生物分離與純化技術(shù)目錄1、有機(jī)溶劑沉淀法簡(jiǎn)介2、有機(jī)溶劑沉淀法的原理3、常用的有機(jī)溶劑4、影響因素及特點(diǎn)1有機(jī)溶劑沉淀法簡(jiǎn)介1、定義：利用有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)等生物大分子在水溶液中的溶解度，而使之沉淀析出的方法。常用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物物質(zhì)的純化。也用于中藥有效成分的提取。有機(jī)溶劑沉淀法簡(jiǎn)介一2、特點(diǎn)：有機(jī)溶劑沉淀法簡(jiǎn)介一缺點(diǎn)：①易使生物大分子變性，需低溫操作；②有機(jī)溶劑消耗大，成本較高；③有機(jī)溶劑易燃易爆，貯存麻煩。優(yōu)點(diǎn)：①分辨率高；②產(chǎn)品更純凈。2有機(jī)溶劑沉淀法的原理有機(jī)溶劑沉淀法的原理二1、蛋白質(zhì)穩(wěn)定的原因表面分布各種親水基團(tuán)（溶解性好）蛋白質(zhì)表面帶有自由氨基和羧基

（斥力>引力）有機(jī)溶劑沉淀法的原理二1、蛋白質(zhì)穩(wěn)定的原因表面分布各種親水基團(tuán)（溶解性好）蛋白質(zhì)表面帶有自由氨基和羧基

（斥力>引力）1、介電常數(shù)，溶質(zhì)之間的靜電引力增加。2、搶奪蛋白質(zhì)表面的水膜。導(dǎo)致脫水凝聚。2、沉淀機(jī)理二有機(jī)溶劑沉淀法的原理3常用的有機(jī)溶劑２、常用有機(jī)溶劑常用的有機(jī)溶劑三水甲醇、乙醇丙酮（介電常數(shù)）極性大極性小不溶于水正丁醇乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷苯四氯化碳石油醚甲醇、乙醇丙酮乙醇、丙酮、甲醇常用的有機(jī)溶劑三選擇有機(jī)溶劑的原則：①介電常數(shù)小，沉淀作用強(qiáng)②對(duì)生物大分子的變性作用小③毒性小，揮發(fā)性適中④一般需能與水無限混溶常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙酮和甲醇等乙醇——最常用常用的有機(jī)溶劑三沉淀作用強(qiáng)沸點(diǎn)適中無毒甲醇——不廣泛沉淀作用強(qiáng)對(duì)蛋白變性作用小口服劇毒丙酮沉淀能力更強(qiáng)沸點(diǎn)低、揮發(fā)性大對(duì)肝臟有毒著火點(diǎn)低4影響因素及特點(diǎn)（1）溫度——低溫防變性有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素四有機(jī)溶劑需預(yù)冷(-20℃

～-10℃)注意攪拌保持散熱少量多次加入立即固液分離沉淀溶于緩沖溶液等采用方法（2）

pH值pH影響蛋白質(zhì)溶解度pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近（3）樣品濃度大，易共沉，分辨率低；小，效率低。一般常將蛋白質(zhì)初濃度控制在0.5～2％為宜。粘多糖則以1～2％較合。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素四（4）其它離子的影響例如：少量中性鹽存在可減少蛋白質(zhì)變性。鹽濃度需嚴(yán)格控制。一般在0.01～0.05mol/L為好。常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。有機(jī)溶劑沉淀法的特點(diǎn)四缺點(diǎn)：①有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，操作需在低溫下進(jìn)行；②需要耗用大量有機(jī)溶劑，成本較高；③有機(jī)溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。優(yōu)點(diǎn)：①分辨能力比鹽析法高：可使目標(biāo)產(chǎn)物在比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀。②產(chǎn)品更純凈：沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易；有機(jī)溶劑沸點(diǎn)低，容易除去。1、有機(jī)溶劑冷卻至-20—-10℃;整個(gè)系統(tǒng)冷卻2、不斷攪拌，少量多次加入；3、低溫短時(shí)間處理后立即抽濾或離心，沉淀溶于緩沖溶液。4、有機(jī)溶劑加入量往往用原溶液體積的倍數(shù)來計(jì)量。有機(jī)溶劑沉淀法的工藝流程四有機(jī)溶劑沉淀法的工藝流程四1、概念：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解性最低的特性，向含有目的藥物成分的混合液中加入酸或堿，調(diào)整其pH值，使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法。只適用于水化程度不大、在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的兩性生化物質(zhì)，如酪蛋白。子任務(wù)2：等電點(diǎn)沉淀法

2、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀法的影響因素a.不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點(diǎn)。大多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)。b.同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點(diǎn)不同。c.目的藥物成分對(duì)Ph值的要求。避免加入強(qiáng)酸強(qiáng)堿，容易引起目的藥物有效蛋白的變性；避免引入新的離子，酸堿應(yīng)于原鹽溶液中的離子相同。子任務(wù)2：等電點(diǎn)沉淀法

概念：蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，并失去原有的生理活性，這個(gè)過程稱為蛋白質(zhì)的變性。變性蛋白質(zhì)在水中溶解度變小并從溶液中析出的方法稱為變性沉淀法。原理：破壞雜質(zhì)，保存目的物。利用蛋白質(zhì)等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離純化的目的。子任務(wù)3：選擇性變性沉淀法：

最常用的方法：1、加熱法：如檸檬酸發(fā)酵液，加熱至80℃，雜蛋白會(huì)變性凝固而除去。

注意：熱處理的方法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的藥物成分。比如說對(duì)熱敏感的藥物青霉素等就不能用這種方法來處理。要嚴(yán)格控制加熱的溫度和時(shí)間。子任務(wù)3：變性沉淀法

2、加入化學(xué)試劑法：常用的加鹽、加有機(jī)酸、加酚等。如核酸抽提的過程中我們所用的除去蛋白的方法就是加入有機(jī)溶劑氯仿，蛋白質(zhì)就會(huì)成為絮狀沉淀除去。3、調(diào)pH值法：溶液的酸堿性發(fā)生劇烈變化時(shí)，會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性而沉淀。如用2.5%的三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶等，均可除去大量雜蛋白，而對(duì)所提取的酶活性沒有影響。子任務(wù)3：變性沉淀法

定義：在有機(jī)聚合物的作用下，蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象稱為有機(jī)聚合物沉淀法。常用的有機(jī)多聚物：不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖等，應(yīng)用較多的是相對(duì)分子質(zhì)量6000～20000的PEG。聚乙二醇的親水性強(qiáng)，溶于許多水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有較廣范圍的分子量。子任務(wù)4：有機(jī)聚合物沉淀法

子任務(wù)4：有機(jī)聚合物沉淀法

優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：所得的沉淀中含有大量的PEG。吸附法、乙醇沉淀法、鹽析法等①操作條件溫和，室溫即可；②沉淀效率高；③沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集。操作方法：1、兩種聚合物形成液-液兩相，蛋白質(zhì)在兩相中的分配比例不同；2、有機(jī)聚合物與無機(jī)鹽形成兩相，蛋白質(zhì)在兩相中的分配比例不同；子任務(wù)4：有