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文檔簡介
miR396-GRF模塊:解鎖水稻發(fā)育與脅迫響應的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義水稻(OryzasativaL.)作為全球最重要的糧食作物之一,為超過半數(shù)的世界人口提供主食,其產(chǎn)量和品質(zhì)直接關(guān)系到全球糧食安全和人類福祉。在人口持續(xù)增長和耕地面積不斷減少的雙重壓力下,提高水稻產(chǎn)量和增強其對各種逆境脅迫的耐受性,成為了農(nóng)業(yè)領域研究的關(guān)鍵目標。植物的生長發(fā)育是一個受到多種因素精細調(diào)控的復雜過程,涉及眾多基因和信號通路的協(xié)同作用。其中,microRNA(miRNA)作為一類重要的非編碼小分子RNA,在植物生長發(fā)育及脅迫響應中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。miRNA通常長度在20-24個核苷酸之間,它本身并不編碼蛋白質(zhì),而是通過與靶mRNA的互補配對,介導靶mRNA的切割或者抑制其翻譯過程,從而實現(xiàn)對基因表達的負調(diào)控,進而參與植物生長發(fā)育的各個階段以及對環(huán)境脅迫的響應。miR396是植物中高度保守的miRNA家族之一,在不同植物物種中廣泛存在。生長調(diào)節(jié)因子(GrowthRegulatoryFactor,GRF)基因則是miR396作用的主要靶基因。在植物中,miR396-GRF模塊形成了一個關(guān)鍵的調(diào)控途徑,對植物的生長發(fā)育、逆境脅迫響應等多個方面起著核心調(diào)控作用。在生長發(fā)育方面,miR396-GRF模塊參與調(diào)控植物的多個重要發(fā)育過程。例如,調(diào)控葉片的生長和發(fā)育,包括葉片的大小、形狀和數(shù)目等。研究表明,在擬南芥中,miR396通過調(diào)控GRF基因的表達,影響葉片細胞的增殖和分化,進而決定葉片的最終大小和形態(tài)。同時,該模塊還參與調(diào)控植物莖的伸長、根系的發(fā)育以及花和果實的形成等過程,對植物整體株型的建成和器官的形態(tài)建成具有重要影響。在逆境脅迫響應方面,miR396-GRF模塊在植物應對各種生物和非生物脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。面對干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫時,植物體內(nèi)miR396和GRF基因的表達水平會發(fā)生顯著變化,通過調(diào)控相關(guān)基因的表達,激活植物體內(nèi)的脅迫響應機制,從而增強植物對逆境的耐受性。在生物脅迫方面,該模塊也參與植物對病原菌的防御反應,調(diào)節(jié)植物的免疫反應和抗病能力。對于水稻而言,miR396-GRF模塊的研究具有尤為重要的意義。一方面,該模塊可能是調(diào)控水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的關(guān)鍵因子。水稻的產(chǎn)量受到多種因素的影響,包括株型、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、粒重等,而miR396-GRF模塊對這些產(chǎn)量相關(guān)性狀可能具有重要的調(diào)控作用。深入研究該模塊在水稻產(chǎn)量形成中的分子機制,有助于挖掘新的高產(chǎn)基因資源,為水稻高產(chǎn)育種提供理論基礎和技術(shù)支撐。另一方面,水稻在生長過程中常常面臨各種逆境脅迫,如鹽害、干旱、病蟲害等,這些逆境脅迫嚴重影響水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量。揭示miR396-GRF模塊在水稻脅迫響應中的作用機制,能夠為培育具有更強抗逆性的水稻新品種提供新的思路和方法。盡管目前對miR396-GRF模塊在植物中的研究取得了一定進展,但在水稻中,該模塊調(diào)控水稻生長發(fā)育及響應脅迫的具體分子機制仍存在許多未知。深入研究miR396-GRF模塊在水稻中的功能和作用機制,不僅有助于豐富我們對植物生長發(fā)育和脅迫響應調(diào)控網(wǎng)絡的認識,也將為水稻遺傳改良和分子育種提供重要的理論依據(jù)和基因資源,對于保障全球糧食安全具有重要的現(xiàn)實意義。1.2miR396-GRF模塊概述miR396是植物中高度保守的一類microRNA,在不同植物物種的基因組中,miR396通常由多個基因位點編碼,形成一個復雜的家族。以擬南芥為例,其基因組中至少存在5個編碼miR396的基因位點。這些基因位點分布在不同的染色體上,通過轉(zhuǎn)錄、加工等過程產(chǎn)生成熟的miR396。成熟的miR396長度一般在21-22個核苷酸,具有特定的核苷酸序列和二級結(jié)構(gòu)。其序列在不同植物物種間具有較高的相似性,這種保守性暗示了miR396在植物生長發(fā)育和適應環(huán)境過程中具有重要且保守的生物學功能。miR396基因在植物基因組中的分布并非隨機,它們可能受到特定的順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控,從而精確地控制miR396的表達水平和時空表達模式。例如,在植物的不同組織和發(fā)育階段,miR396的表達量會發(fā)生動態(tài)變化,以滿足植物生長發(fā)育的需求。生長調(diào)節(jié)因子(GRF)基因是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子基因家族,在植物的生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在水稻基因組中,已鑒定出多個GRF基因成員,如OsGRF1、OsGRF2、OsGRF3等。這些GRF基因具有相似的結(jié)構(gòu)特征,通常包含多個外顯子和內(nèi)含子,其編碼的蛋白質(zhì)含有一些保守的結(jié)構(gòu)域,如N端的QLQ結(jié)構(gòu)域和C端的WRC結(jié)構(gòu)域。QLQ結(jié)構(gòu)域能夠介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,使GRF蛋白與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白形成復合物,從而協(xié)同調(diào)控基因表達;WRC結(jié)構(gòu)域則與DNA結(jié)合活性相關(guān),決定了GRF蛋白對靶基因啟動子區(qū)域的特異性識別和結(jié)合能力。不同的GRF基因在水稻組織中的表達具有特異性,有些GRF基因在葉片中高表達,參與葉片的生長發(fā)育調(diào)控;有些則在莖、根或生殖器官中發(fā)揮重要作用,調(diào)控相應組織器官的形態(tài)建成和功能發(fā)揮。miR396對GRF基因的調(diào)控主要通過轉(zhuǎn)錄后水平的負調(diào)控機制實現(xiàn)。miR396通過堿基互補配對的方式,與GRF基因的mRNA的特定區(qū)域相結(jié)合,這個特定區(qū)域通常位于GRF基因mRNA的編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)(3'UTR)。一旦miR396與GRFmRNA結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu),就會被植物體內(nèi)的RNA誘導沉默復合體(RISC)識別。RISC中的核酸酶成分,如AGO1蛋白,會特異性地切割GRFmRNA,使其降解,從而減少GRF蛋白的合成。另外,miR396與GRFmRNA的結(jié)合還可能抑制mRNA的翻譯過程,使核糖體無法正常讀取mRNA的遺傳信息,進而阻止GRF蛋白的合成。這種精細的負調(diào)控機制確保了植物體內(nèi)GRF蛋白的表達水平維持在合適的范圍內(nèi),避免因GRF蛋白表達過高或過低而對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。在植物的生長發(fā)育過程中,miR396-GRF模塊的調(diào)控作用受到多種環(huán)境因素和內(nèi)源信號的影響,從而實現(xiàn)對植物生長發(fā)育和脅迫響應的動態(tài)調(diào)控。1.3研究目的與主要內(nèi)容本研究旨在深入探究miR396-GRF模塊在水稻生長發(fā)育及響應脅迫過程中的調(diào)控機制,通過一系列實驗手段,全面解析該模塊在水稻生命活動中的重要作用,為水稻遺傳改良和分子育種提供堅實的理論基礎和豐富的基因資源。具體研究內(nèi)容和關(guān)鍵問題如下:miR396和GRF基因家族成員的鑒定與表達分析:利用生物信息學手段,對水稻基因組中的miR396和GRF基因家族成員進行系統(tǒng)鑒定和全面分析,明確其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位以及保守結(jié)構(gòu)域等特征。運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、原位雜交等技術(shù),深入研究miR396和GRF基因在水稻不同組織(如根、莖、葉、穗等)和不同發(fā)育階段(如幼苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期等)的表達模式,分析其表達水平的動態(tài)變化規(guī)律,明確各成員在水稻生長發(fā)育過程中的時空表達特性,為后續(xù)研究其功能奠定基礎。miR396對GRF基因的調(diào)控機制研究:通過5'-RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)實驗,精確驗證miR396與GRF基因mRNA的靶向互作關(guān)系,確定miR396對GRF基因的切割位點。構(gòu)建含有miR396結(jié)合位點突變的GRF基因表達載體,以及miR396過表達和抑制表達載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得相應的轉(zhuǎn)基因水稻植株。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù),如CRISPR/Cas9系統(tǒng),對miR396和GRF基因進行精準調(diào)控,深入研究miR396對GRF基因在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機制,包括對GRF基因mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的影響。miR396-GRF模塊對水稻生長發(fā)育的調(diào)控功能解析:對miR396和GRF基因功能缺失或過表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株進行詳細的表型分析,觀察其在株型(如株高、分蘗數(shù)、莖粗等)、葉片形態(tài)(如葉片大小、形狀、卷曲程度等)、根系發(fā)育(如主根長度、側(cè)根數(shù)量、根表面積等)、穗部性狀(如穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率等)以及種子發(fā)育(如種子大小、千粒重等)等方面的變化。通過細胞學觀察,如掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù),研究miR396-GRF模塊對水稻細胞增殖、分化和伸長的影響,揭示其調(diào)控水稻生長發(fā)育的細胞學機制。利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(BiFC)等技術(shù),篩選和鑒定與GRF蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì),構(gòu)建miR396-GRF模塊調(diào)控水稻生長發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡,深入解析其調(diào)控水稻生長發(fā)育的分子機制。miR396-GRF模塊在水稻響應脅迫中的作用機制研究:對正常生長條件和干旱、高鹽、低溫、病原菌侵染等不同逆境脅迫條件下的水稻植株,檢測miR396和GRF基因的表達變化,分析其表達水平與脅迫響應的相關(guān)性。通過生理生化指標測定,如相對含水量、丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等,研究miR396-GRF模塊對水稻抗逆生理特性的影響,揭示其在水稻應對非生物脅迫和生物脅迫過程中的生理調(diào)控機制。利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)、蛋白質(zhì)組學等技術(shù),分析miR396和GRF基因功能改變的轉(zhuǎn)基因水稻植株在脅迫條件下的基因表達譜和蛋白質(zhì)表達譜變化,篩選出受miR396-GRF模塊調(diào)控的下游靶基因和相關(guān)信號通路,深入解析其在水稻脅迫響應中的分子調(diào)控機制。二、miR396-GRF模塊調(diào)控水稻發(fā)育機制2.1miR396-GRF模塊對水稻籽粒發(fā)育的影響水稻籽粒大小是決定水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一,受到復雜的遺傳和分子調(diào)控。近年來,研究發(fā)現(xiàn)miR396-GRF模塊在水稻籽粒發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。中科院上海植物逆境生物學中心朱健康院士團隊等在這方面的研究取得了顯著成果,為揭示miR396-GRF模塊調(diào)控水稻籽粒發(fā)育的機制提供了重要依據(jù)。研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),對水稻中的MIR396基因家族進行了系統(tǒng)的編輯。在水稻基因組中,存在8個編碼miR396的基因位點(MIR396a-MIR396h),通過對這些基因的編輯,發(fā)現(xiàn)MIR396e和MIR396f是調(diào)控籽粒大小和株型的關(guān)鍵基因。當MIR396e和MIR396f發(fā)生雙基因突變(mir396ef突變)時,水稻籽粒發(fā)生了明顯的變化,籽粒變大,千粒重增加約40%,這表明MIR396e和MIR396f對水稻籽粒大小具有負調(diào)控作用。從細胞學層面分析,mir396ef突變體種子穎殼細胞明顯大于野生型,這說明miR396e和miR396f可能通過影響穎殼細胞的大小來調(diào)控籽粒大小。穎殼作為包裹籽粒的結(jié)構(gòu),其細胞大小直接影響籽粒的生長空間和最終大小,當miR396e和miR396f功能缺失時,穎殼細胞得以更大程度地生長,從而為籽粒的增大提供了條件。進一步研究發(fā)現(xiàn),mir396ef突變對籽粒大小的影響與GRF基因家族密切相關(guān)。miR396通過堿基互補配對的方式,靶向結(jié)合GRF基因的mRNA,從而抑制GRF基因的表達。在mir396ef突變體中,由于miR396e和miR396f的功能喪失,對GRF基因的抑制作用減弱,使得GRF基因的表達水平升高。GRF基因編碼的蛋白質(zhì)是一類轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在水稻籽粒發(fā)育過程中,GRF蛋白可能通過調(diào)控下游一系列與細胞增殖、分化和伸長相關(guān)基因的表達,來影響籽粒的大小。例如,GRF蛋白可能激活一些促進細胞分裂的基因,使穎殼細胞和胚乳細胞的分裂次數(shù)增加,從而增加細胞數(shù)量,導致籽粒增大;或者激活一些促進細胞伸長的基因,使細胞體積增大,進而使籽粒變大。此外,研究還表明,mir396ef突變不僅影響籽粒大小,還會對水稻株型產(chǎn)生顯著影響。突變體植株葉片變長,但節(jié)間縮短,尤其是最上部的節(jié)間。這一現(xiàn)象暗示了miR396-GRF模塊在調(diào)控水稻不同器官發(fā)育過程中的復雜性和特異性。對于葉片變長的機制,通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組和植物激素分析發(fā)現(xiàn),mir396ef雙突變可使嫩葉中赤霉素前體甲瓦龍酸(MVA)的含量增加,進而增加赤霉素(GA)的含量。赤霉素是一類重要的植物激素,在植物生長發(fā)育過程中,對細胞伸長具有促進作用。在mir396ef突變體中,赤霉素含量的升高可能激活了與細胞伸長相關(guān)的信號通路,使得葉片細胞伸長,從而導致葉片變長。而節(jié)間縮短的原因則與CYP96B4基因的表達降低有關(guān),該基因可能參與了節(jié)間伸長的調(diào)控過程,但其具體機制仍有待進一步深入研究。從分子調(diào)控網(wǎng)絡的角度來看,miR396-GRF模塊在水稻籽粒發(fā)育過程中可能與其他信號通路相互作用,共同調(diào)控籽粒的生長和發(fā)育。除了上述提到的與赤霉素信號通路的關(guān)聯(lián)外,還可能與油菜素內(nèi)酯(BR)信號通路、生長素信號通路等存在交叉對話。在水稻種子粒型控制基因gs2/gl2的研究中發(fā)現(xiàn),gs2/gl2編碼GRF4,其序列上的一個稀有變異破壞了miR396在GRF4mRNA上的結(jié)合位點,致使GRF4表達量增加,而GRF4表達的增加促進了油菜素內(nèi)酯響應基因的表達,從而使籽粒變大。這表明miR396-GRF模塊與油菜素內(nèi)酯信號通路之間存在著密切的聯(lián)系,共同調(diào)控水稻籽粒大小。此外,生長素作為一種重要的植物激素,在植物器官發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用,miR396-GRF模塊是否通過影響生長素的合成、運輸或信號轉(zhuǎn)導來調(diào)控籽粒發(fā)育,也值得進一步深入探究。2.2miR396-GRF模塊對水稻株型建成的作用水稻株型是影響其產(chǎn)量和抗逆性的重要農(nóng)藝性狀,包括株高、分蘗數(shù)、莖粗、葉片形態(tài)以及節(jié)間長度等多個方面,這些性狀受到復雜的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡和環(huán)境因素的共同作用。近年來,隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的研究表明miR396-GRF模塊在水稻株型建成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在對mir396ef突變體的研究中,發(fā)現(xiàn)其株型發(fā)生了顯著變化,最為明顯的是葉片變長和節(jié)間縮短,尤其是最上部的節(jié)間。這些表型變化暗示了miR396-GRF模塊在調(diào)控水稻不同器官生長發(fā)育過程中的重要作用。通過深入研究其內(nèi)在機制,發(fā)現(xiàn)這一變化與赤霉素(GA)和CYP96B4等基因密切相關(guān)。赤霉素作為一類重要的植物激素,在植物生長發(fā)育過程中對細胞伸長具有關(guān)鍵的促進作用。在mir396ef突變體中,通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組和植物激素分析發(fā)現(xiàn),嫩葉中赤霉素前體甲瓦龍酸(MVA)的含量顯著增加,進而導致赤霉素的含量升高。這一變化使得葉片細胞伸長,從而引起葉片變長。從分子機制角度來看,miR396e和miR396f的雙基因突變,導致其對GRF基因的抑制作用減弱,GRF基因表達水平升高。GRF蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,可能通過激活與赤霉素合成相關(guān)基因的表達,促進甲瓦龍酸向赤霉素的轉(zhuǎn)化,從而增加赤霉素的含量。例如,GRF蛋白可能與赤霉素合成基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子,增強基因的轉(zhuǎn)錄活性,使得赤霉素合成增加,最終促進葉片細胞伸長,導致葉片變長。節(jié)間縮短現(xiàn)象在mir396ef突變體中也十分顯著,研究表明這與CYP96B4基因表達降低有關(guān)。CYP96B4基因?qū)儆诩毎豍450超家族,在植物生長發(fā)育過程中可能參與了節(jié)間伸長的調(diào)控。雖然目前關(guān)于CYP96B4基因調(diào)控節(jié)間伸長的具體分子機制尚不完全清楚,但推測其可能通過影響植物激素的合成、代謝或信號轉(zhuǎn)導途徑來發(fā)揮作用。例如,CYP96B4基因可能參與了油菜素內(nèi)酯(BR)的合成或代謝過程,油菜素內(nèi)酯是一種重要的植物激素,對植物莖的伸長具有促進作用。當CYP96B4基因表達降低時,可能導致油菜素內(nèi)酯的合成減少或代謝加快,使得油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導受阻,從而抑制了節(jié)間細胞的伸長,最終導致節(jié)間縮短。另外,CYP96B4基因也可能與其他植物激素如生長素、細胞分裂素等相互作用,共同調(diào)控節(jié)間伸長,具體機制仍有待進一步深入研究。除了赤霉素和CYP96B4基因外,miR396-GRF模塊在調(diào)控水稻株型過程中,可能還與其他基因和信號通路存在復雜的相互作用。在植物株型調(diào)控網(wǎng)絡中,多個基因和信號通路相互交織,共同維持植物生長發(fā)育的平衡。例如,生長素信號通路在植物莖的伸長和分枝過程中起著重要作用,miR396-GRF模塊可能通過與生長素信號通路的交叉對話,影響生長素的分布和信號轉(zhuǎn)導,從而調(diào)控水稻株型。另外,細胞分裂素、脫落酸等植物激素以及一些轉(zhuǎn)錄因子家族,如AP2/ERF、bHLH等,也可能參與了miR396-GRF模塊調(diào)控水稻株型的過程。這些基因和信號通路之間的相互作用,構(gòu)成了一個復雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡,共同決定了水稻的株型建成。2.3miR396-GRF模塊參與水稻其他發(fā)育過程除了籽粒發(fā)育和株型建成外,miR396-GRF模塊在水稻的分蘗、開花等其他重要發(fā)育階段也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。分蘗是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一,直接影響水稻的穗數(shù),進而影響產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn),miR396-GRF模塊與水稻分蘗調(diào)控密切相關(guān)。通過對miR396過表達和GRF基因功能缺失的水稻植株研究發(fā)現(xiàn),miR396表達量升高或GRF基因功能缺失時,水稻分蘗數(shù)顯著減少。從分子機制上看,GRF基因可能通過調(diào)控細胞分裂素和生長素等植物激素的信號轉(zhuǎn)導途徑來影響分蘗的發(fā)生。細胞分裂素能夠促進分蘗芽的生長和發(fā)育,而生長素則對分蘗芽的生長具有抑制作用。GRF蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子,與細胞分裂素和生長素相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,調(diào)控這些基因的表達,從而維持細胞分裂素和生長素之間的平衡,促進分蘗的正常發(fā)生。當miR396對GRF基因的抑制作用增強時,GRF蛋白表達量降低,無法有效調(diào)控植物激素信號通路,導致細胞分裂素和生長素平衡失調(diào),最終抑制分蘗的發(fā)生。此外,GRF基因還可能與其他參與分蘗調(diào)控的基因相互作用,共同構(gòu)成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。例如,一些研究表明GRF基因可能與水稻中的MOC1基因存在關(guān)聯(lián),MOC1是調(diào)控水稻分蘗的關(guān)鍵基因,GRF基因可能通過調(diào)節(jié)MOC1基因的表達或與MOC1蛋白相互作用,來影響分蘗的形成和發(fā)育。開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要時期,對水稻的繁殖和產(chǎn)量形成至關(guān)重要。miR396-GRF模塊在水稻開花調(diào)控中也扮演著重要角色。在水稻生長過程中,miR396和GRF基因的表達水平在開花誘導期會發(fā)生明顯變化。通過調(diào)控miR396和GRF基因的表達,發(fā)現(xiàn)改變其表達水平會影響水稻的開花時間。當miR396表達受到抑制時,GRF基因表達上調(diào),水稻開花時間提前;反之,當miR396過表達,抑制GRF基因表達時,水稻開花時間延遲。這表明miR396-GRF模塊對水稻開花時間具有負調(diào)控作用。深入研究其分子機制發(fā)現(xiàn),GRF基因可能通過調(diào)節(jié)開花相關(guān)基因的表達來控制開花時間。在植物開花調(diào)控網(wǎng)絡中,存在一系列關(guān)鍵的開花基因,如FT(FLOWERINGLOCUST)、SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1)等。GRF蛋白可能與這些開花基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,激活或抑制它們的表達,從而調(diào)控水稻從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變。例如,GRF蛋白可能直接激活FT基因的表達,F(xiàn)T蛋白作為開花信號的關(guān)鍵傳遞者,從葉片運輸?shù)角o尖分生組織,與其他蛋白相互作用,激活下游花器官發(fā)育相關(guān)基因的表達,促進水稻開花。而miR396通過抑制GRF基因的表達,減少GRF蛋白的合成,從而間接抑制FT等開花基因的表達,延遲水稻開花時間。此外,miR396-GRF模塊還可能與其他環(huán)境信號和內(nèi)源信號相互作用,共同調(diào)控水稻的開花時間。例如,光周期、溫度等環(huán)境因素以及植物激素信號,都可能影響miR396-GRF模塊的活性,進而影響水稻的開花進程。在光周期調(diào)控開花的過程中,光信號可能通過影響miR396和GRF基因的表達,來調(diào)節(jié)水稻對光周期的響應,從而決定開花時間。三、miR396-GRF模塊響應水稻脅迫的機制3.1miR396-GRF模塊與水稻鹽脅迫響應土壤鹽漬化是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要非生物脅迫之一,嚴重影響水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量。隨著全球氣候變化和不合理的農(nóng)業(yè)灌溉等因素,鹽漬化土地面積不斷擴大,水稻面臨的鹽害威脅日益嚴峻。因此,深入研究水稻的耐鹽機制,挖掘耐鹽相關(guān)基因,對于培育耐鹽水稻品種、提高水稻產(chǎn)量和保障糧食安全具有重要意義。近年來,越來越多的研究表明miR396-GRF模塊在水稻響應鹽脅迫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3.1.1miR396b/GRF6模塊提高水稻耐鹽性的實驗證據(jù)武漢大學李紹清教授課題組在水稻耐鹽研究領域取得了重要進展,其發(fā)表在PlantBiotechnologyJournal上的研究論文“miR396b/GRF6modulecontributestosalttoleranceinrice”揭示了miR396b/GRF6模塊調(diào)控水稻耐鹽的新機制。該研究發(fā)現(xiàn),miR396b/GRF6作為調(diào)控水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵模塊,同時能顯著提高水稻的耐鹽性。研究人員通過構(gòu)建MIM396(miR396的抑制表達載體)和OE-GRF6(GRF6的過表達載體)轉(zhuǎn)基因系,并對這些轉(zhuǎn)基因系和野生型水稻進行鹽脅迫處理實驗。在鹽脅迫條件下,與野生型相比,MIM396轉(zhuǎn)基因系的存活率增加了48.0%,OE-GRF6轉(zhuǎn)基因系的存活率更是增加了74.4%。這一數(shù)據(jù)直觀地表明,miR396b/GRF6模塊對水稻耐鹽性具有正向調(diào)控作用,即抑制miR396的表達或過表達GRF6基因,能夠顯著提高水稻在鹽脅迫環(huán)境下的生存能力。從生理生化角度進一步分析,研究人員發(fā)現(xiàn),在耐鹽性增強的同時,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出H2O2積累減少和ROS(活性氧)清除酶活性提高的現(xiàn)象。鹽脅迫會導致植物體內(nèi)ROS的大量積累,ROS的積累會對細胞造成氧化損傷,影響植物的正常生長和發(fā)育。而ROS清除酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等,能夠及時清除植物體內(nèi)過量的ROS,維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡,從而增強植物的耐鹽性。在MIM396和OE-GRF6轉(zhuǎn)基因系中,ROS清除酶活性的提高,使得植物能夠更有效地清除鹽脅迫下產(chǎn)生的過量ROS,減少H2O2的積累,降低ROS對細胞的氧化損傷,進而提高水稻的耐鹽性。這一結(jié)果表明,miR396b/GRF6模塊可能通過調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)的氧化還原平衡,來增強水稻對鹽脅迫的耐受性。3.1.2負調(diào)控因子ZNF9與miR396b/GRF6的關(guān)系在深入探究miR396b/GRF6模塊調(diào)控水稻耐鹽機制的過程中,李紹清教授課題組還鑒定出了一個重要的負調(diào)控因子ZNF9。ZNF9是一種鋅指蛋白,在植物生長發(fā)育和脅迫響應過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),ZNF9能夠與miR396b的啟動子直接結(jié)合,從而調(diào)控miR396b/GRF6的表達。啟動子是基因表達調(diào)控的重要區(qū)域,它包含了一系列順式作用元件,能夠與轉(zhuǎn)錄因子等反式作用因子相互作用,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。ZNF9與miR396b啟動子的直接結(jié)合,會影響RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子與啟動子的結(jié)合,進而影響miR396b的轉(zhuǎn)錄過程,最終調(diào)節(jié)miR396b的表達水平。當ZNF9與miR396b啟動子結(jié)合后,會促進miR396b的表達。miR396b表達量的增加,會通過堿基互補配對的方式,與GRF6基因的mRNA結(jié)合,抑制GRF6基因的表達。GRF6作為miR396b的靶基因,其表達受到抑制后,會導致水稻耐鹽性和產(chǎn)量降低。這是因為GRF6在水稻耐鹽調(diào)控網(wǎng)絡中起著關(guān)鍵的正向調(diào)控作用,當GRF6表達受到抑制時,其無法有效地激活下游耐鹽相關(guān)基因的表達,從而降低了水稻對鹽脅迫的耐受性。同時,GRF6對水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀也具有重要的調(diào)控作用,其表達抑制會影響水稻的生長發(fā)育,進而導致產(chǎn)量下降。相反,當敲除ZNF9基因時,由于ZNF9蛋白無法合成,其不能與miR396b啟動子結(jié)合,miR396b的表達受到抑制,對GRF6基因的抑制作用減弱,從而促進GRF6表達。GRF6表達量的增加,會激活下游一系列耐鹽相關(guān)基因的表達,提高水稻的耐鹽性。這一研究結(jié)果揭示了ZNF9通過調(diào)控miR396b/GRF6模塊的表達,在水稻耐鹽性和產(chǎn)量調(diào)控中發(fā)揮著重要的負調(diào)控作用,為深入理解水稻耐鹽調(diào)控網(wǎng)絡提供了新的視角。3.1.3miR396b/GRF6下游靶基因MYB3R的作用通過多組學聯(lián)合分析,李紹清教授課題組發(fā)現(xiàn)MYB3R作為miR396b/GRF6的下游靶基因,在水稻耐鹽調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MYB3R是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,在植物生長發(fā)育和脅迫響應過程中參與多種生物學過程的調(diào)控。在水稻耐鹽調(diào)控方面,GRF6作為轉(zhuǎn)錄因子,能夠激活下游靶基因MYB3R的表達。GRF6蛋白通過與MYB3R基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件結(jié)合,招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子,促進MYB3R基因的轉(zhuǎn)錄,從而增加MYB3RmRNA的表達量,最終使MYB3R蛋白的合成增加。MYB3R蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,進一步調(diào)控下游一系列與耐鹽相關(guān)基因的表達,從而提高水稻的耐鹽性。MYB3R可能通過與這些耐鹽相關(guān)基因啟動子區(qū)域的MYB結(jié)合位點相結(jié)合,激活或抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。例如,MYB3R可能激活一些編碼離子轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達,這些離子轉(zhuǎn)運蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)離子平衡,減少Na+的積累,增加K+的吸收,從而減輕鹽脅迫對細胞的傷害。同時,MYB3R也可能激活一些抗氧化酶基因的表達,如前文提到的SOD、CAT和POD等,增強水稻對ROS的清除能力,維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡,進一步提高水稻的耐鹽性。此外,MYB3R還可能參與調(diào)控一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達,如脯氨酸、甜菜堿等,這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)細胞的滲透壓,防止細胞失水,增強水稻在鹽脅迫下的生存能力。3.2miR396-GRF模塊對其他非生物脅迫的響應除了鹽脅迫外,水稻在生長過程中還經(jīng)常面臨干旱、低溫等多種非生物脅迫的挑戰(zhàn)。這些逆境脅迫嚴重影響水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量,而miR396-GRF模塊在水稻應對這些非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。深入研究該模塊在不同非生物脅迫下的響應機制,對于揭示水稻的抗逆機理、培育抗逆水稻品種具有重要意義。3.2.1干旱脅迫下的表達變化干旱脅迫是影響水稻生長和產(chǎn)量的重要非生物脅迫之一。在干旱環(huán)境中,植物會通過一系列生理生化和分子響應機制來適應脅迫,維持自身的生長和發(fā)育。miR396-GRF模塊作為植物生長發(fā)育和脅迫響應的重要調(diào)控途徑,在水稻應對干旱脅迫過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過對正常生長條件和干旱脅迫條件下水稻植株的研究發(fā)現(xiàn),干旱脅迫會導致水稻體內(nèi)miR396和GRF基因的表達發(fā)生顯著變化。以miR396a、e、b、f及OsGRF7、OsGRF9為例,在干旱脅迫處理初期,miR396a、e、b、f的表達水平迅速上調(diào)。研究表明,miR396a、e、b、f的表達上調(diào)可能是水稻對干旱脅迫的一種早期響應機制。miR396通過堿基互補配對的方式,與OsGRF7、OsGRF9基因的mRNA結(jié)合,抑制其表達。在正常生長條件下,OsGRF7、OsGRF9基因維持一定的表達水平,參與調(diào)控水稻的生長發(fā)育過程。然而,當水稻遭受干旱脅迫時,miR396a、e、b、f表達上調(diào),對OsGRF7、OsGRF9基因的抑制作用增強,導致OsGRF7、OsGRF9基因的表達水平顯著下降。從調(diào)控關(guān)系來看,這種表達變化體現(xiàn)了miR396-GRF模塊在干旱脅迫響應中的負反饋調(diào)控機制。OsGRF7、OsGRF9基因編碼的蛋白質(zhì)是一類轉(zhuǎn)錄因子,在正常生長條件下,它們可能通過調(diào)控下游一系列與細胞增殖、分化和生長相關(guān)基因的表達,促進水稻的生長發(fā)育。但在干旱脅迫下,降低OsGRF7、OsGRF9基因的表達,可能有助于水稻減少不必要的生長消耗,將更多的能量和物質(zhì)用于應對干旱脅迫。例如,降低OsGRF7、OsGRF9基因的表達,可能會抑制一些與細胞伸長和分裂相關(guān)基因的表達,使水稻植株的生長速度減緩,從而減少水分的消耗。同時,這種表達變化可能還會激活一些與干旱脅迫響應相關(guān)的基因表達,如編碼抗氧化酶的基因、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)基因等,增強水稻對干旱脅迫的耐受性。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR396-GRF模塊在干旱脅迫下的表達變化還可能與其他信號通路相互作用,共同調(diào)控水稻的干旱響應。例如,干旱脅迫會導致植物體內(nèi)脫落酸(ABA)含量升高,ABA作為一種重要的植物激素,在植物應對干旱脅迫過程中起著關(guān)鍵的信號傳導作用。研究表明,ABA信號通路可能與miR396-GRF模塊存在交叉對話。ABA可能通過調(diào)節(jié)miR396和GRF基因的表達,來影響水稻對干旱脅迫的響應。具體來說,ABA可能激活一些轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子與miR396基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,促進miR396的表達,進而抑制GRF基因的表達。此外,miR396-GRF模塊還可能與其他植物激素信號通路,如生長素、細胞分裂素等相互作用,共同調(diào)控水稻在干旱脅迫下的生長發(fā)育和脅迫響應,但其具體機制仍有待進一步深入研究。3.2.2低溫脅迫下的表達變化低溫脅迫是限制水稻生長和分布的另一個重要非生物脅迫因素,對水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量造成嚴重影響。在低溫環(huán)境下,水稻會啟動一系列復雜的生理生化和分子機制來抵御低溫傷害,miR396-GRF模塊在這一過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。結(jié)合相關(guān)實驗結(jié)果,在低溫脅迫時,水稻體內(nèi)miR396a及OsGRF4、OsGRF6的表達呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫會誘導miR396a的表達上調(diào)。miR396a表達上調(diào)后,通過與OsGRF4、OsGRF6基因的mRNA互補配對,抑制其表達,從而導致OsGRF4、OsGRF6基因的表達水平下降。這種表達變化表明,miR396-GRF模塊參與了水稻對低溫脅迫的響應過程。從其在低溫響應中的作用機制來看,OsGRF4、OsGRF6基因編碼的蛋白質(zhì)在正常生長條件下,可能參與調(diào)控水稻細胞的生理活動,如細胞的增殖、分化和代謝等。然而,在低溫脅迫下,降低OsGRF4、OsGRF6基因的表達,可能是水稻適應低溫環(huán)境的一種策略。通過抑制OsGRF4、OsGRF6基因的表達,水稻細胞的代謝活動可能會發(fā)生調(diào)整,以減少能量消耗,增強對低溫的耐受性。例如,OsGRF4、OsGRF6可能調(diào)控一些與細胞呼吸和光合作用相關(guān)基因的表達,在低溫脅迫下,降低這些基因的表達,使細胞呼吸和光合作用速率適當降低,從而減少能量的消耗,避免因能量供應不足而導致細胞損傷。同時,miR396-GRF模塊的表達變化可能還會激活一些與低溫脅迫響應相關(guān)的基因表達,如編碼低溫響應蛋白(COR蛋白)的基因、抗氧化酶基因等。這些基因的表達產(chǎn)物能夠保護細胞免受低溫傷害,維持細胞的正常生理功能,增強水稻的耐寒性。此外,miR396-GRF模塊在低溫脅迫下的調(diào)控機制可能還與其他信號通路存在密切聯(lián)系。在植物低溫響應過程中,鈣離子信號通路、MAPK信號通路等都發(fā)揮著重要作用。研究推測,miR396-GRF模塊可能與這些信號通路相互作用,共同調(diào)控水稻對低溫脅迫的響應。例如,低溫脅迫會導致植物細胞內(nèi)鈣離子濃度瞬間升高,鈣離子作為第二信使,可能激活一系列鈣離子依賴的蛋白激酶,這些蛋白激酶可能通過磷酸化作用,調(diào)節(jié)miR396和GRF基因的表達,從而影響水稻對低溫脅迫的響應。另外,MAPK信號通路可能通過級聯(lián)磷酸化反應,激活下游的轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子與miR396或GRF基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,調(diào)控其表達,進而參與水稻的低溫響應過程。然而,這些信號通路之間具體的相互作用機制和調(diào)控網(wǎng)絡仍需要進一步深入研究和探索。3.3miR396-GRF模塊與水稻生物脅迫響應的潛在關(guān)系在水稻的生長過程中,生物脅迫如病蟲害的侵襲嚴重威脅其產(chǎn)量和品質(zhì)。盡管目前關(guān)于miR396-GRF模塊在水稻應對生物脅迫方面的直接研究相對較少,但已有研究為揭示該模塊在水稻生物脅迫響應中的潛在作用提供了重要線索。在擬南芥中,有研究表明miR396-GRF模塊參與了植物對病原菌的防御反應。當擬南芥受到丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)侵染時,miR396的表達水平發(fā)生顯著變化。miR396表達的改變進而影響其靶基因GRF的表達,GRF基因表達的變化會調(diào)節(jié)植物體內(nèi)一系列與防御相關(guān)基因的表達,從而影響植物的抗病能力。例如,GRF可能通過與一些防御相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合,調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄,激活植物的免疫反應,增強對病原菌的抵抗能力。雖然這是在擬南芥中的研究結(jié)果,但由于miR396-GRF模塊在植物中具有高度的保守性,因此推測在水稻中可能存在類似的調(diào)控機制。在水稻中,稻瘟病是一種嚴重的真菌病害,對水稻產(chǎn)量造成巨大損失。雖然目前尚未有直接證據(jù)表明miR396-GRF模塊參與水稻對稻瘟病的抗性調(diào)控,但從植物免疫反應的保守機制以及miR396-GRF模塊在其他植物抗病中的作用來看,該模塊很可能參與了水稻對稻瘟病的響應過程。當水稻受到稻瘟病菌侵染時,植物體內(nèi)會啟動一系列復雜的免疫信號通路,包括活性氧(ROS)的爆發(fā)、植物激素信號的傳導以及防御相關(guān)基因的表達調(diào)控。miR396-GRF模塊可能通過與這些免疫信號通路的交叉對話,參與水稻對稻瘟病的防御反應。例如,miR396對GRF基因表達的調(diào)控,可能影響水稻細胞的代謝活動和生理狀態(tài),從而改變水稻對稻瘟病菌的易感性。GRF蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,可能調(diào)控一些與細胞壁合成、ROS清除以及植物激素合成相關(guān)基因的表達,這些基因的表達變化會影響水稻細胞壁的強度、細胞內(nèi)的氧化還原平衡以及植物激素的水平,進而影響水稻對稻瘟病的抗性。此外,水稻還經(jīng)常受到各種害蟲的侵害,如褐飛虱、二化螟等。在植物與害蟲的相互作用中,植物會通過一系列的防御機制來抵御害蟲的取食。miR396-GRF模塊在這一過程中也可能發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn),在一些植物受到害蟲取食后,miRNA的表達譜發(fā)生顯著變化。miR396作為植物中重要的miRNA,其表達可能在水稻受到害蟲侵害時發(fā)生改變,通過調(diào)控GRF基因的表達,影響水稻的生長發(fā)育和生理代謝,從而影響水稻對害蟲的防御能力。例如,GRF基因可能調(diào)控一些與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達,次生代謝產(chǎn)物如萜類、酚類化合物等,在植物防御害蟲過程中起著重要作用,它們可以作為驅(qū)避劑、毒素或信號分子,影響害蟲的取食行為、生長發(fā)育和繁殖能力。當miR396-GRF模塊的調(diào)控失衡時,可能會導致這些次生代謝產(chǎn)物的合成受到影響,從而降低水稻對害蟲的防御能力。盡管目前關(guān)于miR396-GRF模塊在水稻生物脅迫響應中的研究還不夠深入,但從已有的研究基礎和植物生長發(fā)育及脅迫響應的保守機制來看,該模塊在水稻應對病蟲害等生物脅迫過程中具有潛在的重要調(diào)控作用,值得進一步深入研究。四、研究方法與實驗設計4.1實驗材料本研究選用粳稻品種日本晴(OryzasativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare)作為野生型對照材料。日本晴是水稻功能基因組學研究中常用的模式品種,具有全基因組測序完成、遺傳背景清晰、易于轉(zhuǎn)化等優(yōu)點,其基因組信息為后續(xù)的基因鑒定和分析提供了重要的參考依據(jù)。在水稻功能基因研究領域,大量的研究都是基于日本晴品種展開,其穩(wěn)定的遺傳特性和良好的實驗操作性,使其成為本研究理想的野生型對照材料。在突變體材料方面,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了miR396基因家族多個成員的突變體,如mir396e、mir396f以及mir396ef雙突變體等。CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種高效的基因編輯工具,能夠?qū)μ囟ɑ蜻M行精準敲除或修飾。通過設計針對miR396基因的特異性sgRNA(singleguideRNA),將其導入水稻細胞中,Cas9蛋白在sgRNA的引導下,對miR396基因的特定序列進行切割,引發(fā)細胞內(nèi)的DNA修復機制,從而實現(xiàn)對miR396基因的編輯,獲得相應的突變體。這些突變體為研究miR396基因在水稻生長發(fā)育及脅迫響應中的功能提供了重要的材料基礎。同時,構(gòu)建了GRF基因家族成員的突變體,如osgrf1、osgrf2等單突變體以及多個GRF基因的復合突變體。通過對GRF基因突變體的研究,可以深入了解GRF基因在水稻生長發(fā)育和脅迫響應過程中的具體作用。轉(zhuǎn)基因材料方面,構(gòu)建了miR396過表達載體(如35S::miR396)和抑制表達載體(如MIM396)。在構(gòu)建35S::miR396過表達載體時,將miR396基因的編碼序列克隆到含有花椰菜花葉病毒35S啟動子的表達載體中,通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將該載體導入水稻細胞中,使miR396基因在水稻中過量表達。而MIM396載體則是通過人工合成一段與miR396互補的序列,將其導入水稻細胞后,能夠特異性地結(jié)合miR396,抑制其功能。同時,構(gòu)建了GRF基因的過表達載體(如35S::GRF)和RNA干擾載體(RNAi-GRF)。35S::GRF載體通過將GRF基因的編碼序列在35S啟動子的驅(qū)動下進行表達,使GRF基因在水稻中過表達;RNAi-GRF載體則是利用RNA干擾技術(shù),通過導入與GRF基因mRNA互補的雙鏈RNA,引發(fā)細胞內(nèi)的RNA干擾機制,特異性地降解GRF基因的mRNA,從而抑制GRF基因的表達。這些轉(zhuǎn)基因材料對于研究miR396-GRF模塊的調(diào)控機制具有重要意義,能夠從正反兩個方面驗證miR396和GRF基因在水稻生長發(fā)育及脅迫響應中的功能。實驗所需的主要試劑包括:RNA提取試劑TRIzol(Invitrogen公司),該試劑能夠高效地從水稻組織中提取總RNA,為后續(xù)的基因表達分析等實驗提供高質(zhì)量的RNA樣本;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司),用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以便進行實時熒光定量PCR等實驗;實時熒光定量PCR試劑(如SYBRGreenMasterMix,Roche公司),該試劑能夠在實時熒光定量PCR儀上對cDNA進行擴增,并通過檢測熒光信號的變化,精確測定基因的表達量;DNA提取試劑盒(Qiagen公司),用于從水稻組織中提取基因組DNA,用于基因編輯驗證、遺傳分析等實驗;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs公司)等分子生物學工具酶,在基因克隆、載體構(gòu)建等實驗中發(fā)揮關(guān)鍵作用,能夠?qū)NA進行切割和連接等操作。主要儀器設備包括:ABI7500實時熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems公司),該儀器具有高靈敏度、高準確性和高通量的特點,能夠快速、準確地檢測基因的表達水平;高速冷凍離心機(Eppendorf公司),用于對樣品進行離心分離,如在RNA提取、DNA提取等實驗中,能夠快速分離細胞組分和核酸等物質(zhì);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),為實驗提供無菌操作環(huán)境,防止實驗過程中受到微生物污染;恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司),用于水稻組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植株篩選等實驗,能夠精確控制培養(yǎng)溫度,滿足水稻生長發(fā)育的需求;PCR擴增儀(Bio-Rad公司),用于進行常規(guī)的PCR擴增反應,如基因克隆、基因編輯驗證等實驗。四、研究方法與實驗設計4.2實驗方法4.2.1基因編輯技術(shù)本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建miR396和GRF基因家族成員的突變體。該技術(shù)是一種源于細菌獲得性免疫系統(tǒng)的基因編輯工具,具有高效、精準、操作簡便等優(yōu)點,在植物基因功能研究和遺傳改良中得到了廣泛應用。首先,使用在線工具如CRISPR-P2.0(/CRISPR2/)進行sgRNA的設計。針對miR396基因家族的不同成員(如MIR396a-MIR396h)以及GRF基因家族成員(如OsGRF1-OsGRF10),選擇其外顯子區(qū)域或前體miR396的關(guān)鍵序列作為靶點。在設計sgRNA時,確保其GC含量在40%-60%之間,以保證sgRNA的穩(wěn)定性和活性。同時,通過BLAST比對水稻基因組序列,篩選出與其他基因無明顯同源性的sgRNA序列,以降低脫靶效應。例如,對于MIR396e基因,設計的sgRNA序列為5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3',該序列特異性地靶向MIR396e基因的關(guān)鍵區(qū)域,且在水稻基因組中無其他高度同源的匹配位點。將設計好的sgRNA序列與表達載體(如pYLCRISPR/Cas9Pubi-H載體)進行連接。首先,使用限制性內(nèi)切酶(如BsaI)對載體進行酶切,使其產(chǎn)生粘性末端。然后,將合成的sgRNA寡核苷酸序列進行退火處理,形成雙鏈DNA。利用T4DNA連接酶將雙鏈sgRNA與酶切后的載體進行連接,構(gòu)建成重組表達載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定,挑選出陽性克隆。對陽性克隆進行測序驗證,確保sgRNA序列正確插入到載體中。將測序驗證正確的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用電擊轉(zhuǎn)化法,將重組表達載體導入農(nóng)桿菌中。具體操作如下:取100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞,加入1-5μL重組表達載體,輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至預冷的電擊杯中。在電擊儀上設置合適的參數(shù)(如電壓2.5kV,電容25μF,電阻200Ω)進行電擊轉(zhuǎn)化。電擊后迅速加入1mL不含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基,在28℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)2-3h,使農(nóng)桿菌恢復生長。然后,將菌液涂布在含有相應抗生素(如卡那霉素、利福平)的YEP固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2-3天,挑選單菌落進行PCR鑒定和測序驗證。以粳稻品種日本晴的成熟胚為材料,誘導愈傷組織。將水稻成熟種子去殼后,用70%乙醇消毒1-2min,再用20%次氯酸鈉溶液消毒30-60min,期間不斷振蕩。消毒后用無菌蒸餾水沖洗種子4-5次,每次浸泡5-10min。將消毒后的種子接種到含有2,4-D的誘導培養(yǎng)基上,在28℃、黑暗條件下培養(yǎng)3-4周,誘導愈傷組織的形成。挑選生長旺盛、質(zhì)地緊密的胚性愈傷組織,用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。將含有重組表達載體的農(nóng)桿菌接種到含有相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,在28℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中,4℃、4000rpm離心10min,收集菌體。用含有乙酰丁香酮(AS)的AAM液體培養(yǎng)基重懸菌體,使OD600值調(diào)整為0.1-0.2,作為侵染液。將挑選好的水稻愈傷組織放入侵染液中,侵染15-30min,期間輕輕搖晃。侵染結(jié)束后,將愈傷組織取出,用無菌濾紙吸干表面多余的菌液,然后轉(zhuǎn)移到含有AS的共培養(yǎng)基上,在25℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)后的愈傷組織用含有頭孢霉素(500mg/L)的無菌水清洗5-6次,每次振蕩清洗10-15min,以去除殘留的農(nóng)桿菌。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素(50mg/L)和頭孢霉素(500mg/L)的篩選培養(yǎng)基上,在28℃、光照條件下培養(yǎng)2-3周,進行抗性愈傷組織的篩選。每隔1-2周更換一次篩選培養(yǎng)基,以保證篩選壓力。挑選生長良好的抗性愈傷組織,轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上,在25℃、光照條件下培養(yǎng)3-4周,誘導分化成苗。待幼苗長至3-5cm時,將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上,在25℃、光照條件下培養(yǎng)1-2周,促進根系生長。將生根良好的轉(zhuǎn)基因植株移栽到溫室中,進行后續(xù)的鑒定和分析。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行基因型鑒定。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA。根據(jù)sgRNA的靶位點序列,設計特異性引物,通過PCR擴增目的片段。PCR反應體系為25μL,包括10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mM)2μL,上下游引物(10μM)各0.5μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,模板DNA1-2μL,ddH2O補足至25μL。PCR反應條件為:95℃預變性5min;95℃變性30s,55-60℃退火30s,72℃延伸30-60s,共35個循環(huán);72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的條帶切膠回收,送測序公司進行測序。通過與野生型序列比對,分析突變體的基因型,確定基因編輯的類型和效率。例如,對于MIR396e突變體,通過測序分析發(fā)現(xiàn),部分轉(zhuǎn)基因植株在sgRNA的靶位點處發(fā)生了堿基缺失或插入突變,導致MIR396e基因功能喪失。4.2.2實時熒光定量PCR技術(shù)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,具有靈敏度高、特異性強、定量準確等優(yōu)點,廣泛應用于基因表達水平的檢測。根據(jù)miR396和GRF基因家族成員的序列信息,使用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。對于miR396,由于其成熟體序列較短,采用莖環(huán)引物法進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。莖環(huán)引物的設計依據(jù)miR396的3'端序列,通過添加一段莖環(huán)結(jié)構(gòu),使其能夠特異性地與miR396結(jié)合。例如,對于miR396a,設計的莖環(huán)引物序列為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACXXXXXX-3',其中XXXXXX為與miR396a3'端互補的序列。對于GRF基因,根據(jù)其編碼區(qū)序列設計引物,確保引物的特異性和擴增效率。引物設計時,保證引物長度在18-25bp之間,GC含量在40%-60%之間,引物的Tm值在58-62℃之間。同時,通過BLAST比對水稻基因組序列,確保引物只與目標基因特異性結(jié)合,避免非特異性擴增。例如,對于OsGRF4基因,設計的上游引物序列為5'-ATGGCTTCTGCTGCTGCT-3',下游引物序列為5'-TCAGCTTCTCCGCTCTCC-3',擴增片段長度為150bp。以水稻的根、莖、葉、穗等不同組織以及不同發(fā)育階段(如幼苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期等)的樣品為材料,使用TRIzol試劑提取總RNA。具體操作如下:取適量樣品,在液氮中迅速研磨成粉末狀,加入1mLTRIzol試劑,充分混勻。室溫靜置5min后,加入0.2mL氯仿,劇烈振蕩15s,室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min,取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5mL異丙醇,輕輕混勻,室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min,棄上清液。加入1mL75%乙醇,洗滌RNA沉淀,4℃、7500rpm離心5min,棄上清液。將RNA沉淀在超凈工作臺上晾干,加入適量的DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度,確保OD260/OD280值在1.8-2.0之間。同時,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度,確保RNA無降解。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(如TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應前,先使用gDNAEraser去除基因組DNA的污染。具體反應體系為:5×gDNAEraserBuffer2μL,gDNAEraser1μL,TotalRNA1μg,RNase-freedH2O補足至10μL。將反應體系在42℃孵育2min,然后加入5×PrimeScriptBuffer24μL,PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL,RTPrimerMix1μL,RNase-freedH2O補足至20μL。反轉(zhuǎn)錄反應條件為:37℃15min,85℃5s,4℃保存。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可直接用于后續(xù)的qRT-PCR反應,或保存在-20℃?zhèn)溆谩2捎肧YBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應。qRT-PCR反應體系為20μL,包括2×SYBRGreenMasterMix10μL,上下游引物(10μM)各0.5μL,cDNA模板1μL,ddH2O補足至20μL。反應在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進行,反應條件為:95℃預變性30s;95℃變性5s,60℃退火30s,共40個循環(huán);72℃延伸30s。在每個循環(huán)的退火階段采集熒光信號,以監(jiān)測PCR反應的進程。反應結(jié)束后,進行熔解曲線分析,以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。熔解曲線分析條件為:60℃-95℃,每升高0.5℃采集一次熒光信號。正常情況下,熔解曲線應出現(xiàn)單一的峰,表明擴增產(chǎn)物為特異性產(chǎn)物;若出現(xiàn)多個峰,則可能存在非特異性擴增或引物二聚體。選擇水稻中表達相對穩(wěn)定的基因(如OsActin1、OsUBQ5等)作為內(nèi)參基因,用于校正目的基因的表達水平。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。首先,計算每個樣品中目的基因和內(nèi)參基因的Ct值。然后,計算ΔCt值(ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因),表示目的基因相對于內(nèi)參基因的表達差異。接著,選擇一個對照樣品作為校準品,計算ΔΔCt值(ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt校準品)。最后,根據(jù)公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。例如,在分析miR396a在水稻不同組織中的表達水平時,以根組織為校準品,計算其他組織中miR396a相對于根組織的相對表達量。通過比較不同組織或不同處理條件下目的基因的相對表達量,分析miR396和GRF基因的表達模式和差異。4.2.3轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因?qū)胧荏w細胞,使其整合到基因組中并穩(wěn)定遺傳的技術(shù),在植物基因功能驗證和遺傳改良中具有重要作用。本研究通過構(gòu)建miR396和GRF基因的過表達載體和抑制表達載體,利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。從水稻基因組DNA中擴增miR396基因的前體序列或GRF基因的編碼區(qū)序列。根據(jù)基因序列設計特異性引物,引物兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶位點(如BamHI、KpnI等),以便后續(xù)與載體連接。PCR反應體系和條件與基因編輯技術(shù)中的PCR鑒定類似,但需要根據(jù)目的基因的長度和特性進行適當調(diào)整。例如,對于miR396a前體序列的擴增,反應體系為50μL,包括10×PCRBuffer5μL,dNTPs(2.5mM)4μL,上下游引物(10μM)各1μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL,模板DNA1-2μL,ddH2O補足至50μL。反應條件為:95℃預變性5min;95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸60s,共35個循環(huán);72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切膠回收目的條帶。將回收的目的基因片段與表達載體(如pCAMBIA1300-35S)進行連接。首先,用相應的限制性內(nèi)切酶對載體進行雙酶切,酶切后的載體經(jīng)凝膠回收純化。然后,使用T4DNA連接酶將目的基因片段與酶切后的載體進行連接。連接反應體系為10μL,包括10×T4DNALigaseBuffer1μL,載體片段1μL,目的基因片段3-5μL,T4DNALigase1μL,ddH2O補足至10μL。連接反應在16℃過夜進行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定,挑選出陽性克隆。對陽性克隆進行測序驗證,確保目的基因正確插入到載體中,且序列無突變。對于miR396的抑制表達,采用人工微小RNA(amiRNA)技術(shù)或靶標模擬(targetmimicry)技術(shù)。以amiRNA技術(shù)為例,使用WMD3(WebMicroRNADesigner3,/)在線工具設計針對miR396的amiRNA序列。設計時,根據(jù)miR396的成熟體序列,按照amiRNA設計原則,對amiRNA序列進行優(yōu)化,確保其與miR396具有高度的互補性,同時避免與其他基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合。將設計好的amiRNA序列克隆到表達載體(如pCAMBIA1300-35S)中,構(gòu)建成amiRNA表達載體。具體克隆方法與過表達載體構(gòu)建類似,通過限制性內(nèi)切酶酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟,獲得含有amiRNA表達框的重組載體。對重組載體進行測序驗證,確保amiRNA序列正確插入到載體中。將測序驗證正確的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,轉(zhuǎn)化方法同基因編輯技術(shù)中的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌用于侵染水稻愈傷組織,以獲得轉(zhuǎn)基因植株。以水稻成熟胚為材料,誘導愈傷組織,具體方法同基因編輯技術(shù)中的愈傷組織誘導。挑選生長旺盛、質(zhì)地緊密的胚性愈傷組織,用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。將含有重組表達載體的農(nóng)桿菌接種到含有相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,在28℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8。然后按照基因編輯技術(shù)中的遺傳轉(zhuǎn)化步驟,進行農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、篩選、分化和生根等操作,獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行分子鑒定,包括PCR鑒定和Southernblot鑒定。PCR鑒定用于初步檢測轉(zhuǎn)基因植株中是否整合了目的基因。根據(jù)目的基因和載體上的序列,設計特異性引物,以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系和條件與目的基因擴增時類似。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,若出現(xiàn)預期大小的條帶,則表明轉(zhuǎn)基因植株中可能含有目的基因。為了進一步確定目的基因的整合情況和拷貝數(shù),進行Southernblot鑒定。提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA,用合適的限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切后的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。以目的基因片段為探針,進行探針標記和雜交。探針標記可采用隨機引物法或PCR法,使用地高辛(DIG)等標記物。雜交后,通過化學發(fā)光法或顯色法檢測雜交信號。通過與野生型植株的雜交結(jié)果對比,分析目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的整合情況和拷貝數(shù)。例如,對于miR396過表達轉(zhuǎn)基因植株,通過Southernblot鑒定發(fā)現(xiàn),部分轉(zhuǎn)基因植株中目的基因以單拷貝形式整合到基因組中,而部分植株中存在多拷貝整合。對轉(zhuǎn)基因植株進行4.3實驗設計4.3.1miR396和GRF基因家族成員的鑒定與表達分析利用EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(/index.html)和NCBI數(shù)據(jù)庫(/),檢索水稻基因組中miR396和GRF基因家族成員的序列信息。通過生物信息學分析工具,如GeneStructureDisplayServer2.0(/),分析基因的結(jié)構(gòu)特征,包括外顯子、內(nèi)含子的數(shù)量和長度等。利用MapInspect軟件,確定基因在染色體上的定位,并繪制基因家族成員的染色體分布圖。使用MEME軟件(/)分析GRF基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,設置參數(shù)為:motif寬度范圍6-50個氨基酸,最大motif數(shù)量為10個。以粳稻日本晴為材料,在不同發(fā)育階段(幼苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期、成熟期)分別采集根、莖、葉、穗等組織樣品。每個發(fā)育階段設置3個生物學重復,每個重復選取3-5株生長一致的水稻植株,混合采集組織樣品。將采集的樣品迅速放入液氮中冷凍,然后保存于-80℃冰箱備用。利用TRIzol試劑提取各組織樣品的總RNA,通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度和完整性。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,利用設計好的特異性引物,采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR396和GRF基因在不同組織和發(fā)育階段的表達水平。每個樣品設置3個技術(shù)重復,以水稻OsActin1基因作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果,繪制基因表達熱圖和折線圖,分析miR396和GRF基因在水稻不同組織和發(fā)育階段的表達模式和變化規(guī)律。同時,利用原位雜交技術(shù),進一步確定miR396和GRF基因在水稻組織和細胞水平的表達定位。以地高辛(DIG)標記的miR396或GRF基因的特異性探針,與水稻組織切片進行雜交,通過顯色反應觀察基因在組織和細胞中的表達位置和強度。實驗設置陽性對照和陰性對照,以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。4.3.2miR396對GRF基因的調(diào)控機制研究選取預測的miR396與GRF基因mRNA的靶向結(jié)合位點,設計特異性引物,采用5'-RACE技術(shù)驗證二者的靶向互作關(guān)系。以水稻總RNA為模板,利用5'-RACE試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,切膠回收目的條帶,送測序公司進行測序。通過與GRF基因mRNA序列比對,確定miR396對GRF基因的切割位點。利用定點突變技術(shù),對GRF基因mRNA中miR396的結(jié)合位點進行突變。以GRF基因的cDNA為模板,設計含有突變位點的引物,通過PCR擴增獲得突變后的GRF基因片段。將突變后的GRF基因片段克隆到表達載體中,構(gòu)建含有miR396結(jié)合位點突變的GRF基因表達載體(如pCAMBIA1300-35S-mGRF)。同時,構(gòu)建miR396過表達載體(35S::miR396)和抑制表達載體(MIM396)。將這些載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,然后利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將載體導入粳稻日本晴中,獲得相應的轉(zhuǎn)基因水稻植株。對轉(zhuǎn)基因水稻植株進行分子鑒定,包括PCR鑒定和Southernblot鑒定,確定目的基因的整合情況和拷貝數(shù)。通過qRT-PCR和Westernblot技術(shù),檢測轉(zhuǎn)基因植株中miR396和GRF基因的表達水平,以及GRF蛋白的含量。比較野生型、miR396過表達、miR396抑制表達、GRF基因過表達以及miR396結(jié)合位點突變的GRF基因過表達等不同轉(zhuǎn)基因植株中GRF基因mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。例如,通過轉(zhuǎn)錄抑制劑處理轉(zhuǎn)基因植株,檢測GRF基因mRNA在不同時間點的降解情況,分析miR396對GRF基因mRNA穩(wěn)定性的影響。利用多聚核糖體分析技術(shù),檢測GRF基因mRNA與核糖體的結(jié)合情況,分析miR396對GRF基因翻譯效率的影響。4.3.3miR396-GRF模塊對水稻生長發(fā)育的調(diào)控功能解析種植野生型粳稻日本晴、miR396基因家族成員突變體(如mir396e、mir396f、mir396ef雙突變體)、GRF基因家族成員突變體(如osgrf1、osgrf2等單突變體以及多個GRF基因的復合突變體)、miR396過表達和抑制表達轉(zhuǎn)基因植株、GRF基因過表達和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株。每個株系種植30-50株,設置3次生物學重復,種植于溫室或試驗田中,按照常規(guī)水稻栽培管理方法進行管理。在水稻生長的不同時期(如苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期、成熟期),對各株系的株型、葉片形態(tài)、根系發(fā)育、穗部性狀以及種子發(fā)育等表型進行詳細觀察和測量。株型方面,測量株高、分蘗數(shù)、莖粗等指標;葉片形態(tài)方面,測量葉片長度、寬度、卷曲程度等指標;根系發(fā)育方面,測量主根長度、側(cè)根數(shù)量、根表面積等指標;穗部性狀方面,測量穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率等指標;種子發(fā)育方面,測量種子長度、寬度、厚度、千粒重等指標。統(tǒng)計分析不同株系之間的表型差異,確定miR396-GRF模塊對水稻生長發(fā)育相關(guān)性狀的影響。取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株不同組織(如葉片、根、莖、穗等),制作超薄切片,利用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。SEM觀察細胞的表面形態(tài)和排列方式,TEM觀察細胞內(nèi)部的細胞器結(jié)構(gòu)、細胞壁厚度等。統(tǒng)計分析不同株系之間細胞大小、數(shù)量、形態(tài)以及細胞器結(jié)構(gòu)等方面的差異,揭示miR396-GRF模塊對水稻細胞增殖、分化和伸長的影響。以GRF蛋白為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與GRF蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。將GRF基因克隆到酵母雙雜交誘餌載體中,轉(zhuǎn)化酵母細胞。然后將水稻cDNA文庫轉(zhuǎn)化到含有誘餌載體的酵母細胞中,通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選和報告基因檢測,獲得與GRF蛋白相互作用的陽性克隆。對陽性克隆進行測序和生物信息學分析,鑒定與GRF蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。利用雙分子熒光互補(BiFC)技術(shù)在煙草葉片或水稻原生質(zhì)體中驗證酵母雙雜交篩選得到的蛋白質(zhì)與GRF蛋白的相互作用。將GRF蛋白和候選相互作用蛋白分別與熒光蛋白的N端和C端融合,共轉(zhuǎn)化煙草葉片或水稻原生質(zhì)體。通過熒光顯微鏡觀察,檢測熒光信號的產(chǎn)生,確定二者是否在細胞內(nèi)發(fā)生相互作用。綜合qRT-PCR、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析以及表型分析等結(jié)果,構(gòu)建miR396-GRF模塊調(diào)控水稻生長發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡,深入解析其調(diào)控水稻生長發(fā)育的分子機制。4.3.4miR396-GRF模塊在水稻響應脅迫中的作用機制研究將野生型粳稻日本晴、miR396基因家族成員突變體、GRF基因家族成員突變體、miR396過表達和抑制表達轉(zhuǎn)基因植株、GRF基因過表達和RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株種植于溫室中,待水稻生長至三葉一心期時,進行不同的脅迫處理。非生物脅迫處理包括干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫。干旱脅迫采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬,將水稻幼苗根部浸泡在含有15%PEG-600
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