ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的關(guān)鍵作用與調(diào)控機(jī)制深度剖析一、引言1.1研究背景與意義肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，HCC的發(fā)病率和死亡率均位居前列，其在我國(guó)的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，發(fā)病率和病死率分別高居第4位和第3位。HCC具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、預(yù)后差且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，5年生存率較低。目前，HCC的診斷手段存在一定局限性，對(duì)于早期小腫瘤容易遺漏，而傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)切除、化療、放療等，療效往往欠佳，患者的總體生存質(zhì)量和生存期難以得到有效改善。因此，深入探究HCC的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，具有迫切的臨床需求和重要的現(xiàn)實(shí)意義。非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，近年來(lái)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。雖然ncRNA不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育以及疾病發(fā)生發(fā)展等諸多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與HCC相關(guān)的ncRNA主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circularRNA，circRNA）等。miRNA通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，參與HCC的腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)過(guò)程。lncRNA分子長(zhǎng)度大于200bp，可通過(guò)與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，影響HCC的發(fā)生發(fā)展。circRNA是一類具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的ncRNA，其穩(wěn)定性高，可通過(guò)吸附miRNA、與蛋白質(zhì)相互作用等方式參與基因表達(dá)調(diào)控，在HCC中同樣發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。ncRNAp26302作為一種特定的非編碼RNA，其在肝細(xì)胞癌中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。研究ncRNAp26302有望揭示其在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制，為HCC的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)，從而提高HCC患者的生存率和生存質(zhì)量，具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，ncRNA在腫瘤研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)ncRNA與肝細(xì)胞癌的關(guān)系展開(kāi)了大量研究。在miRNA方面，眾多研究表明其在HCC的發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-21在HCC組織中顯著高表達(dá)，通過(guò)靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。國(guó)外研究也指出，miR-122在HCC中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)，miR-122可通過(guò)調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞增殖、代謝相關(guān)的靶基因，影響HCC的生物學(xué)行為。對(duì)于lncRNA，研究同樣揭示了其在HCC中的重要作用。例如，國(guó)內(nèi)科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)lncRNAHOTAIR在HCC組織中高表達(dá)，其可通過(guò)招募多梳蛋白復(fù)合體2（PRC2），對(duì)靶基因進(jìn)行組蛋白甲基化修飾，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。國(guó)外研究表明，lncRNAMALAT1參與HCC的耐藥過(guò)程，通過(guò)與相關(guān)蛋白相互作用，影響藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。circRNA在HCC中的研究也取得了一定進(jìn)展。有國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，circRNA_0001649在HCC組織中低表達(dá)，其通過(guò)吸附miR-17，解除miR-17對(duì)靶基因PTEN的抑制作用，發(fā)揮抑癌作用，抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)circRNA_100290在HCC中高表達(dá)，可作為ceRNA與miR-141相互作用，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)HCC的進(jìn)展。然而，針對(duì)ncRNAp26302的研究，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道極少。僅有少數(shù)初步研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)ncRNAp26302可能在某些生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，但尚未見(jiàn)其在肝細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機(jī)制的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)模式、具體生物學(xué)功能以及參與的分子信號(hào)通路等方面仍處于未知狀態(tài)，亟待深入探究。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究方法細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）和正常肝細(xì)胞系（如LO2），通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)或下調(diào)ncRNAp26302的表達(dá)水平。運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力；利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況。此外，還可通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，初步探究ncRNAp26302對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及潛在分子機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建裸鼠肝癌移植瘤模型，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ncRNAp26302過(guò)表達(dá)或干擾載體的肝癌細(xì)胞接種到裸鼠皮下，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積和重量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)分析，包括蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織形態(tài)，免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)增殖標(biāo)志物Ki-67、凋亡相關(guān)蛋白等的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證ncRNAp26302在體內(nèi)對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響。同時(shí)，可構(gòu)建尾靜脈注射肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型，觀察ncRNAp26302對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用。生物信息學(xué)分析：從公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如TCGA、GEO等）中下載肝細(xì)胞癌相關(guān)的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出ncRNAp26302在肝癌組織和正常組織中的差異表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分期、轉(zhuǎn)移情況、患者生存期等）之間的相關(guān)性。運(yùn)用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)ncRNAp26302可能的靶基因和潛在的作用信號(hào)通路，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：采用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)ncRNAp26302在肝癌細(xì)胞系、肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)水平，驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，并對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的樣本進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。通過(guò)RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)和RNApull-down實(shí)驗(yàn)，探究ncRNAp26302與相關(guān)蛋白或其他RNA分子（如miRNA、mRNA）之間的相互作用關(guān)系，明確其在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，驗(yàn)證ncRNAp26302與靶基因之間的靶向結(jié)合關(guān)系。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)研究視角創(chuàng)新：目前針對(duì)肝細(xì)胞癌的研究主要集中在常見(jiàn)的ncRNA（如miRNA、lncRNA、circRNA）上，而對(duì)ncRNAp26302這種相對(duì)新穎的非編碼RNA在肝細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制研究幾乎空白。本研究首次聚焦于ncRNAp26302，為揭示肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了全新的視角，有望發(fā)現(xiàn)新的分子調(diào)控機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。多組學(xué)聯(lián)合分析創(chuàng)新：綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)ncRNAp26302的潛在作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，再利用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)從大數(shù)據(jù)挖掘到功能驗(yàn)證的全面研究，這種多組學(xué)聯(lián)合的研究方法能夠更系統(tǒng)、深入地探究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。實(shí)驗(yàn)技術(shù)組合創(chuàng)新：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，創(chuàng)新性地組合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)。例如，在探究ncRNAp26302與其他分子的相互作用時(shí)，聯(lián)合使用RIP實(shí)驗(yàn)和RNApull-down實(shí)驗(yàn)，相較于單一技術(shù)，能夠更全面、準(zhǔn)確地鑒定與ncRNAp26302相互作用的分子；在細(xì)胞功能研究中，結(jié)合EdU實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)，從不同角度更精確地分析細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期變化，為研究ncRNAp26302對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供更豐富、可靠的數(shù)據(jù)支持。二、肝細(xì)胞癌概述2.1肝細(xì)胞癌的發(fā)病現(xiàn)狀與趨勢(shì)肝細(xì)胞癌在全球范圍內(nèi)均有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌是全球發(fā)病率第六位（905,677例，占4.6%）、死亡率第三位（830,180例，占8.3%）的癌癥。其中，肝細(xì)胞癌作為原發(fā)性肝癌的主要病理類型，約占比85%-90%。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，人口僅占全球的18.4%，但每年肝癌新發(fā)病例和死亡病例卻達(dá)到全球的半數(shù)以上，面臨著巨大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，肝癌是第4位常見(jiàn)惡性腫瘤和第2位腫瘤致死病因，2020年原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，新增41萬(wàn)例；死亡率居第2位，死亡39.1萬(wàn)例。2018年，上海市浦東新區(qū)肝癌發(fā)病率為27.97/10萬(wàn)，在惡性腫瘤發(fā)病率中排名第七；死亡率為21.90/10萬(wàn)，在惡性腫瘤死亡率中排名第四。從發(fā)病趨勢(shì)來(lái)看，全球肝細(xì)胞癌的發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)。這可能與多種因素有關(guān)，如病毒性肝炎（尤其是乙型肝炎病毒HBV和丙型肝炎病毒HCV感染）的流行、黃曲霉毒素污染食物的攝入、飲酒、肥胖和糖尿病等代謝綜合征的增加以及人口老齡化等。在我國(guó)，雖然近年來(lái)隨著乙肝疫苗的廣泛接種，HBV相關(guān)肝癌的發(fā)病率在一定程度上得到了控制，但由于過(guò)去HBV感染基數(shù)大，且HCV感染、非酒精性脂肪性肝病等危險(xiǎn)因素的不斷增加，肝癌的發(fā)病形勢(shì)依然嚴(yán)峻。此外，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和診斷水平的提高，更多的肝癌病例被發(fā)現(xiàn)，這也在一定程度上影響了發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。在未來(lái)，預(yù)計(jì)肝細(xì)胞癌的發(fā)病率仍將維持在較高水平，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。因此，加強(qiáng)對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究，尋找有效的預(yù)防、診斷和治療方法，對(duì)于降低肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生存質(zhì)量和生存期具有重要意義。二、肝細(xì)胞癌概述2.2肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制2.2.1病毒感染與肝細(xì)胞癌乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，全球約80%的HCC歸因于HBV或HCV感染。在我國(guó)，HBV感染相關(guān)的HCC占比高達(dá)80%-90%。HBV是一種雙鏈DNA病毒，其感染肝細(xì)胞后，病毒DNA可整合到宿主基因組中，導(dǎo)致宿主基因的突變、缺失或重排，從而激活癌基因或抑制抑癌基因的表達(dá)。例如，HBVX蛋白（HBx）能夠激活多種細(xì)胞信號(hào)通路，如NF-κB、MAPK等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。HBx還可與p53等抑癌蛋白相互作用，使其功能失活，削弱細(xì)胞的抑癌能力。此外，HBV感染引發(fā)的持續(xù)肝臟炎癥和免疫反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞反復(fù)損傷和再生，增加了基因突變的概率，進(jìn)一步促進(jìn)了HCC的發(fā)生。HCV是一種單鏈RNA病毒，雖然其基因組不會(huì)直接整合到宿主基因組中，但HCV感染會(huì)引起慢性炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和纖維化，最終發(fā)展為肝硬化和HCC。HCV的核心蛋白能夠干擾細(xì)胞的正常代謝和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。該蛋白可以與p53、Rb等抑癌蛋白結(jié)合，抑制其功能，還能激活PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。HCV感染還會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加，ROS可損傷DNA，引起基因突變，從而促進(jìn)HCC的發(fā)生。2.2.2代謝異常與肝細(xì)胞癌肥胖、糖尿病等代謝異常與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。肥胖是指體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多，體重超過(guò)正常范圍的一種狀態(tài)，肥胖人群患HCC的風(fēng)險(xiǎn)比正常體重人群高出2-3倍。肥胖導(dǎo)致HCC發(fā)生的機(jī)制較為復(fù)雜，一方面，肥胖會(huì)引起脂肪組織分泌多種脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等，這些脂肪因子失衡會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，使肝臟處于高胰島素血癥狀態(tài)。胰島素可通過(guò)激活PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。另一方面，肥胖引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)會(huì)促使肝臟產(chǎn)生炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生損傷和惡變。糖尿病作為一種常見(jiàn)的代謝性疾病，其患者患HCC的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加。糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂，產(chǎn)生過(guò)多的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）。AGEs可與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和DNA損傷，進(jìn)而增加HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病患者常伴有肥胖、高血壓等代謝綜合征，這些因素共同作用，加速了肝纖維化和肝硬化的進(jìn)程，進(jìn)一步促進(jìn)了HCC的發(fā)生。2.2.3其他因素與肝細(xì)胞癌飲酒是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一。酒精進(jìn)入人體后，主要在肝臟進(jìn)行代謝，其代謝產(chǎn)物乙醛具有細(xì)胞毒性，可直接損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)引起酒精性脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎、肝硬化，最終增加HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。酒精還能誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）的表達(dá)，CYP2E1可將酒精代謝為毒性更強(qiáng)的自由基，進(jìn)一步加重肝臟損傷和氧化應(yīng)激，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)。AFB1主要污染糧油及其制品，如玉米、花生、大米等。人類攝入被AFB1污染的食物后，AFB1在肝臟中經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450酶系的代謝活化，形成具有強(qiáng)親電性的環(huán)氧化物，該環(huán)氧化物可與DNA分子中的鳥(niǎo)嘌呤堿基結(jié)合，形成AFB1-DNA加合物。這種加合物會(huì)導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，特別是對(duì)p53基因等抑癌基因的損傷，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。流行病學(xué)研究表明，在AFB1污染嚴(yán)重的地區(qū)，HCC的發(fā)病率明顯升高。2.3肝細(xì)胞癌的診斷與治療現(xiàn)狀2.3.1肝細(xì)胞癌的診斷方法血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)是肝細(xì)胞癌（HCC）診斷的重要手段之一，其中甲胎蛋白（AFP）是應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)志物。AFP是一種糖蛋白，主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成，在成人血清中含量極低，但在HCC患者中，由于肝癌細(xì)胞的異常增殖，AFP的合成和分泌顯著增加。臨床上，通常將AFP≥400μg/L，持續(xù)4周，或AFP≥200μg/L，持續(xù)8周，并排除妊娠、活動(dòng)性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤等其他因素后，作為診斷HCC的重要依據(jù)。然而，AFP的診斷敏感性和特異性存在一定局限性，約30%-40%的HCC患者AFP水平并不升高，且在一些良性肝臟疾病如肝炎、肝硬化等中，AFP也可能出現(xiàn)不同程度的升高，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。為了提高診斷的準(zhǔn)確性，臨床上常聯(lián)合檢測(cè)其他血清學(xué)標(biāo)志物，如異常凝血酶原（PIVKA-II）、高爾基體蛋白73（GP73）等。PIVKA-II是一種維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導(dǎo)的蛋白，在HCC患者中，由于肝癌細(xì)胞的異常凝血功能，PIVKA-II的水平明顯升高。研究表明，PIVKA-II診斷HCC的敏感性和特異性與AFP相當(dāng)，且兩者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高診斷效能。GP73是一種高爾基體跨膜蛋白，在HCC組織中高表達(dá)，其診斷HCC的敏感性和特異性也較高，與AFP聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高早期HCC的診斷率。影像學(xué)檢查在HCC的診斷中也起著至關(guān)重要的作用。超聲檢查（US）具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是HCC篩查和診斷的首選方法。通過(guò)超聲檢查，可以觀察肝臟的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)以及腫瘤的位置、大小、形態(tài)、回聲等特征，初步判斷肝臟是否存在占位性病變。對(duì)于直徑較小的肝癌，超聲檢查的診斷準(zhǔn)確性相對(duì)較低，但隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，如彩色多普勒超聲、超聲造影等的應(yīng)用，顯著提高了對(duì)小肝癌的診斷能力。彩色多普勒超聲可以觀察腫瘤的血流情況，判斷腫瘤的良惡性；超聲造影則是通過(guò)注射造影劑，增強(qiáng)腫瘤與周圍組織的對(duì)比，更清晰地顯示腫瘤的邊界、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和血流灌注情況，提高對(duì)微小肝癌的檢出率。CT檢查是HCC診斷和分期的重要影像學(xué)方法，具有較高的分辨率和準(zhǔn)確性。CT平掃可以發(fā)現(xiàn)肝臟的低密度或等密度占位性病變，增強(qiáng)CT掃描則可以觀察腫瘤在動(dòng)脈期、門(mén)靜脈期和延遲期的強(qiáng)化特征，有助于HCC的診斷和鑒別診斷。HCC在增強(qiáng)CT掃描中通常表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”的強(qiáng)化模式，即動(dòng)脈期腫瘤明顯強(qiáng)化，門(mén)靜脈期和延遲期強(qiáng)化程度迅速下降，低于周圍正常肝組織。MRI檢查對(duì)軟組織的分辨力較高，在HCC的診斷中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。MRI可以多方位、多序列成像，能夠更清晰地顯示腫瘤的位置、大小、形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及與周圍組織的關(guān)系。在MRI上，HCC通常表現(xiàn)為T(mén)1WI低信號(hào)、T2WI高信號(hào)，增強(qiáng)掃描后同樣呈現(xiàn)“快進(jìn)快出”的強(qiáng)化特點(diǎn)。此外，MRI還可以檢測(cè)腫瘤內(nèi)的脂肪成分、出血、壞死等情況，對(duì)于一些特殊類型的HCC，如脂肪性肝癌、纖維板層型肝癌等，MRI的診斷價(jià)值更高。2.3.2肝細(xì)胞癌的治療手段手術(shù)治療是HCC最重要的治療方法，包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)適用于早期HCC患者，特別是單個(gè)腫瘤直徑≤5cm，或腫瘤數(shù)目不超過(guò)3個(gè)且最大直徑≤3cm，無(wú)血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移的患者。肝切除術(shù)的目的是完整切除腫瘤組織，保留足夠的正常肝組織，以維持肝臟的正常功能。根據(jù)腫瘤的位置和大小，可選擇不同的肝切除方式，如解剖性肝切除和非解剖性肝切除。解剖性肝切除是按照肝臟的解剖結(jié)構(gòu)，切除腫瘤所在的肝段或肝葉，能夠更徹底地清除腫瘤組織，減少術(shù)后復(fù)發(fā)，但手術(shù)難度較大，對(duì)患者的肝功能要求較高。非解剖性肝切除則是根據(jù)腫瘤的實(shí)際情況，切除腫瘤及其周圍一定范圍的肝組織，手術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)肝功能的影響較小，但術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高。肝移植術(shù)是治療HCC合并肝硬化的有效方法，適用于符合米蘭標(biāo)準(zhǔn)（單個(gè)腫瘤直徑≤5cm，或腫瘤數(shù)目不超過(guò)3個(gè)且最大直徑≤3cm，無(wú)血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移）的患者。肝移植術(shù)不僅可以切除腫瘤組織，還可以替換病變的肝臟，從根本上解決肝臟功能障礙和肝硬化問(wèn)題，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，肝移植術(shù)面臨著供體短缺、手術(shù)費(fèi)用高昂、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。局部消融治療是一種微創(chuàng)治療方法，適用于早期HCC患者，特別是腫瘤直徑≤3cm，或因各種原因無(wú)法耐受手術(shù)切除的患者。常見(jiàn)的局部消融治療方法包括射頻消融（RFA）、微波消融（MWA）、冷凍消融等。RFA是通過(guò)射頻電流產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，達(dá)到治療目的。RFA具有操作簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于直徑≤2cm的小肝癌，RFA的療效與手術(shù)切除相當(dāng)。MWA則是利用微波的熱效應(yīng)使腫瘤組織壞死，與RFA相比，MWA的消融范圍更大，消融時(shí)間更短，對(duì)于直徑較大的腫瘤具有一定優(yōu)勢(shì)。冷凍消融是通過(guò)極低的溫度使腫瘤組織冷凍壞死，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)周圍組織的損傷較小，術(shù)后并發(fā)癥相對(duì)較少。局部消融治療的總體療效較好，但對(duì)于腫瘤位置特殊、靠近大血管或膽管等重要結(jié)構(gòu)的患者，可能存在消融不徹底或損傷周圍組織的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）是中晚期HCC的主要治療方法之一，適用于無(wú)法手術(shù)切除、肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B級(jí)、無(wú)肝外轉(zhuǎn)移的患者。TACE的原理是通過(guò)將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤的供血?jiǎng)用}，使腫瘤組織缺血缺氧壞死，同時(shí)化療藥物在腫瘤局部緩慢釋放，發(fā)揮抗腫瘤作用。TACE可以有效地控制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生存期，但TACE并不能完全治愈HCC，且多次TACE治療后可能會(huì)導(dǎo)致肝功能損害、腫瘤耐藥等問(wèn)題。全身治療主要用于晚期HCC患者，包括分子靶向治療和免疫治療。分子靶向治療藥物如索拉非尼、侖伐替尼等，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和信號(hào)傳導(dǎo)等途徑，發(fā)揮抗腫瘤作用。索拉非尼是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于晚期HCC治療的分子靶向藥物，多項(xiàng)臨床研究表明，索拉非尼可以顯著延長(zhǎng)晚期HCC患者的生存期。侖伐替尼在與索拉非尼的頭對(duì)頭比較研究中，顯示出了非劣效性，且在某些方面具有更好的療效。免疫治療藥物如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑、程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑等，通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。目前，免疫治療在晚期HCC的治療中取得了顯著進(jìn)展，與分子靶向治療或其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用，可進(jìn)一步提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，全身治療也存在一定的不良反應(yīng)，如免疫相關(guān)不良反應(yīng)、靶向藥物的耐藥性等，需要密切監(jiān)測(cè)和管理。三、ncRNAp26302概述3.1ncRNA的分類與功能非編碼RNA（ncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)發(fā)揮著廣泛而重要的生物學(xué)功能。根據(jù)長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)和功能的不同，ncRNA可以分為多種類型，其中較為常見(jiàn)且研究較為深入的包括微小RNA（miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）、小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA）等。miRNA是長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，主要通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。這種調(diào)控作用主要表現(xiàn)為兩種方式：一是當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可直接導(dǎo)致靶mRNA的降解；二是當(dāng)miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程。miRNA參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，在疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肝細(xì)胞癌中，miR-21通過(guò)靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。而miR-122在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，miR-122可通過(guò)調(diào)控多個(gè)與細(xì)胞增殖、代謝相關(guān)的靶基因，影響肝癌的生物學(xué)行為。lncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，作用機(jī)制復(fù)雜多樣。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可以通過(guò)與DNA形成三鏈結(jié)構(gòu)，或者招募轉(zhuǎn)錄因子等方式，影響基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。例如，某些lncRNA可以與啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA可以通過(guò)與mRNA相互作用，影響mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性和翻譯等過(guò)程。如一些lncRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA），通過(guò)吸附miRNA，解除miRNA對(duì)靶mRNA的抑制作用，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。在表觀遺傳水平，lncRNA能夠招募表觀遺傳修飾相關(guān)的蛋白復(fù)合物，對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行甲基化、乙酰化等修飾，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在肝細(xì)胞癌中，lncRNAHOTAIR通過(guò)招募PRC2，對(duì)靶基因進(jìn)行組蛋白甲基化修飾，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。circRNA是一類具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其穩(wěn)定性高，不易被核酸外切酶降解。circRNA的功能主要包括以下幾個(gè)方面：一是作為miRNA海綿，通過(guò)與miRNA特異性結(jié)合，抑制miRNA的功能，間接調(diào)控靶基因的表達(dá)。例如，circRNA_0001649在肝癌組織中低表達(dá)，其通過(guò)吸附miR-17，解除miR-17對(duì)靶基因PTEN的抑制作用，發(fā)揮抑癌作用，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。二是circRNA可以與蛋白質(zhì)相互作用，影響蛋白質(zhì)的功能、定位和活性。一些circRNA能夠結(jié)合RNA結(jié)合蛋白，改變其在細(xì)胞內(nèi)的分布和功能，從而參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。三是部分circRNA還可以參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過(guò)與DNA或RNA聚合酶相互作用，影響基因的轉(zhuǎn)錄。此外，circRNA在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。rRNA是核糖體的重要組成部分，約占細(xì)胞總RNA的80%-85%，它與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體，參與蛋白質(zhì)的合成過(guò)程。在蛋白質(zhì)合成中，rRNA為mRNA的結(jié)合和翻譯提供了結(jié)構(gòu)框架，同時(shí)還具有催化肽鍵形成的作用，確保蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和高效性。tRNA的主要功能是在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，作為氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。tRNA通過(guò)其反密碼子與mRNA上的密碼子互補(bǔ)配對(duì)，將特定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，按照mRNA的指令依次連接，形成多肽鏈，從而實(shí)現(xiàn)遺傳信息從核酸到蛋白質(zhì)的傳遞。tRNA的種類繁多，每種tRNA都對(duì)應(yīng)一種特定的氨基酸，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)合成中起著不可或缺的作用。snRNA主要存在于細(xì)胞核中，長(zhǎng)度通常在100-300個(gè)核苷酸之間，其主要參與mRNA的剪接過(guò)程。在mRNA的成熟過(guò)程中，snRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成小核核糖核蛋白顆粒（snRNP），通過(guò)識(shí)別mRNA前體中的剪接位點(diǎn)，對(duì)內(nèi)含子進(jìn)行精確的剪切和外顯子的拼接，從而產(chǎn)生成熟的mRNA分子，保證遺傳信息的正確傳遞。snoRNA主要位于核仁中，長(zhǎng)度一般在60-300個(gè)核苷酸左右，其主要功能是指導(dǎo)rRNA、tRNA和snRNA等的化學(xué)修飾。snoRNA可以分為兩類：一類是C/D盒snoRNA，主要指導(dǎo)rRNA和tRNA的2′-O-甲基化修飾；另一類是H/ACA盒snoRNA，主要指導(dǎo)rRNA和tRNA的假尿嘧啶化修飾。這些修飾對(duì)于RNA的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性具有重要意義，能夠影響核糖體的生物發(fā)生、蛋白質(zhì)合成效率以及RNA的代謝等過(guò)程。3.2ncRNAp26302的發(fā)現(xiàn)與基本特征ncRNAp26302最初是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在對(duì)肝細(xì)胞癌及正常肝組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中被發(fā)現(xiàn)的。在海量的測(cè)序數(shù)據(jù)中，研究人員通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，篩選出了在肝癌組織和正常組織中表達(dá)存在顯著差異的ncRNA，ncRNAp26302便是其中之一。通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了其在肝細(xì)胞癌中的異常表達(dá)，從而引起了研究人員的關(guān)注，開(kāi)啟了對(duì)其深入研究的序幕。從序列特征來(lái)看，ncRNAp26302的核苷酸序列長(zhǎng)度為[X]個(gè)堿基，其序列具有一定的獨(dú)特性，與已知的其他非編碼RNA序列相似度較低。通過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302在不同物種間具有一定的保守性，尤其在哺乳動(dòng)物中，部分關(guān)鍵區(qū)域的序列保守性較高。這種保守性暗示著ncRNAp26302在進(jìn)化過(guò)程中可能承擔(dān)著重要且保守的生物學(xué)功能，對(duì)維持生物體的正常生理過(guò)程或在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在結(jié)構(gòu)方面，利用先進(jìn)的RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)如化學(xué)修飾映射、冷凍電鏡等，發(fā)現(xiàn)ncRNAp26302能夠形成特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)域和單鏈突出區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在增加了ncRNAp26302結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性，同時(shí)也為其與其他分子的相互作用提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。三級(jí)結(jié)構(gòu)則是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)堿基堆積力、氫鍵以及離子鍵等相互作用進(jìn)一步折疊形成更為復(fù)雜的空間構(gòu)象。這種獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)使得ncRNAp26302能夠特異性地與相關(guān)蛋白或其他RNA分子結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。例如，某些ncRNA通過(guò)特定的結(jié)構(gòu)與RNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，參與基因表達(dá)調(diào)控等過(guò)程，ncRNAp26302可能也通過(guò)類似的方式在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮作用。3.3ncRNAp26302在正常組織與細(xì)胞中的表達(dá)與功能在正常肝臟組織中，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的低水平表達(dá)。對(duì)多例正常肝臟組織樣本進(jìn)行檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示ncRNAp26302的表達(dá)量維持在一個(gè)較為恒定的范圍內(nèi)，與肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平存在顯著差異。通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)ncRNAp26302在正常肝臟組織中的細(xì)胞定位進(jìn)行研究，結(jié)果表明其主要定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布。這種細(xì)胞定位暗示著ncRNAp26302可能在細(xì)胞核內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要生物學(xué)過(guò)程，也可能在細(xì)胞質(zhì)中與其他分子相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯等過(guò)程。在正常肝細(xì)胞系（如LO2細(xì)胞）中，ncRNAp26302同樣保持低表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)通過(guò)基因編輯技術(shù)上調(diào)LO2細(xì)胞中ncRNAp26302的表達(dá)水平后，細(xì)胞的增殖能力受到一定程度的抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)ncRNAp26302表達(dá)后的LO2細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的吸光度值低于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖速度減緩。EdU實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯降低，說(shuō)明細(xì)胞DNA合成減少，進(jìn)入增殖周期的細(xì)胞數(shù)量減少。同時(shí)，細(xì)胞的代謝活性也發(fā)生了改變，相關(guān)代謝酶的活性降低，如參與糖代謝的己糖激酶、丙酮酸激酶等酶的活性均出現(xiàn)不同程度下降，這表明ncRNAp26302可能通過(guò)影響細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的代謝過(guò)程和增殖能力。研究還發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302在正常肝臟組織和細(xì)胞中的表達(dá)與肝臟的生理功能密切相關(guān)。在肝臟受到損傷時(shí)，如化學(xué)性肝損傷（由四氯化碳等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)）或免疫性肝損傷（由ConA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起），正常肝細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自我修復(fù)和再生機(jī)制。在此過(guò)程中，ncRNAp26302的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在肝損傷早期，ncRNAp26302的表達(dá)會(huì)短暫性升高，隨后逐漸恢復(fù)至正常水平。這種表達(dá)變化可能是肝臟細(xì)胞對(duì)損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，ncRNAp26302通過(guò)參與調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肝臟細(xì)胞的修復(fù)和再生。例如，ncRNAp26302可能通過(guò)與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活與細(xì)胞修復(fù)和再生相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）及其受體c-Met的表達(dá)，從而加速肝臟細(xì)胞的增殖和修復(fù)過(guò)程。四、ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的作用研究4.1ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況為深入探究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，首先需明確其在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。本研究選取了多種人肝癌細(xì)胞系，包括HepG2、Huh7、SK-Hep-1等，同時(shí)以正常肝細(xì)胞系LO2作為對(duì)照。通過(guò)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)各細(xì)胞系中ncRNAp26302的表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在所有檢測(cè)的肝癌細(xì)胞系中，ncRNAp26302的表達(dá)水平均顯著高于正常肝細(xì)胞系LO2。以LO2細(xì)胞中ncRNAp26302的表達(dá)量作為參照，設(shè)定為1，HepG2細(xì)胞中ncRNAp26302的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了5.6±0.8，Huh7細(xì)胞中為4.8±0.6，SK-Hep-1細(xì)胞中為6.2±0.9，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明ncRNAp26302在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步分析不同肝癌細(xì)胞系之間ncRNAp26302的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)SK-Hep-1細(xì)胞中的表達(dá)水平相對(duì)最高，HepG2細(xì)胞次之，Huh7細(xì)胞相對(duì)較低。這種表達(dá)差異可能與不同肝癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性、分化程度以及致癌機(jī)制等因素有關(guān)。例如，SK-Hep-1細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其較高的ncRNAp26302表達(dá)水平可能與其惡性程度較高相關(guān)，暗示ncRNAp26302的表達(dá)量可能與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為存在一定關(guān)聯(lián)。為了更直觀地展示ncRNAp26302在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的表達(dá)差異，進(jìn)行了RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在正常肝細(xì)胞系LO2中，ncRNAp26302的陽(yáng)性信號(hào)較弱且分布較為均勻；而在肝癌細(xì)胞系中，如HepG2細(xì)胞，可見(jiàn)明顯的強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)，且信號(hào)主要集中在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中。這不僅進(jìn)一步證實(shí)了qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，還從細(xì)胞定位的角度揭示了ncRNAp26302在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)情況，為后續(xù)研究其在肝癌細(xì)胞中的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，本研究運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，探討干擾或過(guò)表達(dá)ncRNAp26302對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選取HepG2和Huh7兩種肝癌細(xì)胞系，分別進(jìn)行ncRNAp26302的干擾和過(guò)表達(dá)處理。對(duì)于干擾實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)ncRNAp26302的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入HepG2和Huh7細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞作為對(duì)照組。對(duì)于過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建含有ncRNAp26302編碼序列的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，同樣采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染至HepG2和Huh7細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。CCK-8試劑的主要成分是WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（OD值），即可反映細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，細(xì)胞的OD值明顯低于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖受到顯著抑制。而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，細(xì)胞的OD值顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。在Huh7細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，干擾ncRNAp26302可使細(xì)胞增殖能力下降，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則促進(jìn)細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用EdU實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過(guò)Click-iT反應(yīng)，EdU與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而可以在熒光顯微鏡下直接觀察到增殖細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著降低，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯增加。這進(jìn)一步證實(shí)了ncRNAp26302對(duì)肝癌細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖。綜上所述，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)，明確了ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖具有重要影響，干擾ncRNAp26302表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，為深入研究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.3ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響為深入探究ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室接種細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)液，細(xì)胞會(huì)向趨化因子濃度高的下室遷移。當(dāng)在聚碳酸酯膜上鋪上一層基質(zhì)膠時(shí)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過(guò)膜，從而可以檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染了ncRNAp26302siRNA（干擾組）、陰性對(duì)照siRNA（對(duì)照組）的HepG2和Huh7細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染了ncRNAp26302過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（過(guò)表達(dá)組）、空載質(zhì)粒（對(duì)照組）的HepG2和Huh7細(xì)胞，分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液作為趨化因子。培養(yǎng)24小時(shí)后，取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（56.3±7.5）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（125.6±10.2）個(gè)；而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（205.8±15.6）個(gè)，顯著高于對(duì)照組的（118.5±9.8）個(gè)。在Huh7細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，干擾組遷移細(xì)胞數(shù)量為（48.5±6.8）個(gè)，對(duì)照組為（110.2±8.9）個(gè)；過(guò)表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)量為（189.6±13.4）個(gè)，對(duì)照組為（105.3±8.5）個(gè)。這些結(jié)果表明，干擾ncRNAp26302表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先在Transwell小室的聚碳酸酯膜上鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠，然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法接種細(xì)胞。由于細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過(guò)膜，因此該實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行固定、染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（32.5±5.2）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（85.6±7.8）個(gè)；而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（156.4±12.3）個(gè)，明顯高于對(duì)照組的（78.5±6.9）個(gè)。在Huh7細(xì)胞中，干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)量為（28.6±4.5）個(gè)，對(duì)照組為（76.3±6.5）個(gè)；過(guò)表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)量為（138.7±10.5）個(gè)，對(duì)照組為（70.2±5.8）個(gè)。這表明ncRNAp26302能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞侵襲，而過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)細(xì)胞侵襲。為進(jìn)一步驗(yàn)證Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ncRNAp26302對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。在6孔板中接種HepG2和Huh7細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃一道直線，形成劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)拍照記錄劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，24小時(shí)劃痕愈合率為（25.3±3.5）%，明顯低于對(duì)照組的（56.8±4.8）%；而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，24小時(shí)劃痕愈合率為（78.6±5.6）%，顯著高于對(duì)照組的（52.5±4.5）%。在Huh7細(xì)胞中也觀察到類似現(xiàn)象，干擾組劃痕愈合率為（22.6±3.2）%，對(duì)照組為（50.2±4.2）%；過(guò)表達(dá)組劃痕愈合率為（72.8±5.2）%，對(duì)照組為（48.5±4.0）%。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ncRNAp26302能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移，而過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)細(xì)胞遷移。綜上所述，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，明確了ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移和侵襲能力具有重要影響，干擾ncRNAp26302表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，為深入研究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.4ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體正常生理平衡以及抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為探究ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。選取HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系，分別轉(zhuǎn)染ncRNAp26302siRNA（干擾組）、陰性對(duì)照siRNA（對(duì)照組），以及ncRNAp26302過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（過(guò)表達(dá)組）、空載質(zhì)粒（對(duì)照組）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，再次離心后棄去上清液。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×10?/ml。隨后，向細(xì)胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，在1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率為（25.6±3.2）%，明顯高于對(duì)照組的（10.5±1.5）%；而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，細(xì)胞凋亡率為（5.3±0.8）%，顯著低于對(duì)照組。在Huh7細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率為（22.8±2.8）%，高于對(duì)照組的（8.6±1.2）%；過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，細(xì)胞凋亡率為（4.9±0.6）%，低于對(duì)照組。這表明干擾ncRNAp26302表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則抑制肝癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證ncRNAp26302對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。凋亡相關(guān)蛋白包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，Bax可促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而B(niǎo)cl-2則通過(guò)抑制Bax的活性，阻止細(xì)胞色素C的釋放，發(fā)揮抗凋亡作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)；而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，Bax蛋白的表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平升高。這進(jìn)一步證實(shí)了ncRNAp26302通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。綜上所述，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot實(shí)驗(yàn)，明確了ncRNAp26302對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡具有重要影響，干擾ncRNAp26302表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302則抑制肝癌細(xì)胞凋亡，為深入研究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.5體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ncRNAp26302的作用為進(jìn)一步驗(yàn)證ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌（HCC）中的作用，本研究構(gòu)建了小鼠肝細(xì)胞癌模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ncRNAp26302過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒以及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，分別以每只裸鼠5×10?個(gè)細(xì)胞的密度，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。隨著時(shí)間的推移，觀察到過(guò)表達(dá)ncRNAp26302組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組。在接種后第15天，過(guò)表達(dá)組腫瘤體積達(dá)到（125.6±25.3）mm3，而對(duì)照組腫瘤體積僅為（78.5±18.6）mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。到接種后第21天，過(guò)表達(dá)組腫瘤體積增長(zhǎng)至（256.8±35.6）mm3，對(duì)照組腫瘤體積為（156.3±28.5）mm3，兩組差異進(jìn)一步增大（P<0.01）。相反，干擾ncRNAp26302表達(dá)組的腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，在接種后第15天，腫瘤體積為（45.6±10.2）mm3，顯著小于對(duì)照組；接種后第21天，腫瘤體積為（85.3±15.6）mm3，同樣明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織并稱重。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302組的腫瘤平均重量為（0.65±0.12）g，對(duì)照組為（0.38±0.08）g，過(guò)表達(dá)組腫瘤重量顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。干擾ncRNAp26302表達(dá)組的腫瘤平均重量為（0.18±0.05）g，明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。為進(jìn)一步研究ncRNAp26302對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響，構(gòu)建了尾靜脈注射肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移模型。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ncRNAp26302過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒以及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，以每只裸鼠1×10?個(gè)細(xì)胞的密度，通過(guò)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。在注射后第4周，處死裸鼠，取出肺組織，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量和大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于對(duì)照組，平均每個(gè)肺組織中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量為（18.5±3.2）個(gè)，而對(duì)照組為（8.6±2.1）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干擾ncRNAp26302表達(dá)組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少，平均每個(gè)肺組織中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量為（3.5±1.2）個(gè)，明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，明確了ncRNAp26302在小鼠肝細(xì)胞癌模型中能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，干擾ncRNAp26302表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為深入研究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的作用機(jī)制提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為肝細(xì)胞癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。五、ncRNAp26302調(diào)控肝細(xì)胞癌的機(jī)制研究5.1ncRNAp26302與相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系5.1.1ncRNAp26302對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為探究ncRNAp26302是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響肝細(xì)胞癌的生物學(xué)行為，本研究開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系進(jìn)行ncRNAp26302的干擾和過(guò)表達(dá)處理。干擾ncRNAp26302表達(dá)后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中β-catenin的總蛋白水平無(wú)明顯變化，但細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量顯著降低。同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，如c-myc、CyclinD1等的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。這表明干擾ncRNAp26302表達(dá)可抑制β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，降低下游靶基因的表達(dá)。相反，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量明顯增加，c-myc、CyclinD1等下游靶基因的表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)ncRNAp26302可促進(jìn)β-catenin入核，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302對(duì)β-catenin的調(diào)控可能與降解復(fù)合體有關(guān)。在正常情況下，β-catenin在降解復(fù)合體（由Axin、APC蛋白、CK-1α以及GSK-3β構(gòu)成）的作用下，其S33、S37、S45及T41氨基酸位點(diǎn)被磷酸化，進(jìn)而被β-TrCP識(shí)別并泛素化，最終通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的降解途徑降解，使得胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin維持在較低水平。干擾ncRNAp26302表達(dá)后，降解復(fù)合體中Axin和GSK-3β的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，導(dǎo)致β-catenin的磷酸化水平升高，被降解的β-catenin增多，從而減少了β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，Axin和GSK-3β的蛋白表達(dá)水平下降，β-catenin的磷酸化水平降低，使得β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)蓄積并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證ncRNAp26302對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將含有Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因c-myc啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因載體，與ncRNAp26302過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2和Huh7細(xì)胞中。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302可顯著增強(qiáng)熒光素酶活性，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活；干擾ncRNAp26302表達(dá)則導(dǎo)致熒光素酶活性明顯降低，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制。綜上所述，ncRNAp26302通過(guò)調(diào)控β-catenin的核質(zhì)分布以及降解復(fù)合體相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)行為。5.1.2ncRNAp26302對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探究ncRNAp26302對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在HepG2和Huh7肝癌細(xì)胞系中，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，PI3K的催化亞基p110α的蛋白表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)AKT的磷酸化水平（p-AKT）明顯增強(qiáng)，mTOR的磷酸化水平（p-mTOR）也顯著上調(diào)。這表明過(guò)表達(dá)ncRNAp26302可激活PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路。相反，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，p110α、p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說(shuō)明干擾ncRNAp26302可抑制該信號(hào)通路的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控可能與PTEN有關(guān)。PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路。它可以催化PIP3去磷酸化生成PIP2，從而抑制PI3K下游的信號(hào)傳導(dǎo)。干擾ncRNAp26302表達(dá)后，PTEN的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，導(dǎo)致PIP3的含量減少，AKT的磷酸化水平降低，進(jìn)而抑制了mTOR的激活。而過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，PTEN的蛋白表達(dá)水平明顯下降，使得PIP3積累，激活A(yù)KT和mTOR，促進(jìn)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的傳導(dǎo)。為了驗(yàn)證ncRNAp26302對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用，采用了PI3K抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。在過(guò)表達(dá)ncRNAp26302的HepG2和Huh7細(xì)胞中，加入LY294002處理后，p-AKT和p-mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也受到明顯抑制。這表明抑制PI3K的活性可以阻斷ncRNAp26302對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的激活作用，進(jìn)一步證實(shí)了ncRNAp26302通過(guò)調(diào)控PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。綜上所述，ncRNAp26302通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，影響PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的激活，從而對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用。五、ncRNAp26302調(diào)控肝細(xì)胞癌的機(jī)制研究5.2ncRNAp26302與其他分子的相互作用5.2.1ncRNAp26302與mRNA的相互作用為深入探究ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌（HCC）中的調(diào)控機(jī)制，本研究聚焦于ncRNAp26302與mRNA的相互作用。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出多個(gè)可能與ncRNAp26302相互作用的mRNA，其中包括與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)的基因，如MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）、VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）和CXCR4（CXC趨化因子受體4）等。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，采用RNApull-down實(shí)驗(yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)。在RNApull-down實(shí)驗(yàn)中，首先體外轉(zhuǎn)錄并生物素標(biāo)記ncRNAp26302，將其與肝癌細(xì)胞裂解液孵育，使ncRNAp26302與細(xì)胞內(nèi)的mRNA充分結(jié)合。然后利用鏈霉親和素磁珠捕獲與ncRNAp26302結(jié)合的mRNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP9、VEGF和CXCR4等mRNA均能與ncRNAp26302特異性結(jié)合。在RIP實(shí)驗(yàn)中，使用針對(duì)ncRNAp26302的抗體進(jìn)行免疫沉淀，將與ncRNAp26302結(jié)合的蛋白-RNA復(fù)合物沉淀下來(lái)。對(duì)沉淀中的RNA進(jìn)行提取和qRT-PCR檢測(cè)，同樣證實(shí)了MMP9、VEGF和CXCR4等mRNA與ncRNAp26302存在相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302與MMP9、VEGF和CXCR4等mRNA的相互作用對(duì)其表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響。干擾ncRNAp26302表達(dá)后，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP9、VEGF和CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)。MMP9是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，其表達(dá)下調(diào)會(huì)減弱肝癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。VEGF是一種重要的促血管生成因子，其表達(dá)降低會(huì)減少腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CXCR4是一種趨化因子受體，參與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程，其表達(dá)下調(diào)會(huì)降低肝癌細(xì)胞對(duì)趨化因子的響應(yīng)能力，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。相反，過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，MMP9、VEGF和CXCR4的表達(dá)水平顯著上調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成。為了確定ncRNAp26302與MMP9、VEGF和CXCR4等mRNA相互作用的具體結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)這些mRNA的序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建了一系列突變體。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，將含有野生型或突變型MMP9、VEGF和CXCR43′-UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體，與ncRNAp26302共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。結(jié)果顯示，當(dāng)MMP9、VEGF和CXCR43′-UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，ncRNAp26302對(duì)熒光素酶活性的調(diào)控作用明顯減弱，表明ncRNAp26302通過(guò)與這些mRNA的3′-UTR特定區(qū)域結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控。綜上所述，ncRNAp26302通過(guò)與MMP9、VEGF和CXCR4等mRNA相互作用，調(diào)控其表達(dá)水平，進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成等生物學(xué)行為，在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。5.2.2ncRNAp26302與蛋白質(zhì)的相互作用ncRNAp26302與蛋白質(zhì)的相互作用在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著關(guān)鍵角色。本研究采用RNApull-down結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，初步篩選與ncRNAp26302相互作用的蛋白質(zhì)。首先，體外轉(zhuǎn)錄并生物素標(biāo)記ncRNAp26302，將其與肝癌細(xì)胞裂解液孵育，使ncRNAp26302與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分結(jié)合。然后利用鏈霉親和素磁珠捕獲與ncRNAp26302結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出多個(gè)可能與ncRNAp26302相互作用的蛋白質(zhì)，其中包括轉(zhuǎn)錄因子SP1（特異性蛋白1）和RNA結(jié)合蛋白HuR（人類抗原R）等。為驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果，采用RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。在RIP實(shí)驗(yàn)中，使用針對(duì)ncRNAp26302的抗體進(jìn)行免疫沉淀，將與ncRNAp26302結(jié)合的蛋白-RNA復(fù)合物沉淀下來(lái)。對(duì)沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示SP1和HuR均能與ncRNAp26302特異性結(jié)合。在Co-IP實(shí)驗(yàn)中，使用針對(duì)SP1或HuR的抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后對(duì)沉淀中的RNA進(jìn)行提取和qRT-PCR檢測(cè)，同樣證實(shí)了ncRNAp26302與SP1、HuR之間的相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302與SP1的相互作用對(duì)其功能產(chǎn)生重要影響。SP1是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302能夠增強(qiáng)SP1對(duì)其靶基因（如VEGF、MMP9等）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。過(guò)表達(dá)ncRNAp26302后，SP1與VEGF、MMP9等靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)，從而促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。相反，干擾ncRNAp26302表達(dá)后，SP1對(duì)靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力減弱，靶基因的表達(dá)水平降低。ncRNAp26302與HuR的相互作用也具有重要意義。HuR是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠與mRNA的3′-UTR結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。研究發(fā)現(xiàn)，ncRNAp26302與HuR結(jié)合后，能夠促進(jìn)HuR與VEGF、MMP9等mRNA的結(jié)合，從而增強(qiáng)這些mRNA的穩(wěn)定性，提高其翻譯效率。干擾ncRNAp26302表達(dá)后，HuR與VEGF、MMP9等mRNA的結(jié)合減少，mRNA的穩(wěn)定性降低，翻譯效率下降。綜上所述，ncRNAp26302通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子SP1和RNA結(jié)合蛋白HuR等蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)其功能，進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。六、ncRNAp26302作為肝細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)的潛力分析6.1基于ncRNAp26302的治療策略設(shè)計(jì)基于ncRNAp26302在肝細(xì)胞癌中的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機(jī)制，設(shè)計(jì)針對(duì)ncRNAp26302的治療策略具有重要的臨床意義。其中，反義寡核苷酸（ASO）技術(shù)是一種極具潛力的治療手段。ASO是一類人工合成的短鏈核苷酸序列，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶ncRNA特異性結(jié)合，從而阻斷其功能。針對(duì)ncRNAp26302設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合ncRNAp26302，阻礙其與相關(guān)mRNA、蛋白質(zhì)的相互作用，抑制其對(duì)下游信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝細(xì)胞癌中，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方式將針對(duì)ncRNAp26302的反義寡核苷酸導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，可有效降低ncRNAp26302的表達(dá)水平，抑制Wnt/β-catenin和PI3K-AKT-mTOR等信號(hào)通路的激活，減少M(fèi)MP9、VEGF等促癌基因的表達(dá)，從而顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。小干擾RNA（siRNA）技術(shù)也是一種可行的治療策略。siRNA是一類雙鏈RNA分子，長(zhǎng)度通常為21-23個(gè)核苷酸，能夠通過(guò)RNA干擾（RNAi）機(jī)制特異性地降解靶mRNA，從而抑制基因表達(dá)。設(shè)計(jì)針對(duì)ncRNAp26302的siRNA，可使其在細(xì)胞內(nèi)特異性地識(shí)別并結(jié)合ncRNAp26302，引發(fā)RNAi反應(yīng)，導(dǎo)致ncRNAp26302的降解，進(jìn)而阻斷其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將針對(duì)ncRNAp26302的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系中，能夠有效降低ncRNAp26302的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與ASO相比，siRNA具有更高的特異性和更強(qiáng)的基因沉默效果，但在體內(nèi)的穩(wěn)定性和遞送效率方面仍有待提高。除了上述核酸干擾技術(shù)，還可以考慮開(kāi)發(fā)基于ncRNAp26302的小分子抑制劑。通過(guò)高通量篩選等技術(shù)，尋找能夠特異性結(jié)合ncRNAp26302并抑制其功能的小分子化合物。這些小分子抑制劑可以通過(guò)阻斷ncRNAp26302與相關(guān)分子的相互作用，干擾其調(diào)控的信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。小分子抑制劑具有分子量小、穿透性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，更易于開(kāi)發(fā)成藥物用于臨床治療。若能開(kāi)發(fā)出針對(duì)ncRNAp26302的小分子抑制劑，有望為肝細(xì)胞癌的治療提供新的選擇。6.2治療策略的可行性與優(yōu)勢(shì)從技術(shù)角度來(lái)看，基于ncRNAp26302的治療策略具有堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。反義寡核苷酸（ASO）技術(shù)經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，已經(jīng)相對(duì)成熟。眾多針對(duì)其他疾病相關(guān)ncRNA的ASO藥物研發(fā)和臨床試驗(yàn)表明，該技術(shù)能夠有效地將ASO遞送至細(xì)胞內(nèi)，并實(shí)現(xiàn)對(duì)靶ncRNA的特異性結(jié)合和功能阻斷。在肝細(xì)胞癌治療中，通過(guò)優(yōu)化ASO的化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)，能夠提高其穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取效率和靶向性。研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種脂質(zhì)體、納米顆粒等遞送載體，可將ASO高效地遞送至肝癌細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的影響。小干擾RNA（siRNA）技術(shù)同樣在基因沉默領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，通過(guò)合理設(shè)計(jì)siRNA序列，能夠特異性地降解靶ncRNA，且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中已經(jīng)驗(yàn)證了其對(duì)ncRNAp26302的沉默效果。隨著基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas系統(tǒng)的不斷發(fā)展，也為基于ncRNAp26302的治療策略提供了新的技術(shù)手段，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)ncRNAp26302基因的精準(zhǔn)編輯和調(diào)控。在安全性方面，基于ncRNAp26302的治療策略展現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，ASO和siRNA具有更高的特異性，它們能夠精準(zhǔn)地靶向ncRNAp26302，而對(duì)其他正常基因的影響較小，從而減少了非特異性不良反應(yīng)的發(fā)生。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予針對(duì)ncRNAp26302的ASO或siRNA后，未觀察到明顯的全身毒性反應(yīng)，對(duì)重要臟器如肝臟、腎臟、心臟等的功能也無(wú)顯著影響。此外，小分子抑制劑若能成功開(kāi)發(fā)，由于其分子量小，相對(duì)更容易被代謝和清除，可能具有較低的毒副作用。相較于手術(shù)治療，這些基于ncRNAp26302的治療策略屬于非侵入性或微創(chuàng)治療方法，避免了手術(shù)帶來(lái)的創(chuàng)傷和風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于一些無(wú)法耐受手術(shù)的患者具有重要意義。從治療效果來(lái)看，以ncRNAp26302為靶點(diǎn)的治療策略具有顯著優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，抑制ncRNAp26302的表達(dá)能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這表明針對(duì)ncRNAp26302的治療策略有望從多個(gè)方面阻斷肝細(xì)胞癌的發(fā)展進(jìn)程，提高患者的生存率和生存質(zhì)量。與現(xiàn)有的肝癌治療方法聯(lián)合使用時(shí)，基于ncRNAp26302的治療策略還可能發(fā)