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CCS

SDYYXH

團體標準

T/SDYYXHXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性快速

評價方法

Arapidmethodforevaluatingearlycardiotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel

-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

山東省醫藥行業協會??發布

T/SDYYXHXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性快速評價方法

1范圍

本文件規定了基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性評價的方法原理、受試物、儀器設備、試驗準備、

試驗步驟、保證試驗有效性的條件、判定步驟、數據處理與試驗報告等內容。

本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期心臟毒性的評價。

2規范性引用文件

本文件沒有規范性引用文件。

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

斑馬魚zebrafish

模式動物的一種，常用于教學和科研。生物分類學上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、

斑馬魚屬、斑馬魚種。

3.2

Tg（cmcl2:EGFP）品系轉基因斑馬魚Tg（cmcl2:EGFP）straintransgeniczebrafish

實驗室常用斑馬魚品系，心臟被綠色熒光標記。

3.3

仔魚larva

性腺發育尚未成熟的斑馬魚。

3.4

受精后小時數hourspost-fertilization（hpf）

斑馬魚胚胎體外受精后的小時數。

3.5

10?%致死濃度10%lethalconcentration（LC10）

受試物導致10%受試魚死亡的濃度。沒有心跳判定為死亡。

3.6

心率heartrate

心臟每分鐘搏動的次數。

3.7

SV-BA距離SV-BAdistance

SV-BA距離是指靜脈竇（SV）和動脈球（BA）之間的距離。

3.8

心室短軸縮短率ventricularfractionalshortening（FS）

心室短軸縮短率（FS）＝［心室舒張末期內徑（Dd）－心室收縮末期內徑（Ds）］/Dd。

3.9

射血分數ejectionfraction

每搏輸出量占心室舒張末期容積的百分比，稱為射血分數。

3.10

每搏輸出量strokevolume

舒張末期容積與收縮末期容積之差，即為每搏輸出量。

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4方法原理

斑馬魚的心血管系統在解剖結構和生理功能方面與哺乳動物相似，心臟由心房和心室構成，房室之

間存在瓣膜，且其心臟的發育及基因調控機制等也與人類相似。受精后48h，靜脈竇、心房、心室發育

完成，心臟通過舒縮實現泵血功能。斑馬魚胚胎通體透明，心臟形態和心跳可在顯微鏡下直接觀察，可

快速、無創獲取斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量等心功能評

價相關指標。因此，以斑馬魚為試驗動物，應用熒光顯微成像等技術，以心率、心包面積、SV-BA距離、

射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量等為檢測指標，可對藥物的早期心臟毒性進行快速定量分析。

5受試物

5.1受試物配制

5.1.1水溶性藥物：斑馬魚培養水直接溶解配制成檢測溶液。

5.1.2非水溶性藥物：選用有機溶劑、乳化劑或分散劑等進行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁

液。

5.2受試物準備量

5.2.1固態受試物檢測用量10?mg～50?mg。

5.2.2液態受試物檢測用量30?mL～50?mL。

5.2.3半固態受試物檢測用量20?mg～100?mg。

5.2.4半液態受試物檢測用量20?mL～100?mL。

5.3受試物相關信息

5.3.1受試物的名稱、性狀、批號、規格、生產日期、保存條件、保質期。

5.3.2受試物為單體成分時，還需要提供該成分相應的化學信息，包括分子量、分子式、分子結構。

5.3.3提供受試物理化性質，包含如下信息：

a)在水中或其它溶劑中的溶解性；

b)在水中和光中的穩定性；

c)溫度對受試物穩定性的影響。

6儀器設備

6.1分析天平。精度0.0001g。

6.2體視熒光顯微鏡。

6.3圖像采集系統。

6.4恒溫光照培養箱。精度±1℃。

6.5斑馬魚養殖系統。配備溫控裝置，水循環和過濾裝置。

6.6水質監測設備。pH計、溶解氧測定儀、鹽度計。

6.7試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應選用惰性材料（如玻

璃）來減少吸附。

7試驗準備

7.1受試斑馬魚

發育至48hpf綠色熒光蛋白EGFP標記心臟的轉基因斑馬魚Tg（cmcl2：EGFP）胚胎，使用脫膜劑（配

置方法見附錄A）去除包被斑馬魚的外部卵膜。

7.2斑馬魚培養水

7.2.1斑馬魚培養水使用存放24h以上并經曝氣處理的去離子水配制，內含5mmol/LNaCl、

0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。

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7.2.2斑馬魚培養水配制方法：用分析天平稱取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06g

MgSO4·7H2O，加入1000mL純凈水配制成50×斑馬魚培養水。量取20mL的50×斑馬魚培養水，加入

980mL純凈水，配制成1×斑馬魚培養水。

7.2.3pH值保持在6.5～8.0，水的硬度（以CaCO3計）為10mg/L～250mg/L，溶解氧濃度不低于6.0mg/L。

注：此培養水為斑馬魚提供最適生存水環境。

7.3試驗溶液配制

7.3.1加入受試物后，試驗溶液pH值在6.5～8.0之間，不需調節試驗溶液的pH值。

7.3.2如果加入受試物后試驗溶液的pH值小于6.5或大于8.0，重新配制，調節受試物貯備液的pH

值，使其接近加入受試物前稀釋水的pH值。用于調節pH值的物質不應使儲備液的濃度明顯改變，也不

應與受試物發生化學反應或產生沉淀。

7.3.3非水溶性受試物，添加有機溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受

試物試驗溶液中助溶劑濃度不得超過100mg/L。

8試驗步驟

8.1試驗分組

試驗設置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設1個溶劑對照組。

8.2空白對照組設置

隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，

每孔含10尾仔魚和2mL斑馬魚培養水。

8.3溶劑對照組設置

隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔板中，

每孔含10尾仔魚和2mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。

8.4陽性對照組設置

隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔

板中，每孔含10尾仔魚和2mL烏頭堿溶液，烏頭堿溶液濃度為10μM。

8.5受試物組設置

隨機挑取發育至48hpf的心臟熒光標記的健康Tg（cmcl2：EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于24孔

板中，每孔含10尾仔魚和2mL受試物溶液（配制方法見7.3），受試物試驗溶液濃度需＜LC10（沒有

心跳特征的斑馬魚界定為死亡），試驗時根據需要設置多個受試物濃度組。。

8.6暴露條件

空白對照組、溶劑對照組和受試物組斑馬魚靜置于28.5℃±1℃的恒溫光照培養箱，連續暴露24h。

注：暴露期間禁止喂食。

8.7心率檢測

暴露結束，體視顯微鏡下計數斑馬魚15秒心跳次數，并計算心率。

8.8心包面積和SV-BA距離檢測

暴露結束，體視熒光顯微鏡下拍照，并測量心包面積以及SV-BA距離。

8.9射血分數、短軸縮短率和每搏輸出量檢測

暴露結束，倒置熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚心跳視頻，并提取心室舒張末期和收縮末期圖片，測量心

室短軸和長軸長度，計算射血分數、短軸縮短率和每搏輸出量。

9保證試驗有效性的條件

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9.1每孔內斑馬魚密度小于5尾/mL。

9.2水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用有機溶劑進行助溶。

9.3斑馬魚圖像采集時，各組間拍照參數一致。

10判定標準

10.1各試驗組暴露完成后至少90%仔魚存活，否則對應試驗組結果無效。

10.2受試物組與空白對照組相比，斑馬魚心率、射血分數、短軸縮短率或每搏輸出量在統計學上顯著

減小（P＜0.05），或斑馬魚心包面積、SV-BA距離顯著增加（P＜0.05），此時試驗結果可作為受試物

具有心臟毒性的支持證據，但不替代人體功能檢測。

11數據處理

11.1統計參數：斑馬魚心率、心包面積、SV-BA距離、射血分數、短軸縮短率、每搏輸出量。

11.2統計分析方法：方差分析（ANOVA），輔助以T-test檢驗，分析各試驗組間的差異。

12試驗報告

試驗報告包含下列內容：

a)受試物——物理屬性、物理/化學特性；

b)受試斑馬魚——學名、品系、來源、發育階段、受精卵收集方法及后續處理；

c)試驗條件：

1)光照周期；

2)試驗設計（試驗容器及其平行的數目，每個平行中的仔魚數量）；

3)制備儲備液的方法；若使用助溶劑，應給出其成分和濃度；

4)斑馬魚培養水特性：pH值、硬度、溫度、溶解氧濃度；

5)試驗容器內的水質：pH值、硬度、溫度、溶解氧濃度；

6)喂食情況。

d)試驗