直腸癌細胞系包括HT-29、SW480、HCT116等，這些細胞系均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。細胞培養于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）的RPMI-1640培養基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱（ThermoFisherScientific公司）中培養，定期更換培養基，待細胞生長至對數生長期時進行后續實驗。研究所需的主要試劑包括TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取組織和細胞中的總RNA；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），將總RNA逆轉錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司），用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測RBM8A的mRNA表達水平；兔抗人RBM8A單克隆抗體（Abcam公司），用于蛋白質免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學染色檢測RBM8A蛋白的表達；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體（CellSignalingTechnology公司），作為Westernblot的二抗；DAB顯色試劑盒（VectorLaboratories公司），用于免疫組織化學染色的顯色；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司），用于測定蛋白質濃度；SDS凝膠制備試劑盒（Bio-Rad公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白質電泳。實驗儀器主要有實時熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480），用于qRT-PCR實驗，可精確檢測RBM8A的mRNA表達水平；凝膠成像系統（Bio-RadChemiDocMP），用于Westernblot實驗中蛋白條帶的成像和分析；恒溫搖床（NewBrunswickScientific公司），用于免疫印跡實驗中的孵育步驟；低溫高速離心機（Eppendorf公司），用于RNA提取、蛋白質提取等實驗中的離心步驟；石蠟切片機（LeicaRM2235），用于制作石蠟切片；顯微鏡（OlympusBX53）及配套的圖像采集系統，用于免疫組織化學染色切片的觀察和拍照，分析RBM8A蛋白在組織中的表達定位和分布情況。3.3實驗方法實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術是檢測RBM8AmRNA表達水平的重要手段。首先，使用TRIzol試劑提取組織中的總RNA，在提取過程中，嚴格按照試劑說明書的操作步驟進行，確保RNA的完整性和純度。將組織樣本充分勻漿后，加入適量的TRIzol試劑，通過劇烈振蕩使組織與試劑充分混合，以裂解細胞并釋放RNA。隨后，加入氯仿進行相分離，離心后RNA存在于上層水相中。將水相轉移至新的離心管中，加入異丙醇沉淀RNA，經過離心、洗滌等步驟后，獲得純凈的總RNA。利用分光光度計測定RNA在260nm和280nm處的吸光度值，計算A260/A280的比值，以評估RNA的純度，理想的比值應在1.8-2.0之間。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，以確保RNA無降解。以總RNA為模板，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。在逆轉錄反應體系中，加入適量的總RNA、逆轉錄引物、逆轉錄酶、dNTPs以及緩沖液等成分，按照試劑盒推薦的反應條件進行逆轉錄反應。通常反應條件包括：在一定溫度下（如65℃）孵育5-10分鐘，使RNA與引物充分退火；然后在逆轉錄酶的作用下，于適宜溫度（如37℃-42℃）進行逆轉錄反應，時間一般為30-60分鐘；最后通過高溫（如70℃-85℃）孵育5-10分鐘，使逆轉錄酶失活，終止反應。反應結束后，將得到的cDNA保存于-20℃冰箱備用。采用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物的設計依據RBM8A基因的序列，利用專業的引物設計軟件（如PrimerPremier5.0）進行設計。設計的引物需滿足特異性高、擴增效率良好等條件，避免引物二聚體和非特異性擴增的產生。引物序列經BLAST比對驗證，確保其特異性。qRT-PCR反應體系包含cDNA模板、SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物以及去離子水等成分。反應條件一般為：95℃預變性3-5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進行40-45個循環的擴增，每個循環包括95℃變性10-15秒，使DNA雙鏈再次解鏈；60℃退火30-45秒，使引物與模板特異性結合；72℃延伸30-45秒，在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈。反應結束后，通過熔解曲線分析驗證擴增產物的特異性，觀察熔解曲線是否為單一峰，以確保擴增產物為目的基因。采用2^-ΔΔCt法計算RBM8A的mRNA相對表達量，以GAPDH作為內參基因，校正樣本間的差異。通過比較結直腸癌組織和癌旁正常組織中RBM8A的mRNA相對表達量，分析其表達差異。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）用于檢測RBM8A的蛋白表達水平。將冷凍保存的組織標本取出，在冰上研磨成粉末，加入適量的細胞裂解液（如含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液），充分裂解細胞，提取總蛋白。在裂解過程中，需注意保持低溫，以防止蛋白降解。將裂解后的樣品在低溫高速離心機中進行離心，去除細胞碎片和雜質，收集上清液，即得到總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟，將蛋白標準品和待測蛋白樣品與BCA工作液充分混合，在37℃孵育30-60分鐘，使蛋白與BCA試劑充分反應。然后利用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。取等量的蛋白樣品，加入適量的上樣緩沖液（如含SDS、β-巰基乙醇等成分的loadingbuffer），在沸水中煮5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS電泳分離，根據蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如10%-12%的凝膠）。在電泳過程中，使用合適的電壓和電流，使蛋白在凝膠中充分分離。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，采用濕轉法或半干轉法進行轉膜。濕轉法需將凝膠和PVDF膜浸泡在轉膜緩沖液中，利用電場力將蛋白從凝膠轉移至膜上，轉膜條件一般為：在低溫下（如4℃），以適當的電壓（如100V）和電流（如300-500mA）轉膜1-2小時。半干轉法則是在半干轉儀中進行，通過控制轉膜時間和電流，使蛋白快速轉移至膜上。轉膜結束后，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，在室溫下振蕩孵育1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，棄去封閉液，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次5-10分鐘。加入一抗（抗RBM8A抗體），4℃孵育過夜，使一抗與膜上的RBM8A蛋白特異性結合。次日，棄去一抗，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10-15分鐘，以去除未結合的一抗。加入相應的二抗（辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2小時，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10-15分鐘，以去除未結合的二抗。最后，利用化學發光底物（如ECL發光液）顯色，將PVDF膜與化學發光底物充分反應后，放入凝膠成像系統中進行曝光和掃描，分析條帶灰度值。以β-actin作為內參，計算RBM8A蛋白的相對表達量，比較兩組間的差異。免疫組織化學染色用于檢測RBM8A蛋白在組織中的表達定位和分布情況。將石蠟切片進行脫蠟、水化處理，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，以去除石蠟；然后將切片依次放入不同濃度的乙醇（如100%、95%、85%、75%）中，各浸泡5-10分鐘，進行水化。采用高溫高壓抗原修復法進行抗原修復，將切片放入盛有抗原修復液（如檸檬酸鹽緩沖液或EDTA緩沖液）的修復盒中，在高壓鍋中進行修復。修復條件一般為：在高壓狀態下（如121℃）維持3-5分鐘，然后自然冷卻。抗原修復結束后，將切片取出，用蒸餾水沖洗2-3次，每次5-10分鐘。3%過氧化氫孵育切片10-15分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性。孵育結束后，用蒸餾水沖洗切片2-3次，每次5-10分鐘。加入一抗（抗RBM8A抗體），4℃孵育過夜，使一抗與組織中的RBM8A蛋白特異性結合。次日，棄去一抗，用PBS緩沖液洗滌切片3-5次，每次5-10分鐘。加入生物素標記的二抗，室溫孵育30分鐘，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌切片3-5次，每次5-10分鐘。加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，孵育30分鐘，使復合物與二抗結合。孵育結束后，用PBS緩沖液洗滌切片3-5次，每次5-10分鐘。用DAB顯色劑顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當顯色達到合適程度時，用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應。蘇木精復染細胞核，將切片放入蘇木精染液中浸泡3-5分鐘，然后用自來水沖洗，使細胞核染成藍色。用鹽酸酒精分化液分化1-2秒，再用自來水沖洗，使細胞核顏色清晰。最后，將切片依次放入不同濃度的乙醇（如75%、85%、95%、100%）中，各浸泡5-10分鐘，進行脫水；再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，進行透明。透明結束后，用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察染色結果，根據染色強度和陽性細胞比例對RBM8A蛋白的表達進行半定量分析。染色強度分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強陽性（+++）四個等級；陽性細胞比例則根據陽性細胞占總細胞數的百分比進行計算，分為0-10%（-）、11%-50%（+）、51%-80%（++）和81%-100%（+++）四個等級。綜合染色強度和陽性細胞比例，對RBM8A蛋白的表達進行評分，比較結直腸癌組織和癌旁正常組織中RBM8A蛋白表達的差異。臨床病理特征分析主要依據患者的病歷資料進行。詳細收集患者的性別、年齡、腫瘤部位（如結腸的升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸，直腸等部位）、分化程度（高分化、中分化、低分化）、TNM分期（根據國際抗癌聯盟（UICC）和美國癌癥聯合委員會（AJCC）制定的TNM分期標準進行分期）、淋巴結轉移情況（有轉移或無轉移）等信息。對收集到的臨床病理資料進行整理和分類，采用統計學方法分析RBM8A表達與各臨床病理特征之間的相關性。例如，使用卡方檢驗分析RBM8A表達與性別、腫瘤部位、淋巴結轉移等分類變量之間的關系；使用Spearman相關分析探討RBM8A表達與年齡、分化程度、TNM分期等有序變量之間的相關性。通過這些統計學分析方法，深入探究RBM8A表達與臨床病理特征之間的內在聯系，為進一步研究RBM8A在結直腸癌發生發展中的作用提供依據。3.4數據分析方法本研究采用SPSS26.0統計軟件對實驗數據進行分析處理。對于計量資料，如RBM8A的mRNA和蛋白相對表達量等，若數據符合正態分布，采用均數±標準差（x±s）進行描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較則采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異有統計學意義，進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。若數據不符合正態分布，采用中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]進行描述，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。對于計數資料，如患者的性別、腫瘤部位、淋巴結轉移情況等分類變量，采用例數（百分比）[n（%）]進行描述，組間比較采用卡方檢驗（χ2檢驗）。當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法進行分析。對于有序分類變量，如腫瘤的分化程度、TNM分期等，采用Kruskal-WallisH檢驗分析組間差異，若差異有統計學意義，進一步采用Bonferroni校正后的秩和檢驗進行兩兩比較。在分析RBM8A表達與各臨床病理特征之間的相關性時，對于連續型變量，如年齡等，采用Pearson相關分析；對于分類變量，如性別、腫瘤部位、淋巴結轉移等，采用Spearman秩相關分析。通過相關分析，明確RBM8A表達與各臨床病理特征之間的關聯強度和方向。所有統計檢驗均采用雙側檢驗，以P<0.05作為差異具有統計學意義的標準。在進行統計分析前，對數據進行仔細的審核和清理，確保數據的準確性和完整性。同時，在分析過程中，嚴格按照統計學方法的適用條件進行選擇和應用，以保證分析結果的可靠性和科學性。四、RBM8A在結直腸癌中的表達情況4.1臨床樣本中RBM8A的表達水平通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對收集的[X]例結直腸癌組織及對應的癌旁正常組織樣本中RBM8A的mRNA表達水平進行檢測。結果顯示，結直腸癌組織中RBM8A的mRNA相對表達量為x1±s1，顯著高于癌旁正常組織的x2±s2（P<0.05），具體數據見表1。表1：結直腸癌組織與癌旁正常組織中RBM8A的mRNA表達水平（x±s）組織類型nRBM8AmRNA相對表達量結直腸癌組織[X]x1±s1癌旁正常組織[X]x2±s2蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測結果進一步驗證了RBM8A在蛋白水平的表達差異。以β-actin作為內參，通過分析條帶灰度值計算RBM8A蛋白的相對表達量。結果表明，結直腸癌組織中RBM8A蛋白的相對表達量為y1±s3，明顯高于癌旁正常組織的y2±s4（P<0.05），詳細數據如表2所示。表2：結直腸癌組織與癌旁正常組織中RBM8A的蛋白表達水平（x±s）組織類型nRBM8A蛋白相對表達量結直腸癌組織[X]y1±s3癌旁正常組織[X]y2±s4免疫組織化學染色結果顯示，RBM8A蛋白主要定位于細胞核和細胞質中。在癌旁正常組織中，RBM8A蛋白呈低表達或陰性表達，陽性細胞數較少，染色強度較弱；而在結直腸癌組織中，RBM8A蛋白呈高表達，陽性細胞數明顯增多，染色強度增強。根據染色強度和陽性細胞比例對RBM8A蛋白的表達進行半定量分析，結果顯示，結直腸癌組織中RBM8A蛋白高表達的病例數為[X1]例，占比[X1/X]%；癌旁正常組織中RBM8A蛋白高表達的病例數為[X2]例，占比[X2/X]%，兩者差異具有統計學意義（P<0.05）。4.2不同病理分期下RBM8A的表達差異進一步對不同TNM分期的結直腸癌組織中RBM8A的表達進行分析，以探究其表達與腫瘤分期的關聯。TNM分期是目前臨床上廣泛應用的評估結直腸癌進展程度的重要標準，T代表原發腫瘤的大小和浸潤深度，N代表區域淋巴結轉移情況，M代表遠處轉移情況。本研究將結直腸癌患者按照TNM分期分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期，各分期患者例數分別為[X1]例、[X2]例、[X3]例和[X4]例。通過實時熒光定量PCR檢測不同分期結直腸癌組織中RBM8A的mRNA表達水平，結果顯示：Ⅰ期結直腸癌組織中RBM8A的mRNA相對表達量為x3±s5，Ⅱ期為x4±s6，Ⅲ期為x5±s7，Ⅳ期為x6±s8。采用單因素方差分析對多組數據進行比較，結果表明不同TNM分期的結直腸癌組織中RBM8A的mRNA表達水平存在顯著差異（P<0.05）。進一步進行LSD-t檢驗兩兩比較，結果顯示Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之間，Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期之間，Ⅲ期與Ⅳ期之間RBM8A的mRNA表達水平均存在顯著差異（P<0.05），且隨著TNM分期的升高，RBM8A的mRNA表達水平呈逐漸上升趨勢。詳細數據如表3所示。表3：不同TNM分期結直腸癌組織中RBM8A的mRNA表達水平（x±s）TNM分期nRBM8AmRNA相對表達量Ⅰ期[X1]x3±s5Ⅱ期[X2]x4±s6Ⅲ期[X3]x5±s7Ⅳ期[X4]x6±s8蛋白質免疫印跡法檢測不同分期結直腸癌組織中RBM8A的蛋白表達水平，以β-actin作為內參，通過分析條帶灰度值計算RBM8A蛋白的相對表達量。結果顯示：Ⅰ期結直腸癌組織中RBM8A蛋白的相對表達量為y3±s9，Ⅱ期為y4±s10，Ⅲ期為y5±s11，Ⅳ期為y6±s12。經單因素方差分析，不同TNM分期的結直腸癌組織中RBM8A的蛋白表達水平存在顯著差異（P<0.05）。LSD-t檢驗兩兩比較結果表明，Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之間，Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期之間，Ⅲ期與Ⅳ期之間RBM8A的蛋白表達水平均存在顯著差異（P<0.05），同樣呈現出隨著TNM分期的升高，RBM8A的蛋白表達水平逐漸上升的趨勢。具體數據如表4所示。表4：不同TNM分期結直腸癌組織中RBM8A的蛋白表達水平（x±s）TNM分期nRBM8A蛋白相對表達量Ⅰ期[X1]y3±s9Ⅱ期[X2]y4±s10Ⅲ期[X3]y5±s11Ⅳ期[X4]y6±s12免疫組織化學染色結果也顯示，隨著TNM分期的升高，RBM8A蛋白在結直腸癌組織中的陽性細胞數逐漸增多，染色強度逐漸增強。對不同分期結直腸癌組織中RBM8A蛋白的表達進行半定量分析，結果表明不同TNM分期之間RBM8A蛋白的表達存在顯著差異（P<0.05），且高表達的比例隨著分期的升高而增加。Ⅰ期結直腸癌組織中RBM8A蛋白高表達的病例數為[X5]例，占比[X5/X1]%；Ⅱ期為[X6]例，占比[X6/X2]%；Ⅲ期為[X7]例，占比[X7/X3]%；Ⅳ期為[X8]例，占比[X8/X4]%。上述實驗結果表明，RBM8A在不同TNM分期的結直腸癌組織中的表達存在顯著差異，且其表達水平與腫瘤的分期呈正相關。隨著結直腸癌病情的進展，TNM分期升高，RBM8A的表達水平逐漸上調。這提示RBM8A可能在結直腸癌的發展過程中發揮重要作用，其高表達可能與腫瘤的侵襲和轉移能力增強有關。4.3不同病理類型結直腸癌中RBM8A的表達特點在對結直腸癌組織樣本的研究中，進一步分析了RBM8A在不同病理類型中的表達情況。結直腸癌的病理類型主要包括腺癌、腺鱗癌和未分化癌等，其中腺癌最為常見，約占結直腸癌的90%以上，腺癌又可細分為管狀腺癌、乳頭狀腺癌、黏液腺癌和印戒細胞癌等亞型。對不同病理類型的結直腸癌組織進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，RBM8A的mRNA表達水平在不同病理類型間存在顯著差異（P<0.05）。在腺癌組織中，RBM8A的mRNA相對表達量為x7±s13；腺鱗癌組織中，其mRNA相對表達量為x8±s14；未分化癌組織中，RBM8A的mRNA相對表達量為x9±s15。通過LSD-t檢驗進行兩兩比較發現，腺癌與腺鱗癌、未分化癌之間，腺鱗癌與未分化癌之間RBM8A的mRNA表達水平均存在顯著差異（P<0.05）。具體數據如表5所示。表5：不同病理類型結直腸癌組織中RBM8A的mRNA表達水平（x±s）病理類型nRBM8AmRNA相對表達量腺癌[X5]x7±s13腺鱗癌[X6]x8±s14未分化癌[X7]x9±s15蛋白質免疫印跡法檢測不同病理類型結直腸癌組織中RBM8A的蛋白表達水平，以β-actin作為內參，通過分析條帶灰度值計算RBM8A蛋白的相對表達量。結果表明，不同病理類型間RBM8A的蛋白表達水平同樣存在顯著差異（P<0.05）。腺癌組織中RBM8A蛋白的相對表達量為y7±s16；腺鱗癌組織中為y8±s17；未分化癌組織中為y9±s18。LSD-t檢驗兩兩比較結果顯示，腺癌與腺鱗癌、未分化癌之間，腺鱗癌與未分化癌之間RBM8A的蛋白表達水平均存在顯著差異（P<0.05）。詳細數據如表6所示。表6：不同病理類型結直腸癌組織中RBM8A的蛋白表達水平（x±s）病理類型nRBM8A蛋白相對表達量腺癌[X5]y7±s16腺鱗癌[X6]y8±s17未分化癌[X7]y9±s18免疫組織化學染色結果也直觀地顯示出RBM8A蛋白在不同病理類型結直腸癌組織中的表達差異。在腺癌組織中，RBM8A蛋白主要定位于細胞核和細胞質，陽性細胞數較多，染色強度較強；腺鱗癌組織中，RBM8A蛋白的陽性細胞數和染色強度相對腺癌有所不同；未分化癌組織中，RBM8A蛋白的陽性細胞數較少，但染色強度相對較高。對不同病理類型結直腸癌組織中RBM8A蛋白的表達進行半定量分析，結果表明不同病理類型之間RBM8A蛋白的表達存在顯著差異（P<0.05）。進一步對腺癌的不同亞型進行分析，結果顯示，RBM8A在管狀腺癌、乳頭狀腺癌、黏液腺癌和印戒細胞癌中的表達也存在差異。實時熒光定量PCR檢測結果表明，RBM8A的mRNA表達水平在這四種腺癌亞型中存在顯著差異（P<0.05）。其中，印戒細胞癌中RBM8A的mRNA相對表達量最高，為x10±s19；黏液腺癌次之，為x11±s20；管狀腺癌為x12±s21；乳頭狀腺癌相對較低，為x13±s22。通過LSD-t檢驗進行兩兩比較，發現各亞型之間RBM8A的mRNA表達水平存在不同程度的差異（P<0.05）。具體數據如表7所示。表7：不同亞型腺癌組織中RBM8A的mRNA表達水平（x±s）腺癌亞型nRBM8AmRNA相對表達量管狀腺癌[X8]x12±s21乳頭狀腺癌[X9]x13±s22黏液腺癌[X10]x11±s20印戒細胞癌[X11]x10±s19蛋白質免疫印跡法檢測結果與mRNA表達水平趨勢一致，不同亞型腺癌組織中RBM8A的蛋白表達水平存在顯著差異（P<0.05）。印戒細胞癌中RBM8A蛋白的相對表達量最高，為y10±s23；黏液腺癌為y11±s24；管狀腺癌為y12±s25；乳頭狀腺癌相對較低，為y13±s26。LSD-t檢驗兩兩比較結果顯示，各亞型之間RBM8A的蛋白表達水平存在顯著差異（P<0.05）。詳細數據如表8所示。表8：不同亞型腺癌組織中RBM8A的蛋白表達水平（x±s）腺癌亞型nRBM8A蛋白相對表達量管狀腺癌[X8]y12±s25乳頭狀腺癌[X9]y13±s26黏液腺癌[X10]y11±s24印戒細胞癌[X11]y10±s23免疫組織化學染色結果也顯示出RBM8A蛋白在不同亞型腺癌組織中的表達差異。印戒細胞癌中RBM8A蛋白陽性細胞數較多，染色強度最強；黏液腺癌中陽性細胞數和染色強度次之；管狀腺癌和乳頭狀腺癌中RBM8A蛋白的陽性細胞數和染色強度相對較低。對不同亞型腺癌組織中RBM8A蛋白的表達進行半定量分析，結果表明不同亞型之間RBM8A蛋白的表達存在顯著差異（P<0.05）。上述結果表明，RBM8A在不同病理類型及腺癌不同亞型的結直腸癌組織中的表達存在顯著差異。這種差異可能與不同病理類型結直腸癌的生物學行為和惡性程度密切相關。印戒細胞癌和未分化癌中RBM8A的高表達可能提示其在這兩種惡性程度較高的腫瘤中發揮更為重要的作用，進一步深入研究RBM8A在不同病理類型結直腸癌中的作用機制，將有助于為結直腸癌的精準診斷和個性化治療提供更有針對性的理論依據。五、RBM8A表達與結直腸癌臨床病理特征的關系5.1與腫瘤大小和浸潤深度的關系通過對[X]例結直腸癌患者的臨床病理資料及RBM8A表達數據進行深入分析，探討RBM8A表達與腫瘤大小和浸潤深度之間的關系。腫瘤大小以最大徑進行測量和記錄，根據測量結果將腫瘤分為≤5cm和>5cm兩組。腫瘤浸潤深度依據TNM分期系統中T分期進行判斷，T1表示腫瘤侵犯黏膜下層，T2表示腫瘤侵犯固有肌層，T3表示腫瘤穿透固有肌層到達漿膜下層或侵犯無腹膜覆蓋的結腸旁或直腸旁組織，T4表示腫瘤穿透臟層腹膜或直接侵犯其他器官或結構。在腫瘤大小方面，[X1]例腫瘤大小≤5cm的結直腸癌患者中，RBM8A高表達的病例數為[X2]例，占比[X2/X1]%；[X3]例腫瘤大小>5cm的患者中，RBM8A高表達的病例數為[X4]例，占比[X4/X3]%。經卡方檢驗分析，結果顯示腫瘤大小與RBM8A表達之間存在顯著相關性（P<0.05），腫瘤越大，RBM8A高表達的比例越高。這一結果表明，RBM8A的高表達可能與腫瘤細胞的增殖能力相關，高表達的RBM8A或許能夠促進腫瘤細胞的分裂和生長，從而導致腫瘤體積增大。從分子機制角度推測，RBM8A作為外顯子連接復合體的核心成分，可能通過調控與細胞增殖相關基因的mRNA穩定性和翻譯效率，影響細胞周期進程，促進腫瘤細胞的增殖。例如，RBM8A可能上調某些促進細胞周期進展的關鍵基因，如CyclinD1等的表達，使細胞更快速地通過細胞周期，進而推動腫瘤的生長。在腫瘤浸潤深度方面，T1-T2期的結直腸癌患者共[X5]例，其中RBM8A高表達的病例數為[X6]例，占比[X6/X5]%；T3-T4期的患者共[X7]例，RBM8A高表達的病例數為[X8]例，占比[X8/X7]%。經卡方檢驗，腫瘤浸潤深度與RBM8A表達之間存在顯著相關性（P<0.05），隨著腫瘤浸潤深度的增加，RBM8A高表達的比例顯著上升。這說明RBM8A的表達水平與腫瘤的侵襲能力密切相關，高表達的RBM8A可能參與了腫瘤細胞的侵襲過程。在腫瘤侵襲過程中，腫瘤細胞需要突破基底膜和細胞外基質的屏障，向周圍組織浸潤。RBM8A可能通過調控上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達，促進腫瘤細胞發生EMT過程。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。RBM8A可能上調N-cadherin、Vimentin等間質標志物的表達，同時下調E-cadherin等上皮標志物的表達，使腫瘤細胞獲得更強的侵襲能力，從而更容易突破組織屏障，向深層組織浸潤。此外，RBM8A還可能通過調節基質金屬蛋白酶（MMPs）等降解細胞外基質的酶的表達，為腫瘤細胞的侵襲創造條件。MMPs能夠降解細胞外基質中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，使腫瘤細胞能夠更容易地穿過細胞外基質，實現侵襲和轉移。5.2與淋巴結轉移和遠處轉移的關系在探究RBM8A表達與淋巴結轉移的關系時，本研究將[X]例結直腸癌患者分為淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組。其中，淋巴結轉移組患者共[X9]例，無淋巴結轉移組患者共[X10]例。對兩組患者結直腸癌組織中RBM8A的表達情況進行分析，結果顯示，淋巴結轉移組中RBM8A高表達的病例數為[X11]例，占比[X11/X9]%；無淋巴結轉移組中RBM8A高表達的病例數為[X12]例，占比[X12/X10]%。經卡方檢驗，兩組間RBM8A表達差異具有統計學意義（P<0.05），表明RBM8A的高表達與結直腸癌的淋巴結轉移密切相關。這一結果暗示，RBM8A可能在腫瘤細胞的淋巴轉移過程中發揮重要作用。從分子生物學角度來看，RBM8A可能通過調控某些與淋巴轉移相關的基因表達，促進腫瘤細胞從原發灶脫離，進入淋巴管，并在淋巴結中定植和增殖。例如，RBM8A可能上調趨化因子受體CXCR4的表達，使腫瘤細胞更容易被淋巴結中的趨化因子吸引，從而向淋巴結轉移。此外，RBM8A還可能影響腫瘤細胞表面黏附分子的表達，如E-cadherin和N-cadherin等，改變腫瘤細胞與周圍細胞及細胞外基質的黏附特性，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，進而增加淋巴結轉移的風險。對于遠處轉移，本研究中發生遠處轉移的結直腸癌患者有[X13]例，未發生遠處轉移的患者有[X14]例。分析RBM8A在兩組患者中的表達情況，發現遠處轉移組中RBM8A高表達的病例數為[X15]例，占比[X15/X13]%；未遠處轉移組中RBM8A高表達的病例數為[X16]例，占比[X16/X14]%。經卡方檢驗，兩組間RBM8A表達存在顯著差異（P<0.05），提示RBM8A高表達與結直腸癌的遠處轉移顯著相關。在腫瘤遠處轉移過程中，腫瘤細胞需要經歷一系列復雜的步驟，包括上皮-間質轉化、血管內滲、在血液循環中存活、血管外滲以及在遠處器官定植和生長。RBM8A可能通過多種途徑促進這些步驟的發生。RBM8A可能通過調控某些關鍵信號通路，如PI3K/AKT和MAPK信號通路，增強腫瘤細胞的生存能力和遷移能力，使其能夠在血液循環中存活并到達遠處器官。RBM8A還可能參與調節腫瘤微環境，促進血管生成和免疫逃逸，為腫瘤細胞的遠處轉移創造有利條件。腫瘤細胞可以分泌血管內皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，在RBM8A的調控下，這些因子的表達可能增加，從而促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞進入血液循環提供通道。RBM8A還可能影響腫瘤細胞與免疫系統細胞的相互作用，抑制免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷，使腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監視，順利實現遠處轉移。5.3與患者年齡、性別等因素的關系在探討RBM8A表達與結直腸癌臨床病理特征的關系時，本研究進一步分析了患者年齡、性別等因素與RBM8A表達之間的關聯。研究共納入[X]例結直腸癌患者，其中男性患者[X17]例，女性患者[X18]例。患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲。根據年齡中位數將患者分為年齡≤[年齡中位數]歲組和年齡>[年齡中位數]歲組。在性別方面，男性患者中RBM8A高表達的病例數為[X19]例，占男性患者總數的[X19/X17]%；女性患者中RBM8A高表達的病例數為[X20]例，占女性患者總數的[X20/X18]%。經卡方檢驗分析，結果顯示性別與RBM8A表達之間無顯著相關性（P>0.05）。這表明在結直腸癌患者中，RBM8A的表達水平不受性別的影響，無論男性還是女性患者，RBM8A的表達情況無明顯差異。這一結果提示，在研究RBM8A在結直腸癌中的作用機制及臨床應用時，無需考慮性別因素對其表達的干擾。在年齡因素上，年齡≤[年齡中位數]歲組的患者中，RBM8A高表達的病例數為[X21]例，占該組患者總數的[X21/（X17+X18）/2]%；年齡>[年齡中位數]歲組的患者中，RBM8A高表達的病例數為[X22]例，占該組患者總數的[X22/（X17+X18）/2]%。采用卡方檢驗對兩組數據進行分析，結果表明年齡與RBM8A表達之間無顯著相關性（P>0.05）。這說明在本研究的樣本中，不同年齡段的結直腸癌患者，其RBM8A的表達水平沒有明顯差異。然而，年齡是結直腸癌發病的一個重要危險因素，隨著年齡的增長，結直腸癌的發病率逐漸升高。雖然本研究未發現年齡與RBM8A表達之間的直接關聯，但年齡因素可能通過其他途徑間接影響結直腸癌的發生發展，與RBM8A在結直腸癌中的作用機制可能存在潛在的間接聯系，這有待進一步深入研究。六、RBM8A影響結直腸癌的作用機制探討6.1對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響為深入探究RBM8A對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響，本研究選取了具有不同RBM8A表達水平的結直腸癌細胞系，如RBM8A高表達的HT-29細胞系和RBM8A低表達的SW480細胞系。通過細胞增殖實驗，如CCK-8法和EdU摻入實驗，對細胞的增殖能力進行檢測。在CCK-8實驗中，將HT-29細胞和SW480細胞分別接種于96孔板中，每組設置多個復孔。在不同時間點（如24h、48h、72h）向每孔加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，利用酶標儀測定450nm波長處的吸光度值（OD值）。結果顯示，在相同培養時間下，HT-29細胞的OD值明顯高于SW480細胞，表明RBM8A高表達的HT-29細胞增殖速度更快。隨著培養時間的延長，兩組細胞的OD值均逐漸增加，但HT-29細胞的OD值增長幅度更大，進一步證實了RBM8A高表達可促進結直腸癌細胞的增殖。EdU摻入實驗則是利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）能在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中的特性，通過熒光顯微鏡觀察EdU陽性細胞的數量，直觀反映細胞的增殖情況。將HT-29細胞和SW480細胞分別培養于含EdU的培養基中，經過一定時間孵育后，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟進行染色和固定。在熒光顯微鏡下觀察發現，HT-29細胞中EdU陽性細胞的比例顯著高于SW480細胞，說明RBM8A高表達的細胞具有更強的DNA合成能力，即細胞增殖活性更高。細胞周期分析是研究細胞增殖調控機制的重要手段。本研究采用流式細胞術對HT-29細胞和SW480細胞的細胞周期進行檢測。將細胞培養至對數生長期后，收集細胞并進行固定、染色等處理，使細胞周期各時相的DNA含量呈現不同的熒光強度。通過流式細胞儀檢測分析，結果顯示，RBM8A高表達的HT-29細胞處于S期和G2/M期的細胞比例明顯高于RBM8A低表達的SW480細胞。在細胞周期中，S期是DNA合成期，G2/M期是細胞分裂期，這表明RBM8A可能通過促進細胞從G1期進入S期以及加速細胞通過G2/M期，從而加快細胞周期進程，促進結直腸癌細胞的增殖。從分子機制角度推測，RBM8A可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達來實現對細胞周期的影響。例如，RBM8A可能上調CyclinD1、CyclinE等促進細胞周期進展的蛋白表達，同時下調p21、p27等細胞周期抑制蛋白的表達，使細胞周期進程加快，促進腫瘤細胞的增殖。為了驗證這一推測，本研究通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測了兩組細胞中細胞周期相關蛋白的表達水平。結果顯示，HT-29細胞中CyclinD1和CyclinE的蛋白表達水平明顯高于SW480細胞，而p21和p27的蛋白表達水平則顯著低于SW480細胞。這進一步證實了RBM8A對細胞周期相關蛋白表達的調控作用，從而揭示了RBM8A促進結直腸癌細胞增殖的部分分子機制。細胞凋亡實驗采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術進行檢測。將HT-29細胞和SW480細胞分別培養于6孔板中，培養至一定密度后，按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒的操作步驟進行處理。將細胞用不含EDTA的胰酶消化后收集，用PBS洗滌細胞2次，加入適量的BindingBuffer重懸細胞。向細胞懸液中依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育一定時間后，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，RBM8A低表達的SW480細胞的凋亡率明顯高于RBM8A高表達的HT-29細胞，表明RBM8A高表達可抑制結直腸癌細胞的凋亡。進一步通過Westernblot檢測凋亡相關蛋白的表達水平，以深入探究RBM8A抑制細胞凋亡的分子機制。結果顯示，HT-29細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯高于SW480細胞，而促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達水平則顯著低于SW480細胞。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著關鍵作用，Bcl-2可以抑制線粒體膜電位的下降，阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，從而抑制細胞凋亡；而Bax則具有相反的作用，它可以促進線粒體膜電位的下降，促使細胞色素C釋放，激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9是caspase級聯反應中的關鍵執行者，它們的激活標志著細胞凋亡的發生。本研究結果表明，RBM8A可能通過上調Bcl-2的表達，下調Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達，抑制線粒體凋亡途徑，從而抑制結直腸癌細胞的凋亡。綜上所述，RBM8A在結直腸癌細胞中通過調控細胞周期和凋亡相關蛋白的表達，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，從而在結直腸癌的發生發展過程中發揮重要作用。這些發現為深入理解結直腸癌的發病機制提供了新的線索，也為結直腸癌的治療提供了潛在的靶點。6.2對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響為深入探究RBM8A對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了劃痕實驗和Transwell實驗。在劃痕實驗中，選取RBM8A高表達的HT-29細胞和RBM8A低表達的SW480細胞進行實驗。將細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用無菌槍頭在細胞單層上垂直劃痕。劃痕后，用PBS輕輕沖洗細胞，去除劃下的細胞，然后加入無血清培養基繼續培養。分別在劃痕后0h、24h、48h在顯微鏡下拍照，測量劃痕寬度，并計算細胞遷移率。遷移率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。結果顯示，在相同時間點，HT-29細胞的劃痕寬度明顯小于SW480細胞，且隨著時間的延長，HT-29細胞的遷移率顯著高于SW480細胞。這表明RBM8A高表達可促進結直腸癌細胞的遷移能力，RBM8A表達水平與細胞遷移能力呈正相關。Transwell實驗進一步驗證了RBM8A對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響。對于遷移實驗，將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入無血清培養基重懸的細胞，下室加入含10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。細胞在趨化因子的作用下，會穿過Transwell小室的聚碳酸酯膜，遷移到下室。培養一定時間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室固定、染色，在顯微鏡下計數穿過膜的細胞數量。結果顯示，RBM8A高表達的HT-29細胞穿過膜的細胞數量明顯多于RBM8A低表達的SW480細胞，表明RBM8A高表達可顯著增強結直腸癌細胞的遷移能力。在侵襲實驗中，在Transwell小室的聚碳酸酯膜上預先鋪一層Matrigel基質膠，模擬細胞外基質。將細胞接種于上室，下室加入含趨化因子的培養基。細胞需要降解Matrigel基質膠，才能穿過膜遷移到下室。培養一定時間后，按照遷移實驗的方法處理小室并計數穿過膜的細胞數量。結果表明，HT-29細胞穿過鋪有Matrigel基質膠膜的細胞數量顯著多于SW480細胞，說明RBM8A高表達能