RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下，尤其是在我國(guó)，形勢(shì)更為嚴(yán)峻。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中分別位居第四位和第二位，每年新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均達(dá)到數(shù)十萬(wàn)之多。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，受到多種因素的共同作用，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的感染、黃曲霉毒素的暴露、長(zhǎng)期大量飲酒以及遺傳因素等。其中，HBV感染在我國(guó)肝癌的發(fā)病原因中占據(jù)主導(dǎo)地位，約有80%的肝癌患者存在HBV感染史。肝癌起病隱匿，早期通常缺乏典型的臨床癥狀，這使得大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期。中晚期肝癌患者往往伴有腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，手術(shù)切除的機(jī)會(huì)大幅減少，且對(duì)放化療的敏感性較低，總體治療效果不佳，5年生存率僅約為10%-20%。目前，肝癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融、介入治療、化療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性，如手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率較高，肝移植面臨供體短缺和免疫排斥等問(wèn)題，放化療的副作用較大，靶向治療和免疫治療的有效率有限且易出現(xiàn)耐藥等。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略，對(duì)于提高肝癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE），作為一種跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。RAGE具有多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，能夠與多種配體特異性結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、S100/鈣粒蛋白等。在生理狀態(tài)下，RAGE的表達(dá)水平較低，主要參與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等過(guò)程。然而，在多種病理狀態(tài)下，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及腫瘤等，RAGE的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)，并通過(guò)激活下游一系列復(fù)雜的信號(hào)通路，參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等病理過(guò)程。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，RAGE在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。RAGE在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞系中，上調(diào)RAGE的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)RAGE的表達(dá)則能夠抑制肝癌細(xì)胞的這些生物學(xué)行為。RAGE可能通過(guò)激活核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）等信號(hào)通路，調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、凋亡以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等過(guò)程，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。然而，目前關(guān)于RAGE在肝癌中的具體作用機(jī)制仍不完全清楚，尚有許多問(wèn)題亟待進(jìn)一步深入研究。本研究旨在通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)方法，深入探究RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響及其潛在的分子機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)RAGE在不同人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析其與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能之間的相關(guān)性；利用基因干擾技術(shù)和抗體阻斷技術(shù)，研究抑制RAGE表達(dá)或活性對(duì)人肝癌細(xì)胞系增殖、侵襲和遷移能力的影響；通過(guò)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和活性變化，初步探討RAGE調(diào)控人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的分子機(jī)制。本研究的結(jié)果有望為肝癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，為肝癌的早期診斷和治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入剖析RAGE在人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為變化中的作用機(jī)制，通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。肝癌的高發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重威脅人類健康，盡管現(xiàn)有治療手段眾多，但療效仍不盡人意，關(guān)鍵在于對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的理解不夠深入。RAGE作為一種與多種疾病相關(guān)的跨膜蛋白，在肝癌中的作用機(jī)制尚未完全明確，因此，探究其在人肝癌細(xì)胞系中的作用具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將圍繞以下幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題展開深入探討：首先，RAGE在不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況存在怎樣的差異，以及這種表達(dá)差異與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能之間存在何種關(guān)聯(lián)？肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因，明確RAGE表達(dá)與轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系，有助于揭示肝癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。其次，通過(guò)基因干擾技術(shù)降低RAGE的表達(dá)，或者利用抗體阻斷RAGE的活性，人肝癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移能力會(huì)發(fā)生怎樣的變化？這將直接驗(yàn)證RAGE對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為后續(xù)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。再者，在上述干預(yù)過(guò)程中，RAGE調(diào)控人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的具體信號(hào)通路是怎樣的，哪些關(guān)鍵分子參與其中？深入了解信號(hào)通路機(jī)制，有助于找到潛在的治療靶點(diǎn)，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供理論支持。最后，能否將RAGE作為肝癌治療的新靶點(diǎn)，通過(guò)干預(yù)RAGE的表達(dá)或活性，開發(fā)出有效的肝癌治療策略？這是本研究的最終落腳點(diǎn)，也是將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。通過(guò)對(duì)這些問(wèn)題的深入研究，有望為肝癌的治療開辟新的道路，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于RAGE與肝癌關(guān)系的研究起步較早。一些研究聚焦于RAGE在肝癌組織中的表達(dá)特征，通過(guò)免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RAGE在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。例如，有研究對(duì)大量肝癌患者的組織樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RAGE高表達(dá)的肝癌患者其腫瘤分期往往更晚，預(yù)后更差，提示RAGE表達(dá)與肝癌的惡性程度密切相關(guān)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)構(gòu)建RAGE過(guò)表達(dá)或敲低的肝癌細(xì)胞模型，深入探究RAGE對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RAGE表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)RAGE表達(dá)則產(chǎn)生相反的效果。在機(jī)制研究上，國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)RAGE可能通過(guò)激活NF-κB、MAPK等信號(hào)通路，調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和凋亡等過(guò)程。然而，這些研究在信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制上仍存在諸多爭(zhēng)議，不同研究結(jié)果之間存在一定差異。國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究也取得了豐碩成果。眾多研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)RAGE的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。例如，利用RT-PCR、Westernblot等方法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中RAGE的表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系。在臨床研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)肝癌患者的臨床資料進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了RAGE表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RAGE高表達(dá)的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，生存率更低。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)研究不僅關(guān)注經(jīng)典的NF-κB、MAPK信號(hào)通路，還探索了RAGE與其他信號(hào)分子或通路的相互作用，如RAGE與miRNA的調(diào)控關(guān)系等。但目前國(guó)內(nèi)研究在RAGE調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的上游調(diào)控機(jī)制以及RAGE在肝癌微環(huán)境中的作用研究相對(duì)較少。盡管國(guó)內(nèi)外在RAGE與肝癌關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足之處。在RAGE表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面，目前的研究?jī)H揭示了部分上游調(diào)控因子，對(duì)于整體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。在信號(hào)通路研究中，雖然發(fā)現(xiàn)RAGE可激活多條信號(hào)通路，但各信號(hào)通路之間的相互關(guān)系以及它們?cè)诓煌伟┌l(fā)展階段的作用差異尚不明確。在臨床應(yīng)用研究方面，雖然RAGE有望成為肝癌診斷和治療的新靶點(diǎn)，但目前仍缺乏有效的靶向RAGE的治療藥物和方法，相關(guān)臨床試驗(yàn)也較少。此外，現(xiàn)有研究大多集中在細(xì)胞和動(dòng)物模型層面，對(duì)于RAGE在人體肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及作用機(jī)制的研究還相對(duì)匱乏。因此，深入探究RAGE在人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為變化中的作用機(jī)制，對(duì)于完善肝癌發(fā)病機(jī)制理論、開發(fā)新的治療策略具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。二、RAGE與肝癌細(xì)胞系相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1RAGE概述晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE），作為一種重要的跨膜蛋白，在人體生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從結(jié)構(gòu)上看，RAGE由404個(gè)氨基酸組成，可細(xì)分為三個(gè)主要部分：較大的細(xì)胞外段（包含321個(gè)氨基酸殘基）、跨膜段（由19個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成）以及短的細(xì)胞內(nèi)段（含有41個(gè)氨基酸殘基）。其中，細(xì)胞外段是RAGE與配體相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，它具有V型片段緊接兩個(gè)C型片段的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，每個(gè)片段都含有一對(duì)保守的半胱氨酸殘基，V型片段還包含兩個(gè)與N偶聯(lián)的糖基化位點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)特征對(duì)于RAGE分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及特異識(shí)別配體的功能至關(guān)重要?？缒ざ蝿t將RAGE錨定在細(xì)胞膜上，確保其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的正確定位。細(xì)胞內(nèi)段與B細(xì)胞激活標(biāo)記CD20具有高度同源性，在配體與RAGE結(jié)合后，該段很可能參與結(jié)合胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，從而引發(fā)一系列細(xì)胞效應(yīng)。RAGE具有多種重要功能，這些功能在生理和病理狀態(tài)下均有體現(xiàn)。在生理狀態(tài)下，RAGE的表達(dá)水平相對(duì)較低，主要參與胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的遷移和分化。以神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育為例，RAGE能夠協(xié)助神經(jīng)元遷移到正確的位置，進(jìn)而形成復(fù)雜而有序的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能維持起到不可或缺的作用。在免疫系統(tǒng)中，RAGE同樣發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體遭受病原體入侵時(shí)，RAGE能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，激活免疫細(xì)胞，啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)，幫助機(jī)體抵御病原體的侵害。此外，RAGE還參與維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，確保細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)處于穩(wěn)定水平，為細(xì)胞的正常代謝和功能發(fā)揮提供適宜的環(huán)境。在病理狀態(tài)下，RAGE的作用更為顯著，尤其是在糖尿病及其并發(fā)癥、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。在糖尿病及其并發(fā)癥方面，糖尿病患者長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的大量生成。過(guò)量的AGEs與RAGE結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列不良后果。在糖尿病血管病變中，AGE-RAGE相互作用會(huì)激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥因子的釋放和氧化應(yīng)激水平升高，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。在糖尿病腎病中，RAGE的過(guò)度表達(dá)會(huì)使得腎臟系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)堆積，加速腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎功能受損。在神經(jīng)退行性疾病方面，以阿爾茨海默病為例，大腦中會(huì)積累大量的淀粉樣蛋白，這些蛋白可以與RAGE結(jié)合。這一結(jié)合會(huì)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡。同時(shí)，RAGE還可能參與了tau蛋白的過(guò)度磷酸化過(guò)程，進(jìn)一步加重神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，加速阿爾茨海默病的病程進(jìn)展。在帕金森病中，RAGE同樣被發(fā)現(xiàn)與α-突觸核蛋白的聚集和神經(jīng)炎癥有關(guān)。在腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域，RAGE的作用機(jī)制日益受到關(guān)注。在腫瘤微環(huán)境中，AGEs的水平升高，RAGE的表達(dá)也隨之增加。RAGE與AGEs的結(jié)合能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，RAGE激活的信號(hào)通路可以上調(diào)一些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶等，幫助腫瘤細(xì)胞突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，RAGE還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，支持腫瘤的生長(zhǎng)。在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤中，均發(fā)現(xiàn)RAGE及其配體的表達(dá)水平升高，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。在乳腺癌中，RAGE的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)RAGE的乳腺癌患者預(yù)后往往較差。在肺癌研究中，通過(guò)構(gòu)建RAGE過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RAGE可以通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和間充質(zhì)干細(xì)胞特性，提示RAGE在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。2.2人肝癌細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞系在肝癌研究中具有不可替代的重要作用，它們是深入探究肝癌發(fā)病機(jī)制、篩選抗癌藥物以及評(píng)估治療效果的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。常?jiàn)的人肝癌細(xì)胞系眾多，各有其獨(dú)特的來(lái)源、特性及應(yīng)用價(jià)值。SMMC-7721人肝癌細(xì)胞株于1977年建立，材料取自一名50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本。該細(xì)胞系生長(zhǎng)迅速且穩(wěn)定，細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)。其甲胎蛋白（AFP）免疫熒光染色呈陽(yáng)性，LDH同工酶譜的變化與肝癌細(xì)胞的一般特征一致。在免疫缺陷小鼠體內(nèi)，SMMC-7721細(xì)胞系具有較高的成瘤率，動(dòng)物異種移植后瘤結(jié)節(jié)的病理切片檢查顯示，其組織形態(tài)與原手術(shù)切除標(biāo)本類似。由于其易于培養(yǎng)和穩(wěn)定的特性，SMMC-7721細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于肝癌的基礎(chǔ)研究，如肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡機(jī)制研究，以及抗癌藥物的篩選和細(xì)胞毒性測(cè)試等。在研究某種新型抗癌藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的作用時(shí)，常選用SMMC-7721細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察藥物對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。Bel-7402人肝癌細(xì)胞株建立于1974年，來(lái)源于一位53歲男性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本。該細(xì)胞增長(zhǎng)迅速且恒定，6-7天可傳代1次，細(xì)胞形態(tài)以多邊形、上皮樣為主，貼壁生長(zhǎng)。其染色體中有一大而長(zhǎng)的近端著絲點(diǎn)染色體，出現(xiàn)頻率高，是該株細(xì)胞的標(biāo)記染色體。AFP免疫熒光反應(yīng)陽(yáng)性，LDH、G6PD、TAT等酶代謝及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本上保持臨床人體肝癌的特性。在異種接種后，Bel-7402細(xì)胞系成瘤率高，3-4天即可成瘤，瘤塊組織學(xué)病理與臨床HCC相近。因其具有與臨床肝癌相似的生物學(xué)特性，Bel-7402細(xì)胞系常用于肝癌的實(shí)驗(yàn)研究，如肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究，以及肝癌治療靶點(diǎn)的探索等。在研究肝癌細(xì)胞的侵襲能力時(shí)，可以利用Bel-7402細(xì)胞系進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的能力。MHCC97人肝癌細(xì)胞系于1998年由上海醫(yī)科大學(xué)中山醫(yī)院建立，將一名39歲男性HCC患者的肝右葉轉(zhuǎn)移病灶的手術(shù)切除標(biāo)本接種于裸鼠肝內(nèi)建造出人肝癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型（LCI-D20）而得。該細(xì)胞系符合一般人惡性腫瘤的病理學(xué)和遺傳學(xué)特征，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，血清HBsAg、AFP高表達(dá)，成瘤率高且優(yōu)先轉(zhuǎn)移的靶器官是肺，肺轉(zhuǎn)移率達(dá)100%，被證實(shí)為高轉(zhuǎn)移特性的人肝癌細(xì)胞系。2001年，研究者從MHCC97細(xì)胞系中分離出不同轉(zhuǎn)移潛能的2個(gè)細(xì)胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺轉(zhuǎn)移率100%，后者40%；從生長(zhǎng)速度上看，前者細(xì)胞倍增時(shí)間較后者短；穿透人工基底膜能力前者較后者大；前者活力強(qiáng)、代謝旺。之后又從MHCC97-H裸鼠接種后成功得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系。MHCC97及其相關(guān)細(xì)胞系為研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了理想的模型，在研究肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和信號(hào)通路時(shí)，常選用這些細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)MHCC97-H和MHCC97-L細(xì)胞系的比較研究，可以篩選出與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。HepG2人肝癌細(xì)胞系于1979年從阿根廷一名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤中分離建立。該細(xì)胞系呈上皮樣，貼壁抱團(tuán)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)較快，傳代周期為1-2天，具有低轉(zhuǎn)移的特性，在裸鼠中成瘤率較差。AFP陽(yáng)性，HBsAg陰性，目前尚未證明該細(xì)胞中有乙型肝炎病毒（HBV）基因組。然而，該細(xì)胞系分化程度較高，細(xì)胞內(nèi)代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整，不需加入外源性活化系統(tǒng)，在藥物作用相關(guān)研究中代謝酶保持穩(wěn)定，不會(huì)因傳代次數(shù)增多而有所改變，所含有的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞同源，因此，常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)方面。例如，在研究藥物對(duì)肝細(xì)胞代謝的影響時(shí)，HepG2細(xì)胞系是常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎糜跈z測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性的影響。其衍生株HepG2.2.15是抗HBV新藥開發(fā)的良好體外研究工具，該細(xì)胞株是用2個(gè)頭尾相連的HBV-DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞HepG2而成，可在體外無(wú)性繁殖，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，而且還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，常用于抗HBV藥物的篩選和研究。Hep3B人肝癌細(xì)胞株分離自8歲美國(guó)黑人男童的肝癌組織。細(xì)胞形態(tài)與HepG2類似，呈上皮細(xì)胞，電鏡下觀察胞漿里面有很多粗大的黑顆粒，同樣喜抱團(tuán)貼壁生長(zhǎng)。其在裸鼠中能致瘤，但基本不轉(zhuǎn)移。與HepG2不同的是，Hep3B細(xì)胞系HBV陽(yáng)性，該細(xì)胞整合了完整的HBV基因組，可用于HBV感染后發(fā)展致癌相關(guān)研究。在研究HBV感染與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系時(shí)，Hep3B細(xì)胞系是重要的研究模型，可用于探討HBV基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響。Huh-7人肝癌細(xì)胞系于1982年從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)而得。該細(xì)胞AFP陽(yáng)性，高度分化，細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，特點(diǎn)是HBV陰性，但具有丙型肝炎病毒（HCV）易感性，故可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究。除了用于研究致癌性，還用于基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制、新陳代謝及VLDL的分泌等。此細(xì)胞系還可用于生產(chǎn)重組蛋白如促紅細(xì)胞生成素；在蛋白質(zhì)生物學(xué)方面用于研究在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的登革病毒；廣泛用于異種移植動(dòng)物模型。在研究HCV感染對(duì)肝癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響時(shí)，Huh-7細(xì)胞系是常用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)比較感染HCV前后細(xì)胞基因表達(dá)的變化，揭示HCV與肝癌發(fā)生發(fā)展的潛在聯(lián)系。PLC/PRF/5人肝癌亞歷山大細(xì)胞于1976年建系，細(xì)胞來(lái)自一位患有原發(fā)性HCC的莫桑比克男性患者的標(biāo)本。該細(xì)胞為上皮樣貼壁生長(zhǎng)，AFP陽(yáng)性，不產(chǎn)生白蛋白，分泌ad亞型的HBsAg而不產(chǎn)生HBcAg或HBeAg和Dane顆粒，卻可維持HAV的繁殖，該細(xì)胞可能含有全部HBV基因組，同工酶譜及核型與人類同源；裸鼠異種移植可致瘤。由于其產(chǎn)生HBsAg的物理化學(xué)和免疫化學(xué)特性跟HBV攜帶者血清中HBsAg相似，因此，常被用來(lái)研究HBV體外病毒及其與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián)，抗HBV疫苗所需的HBsAg顆粒的制備及抗病毒藥物的制備等方面。在研究HBV的體外復(fù)制機(jī)制以及開發(fā)抗HBV藥物時(shí)，PLC/PRF/5細(xì)胞系發(fā)揮著重要作用，可用于評(píng)估藥物對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果。不同的人肝癌細(xì)胞系在生物學(xué)特性上存在顯著差異，這些差異對(duì)肝癌研究產(chǎn)生了多方面的影響。在細(xì)胞增殖能力方面，SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞系生長(zhǎng)迅速，適合用于研究肝癌細(xì)胞的快速增殖機(jī)制以及篩選能夠抑制細(xì)胞增殖的藥物。而HepG2細(xì)胞系生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，但其分化程度高，更適合用于研究肝細(xì)胞的分化和代謝相關(guān)機(jī)制。在轉(zhuǎn)移潛能上，MHCC97及其衍生的高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系，如MHCC97-H和HCCLM3，為研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了獨(dú)特的模型，通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞系的研究，可以深入了解肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中涉及的分子事件和信號(hào)通路。相比之下，HepG2和Hep3B等低轉(zhuǎn)移或基本不轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系，則可作為對(duì)照，用于對(duì)比分析轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)差異。在病毒感染特性方面，Hep3B細(xì)胞系的HBV陽(yáng)性和Huh-7細(xì)胞系的HCV易感性，使得它們分別成為研究HBV和HCV相關(guān)肝癌的重要工具，有助于揭示病毒感染在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。這些差異使得研究人員能夠根據(jù)不同的研究目的，選擇最合適的人肝癌細(xì)胞系，從而更準(zhǔn)確、深入地探究肝癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)和開發(fā)新的治療策略。三、RAGE在人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用多種具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系，包括高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系、MHCC97-H細(xì)胞系，以及低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞系、SMMC-7721細(xì)胞系等。這些細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），并經(jīng)過(guò)STR鑒定，確保細(xì)胞系的真實(shí)性和穩(wěn)定性。細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司，美國(guó)）的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。主要試劑：RAGE抗體（兔抗人多克隆抗體，Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)ab181808，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)RAGE蛋白表達(dá)；β-actin抗體（鼠抗人單克隆抗體，Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，貨號(hào)A5441，工作濃度1:5000），作為內(nèi)參抗體；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearch公司，美國(guó)，工作濃度1:5000），用于二抗孵育；RIPA裂解液（Beyotime公司，中國(guó)，貨號(hào)P0013B），用于細(xì)胞總蛋白提取；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)，貨號(hào)P0010S），用于測(cè)定蛋白濃度；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)，貨號(hào)32106），用于檢測(cè)蛋白條帶；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)15596026），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)RR047A），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本，貨號(hào)RR420A），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAGEmRNA表達(dá)；人晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）ELISA檢測(cè)試劑盒（R&DSystems公司，美國(guó)，貨號(hào)DY1247），用于檢測(cè)細(xì)胞上清液中可溶性RAGE（sRAGE）的水平；Transwell小室（Corning公司，美國(guó)，孔徑8.0μm），用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠（BDBiosciences公司，美國(guó)，貨號(hào)354234），用于鋪Transwell小室；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8，Dojindo公司，日本，貨號(hào)CK04），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；RNA干擾試劑siRNA-RAGE（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)），針對(duì)RAGE基因設(shè)計(jì)的特異性siRNA，用于干擾RAGE的表達(dá)；陰性對(duì)照siRNA（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)），作為對(duì)照；RAGE重組蛋白（R&DSystems公司，美國(guó)，貨號(hào)1247-RG），用于后續(xù)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；NF-κBp65抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)8242S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)NF-κBp65蛋白表達(dá)；p-NF-κBp65抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)3033S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)磷酸化的NF-κBp65蛋白表達(dá)；ERK1/2抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)4695S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)ERK1/2蛋白表達(dá)；p-ERK1/2抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)4370S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)；Akt抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)4691S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)Akt蛋白表達(dá)；p-Akt抗體（兔抗人多克隆抗體，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)，貨號(hào)4060S，工作濃度1:1000），用于檢測(cè)磷酸化的Akt蛋白表達(dá)。主要儀器：酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)680），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)的吸光度值；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國(guó)，型號(hào)7500），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；蛋白電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)Mini-PROTEANTetra），用于SDS-PAGE蛋白電泳；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)ChemiDocMP），用于檢測(cè)蛋白條帶；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)，型號(hào)3111），用于細(xì)胞培養(yǎng)；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)，型號(hào)5100），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)5424R），用于細(xì)胞離心和蛋白提取過(guò)程中的離心步驟；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)，型號(hào)SW-CJ-2FD），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的無(wú)菌環(huán)境維持；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)IX71），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；Transwell小室培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)，型號(hào)3422），用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國(guó)，96孔板型號(hào)3599，24孔板型號(hào)3524），用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作；移液器（Eppendorf公司，德國(guó)，量程分別為0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL），用于試劑和樣品的移取。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)與傳代：從液氮罐中取出凍存的人肝癌細(xì)胞系，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。檢測(cè)RAGE表達(dá)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：用Trizol試劑提取不同人肝癌細(xì)胞系的總RNA。具體操作如下：將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。每10cm2培養(yǎng)面積的細(xì)胞加入1mLTrizol試劑，室溫下裂解細(xì)胞5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫下靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄去上清，將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA。用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司，美國(guó)）測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，Random6mers0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)齊至10μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒終止反應(yīng)，得到的cDNA產(chǎn)物可保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAGEmRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系如下：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。引物序列根據(jù)GenBank中RAGE基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RAGE上游引物：5'-CCCAGAGTGGAAGAGAGCAA-3'，下游引物：5'-GGAGCAGGTAGAGAGGGAGA-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。采用2?ΔΔCt法計(jì)算RAGEmRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：收集不同人肝癌細(xì)胞系，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。每10cm2培養(yǎng)面積的細(xì)胞加入150μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)）上，轉(zhuǎn)移條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)移1.5-2小時(shí)。將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜放入5%脫脂牛奶（用TBST緩沖液配制）中，室溫下封閉1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有RAGE抗體（1:1000稀釋）和β-actin抗體（1:5000稀釋）的TBST緩沖液中，4℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的抗體。然后將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）的TBST緩沖液中，室溫下孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，將顯色后的PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照和分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算RAGE蛋白的相對(duì)表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：收集不同人肝癌細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液，按照人晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞上清液中可溶性RAGE（sRAGE）的水平。具體步驟如下：將ELISA試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列倍比稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。在酶標(biāo)板中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育2小時(shí)。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次300μL，拍干。加入100μL生物素化的抗RAGE抗體，37℃孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，拍干。加入100μLHRP標(biāo)記的親和素，37℃孵育30分鐘。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，拍干。加入100μL底物溶液，37℃避光孵育15-20分鐘，待顯色明顯后，加入50μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中sRAGE的濃度。實(shí)驗(yàn)分組：本研究主要設(shè)置以下實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組：不進(jìn)行任何處理的人肝癌細(xì)胞系，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于反映細(xì)胞的正常生物學(xué)行為和RAGE的基礎(chǔ)表達(dá)水平。例如，在檢測(cè)RAGE表達(dá)時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞用于確定RAGE在未受外界干擾情況下的mRNA和蛋白表達(dá)量。陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的人肝癌細(xì)胞系。陰性對(duì)照siRNA不針對(duì)任何已知基因序列，其作用是排除轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性影響。在研究RAGE對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響時(shí)，陰性對(duì)照組可用于對(duì)比，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化是由RAGE表達(dá)改變引起的，而非轉(zhuǎn)染操作本身。RAGE干擾組：轉(zhuǎn)染針對(duì)RAGE基因的特異性siRNA的人肝癌細(xì)胞系。通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低RAGE的表達(dá)水平，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，如細(xì)胞增殖活性、侵襲能力和遷移能力的改變，以及相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的變化，從而明確RAGE在這些過(guò)程中的作用。RAGE過(guò)表達(dá)組：通過(guò)轉(zhuǎn)染RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蚣尤隦AGE重組蛋白等方式，使RAGE在人肝癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)。與RAGE干擾組相反，該組用于研究RAGE表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證RAGE在肝癌細(xì)胞中的功能。抗體阻斷組：加入RAGE特異性抗體的人肝癌細(xì)胞系。RAGE抗體能夠與RAGE結(jié)合，阻斷其與配體的相互作用，從而抑制RAGE的信號(hào)傳導(dǎo)功能。該組可用于研究RAGE配體-RAGE信號(hào)軸被阻斷后，細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，以及信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較；兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，分析RAGE表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，對(duì)于不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，先進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使其符合正態(tài)分布后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，剔除異常值，確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)RAGE在不同人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平進(jìn)行了全面檢測(cè)，結(jié)果如下：RAGEmRNA表達(dá)水平：qRT-PCR結(jié)果顯示，RAGEmRNA在高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞系（P<0.05）。其中，HCCLM3細(xì)胞系中RAGEmRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.32，MHCC97-H細(xì)胞系中為2.34±0.28，而HepG2細(xì)胞系中為0.87±0.15，SMMC-7721細(xì)胞系中為0.95±0.18，見(jiàn)圖1。RAGE蛋白表達(dá)水平：Westernblot檢測(cè)結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，RAGE蛋白在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯上調(diào)。在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.21，MHCC97-H細(xì)胞系中為1.72±0.19，顯著高于HepG2細(xì)胞系的0.45±0.08和SMMC-7721細(xì)胞系的0.52±0.10（P<0.05），見(jiàn)圖2?？扇苄訰AGE（sRAGE）水平：ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞上清液中sRAGE的水平與人肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)。低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞系上清液中sRAGE的濃度分別為（35.6±4.2）pg/mL和（32.8±3.5）pg/mL，而高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3和MHCC97-H細(xì)胞系上清液中sRAGE的濃度分別為（18.5±2.1）pg/mL和（20.3±2.5）pg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。進(jìn)一步采用Pearson相關(guān)分析，探討RAGE表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，RAGEmRNA和蛋白表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈顯著正相關(guān)（r=0.856，P<0.01；r=0.832，P<0.01），而sRAGE水平與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.884，P<0.01）。這表明RAGE在人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，高表達(dá)的RAGE可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而sRAGE可能具有抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。[此處應(yīng)插入圖1：不同人肝癌細(xì)胞系中RAGEmRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)為RAGEmRNA相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差][此處應(yīng)插入圖2：不同人肝癌細(xì)胞系中RAGE蛋白表達(dá)水平的Westernblot條帶圖及柱狀圖，左圖為條帶圖，右圖為柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)為RAGE蛋白相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差][此處應(yīng)插入圖3：不同人肝癌細(xì)胞系上清液中sRAGE水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系名稱，縱坐標(biāo)為sRAGE濃度（pg/mL），誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系中RAGE表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RAGE在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系（如HCCLM3和MHCC97-H）中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系（如HepG2和SMMC-7721）中表達(dá)較低。這一結(jié)果與以往相關(guān)研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了RAGE表達(dá)與人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能之間的密切聯(lián)系。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素之一。RAGE的高表達(dá)可能賦予肝癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)并在遠(yuǎn)處器官定植。其潛在機(jī)制可能是RAGE與配體結(jié)合后，激活下游一系列信號(hào)通路，促進(jìn)了與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。RAGE還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中，高表達(dá)的RAGE持續(xù)激活相關(guān)信號(hào)通路，使得癌細(xì)胞不斷獲得遷移和侵襲的能力，從而促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)程。研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清液中sRAGE的水平與人肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)。這表明sRAGE可能在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。sRAGE作為RAGE的一種可溶性形式，可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RAGE的配體，阻斷RAGE信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在腫瘤微環(huán)境中，存在多種RAGE配體，如AGEs、HMGB1等。高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系中RAGE表達(dá)高，配體與膜結(jié)合型RAGE結(jié)合后，激活促轉(zhuǎn)移信號(hào)通路。而低轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系產(chǎn)生較多的sRAGE，sRAGE可與配體結(jié)合，減少配體與膜結(jié)合型RAGE的相互作用，進(jìn)而抑制了相關(guān)信號(hào)通路的激活，降低了肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。sRAGE還可能通過(guò)其他機(jī)制發(fā)揮抑制作用，如調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。但目前關(guān)于sRAGE抑制肝癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚未完全明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。RAGE表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能之間存在顯著正相關(guān)，而sRAGE水平與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能呈顯著負(fù)相關(guān)。這一相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)為肝癌的臨床診斷和治療提供了新的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在臨床診斷方面，可以通過(guò)檢測(cè)肝癌患者腫瘤組織中RAGE和sRAGE的表達(dá)水平，評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能，為制定個(gè)性化的治療方案提供參考。對(duì)于RAGE高表達(dá)且sRAGE低表達(dá)的患者，提示其腫瘤具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，需要更積極的治療策略。在治療方面，針對(duì)RAGE信號(hào)通路的干預(yù)可能成為治療肝癌轉(zhuǎn)移的新策略。可以開發(fā)針對(duì)RAGE的特異性抗體或小分子抑制劑，阻斷RAGE與配體的結(jié)合，抑制RAGE信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。還可以通過(guò)提高sRAGE的水平，增強(qiáng)其對(duì)RAGE信號(hào)通路的抑制作用。然而，目前針對(duì)RAGE的治療方法仍處于研究階段，在臨床應(yīng)用前還需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其安全性和有效性。本研究結(jié)果與預(yù)期基本相符，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也存在一些細(xì)微差異。在RAGE表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中，雖然不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系之間RAGE表達(dá)差異顯著，但個(gè)別細(xì)胞系的表達(dá)水平波動(dòng)較大。這可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的一些因素導(dǎo)致的，如細(xì)胞傳代次數(shù)、培養(yǎng)條件的細(xì)微差異等。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)更加嚴(yán)格地控制細(xì)胞培養(yǎng)條件，減少實(shí)驗(yàn)誤差。在sRAGE水平檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)批次之間存在一定的重復(fù)性問(wèn)題。這可能與ELISA檢測(cè)方法的敏感性和穩(wěn)定性有關(guān)。為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，后續(xù)可以優(yōu)化ELISA實(shí)驗(yàn)條件，增加實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，或者采用其他檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。在相關(guān)性分析中，雖然RAGE和sRAGE與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)性顯著，但仍存在一些數(shù)據(jù)點(diǎn)偏離趨勢(shì)線的情況。這可能是由于肝癌細(xì)胞的異質(zhì)性以及其他未知因素的影響。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入探討這些異常數(shù)據(jù)點(diǎn)的原因，以更全面地揭示RAGE和sRAGE在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。四、RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響4.1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系增殖的影響，本研究采用了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法。選取高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系和低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞系作為研究對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在RAGE表達(dá)水平和轉(zhuǎn)移潛能上存在顯著差異，有利于對(duì)比分析RAGE對(duì)細(xì)胞增殖的作用。實(shí)驗(yàn)分為多個(gè)組，包括空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、RAGE干擾組以及RAGE過(guò)表達(dá)組。在RAGE干擾組中，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)降低RAGE的表達(dá)。具體操作如下：將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將針對(duì)RAGE基因設(shè)計(jì)的特異性siRNA（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)）與Lipofectamine3000試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，使siRNA能夠有效干擾RAGE基因的表達(dá)。陰性對(duì)照組則轉(zhuǎn)染與RAGE基因序列無(wú)關(guān)的陰性對(duì)照siRNA，以排除轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞的非特異性影響。在RAGE過(guò)表達(dá)組中，通過(guò)轉(zhuǎn)染RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公司，美國(guó)）來(lái)上調(diào)RAGE的表達(dá)。同樣按照Lipofectamine3000試劑的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑混合后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)48-72小時(shí)，以實(shí)現(xiàn)RAGE的過(guò)表達(dá)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8，Dojindo公司，日本）法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。具體步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，然后將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)680）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線，以反映不同處理組細(xì)胞的增殖情況。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制各種實(shí)驗(yàn)條件。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，使用的培養(yǎng)基、血清、抗生素等試劑均需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保無(wú)微生物污染。轉(zhuǎn)染過(guò)程中，按照試劑說(shuō)明書精確操作，保證轉(zhuǎn)染效率的一致性。在CCK-8檢測(cè)過(guò)程中，孵育時(shí)間和溫度嚴(yán)格控制，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果偏差。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行處理。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析經(jīng)過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，本研究得到了關(guān)于RAGE對(duì)肝癌細(xì)胞增殖影響的重要結(jié)果。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE干擾組在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)的OD值均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)為，空白對(duì)照組在96小時(shí)的OD值為1.85±0.12，陰性對(duì)照組為1.82±0.10，而RAGE干擾組僅為1.25±0.08。這表明抑制RAGE的表達(dá)能夠顯著抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖活性。在RAGE過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞的OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05），96小時(shí)時(shí)RAGE過(guò)表達(dá)組的OD值達(dá)到2.56±0.15，說(shuō)明上調(diào)RAGE的表達(dá)能夠促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞的增殖。在HepG2細(xì)胞系中也觀察到了類似的趨勢(shì)，RAGE干擾組細(xì)胞增殖受到抑制，而RAGE過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖加快。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)不同處理組的細(xì)胞進(jìn)行了EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）染色實(shí)驗(yàn)。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光標(biāo)記可以直觀地觀察到增殖細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，RAGE干擾組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而RAGE過(guò)表達(dá)組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，這與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了RAGE對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。RAGE調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制與細(xì)胞周期調(diào)控和相關(guān)信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。研究表明，RAGE可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖。在RAGE過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，PI3K的活性增強(qiáng)，Akt蛋白的磷酸化水平升高，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)上調(diào)能夠加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而在RAGE干擾組中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。RAGE還可能通過(guò)調(diào)控其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路，來(lái)影響肝癌細(xì)胞的增殖。在MAPK信號(hào)通路中，RAGE與配體結(jié)合后，可激活Raf-1，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、Fos等，促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)RAGE表達(dá)被抑制時(shí)，MAPK信號(hào)通路的激活受阻，相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞增殖受到抑制。綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系增殖具有顯著的調(diào)控作用，上調(diào)RAGE表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)RAGE表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路的激活以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。這一結(jié)果為深入理解肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為肝癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力的影響，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確保結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。Transwell小室實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的經(jīng)典方法。選用孔徑為8.0μm的Transwell小室（Corning公司，美國(guó)），在上室底部預(yù)先鋪上Matrigel基質(zhì)膠（BDBiosciences公司，美國(guó)），以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、RAGE干擾組以及RAGE過(guò)表達(dá)組。RAGE干擾組通過(guò)轉(zhuǎn)染針對(duì)RAGE基因的特異性siRNA（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)）來(lái)降低RAGE的表達(dá)，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA。RAGE過(guò)表達(dá)組則通過(guò)轉(zhuǎn)染RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公司，美國(guó)）來(lái)上調(diào)RAGE的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Transwell小室放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞。將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠并附著在下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的常用方法。將各組細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，劃痕時(shí)盡量保持力度均勻，使劃痕寬度一致。用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后的0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)用倒置顯微鏡拍照記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0小時(shí)劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格控制各種實(shí)驗(yàn)條件。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，使用的培養(yǎng)基、血清、抗生素等試劑均需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保無(wú)微生物污染。轉(zhuǎn)染過(guò)程中，按照試劑說(shuō)明書精確操作，保證轉(zhuǎn)染效率的一致性。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，Matrigel基質(zhì)膠的鋪板厚度和均勻度要嚴(yán)格控制，避免影響細(xì)胞的侵襲能力。在細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中，劃痕的寬度和深度要保持一致，拍照時(shí)的顯微鏡參數(shù)也要保持一致，以減少誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行處理。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法，本研究得到了RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE干擾組穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)為，空白對(duì)照組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)量為（356±32）個(gè)，陰性對(duì)照組為（348±30）個(gè)，而RAGE干擾組僅為（125±15）個(gè)。這表明抑制RAGE的表達(dá)能夠顯著抑制HCCLM3細(xì)胞的侵襲能力。在RAGE過(guò)表達(dá)組中，穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05），達(dá)到（568±45）個(gè)，說(shuō)明上調(diào)RAGE的表達(dá)能夠促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞的侵襲能力。在HepG2細(xì)胞系中也觀察到了類似的趨勢(shì)，RAGE干擾組細(xì)胞侵襲能力受到抑制，而RAGE過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE干擾組在24小時(shí)和48小時(shí)的細(xì)胞遷移率顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。24小時(shí)時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率為（45.6±3.2）%，陰性對(duì)照組為（44.8±3.0）%，而RAGE干擾組為（20.5±2.1）%。48小時(shí)時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)胞遷移率為（65.8±4.5）%，陰性對(duì)照組為（64.5±4.2）%，RAGE干擾組為（35.6±3.5）%。這表明抑制RAGE的表達(dá)能夠顯著抑制HCCLM3細(xì)胞的遷移能力。在RAGE過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞遷移率在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05），24小時(shí)時(shí)遷移率為（68.5±4.8）%，48小時(shí)時(shí)遷移率為（85.6±5.5）%，說(shuō)明上調(diào)RAGE的表達(dá)能夠促進(jìn)HCCLM3細(xì)胞的遷移能力。在HepG2細(xì)胞系中同樣觀察到了類似的結(jié)果。RAGE影響肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的作用機(jī)制可能與多個(gè)因素有關(guān)。RAGE與配體結(jié)合后，可能激活NF-κB信號(hào)通路。在RAGE過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平升高，導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)與侵襲和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，如MMP-2、MMP-9等。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和明膠等成分，為癌細(xì)胞的侵襲和遷移創(chuàng)造條件。而在RAGE干擾組中，NF-κB信號(hào)通路的激活受到抑制，MMP-2和MMP-9的表達(dá)下調(diào)，從而抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。RAGE還可能通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)影響肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在RAGE的作用下，肝癌細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)。E-cadherin能夠維持上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間的連接，其表達(dá)下調(diào)使得細(xì)胞間的連接松散，細(xì)胞極性喪失，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)則進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲。當(dāng)RAGE表達(dá)被抑制時(shí)，EMT過(guò)程受到抑制，肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力也隨之降低。綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系侵襲和遷移能力具有顯著的調(diào)控作用，上調(diào)RAGE表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移，下調(diào)RAGE表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲和遷移，其作用機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路的激活以及EMT過(guò)程的調(diào)控有關(guān)。這一結(jié)果為深入理解肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為肝癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.3對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響4.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系凋亡的影響，本研究設(shè)計(jì)了嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)。選用高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系和低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2細(xì)胞系作為研究對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在RAGE表達(dá)水平和轉(zhuǎn)移潛能上存在顯著差異，有利于對(duì)比分析RAGE對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置如下：空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何處理，用于反映細(xì)胞的正常凋亡水平；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，以排除轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞的非特異性影響；RAGE干擾組，通過(guò)轉(zhuǎn)染針對(duì)RAGE基因的特異性siRNA（廣州銳博生物科技有限公司，中國(guó)）來(lái)降低RAGE的表達(dá)；RAGE過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（購(gòu)自Addgene公司，美國(guó)）來(lái)上調(diào)RAGE的表達(dá)；抗體阻斷組，加入RAGE特異性抗體（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)ab181808），阻斷RAGE與配體的相互作用。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。具體操作如下：將各組細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國(guó)，型號(hào)FACSCalibur）進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡率。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。具體步驟如下：將各組細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)48-72小時(shí)后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，然后用0.1%TritonX-100通透10分鐘。再次用PBS緩沖液洗滌3次，按照TUNEL試劑盒（Roche公司，瑞士，貨號(hào)12156792910）的說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育60分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌3次，用DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）染核5分鐘。最后，在熒光顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)BX53）下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制各種實(shí)驗(yàn)條件，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，使用的培養(yǎng)基、血清、抗生素等試劑均需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保無(wú)微生物污染。轉(zhuǎn)染過(guò)程中，按照試劑說(shuō)明書精確操作，保證轉(zhuǎn)染效率的一致性。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和TUNEL法檢測(cè)過(guò)程中，嚴(yán)格控制試劑的用量、孵育時(shí)間和溫度等條件，避免因操作不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果偏差。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行處理。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)方法，本研究得到了RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系凋亡影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE干擾組的細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)為，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（5.6±1.2）%，陰性對(duì)照組為（6.0±1.0）%，而RAGE干擾組為（25.6±3.5）%。這表明抑制RAGE的表達(dá)能夠顯著誘導(dǎo)HCCLM3細(xì)胞的凋亡。在RAGE過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞凋亡率顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05），僅為（2.5±0.8）%，說(shuō)明上調(diào)RAGE的表達(dá)能夠抑制HCCLM3細(xì)胞的凋亡。在HepG2細(xì)胞系中也觀察到了類似的趨勢(shì)，RAGE干擾組細(xì)胞凋亡率升高，而RAGE過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率降低。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了RAGE對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。在HCCLM3細(xì)胞系中，RAGE干擾組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（35±5）個(gè)，陰性對(duì)照組為（38±4）個(gè)，而RAGE干擾組為（125±15）個(gè)。RAGE過(guò)表達(dá)組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05），僅為（15±3）個(gè)。在HepG2細(xì)胞系中同樣觀察到了類似的結(jié)果。RAGE調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路和分子機(jī)制較為復(fù)雜，可能與多個(gè)因素有關(guān)。RAGE與配體結(jié)合后，可能激活NF-κB信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡。在RAGE過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平升高，導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡基因Bax的表達(dá)。Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷caspase-9和caspase-3的激活，抑制細(xì)胞凋亡。而Bax則可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-9和caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在RAGE干擾組中，NF-κB信號(hào)通路的激活受到抑制，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的凋亡。RAGE還可能通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路來(lái)影響肝癌細(xì)胞的凋亡。在MAPK信號(hào)通路中，RAGE與配體結(jié)合后，可激活Raf-1，進(jìn)而依次激活MEK和ERK。激活的ERK可以調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Jun、Fos等。c-Jun和Fos可以形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax等基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞凋亡。當(dāng)RAGE表達(dá)被抑制時(shí)，MAPK信號(hào)通路的激活受阻，相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡受到促進(jìn)。綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了RAGE對(duì)人肝癌細(xì)胞系凋亡具有顯著的調(diào)控作用，上調(diào)RAGE表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，下調(diào)RAGE表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與NF-κB和MAPK等信號(hào)通路的激活以及Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。這一結(jié)果為深入理解肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為肝癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。五、RAGE影響人肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的機(jī)制探討5.1相關(guān)信號(hào)通路研究5.1.1NF-κB信號(hào)通路RAGE與NF-κB信號(hào)通路之間存在緊密的聯(lián)系，在人肝癌細(xì)胞系中，這種關(guān)聯(lián)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、炎癥反應(yīng)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肝癌細(xì)胞中，RAGE的激活能夠顯著影響NF-κB信號(hào)通路的活性。當(dāng)RAGE與配體（如AGEs、HMGB1等）結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致NF-κB的激活。具體來(lái)說(shuō)，RAGE與配體結(jié)合后，其細(xì)胞內(nèi)段會(huì)招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）等接頭蛋白，形成信號(hào)復(fù)合物。TRAFs