ICS

CCS

SDYYXH

團體標準

T/SDYYXHXXXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速

評價方法

Arapidmethodforevaluatingearlyhepatotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel

-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

山東省醫藥行業協會??發布

T/SDYYXHXXXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評價方法

1范圍

本文件規定了基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評價方法的原理、受試物、儀器設備、試驗準

備、試驗步驟、保證試驗有效性的條件、判定步驟、數據處理與試驗報告等內容。

本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性的快速評價。

2規范性引用文件

本文件沒有規范性引用文件。

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

斑馬魚zebrafish

模式動物的一種，常用于教學和科研。生物分類學上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、

斑馬魚屬、斑馬魚種。

3.2

Tg（L-FABP:EGFP）品系轉基因斑馬魚Tg（L-FABP:EGFP）straintransgeniczebrafish

實驗室常用轉基因品系斑馬魚，肝臟被綠色熒光特異標記。

3.3

仔魚larva

性腺發育尚未成熟的斑馬魚。

3.4

受精后小時數hourspost-fertilization（hpf）

斑馬魚胚胎體外受精后的小時數。

3.5

沒有心跳lackofheartbeat

一分鐘內心臟沒有跳動。

3.6

藥物drugs

以預防、治療及診斷疾病的物質。

3.7

10?%致死濃度10%lethalconcentration（LC10）

受試物導致10%受試魚死亡的濃度。沒有心跳判定為死亡。

3.8

熒光顯微成像fluorescencemicroscopy

對特定樣本使用熒光蛋白或分子標記后，對其標記物成像的光學顯微成像技術。

3.9

組織切片tissueslice

以生物組織為材料，處理為薄片，應用于玻片以適合顯微鏡之觀察。

3.10

熒光實時定量聚合酶鏈式反應real-timequantitativePCR（RT-qPCR）

在DNA擴增反應中，應用熒光化學物質檢測每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法。

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4方法原理

斑馬魚的肝臟與人類相似，不僅具有分泌膽汁，合成蛋白質的功能，還能中和分解有毒物質。斑馬

魚受精48hpf時，肝臟形態基本形成；受精72hpf后，肝臟的形態及功能全部發育成熟。斑馬魚的肝臟

對藥物的介入非常敏感，肝毒性藥物極易使其生理結構發生改變，誘導肝臟細胞發生凋亡。綜上所述，

以斑馬魚為試驗動物，應用熒光顯微成像、組織切片和熒光實時定量PCR等技術，以肝臟面積、肝臟組

織形態和凋亡相關基因表達等為檢測指標，可對藥物的早期肝臟毒性進行快速定量分析。

5受試物

5.1受試物配制

5.1.1水溶性藥物：斑馬魚培養水直接溶解配制成檢測溶液。

5.1.2非水溶性藥物：選用有機溶劑、乳化劑或分散劑等進行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁

液。

5.2受試物準備量

5.2.1固態受試物檢測用量10?mg～50?mg。

5.2.2液態受試物檢測用量30?mL～50?mL。

5.2.3半固態受試物檢測用量20?mg～100?mg。

5.2.4半液態受試物檢測用量20?mL～100?mL。

5.3受試物相關信息

5.3.1受試物的名稱、性狀、批號、規格、生產日期、保存條件、保質期。

5.3.2受試物為單體成分時，還需要提供該成分相應的化學信息，包括分子量、分子式、分子結構。

5.3.3提供受試物理化性質，包含如下信息：

a)在水中或其它溶劑中的溶解性；

b)在水中和光中的穩定性；

c)溫度對受試物穩定性的影響。

6儀器設備

6.1分析天平。精度0.0001g。

6.2量筒。500mL，精度0.5mL

6.3熒光顯微鏡。配置藍色濾光片和圖像采集系統，放大倍數為40倍。

6.4組織切片機。可用于石蠟組織切片的制備。

6.5RT-qPCR反應儀。內置96孔半導體控溫PCR模塊；溫控精度：≤±0.25℃；溫控范圍：0℃～99.9℃。

6.6恒溫光照培養箱。精度±1℃。

6.7斑馬魚養殖系統。配備溫控裝置，水循環和過濾裝置。

6.8水質監測設備。pH計、溶解氧測定儀、鹽度計。

6.9試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應選用惰性材料（如玻

璃）來減少吸附。

7試驗準備

7.1受試斑馬魚

發育至72hpf健康AB系斑馬魚。

7.2斑馬魚培養水

7.2.1斑馬魚培養水使用存放24h以上并經曝氣處理的去離子水配制，內含5mmol/LNaCl、

0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。

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7.2.2斑馬魚培養水配制方法：用分析天平稱取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06g

MgSO4·7H2O，加入1000mL純凈水配制成50×斑馬魚培養水。量取20mL的50×斑馬魚培養水，加入

980mL純凈水，配制成1×斑馬魚培養水。

7.2.3pH值保持在6.5～8.0，水的硬度（以CaCO3計）為10mg/L～250mg/L，溶解氧濃度不低于6.0mg/L。

注：此培養水為斑馬魚提供最適生存水環境。

7.3試驗溶液配制

7.3.1加入受試物后，試驗溶液pH值在6.5～8.0之間，不需調節試驗溶液的pH值。

7.3.2如果加入受試物后試驗溶液的pH值小于6.5或大于8.0，重新配制，調節受試物貯備液的pH

值，使其接近加入受試物前稀釋水的pH值。用于調節pH值的物質不應使儲備液的濃度明顯改變，也不

應與受試物發生化學反應或產生沉淀。

7.3.3非水溶性受試物，添加有機溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受

試物試驗溶液中助溶劑濃度不得超過100mg/L。

8試驗步驟

8.1試驗分組

試驗設置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設1個溶劑對照組。

8.2空白對照組設置

隨機挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL斑馬魚培養水。

8.3溶劑對照組設置

隨機挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。

8.4陽性對照組設置

隨機挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含

15尾仔魚和5mL異煙肼溶液，異煙肼溶液濃度為6mM。

8.5受試物組設置

挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL受試物溶液（配制方法見7.3），受試物試驗溶液濃度需＜LC10（沒有心跳特征的斑馬魚

界定為死亡），試驗時根據需要設置多個受試物濃度組。

8.6暴露條件

空白對照組、陽性對照組和受試物組斑馬魚靜置于28.5℃±1℃的恒溫光照培養箱，避光連續暴露

72h。

注：暴露期間禁止喂食。

8.7肝臟面積檢測

暴露結束，熒光顯微鏡下觀察拍攝仔魚顯示綠色熒光的肝臟組織圖像，并測量其面積。

8.8肝臟組織形態檢測

暴露結束，4%多聚甲醛固定仔魚組織，應用石蠟將其包埋后，將仔魚制備為厚度為5-10μm的石蠟

組織切片。使用蘇木精和伊紅對斑馬魚石蠟組織切片進行染色。顯微鏡下觀察拍攝染色后的肝臟組織。

8.9凋亡相關基因表達量檢測

暴露結束，提取仔魚RNA，將其反轉錄為cDNA，應用RT-qPCR技術檢測凋亡相關基因（bax、caspase-3、

caspase-8和caspase-9）的表達量。

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9保證試驗有效性的條件

9.1每孔內斑馬魚密度小于5尾/mL。

9.2水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可配制成均勻分散的懸濁液或乳濁液。

9.3斑馬魚圖像采集時，各組間拍照參數一致。

10判定標準

10.1各試驗組暴露完成后至少90%仔魚存活，否則對應試驗組結果無效。

10.2受試物組與空白對照組相比，斑馬魚肝臟面積在統計學上顯著減小（P＜0.05），此時試驗結果

可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據，但不替代人體功能檢測。

10.3受試物組與空白對照組相比，斑馬魚肝臟細胞排列松散，萎縮變形，胞質溶解出現空泡化，此時

試驗結果可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據，但不替代人體功能檢測。

10.4試物組與空白對照組相比，斑馬魚凋亡相關基因bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達

量在統計學上顯著增加（P＜0.05），此時試驗結果可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據，但不替代

人體功能檢測。

11數據處理

11.1毒性評價指標：斑馬魚的肝臟面積，肝臟組織病理改變、凋亡相關基因（bax、caspase-3、caspase-8

和caspase-9）表達量。

11.2統計分析方法：方差分析（ANOVA），輔助以