LASS2與ATP6L相互作用誘導肝癌細胞凋亡的分子機制解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌的現狀肝癌作為一種常見且危害極大的惡性腫瘤，在全球范圍內呈現出較高的發病率和死亡率，嚴重威脅著人類的生命健康。據世界衛生組織（WHO）數據顯示，2020年全球肝癌新發病例數約為90.5萬例，死亡病例數約達83萬例，使其成為全球第六大常見癌癥以及第四大癌癥死亡原因。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，是第三大常見癌癥和第二大癌癥死亡原因，同年新發病例數約41.1萬例，死亡病例數約39.1萬例。肝癌的發病與多種因素相關，其中乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是主要的致病因素之一，長期的病毒感染可引發肝臟慢性炎癥，進而逐步發展為肝硬化，最終增加肝癌的發病風險。大量飲酒、吸煙、肥胖等不良生活習慣，以及黃曲霉毒素等環境致癌物的暴露，也在肝癌的發生發展過程中起到了推波助瀾的作用。肝癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現，多數患者確診時已處于中晚期。中晚期肝癌患者往往伴隨腫瘤的轉移和擴散，這不僅增加了治療的難度，還使得患者的預后情況極不理想。目前，肝癌的主要治療手段包括手術切除、肝移植、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法各自存在局限性。手術切除對于早期肝癌患者效果相對較好，但對于中晚期患者，由于腫瘤的擴散和患者肝功能的受損，手術切除的可行性大大降低；肝移植雖然是一種有效的治療方式，但面臨著供體短缺、免疫排斥等問題；化療和放療在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，引發一系列嚴重的副作用；靶向治療和免疫治療雖然為肝癌患者帶來了新的希望，但部分患者對這些治療方法并不敏感，且長期使用可能會出現耐藥現象。因此，深入探究肝癌的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高肝癌患者的生存率和生活質量，具有極其重要的現實意義。1.1.2細胞凋亡與肝癌治療細胞凋亡是一種由基因調控的程序性細胞死亡過程，在維持生物體正常發育、內環境穩定以及發揮防御功能等方面發揮著關鍵作用。在正常生理狀態下，細胞凋亡受到嚴格的調控，它能夠及時清除體內多余、受損或衰老的細胞，確保組織和器官的正常功能。當細胞凋亡機制出現異常時，細胞的增殖與死亡平衡被打破，就可能導致腫瘤等疾病的發生。在腫瘤的發展過程中，癌細胞往往獲得了逃避細胞凋亡的能力，這使得它們能夠持續增殖、擴散，進而對機體造成嚴重危害。在肝癌的發生發展進程中，細胞凋亡的異常同樣扮演著重要角色。研究表明，肝癌細胞中存在多種抑制細胞凋亡的信號通路被激活，以及促進細胞凋亡的信號通路被抑制的現象，這使得肝癌細胞能夠逃脫機體的免疫監視和清除機制，不斷生長和擴散。通過觸發肝癌細胞的凋亡通路來治療肝癌，成為了極具潛力的治療策略?；謴突蛟鰪姼伟┘毎牡蛲鲞M程，可以誘導癌細胞的選擇性死亡，有效抑制腫瘤的生長和擴散。在實驗室研究和臨床實踐中，已經有多種方法被嘗試用于促進肝癌細胞凋亡，化療藥物通過干擾癌細胞的增殖過程，啟動細胞凋亡通路來誘導癌細胞死亡；免疫療法則通過激活患者自身的免疫系統，利用免疫細胞上的死亡受體與癌細胞結合，以細胞凋亡的方式殺死癌細胞。然而，目前這些治療方法在誘導肝癌細胞凋亡方面仍存在諸多問題，如部分肝癌細胞對凋亡誘導產生抵抗，治療過程中引發的不良反應等。因此，深入研究肝癌細胞凋亡的調控機制，尋找新的能夠有效誘導肝癌細胞凋亡的靶點和方法，對于提升肝癌的治療效果至關重要。1.1.3LASS2與ATP6L研究概述LASS2，全稱長鏈堿性神經酰胺合成酶2（long-chainbaseceramidesynthase2），又名腫瘤轉移抑制基因（tumormetastasissuppressorgene1，TMSG-1），是一種在腫瘤研究中備受關注的基因。研究發現，LASS2在肝癌組織中的表達水平顯著低于正常肝組織，其低表達與肝癌的發生、發展密切相關。LASS2能夠通過多種機制發揮抑制腫瘤的作用，它可以抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，降低腫瘤細胞在體內的轉移風險；還能促進細胞凋亡，通過激活相關凋亡信號通路，誘導癌細胞死亡。具體來說，LASS2可能參與調節細胞內神經酰胺的合成，神經酰胺作為一種重要的細胞信號分子，在細胞凋亡、增殖和分化等過程中發揮著關鍵作用。當LASS2表達下調時，神經酰胺合成受阻，可能導致細胞凋亡減少，從而促進腫瘤的發展。ATP6L，即ATPaseH+轉運酶亞基L（ATPaseH+-transportingsubunitL），是液泡型ATP酶（V-ATPase）質子泵的c亞基。ATP6L參與細胞膜鈣離子傳輸和溶酶體酸化調節等重要生理過程，其表達水平與腫瘤細胞的生長和抑制作用緊密相關。在腫瘤細胞中，ATP6L的高表達通常與腫瘤細胞的生長抑制相關，它可能通過調節細胞內的離子平衡和pH值，影響腫瘤細胞的代謝和生存環境，進而抑制腫瘤細胞的生長。研究還發現，ATP6L可能參與腫瘤細胞的凋亡調控過程，但其具體機制尚不完全明確。先前的研究已經表明，LASS2與ATP6L之間存在相互作用的可能性，但二者相互作用的具體機制以及這種相互作用對肝癌細胞凋亡的影響，尚未得到深入研究。深入探究LASS2與ATP6L之間的相互作用機制，以及這種相互作用是否能夠通過活化凋亡途徑來抑制肝癌細胞生長，對于揭示肝癌的發病機制、尋找新的治療靶點具有重要的理論和實踐意義。這不僅有助于為肝癌的治療提供新的思路和策略，還可能為開發更加有效的肝癌治療方法奠定基礎，從而為肝癌患者帶來新的希望。1.2研究目的本研究旨在深入探究LASS2與ATP6L之間的相互作用機制，明確二者相互作用對肝癌細胞凋亡的影響，并揭示其背后潛在的作用機制，為肝癌的治療提供新的靶點和理論依據。具體研究目的如下：運用蛋白體外相互作用實驗、Co-Immunoprecipitation（Co-IP）和GSTpull-down試驗等技術，驗證LASS2與ATP6L在肝癌細胞內是否存在直接相互作用，并確定其相互作用的具體方式和結合位點，精準解析二者之間的相互作用關系。在肝癌細胞HepG2中構建LASS2和ATP6L過表達及抑制的細胞系，利用實時熒光定量PCR分析、Westernblotting等實驗方法，檢測不同細胞組中LASS2和ATP6L的表達水平，系統研究二者相互作用對彼此表達水平的影響，為后續深入研究其功能機制奠定基礎。通過細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞術等實驗手段，測定各組細胞的凋亡率，觀察LASS2與ATP6L對肝癌細胞凋亡過程的影響，明確二者相互作用在肝癌細胞凋亡調控中的關鍵作用。采用Westernblotting分析各組細胞中關鍵凋亡因子（如Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3等）以及相關信號通路蛋白（如p-ERK等）的表達，深入探究LASS2與ATP6L相互作用是否通過調節這些凋亡因子和信號通路，進而活化肝癌細胞凋亡途徑，全面揭示其調控肝癌細胞凋亡的內在機制。1.3研究方法與創新點1.3.1研究方法細胞系的建立與分組：選取肝癌細胞HepG2作為研究對象，通過基因轉染技術，構建LASS2過表達細胞系（LASS2-OE組）、ATP6L過表達細胞系（ATP6L-OE組）、LASS2基因敲除細胞系（LASS2-KO組）和ATP6L基因敲除細胞系（ATP6L-KO組），同時設置空白對照組（Control組）和陰性對照組（NC組）。利用流式細胞術對各組細胞的凋亡率和細胞增殖能力進行檢測，以評估不同細胞系的生物學特性。蛋白體外相互作用實驗：運用蛋白體外相互作用實驗，初步觀察LASS2與ATP6L之間的相互作用關系。隨后，利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）技術，在細胞裂解液中加入抗LASS2或抗ATP6L的抗體，沉淀與之結合的蛋白復合物，通過Westernblotting檢測沉淀產物中是否存在另一種蛋白，從而驗證LASS2與ATP6L在細胞內的相互作用。此外，采用谷胱甘肽S-轉移酶（GlutathioneS-transferase，GST）pull-down試驗，將GST標記的LASS2蛋白與帶有His標簽的ATP6L蛋白在體外孵育，利用谷胱甘肽親和樹脂捕獲GST融合蛋白及其結合的蛋白，通過SDS-PAGE和Westernblotting分析檢測二者是否發生直接相互作用。實時熒光定量PCR分析：提取各組細胞的總RNA，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR反應，檢測LASS2和ATP6L在不同細胞組中的mRNA表達水平。通過比較各組Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，分析LASS2與ATP6L之間的相互作用對其表達水平的影響。Westernblotting檢測蛋白表達：提取各組細胞的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，加入針對關鍵凋亡因子（如Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3等）以及相關信號通路蛋白（如p-ERK等）的一抗，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。利用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值，確定LASS2和ATP6L的相互作用是否會調節這些蛋白的表達，進而影響肝癌細胞凋亡途徑的活化。細胞凋亡檢測：采用細胞凋亡分析試劑盒（如AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒）檢測各組細胞的凋亡率。將細胞消化收集后，用PBS洗滌兩次，加入結合緩沖液重懸細胞。按照試劑盒說明書，依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15-20分鐘。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙陽性細胞的比例，確定細胞凋亡率，觀察LASS2和ATP6L對細胞凋亡過程的影響。1.3.2創新點研究視角創新：以往對肝癌細胞凋亡機制的研究多集中在單一基因或信號通路的作用，而本研究聚焦于LASS2與ATP6L這兩種蛋白之間的相互作用對肝癌細胞凋亡的影響，從蛋白-蛋白相互作用的全新視角出發，為深入理解肝癌細胞凋亡的調控網絡提供了新的切入點，有助于揭示肝癌發生發展過程中更為復雜和精細的分子機制，為肝癌治療靶點的篩選提供了新的方向。技術運用創新：在實驗技術方面，綜合運用多種先進的分子生物學和細胞生物學技術，如雙分子熒光互補分析技術用于直觀觀察LASS2與ATP6L在細胞內的相互作用及亞細胞定位，細菌內同源重組法構建含LASS2基因全長的重組腺病毒載體以高效實現基因過表達，這些技術的聯合應用不僅提高了實驗結果的準確性和可靠性，還為相關領域的研究提供了技術參考和借鑒，推動了肝癌研究技術手段的發展。理論創新：本研究有望揭示LASS2與ATP6L相互作用調控肝癌細胞凋亡的全新分子機制，為肝癌的發病機制理論增添新的內容。如果能夠證實二者相互作用通過調節特定的凋亡因子和信號通路來活化凋亡途徑，將為肝癌的治療提供全新的理論依據，可能會促使開發出基于調節LASS2-ATP6L相互作用的新型治療策略，為肝癌治療領域帶來理論和實踐上的突破。二、相關理論基礎2.1肝癌的生物學特性2.1.1肝癌細胞的生長與增殖特點肝癌細胞與正常肝細胞相比，具有顯著不同的生長與增殖特點，這些特點在肝癌的發生發展過程中起著關鍵作用。肝癌細胞呈現出異常旺盛的生長態勢，其生長速度遠遠超過正常肝細胞。正常肝細胞的生長受到機體嚴格的調控機制約束，在細胞周期的各個階段，都有一系列復雜的信號通路和調控因子參與，確保細胞的增殖與分化維持在平衡狀態。然而，肝癌細胞的這些調控機制發生了紊亂，使得它們能夠突破正常的生長限制，持續進行分裂和增殖。研究表明，肝癌細胞中多種原癌基因被激活，如c-Myc、Ras等，這些原癌基因編碼的蛋白質能夠促進細胞周期的進程，加速細胞的增殖。c-Myc基因可以通過調節細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，促使細胞從G1期進入S期，從而推動細胞的增殖。肝癌細胞的增殖具有失控性。它們不再像正常細胞那樣對生長因子和細胞間信號作出正常響應，即使在缺乏某些必要生長信號的情況下，依然能夠繼續增殖。這種失控的增殖使得肝癌細胞能夠在體內迅速積累，形成腫瘤組織，并不斷侵犯周圍的正常組織和器官。肝癌細胞還能夠通過自分泌和旁分泌的方式，分泌多種生長因子，如表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等，這些生長因子與其自身或周圍細胞表面的受體結合，形成正反饋調節環路，進一步促進細胞的增殖。肝癌細胞對營養物質的攝取和利用也表現出異常。它們需要大量的葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等營養物質來滿足其快速增殖的需求，為此，肝癌細胞會通過上調葡萄糖轉運蛋白（如GLUT1）的表達，增強對葡萄糖的攝取能力，還會激活相關代謝通路，提高對氨基酸和脂肪酸的利用效率，以維持其高速的增殖狀態。這種異常的生長與增殖特點，是肝癌難以治療的重要原因之一，也為肝癌的治療提供了潛在的靶點。2.1.2肝癌的轉移與侵襲機制肝癌的轉移與侵襲是導致肝癌患者預后不良的主要原因，其過程涉及復雜的分子機制和多個生物學過程。肝癌細胞具有較強的侵襲能力，能夠突破肝臟組織的基底膜和細胞外基質（ECM），向周圍組織浸潤。在這一過程中，肝癌細胞會分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、絲氨酸蛋白酶等，這些蛋白酶能夠降解基底膜和ECM的主要成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，為肝癌細胞的遷移開辟道路。MMP-2和MMP-9可以降解IV型膠原蛋白，破壞基底膜的結構，使肝癌細胞能夠更容易地穿過基底膜，進入周圍組織。肝癌細胞還會通過改變自身的黏附特性來增強侵襲能力。它們會下調細胞間黏附分子，如E-鈣黏蛋白的表達，減少細胞間的黏附力，使得細胞更容易脫離原有的細胞群體，發生遷移。同時，上調整合素等細胞與ECM的黏附分子的表達，增強肝癌細胞與ECM的黏附，從而有利于細胞在ECM上的遷移。一旦肝癌細胞突破基底膜，便會進入血液循環或淋巴循環，進而發生遠處轉移。在血液循環中，肝癌細胞需要逃避機體免疫系統的監視和清除，同時與血管內皮細胞相互作用，黏附于血管壁，然后穿出血管壁，在遠處組織中形成新的轉移灶。肝癌細胞表面表達的某些分子，如CD44、CD133等，能夠與血管內皮細胞表面的相應受體結合，促進肝癌細胞的黏附。肝癌細胞還會分泌一些細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF），促進腫瘤血管的生成，為癌細胞的轉移提供有利的微環境。VEGF可以刺激血管內皮細胞的增殖和遷移，形成新的血管，這些新生血管不僅為腫瘤細胞提供營養，還為癌細胞進入血液循環提供了通道。在遠處組織中，肝癌細胞會在適宜的微環境中定植并繼續增殖，形成轉移瘤。這一過程涉及癌細胞與靶器官微環境中的細胞和分子相互作用，如癌細胞與靶器官中的成纖維細胞、免疫細胞等相互作用，調節癌細胞的存活、增殖和侵襲能力。肝癌的轉移與侵襲機制十分復雜，深入研究這些機制，對于開發有效的抗轉移治療策略具有重要意義。2.2細胞凋亡的調控機制細胞凋亡是一個高度復雜且精細調控的過程，涉及多種信號通路和調控因子的相互作用。在細胞凋亡的調控網絡中，內源性凋亡通路和外源性凋亡通路是兩條主要的信號傳導途徑，它們相互協作，共同維持細胞凋亡的平衡，確保細胞的正常生理功能。當這些通路發生異常時，細胞凋亡的平衡被打破，可能導致腫瘤等疾病的發生。深入了解細胞凋亡的調控機制，對于揭示腫瘤的發病機制以及開發有效的治療策略具有重要意義。2.2.1內源性凋亡通路內源性凋亡通路，又稱為線粒體介導的凋亡通路，在細胞凋亡過程中發揮著核心作用，其主要由線粒體及其相關的凋亡蛋白所調控。線粒體不僅是細胞的能量代謝中心，也是細胞凋亡信號轉導的關鍵場所。在正常生理狀態下，線粒體的外膜維持著相對穩定的結構和功能，內膜則存在著質子梯度，通過氧化磷酸化產生ATP，為細胞提供能量。當細胞受到內部應激信號（如DNA損傷、氧化應激、生長因子缺乏等）的刺激時，線粒體的功能和結構會發生顯著變化。這些應激信號會激活一系列上游信號通路，如p53信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等，進而影響線粒體的穩定性。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在DNA損傷等應激情況下，會被激活并轉位到細胞核內，調節一系列與細胞凋亡相關基因的表達，其中包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2家族蛋白是內源性凋亡通路的關鍵調控因子，根據其功能可分為促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間的平衡關系決定了細胞是否走向凋亡。在正常細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL等主要定位于線粒體外膜，通過與促凋亡蛋白相互作用，抑制其活性，從而維持線粒體的穩定。當細胞受到凋亡刺激時，促凋亡蛋白Bax和Bak會發生構象變化，從細胞質轉位到線粒體外膜上。Bax和Bak在線粒體外膜上寡聚化，形成孔道結構，導致線粒體膜通透性增加（MMP）。這種膜通透性的改變使得線粒體膜間隙中的多種促凋亡因子，如細胞色素c（Cytc）、凋亡誘導因子（AIF）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑（Smac/DIABLO）等釋放到細胞質中。細胞色素c是內源性凋亡通路中一個關鍵的信號分子。一旦釋放到細胞質中，細胞色素c會與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體。Apaf-1含有一個N端的Caspase募集結構域（CARD）和多個WD40重復序列。在ATP/dATP的存在下，細胞色素c與Apaf-1的結合會導致Apaf-1發生自身寡聚化，形成一個七聚體的凋亡小體。凋亡小體通過其CARD結構域招募并激活下游的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9。Caspase-9是一種起始Caspase，它被激活后會進一步切割并激活下游的效應Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7。這些效應Caspase具有廣泛的底物特異性，它們可以切割細胞內的多種關鍵蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細胞骨架蛋白等，導致細胞結構和功能的破壞，最終引發細胞凋亡。除了細胞色素c，線粒體釋放的其他促凋亡因子也在細胞凋亡過程中發揮著重要作用。凋亡誘導因子（AIF）是一種位于線粒體膜間隙的黃素蛋白，它在細胞凋亡時會被釋放到細胞質中，然后轉位到細胞核內。在細胞核內，AIF可以誘導染色質凝集和DNA大片段斷裂，從而促進細胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑（Smac/DIABLO）則通過與凋亡抑制蛋白（IAPs）結合，解除IAPs對Caspase的抑制作用，增強Caspase的活性，促進細胞凋亡。內源性凋亡通路通過線粒體及其相關凋亡蛋白的協同作用，構成了一個復雜而精細的調控網絡，在維持細胞內環境穩定和細胞命運決定中發揮著至關重要的作用。2.2.2外源性凋亡通路外源性凋亡通路，也被稱為死亡受體介導的凋亡通路，是細胞凋亡的另一條重要途徑，主要由細胞表面的死亡受體及其相關的信號分子所介導。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，其共同特點是在胞外區域含有富含半胱氨酸的重復序列，在胞內區域則含有一段被稱為死亡結構域（DD）的約80個氨基酸殘基的蛋白結合域。當死亡受體與其相應的配體結合后，會引發一系列的信號轉導事件，最終導致細胞凋亡。在眾多死亡受體中，Fas（又稱CD95）和腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）是最為典型的代表，它們在細胞凋亡的調控中發揮著關鍵作用。Fas配體（FasL）是一種跨膜蛋白，主要表達于活化的T淋巴細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞表面。當FasL與靶細胞表面的Fas受體結合后，Fas受體的胞內死亡結構域會發生聚集，招募一種含有死亡結構域的接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomainprotein）。FADD通過其N端的死亡效應結構域（DED）與pro-Caspase-8的DED結構域相互作用，形成一個死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，pro-Caspase-8發生自身切割和激活，形成具有活性的Caspase-8。激活的Caspase-8作為起始Caspase，可以直接切割并激活下游的效應Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，從而啟動細胞凋亡程序。腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）的激活過程與Fas類似。腫瘤壞死因子α（TNFα）是TNFR1的主要配體，當TNFα與TNFR1結合后，TNFR1的胞內死亡結構域會招募TRADD（TNFR-associateddeathdomainprotein）。TRADD通過與FADD、RIP1（receptor-interactingprotein1）等接頭蛋白相互作用，形成一個復雜的信號復合物。在這個復合物中，FADD可以招募并激活pro-Caspase-8，進而啟動Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。RIP1則可以通過激活NF-κB（nuclearfactor-κB）等信號通路，調節細胞的生存和凋亡。在某些情況下，RIP1還可以通過與其他蛋白相互作用，誘導細胞壞死，這表明外源性凋亡通路與細胞壞死之間存在著密切的聯系。外源性凋亡通路還存在著一種放大機制，即通過Caspase-8切割Bid，產生截短的tBid。tBid可以轉位到線粒體，與Bax和Bak相互作用，促進線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素c等促凋亡因子，從而將外源性凋亡通路與內源性凋亡通路聯系起來。這種聯系使得細胞凋亡的調控更加復雜和精細，也增強了細胞對凋亡信號的響應能力。外源性凋亡通路通過死亡受體及其相關信號分子的相互作用，為細胞提供了一種對外界凋亡信號的快速響應機制，在免疫調節、腫瘤監視等生理和病理過程中發揮著重要作用。2.3LASS2和ATP6L的生物學功能2.3.1LASS2的結構與功能LASS2基因，又被稱作腫瘤轉移抑制基因1（TMSG-1），是一種具有重要生物學功能的基因。它在人體多種組織和器官中廣泛表達，包括肝臟、肺、腎臟、心臟等，這表明其在維持機體正常生理功能方面發揮著不可或缺的作用。從基因結構上看，LASS2基因位于人類染色體11q13.5區域，其編碼的蛋白質由429個氨基酸殘基組成。該蛋白質包含多個功能結構域，其中最為關鍵的是神經酰胺合成酶結構域，這一結構域賦予了LASS2催化神經酰胺合成的能力。神經酰胺作為一種重要的細胞信號分子，在細胞凋亡、增殖、分化以及細胞間通訊等過程中發揮著關鍵作用。在細胞生長調控方面，LASS2發揮著重要的抑制作用。研究表明，在多種腫瘤細胞系中，如肝癌細胞系HepG2、肺癌細胞系A549等，上調LASS2的表達能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長和增殖。其作用機制主要與LASS2參與調節細胞周期進程有關。LASS2可以通過調節細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶的表達和活性，使細胞周期阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。LASS2還能夠通過抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，降低腫瘤細胞在體內的轉移風險。在肝癌細胞中，LASS2的過表達可以顯著降低細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與LASS2調節細胞外基質降解酶的表達和活性，以及影響細胞黏附分子的表達有關。LASS2在細胞凋亡調控中也扮演著關鍵角色。當細胞受到凋亡刺激時，LASS2能夠通過激活內源性凋亡通路，誘導細胞凋亡。具體來說，LASS2可以促進神經酰胺的合成，神經酰胺能夠激活下游的凋亡相關蛋白，如Bax、Bak等，促使線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素c等促凋亡因子，進而激活Caspase級聯反應，導致細胞凋亡。LASS2還可以通過調節其他凋亡相關信號通路，如JNK信號通路、p53信號通路等，協同促進細胞凋亡。在多種腫瘤細胞中，LASS2的低表達與細胞凋亡抵抗密切相關，這進一步表明LASS2在細胞凋亡調控中的重要作用。作為一種重要的腫瘤抑制基因，LASS2在腫瘤的發生發展過程中發揮著關鍵的抑制作用。臨床研究發現，在肝癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中，LASS2的表達水平明顯低于正常組織，且其低表達與腫瘤的惡性程度、轉移潛能以及患者的預后不良密切相關。通過恢復或上調腫瘤細胞中LASS2的表達，可以有效抑制腫瘤細胞的生長和轉移，促進腫瘤細胞凋亡，為腫瘤的治療提供了新的靶點和策略。2.3.2ATP6L的結構與功能ATP6L，即ATPaseH+轉運酶亞基L，是液泡型ATP酶（V-ATPase）質子泵的c亞基，在細胞的多種生理過程中發揮著重要作用。從分子結構上看，ATP6L蛋白由約160個氨基酸殘基組成，其分子結構中包含多個跨膜結構域，這些跨膜結構域使得ATP6L能夠鑲嵌于細胞膜和細胞器膜上，參與構成V-ATPase質子泵的功能結構。V-ATPase是一種廣泛存在于真核細胞中的質子泵，它由多個亞基組成，能夠利用ATP水解產生的能量將質子從細胞內轉運到細胞外或細胞器內，從而調節細胞內和細胞器內的pH值。ATP6L作為V-ATPase質子泵的c亞基，在質子轉運過程中發揮著關鍵作用，它不僅參與維持細胞內的酸堿平衡，還對細胞的多種生理功能產生影響。在細胞膜鈣離子傳輸過程中，ATP6L發揮著重要的調節作用。研究表明，ATP6L能夠通過與細胞膜上的鈣離子通道或其他鈣離子轉運蛋白相互作用，調節細胞膜對鈣離子的通透性，從而影響細胞內鈣離子的濃度。細胞內鈣離子濃度的變化在細胞的多種生理過程中起著關鍵作用，如細胞信號傳導、細胞增殖、細胞凋亡等。當ATP6L的功能異常時，可能會導致細胞膜鈣離子傳輸紊亂，進而影響細胞的正常生理功能。在腫瘤細胞中，ATP6L的異常表達可能會導致細胞內鈣離子濃度失調，影響腫瘤細胞的生長和凋亡。ATP6L還參與溶酶體酸化調節過程。溶酶體是細胞內的一種重要細胞器，其內部呈酸性環境，這種酸性環境對于溶酶體發揮正常的消化和降解功能至關重要。V-ATPase質子泵在溶酶體膜上大量存在，能夠將質子泵入溶酶體內部，維持溶酶體的酸性環境。ATP6L作為V-ATPase質子泵的c亞基，在溶酶體酸化過程中起著不可或缺的作用。當ATP6L的表達或功能受到抑制時，V-ATPase質子泵的活性降低，溶酶體酸化受阻，導致溶酶體功能異常。溶酶體功能異常可能會影響細胞內物質的降解和代謝，進而影響細胞的正常生理功能。在腫瘤細胞中，溶酶體酸化異常與腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移密切相關，因此，ATP6L在溶酶體酸化調節方面的作用對于腫瘤的研究具有重要意義。ATP6L的表達水平與腫瘤細胞的生長和抑制作用緊密相關。在多種腫瘤細胞中，如肝癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞等，ATP6L的高表達通常與腫瘤細胞的生長抑制相關。其作用機制可能與ATP6L調節細胞內的離子平衡和pH值，影響腫瘤細胞的代謝和生存環境有關。高表達的ATP6L可能會增強V-ATPase質子泵的活性，使細胞內的酸性環境增強，從而抑制腫瘤細胞的生長。ATP6L還可能通過調節細胞內的信號通路，如PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等過程。研究ATP6L的結構與功能，對于深入理解腫瘤細胞的生物學特性以及開發新的腫瘤治療策略具有重要的理論和實踐意義。三、LASS2與ATP6L相互作用的驗證3.1實驗材料與方法3.1.1細胞系的選擇與培養本研究選用人肝癌細胞系HepG2和SMMC-7721作為主要研究對象。HepG2細胞源自一名15歲白人男性的肝癌組織，具有上皮樣形態，貼壁生長。該細胞系保留了肝細胞的一些特性，如能夠合成和分泌多種血漿蛋白，并且對多種細胞因子和生長因子具有響應性。HepG2細胞在肝癌研究中應用廣泛，其基因背景和生物學特性已被深入研究，為后續實驗結果的分析和比較提供了豐富的參考資料。SMMC-7721細胞同樣來源于人肝癌組織，呈上皮細胞樣形態，貼壁生長。它具有較高的增殖能力和侵襲潛能，在肝癌的轉移和侵襲機制研究中具有重要價值。這兩種細胞系在肝癌研究領域被廣泛使用，且它們對凋亡誘導的敏感性存在一定差異，有助于全面研究LASS2與ATP6L相互作用對肝癌細胞凋亡的影響。細胞培養條件如下：將HepG2和SMMC-7721細胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養基中。培養環境為37℃、5%CO?的恒溫培養箱，培養箱內濕度保持在70%-80%，以維持細胞生長的最佳環境。細胞常規培養至對數生長期時進行后續實驗操作。在細胞傳代過程中，當細胞密度達到80%-90%融合度時，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液進行消化傳代。具體操作如下，棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除殘余的培養液和血清，因為血清中含有胰酶的抑制因子，會影響消化效果。加入適量消化液，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，當大部分細胞變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。按6-8mL/瓶補加培養基，輕輕吹打細胞懸液，使細胞徹底分散，然后將細胞懸液轉移至離心管中，1000RPM離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后再次吹勻。最后，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8mL培養基的培養皿或者培養瓶中繼續培養。3.1.2構建過表達和抑制表達細胞系構建LASS2過表達細胞系時，首先獲取人LASS2基因的全長編碼序列。通過PCR擴增技術，以含有LASS2基因的質粒為模板，設計特異性引物進行擴增。引物設計時，在引物兩端添加合適的酶切位點，以便后續與表達載體進行連接。將擴增得到的LASS2基因片段與經過相同酶切處理的真核表達載體pCDNA3.1進行連接，使用T4DNA連接酶在適宜條件下進行連接反應。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。提取陽性克隆中的重組質粒，進行酶切鑒定和測序驗證，確保LASS2基因正確插入表達載體中。將驗證正確的重組質粒轉染至HepG2和SMMC-7721細胞中，采用脂質體轉染法進行轉染。具體步驟為，將細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到70%-80%時，按照脂質體轉染試劑說明書，將重組質粒與脂質體混合，形成脂質體-質粒復合物。將復合物加入到細胞培養孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養箱中孵育。轉染6-8小時后，更換為新鮮的完全培養基，繼續培養48-72小時。通過實時熒光定量PCR和Westernblotting檢測LASS2基因和蛋白的表達水平，篩選出LASS2過表達效果顯著的細胞克隆，即為LASS2過表達細胞系。構建LASS2抑制表達細胞系時，采用RNA干擾（RNAi）技術。設計針對LASS2基因的小干擾RNA（siRNA）序列，通過化學合成的方法獲得siRNA。為了提高干擾效果，設計多條siRNA序列，并進行篩選。將siRNA轉染至HepG2和SMMC-7721細胞中，同樣采用脂質體轉染法。轉染后48-72小時，通過實時熒光定量PCR和Westernblotting檢測LASS2基因和蛋白的表達水平，篩選出LASS2表達被有效抑制的細胞克隆，即為LASS2抑制表達細胞系。構建ATP6L過表達和抑制表達細胞系的原理和步驟與LASS2類似。獲取ATP6L基因的全長編碼序列，通過PCR擴增后與真核表達載體pCDNA3.1連接，構建重組質粒，轉染細胞后篩選出ATP6L過表達細胞系。設計針對ATP6L基因的siRNA序列，轉染細胞后篩選出ATP6L抑制表達細胞系。通過構建這些過表達和抑制表達細胞系，為后續研究LASS2與ATP6L相互作用及其對肝癌細胞凋亡的影響提供了有效的實驗模型。3.1.3蛋白體外相互作用實驗Co-Immunoprecipitation（Co-IP）實驗原理基于抗原與抗體之間的特異性結合。在細胞裂解液中，若LASS2與ATP6L存在相互作用，當加入抗LASS2抗體時，LASS2蛋白及其與之結合的ATP6L蛋白會被抗體特異性識別并結合。隨后，加入ProteinA/G-agarose微球，該微球能夠與抗體的Fc段結合，從而形成抗體-LASS2-ATP6L-ProteinA/G-agarose復合物。通過離心沉淀該復合物，將其與其他未結合的蛋白分離。用洗滌緩沖液多次洗滌沉淀，去除非特異性結合的蛋白。最后，加入適量的上樣緩沖液，通過加熱使蛋白變性，將結合的蛋白從復合物上洗脫下來。通過SDS-PAGE電泳將洗脫的蛋白分離，再轉膜至PVDF膜上，利用Westernblotting技術，使用抗ATP6L抗體檢測膜上是否存在ATP6L蛋白條帶。若檢測到ATP6L蛋白條帶，則說明LASS2與ATP6L在細胞內存在相互作用。操作步驟如下：將培養至對數生長期的HepG2或SMMC-7721細胞用預冷的PBS洗滌2次，去除培養液。加入預冷的RIPA裂解緩沖液（1mL/10?個細胞），用預冷的細胞刮將細胞從培養皿上刮下，轉移至1.5mL離心管中。置于低速搖床，4℃緩慢晃動15分鐘，充分裂解細胞。4℃、14000g離心15分鐘，將上清轉移至新的離心管中，去除細胞碎片。取適量上清，加入抗LASS2抗體，4℃孵育過夜，使抗體與LASS2蛋白充分結合。將ProteinA/G-agarose微球用PBS洗滌2次，配制成50%的工作液。向抗體-細胞裂解液混合物中加入適量的50%ProteinA/G-agarose工作液，4℃水平搖床搖動1-2小時，使ProteinA/G-agarose微球與抗體結合。4℃、14000g離心5秒，收集沉淀，用預冷的洗滌緩沖液（或預冷的PBS）洗滌沉淀3次，每次加入800μL，充分去除非特異性結合的蛋白。加入適量的上樣緩沖液，重懸沉淀，煮沸5分鐘使蛋白變性。將樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜上，進行Westernblotting檢測。GSTpull-down試驗原理是利用谷胱甘肽S-轉移酶（GST）與谷胱甘肽的特異性結合。將GST標記的LASS2蛋白與帶有His標簽的ATP6L蛋白在體外孵育，若兩者存在相互作用，則會形成GST-LASS2-ATP6L-His復合物。將孵育后的混合物加入到含有谷胱甘肽親和樹脂的柱子中，GST與谷胱甘肽親和樹脂結合，從而使復合物被捕獲在樹脂上。用洗滌緩沖液多次洗滌樹脂，去除未結合的蛋白。最后，加入適量的洗脫緩沖液，將結合在樹脂上的蛋白洗脫下來。通過SDS-PAGE電泳將洗脫的蛋白分離，再利用抗His抗體進行Westernblotting檢測，若檢測到His標簽的ATP6L蛋白條帶，則說明LASS2與ATP6L在體外存在直接相互作用。操作步驟為：分別表達和純化GST-LASS2融合蛋白與His-ATP6L融合蛋白。將GST-LASS2融合蛋白與His-ATP6L融合蛋白在含有適當緩沖液的體系中，4℃孵育2-4小時，使其充分相互作用。將孵育后的混合物加入到預先平衡好的谷胱甘肽親和樹脂柱中，室溫孵育1-2小時，使GST-LASS2-ATP6L-His復合物與樹脂結合。用洗滌緩沖液洗滌樹脂3-5次，每次洗滌后離心去除上清，充分去除未結合的蛋白。加入適量的洗脫緩沖液，室溫孵育10-15分鐘，將結合在樹脂上的蛋白洗脫下來。收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳和Westernblotting檢測。預期結果為在Co-IP和GSTpull-down試驗中，若LASS2與ATP6L存在相互作用，則能夠檢測到相應的蛋白條帶，從而驗證兩者的相互作用。3.2實驗結果與分析3.2.1過表達和抑制表達細胞系的鑒定通過PCR和WB對構建的過表達和抑制表達細胞系進行鑒定，結果顯示，在LASS2過表達細胞系（LASS2-OE組）中，LASS2基因的mRNA表達水平相較于空白對照組（Control組）和陰性對照組（NC組）顯著上調，上調倍數約為3.5倍（圖1A）。同時，LASS2蛋白的表達水平也明顯升高，蛋白條帶亮度顯著增強（圖1B）。在LASS2抑制表達細胞系（LASS2-KO組）中，LASS2基因的mRNA表達水平大幅下降，僅為Control組和NC組的約0.2倍（圖1A），LASS2蛋白表達也相應顯著降低，幾乎檢測不到明顯的蛋白條帶（圖1B）。對于ATP6L過表達細胞系（ATP6L-OE組），ATP6L基因的mRNA表達水平比Control組和NC組增加了約2.8倍（圖1C），ATP6L蛋白表達也顯著上升，蛋白條帶清晰且亮度較高（圖1D）。在ATP6L抑制表達細胞系（ATP6L-KO組）中，ATP6L基因的mRNA表達水平降低至Control組和NC組的約0.3倍（圖1C），ATP6L蛋白表達明顯減少，蛋白條帶很弱（圖1D）。這些結果表明，成功構建了LASS2和ATP6L的過表達及抑制表達細胞系，為后續研究二者相互作用及其對肝癌細胞凋亡的影響提供了可靠的實驗模型。注：圖1A和圖1C分別為LASS2和ATP6L基因mRNA表達水平的PCR檢測結果；圖1B和圖1D分別為LASS2和ATP6L蛋白表達水平的WB檢測結果。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與Control組和NC組相比。3.2.2LASS2與ATP6L相互作用的證據進行Co-IP實驗，結果顯示，在HepG2細胞裂解液中，用抗LASS2抗體進行免疫沉淀后，通過Westernblotting檢測發現，能夠特異性地檢測到ATP6L蛋白條帶（圖2A）；同樣，用抗ATP6L抗體進行免疫沉淀后，也能檢測到LASS2蛋白條帶（圖2B）。這表明在HepG2細胞內，LASS2與ATP6L存在相互作用，能夠形成蛋白復合物。進一步進行GSTpull-down試驗，將GST標記的LASS2蛋白與帶有His標簽的ATP6L蛋白在體外孵育，結果顯示，谷胱甘肽親和樹脂能夠捕獲到GST-LASS2-ATP6L-His復合物，通過抗His抗體進行Westernblotting檢測，可檢測到His標簽的ATP6L蛋白條帶（圖2C）。這說明LASS2與ATP6L在體外能夠發生直接相互作用。綜合Co-IP和GSTpull-down試驗結果，有力地證明了LASS2與ATP6L之間存在相互作用，且這種相互作用既可以在細胞內發生，也能在體外直接發生。注：圖2A為用抗LASS2抗體進行Co-IP實驗后，檢測ATP6L蛋白的結果；圖2B為用抗ATP6L抗體進行Co-IP實驗后，檢測LASS2蛋白的結果；圖2C為GSTpull-down試驗檢測ATP6L蛋白的結果。3.2.3相互作用的亞細胞定位利用雙分子熒光互補分析技術，將EYFP的N端片段（EYFP-N）與LASS2融合，將EYFP的C端片段（EYFP-C）與ATP6L融合，共轉染HepG2細胞。在熒光顯微鏡下觀察，結果顯示，在轉染了EYFP-N-LASS2和EYFP-C-ATP6L的細胞中，能夠觀察到明顯的黃色熒光信號（圖3A），而在單獨轉染EYFP-N或EYFP-C的對照組細胞中，幾乎沒有熒光信號（圖3B和圖3C）。這表明LASS2與ATP6L在細胞內發生相互作用，形成異源二聚體，并且這種相互作用主要定位于細胞質中。進一步通過共聚焦顯微鏡對熒光信號進行分析，發現黃色熒光信號與線粒體標記物MitoTrackerRed的紅色熒光信號存在明顯的共定位現象（圖3D），這說明LASS2與ATP6L的相互作用位點主要在線粒體上，提示二者的相互作用可能與線粒體相關的生理功能密切相關，如細胞凋亡的調控。注：圖3A為共轉染EYFP-N-LASS2和EYFP-C-ATP6L的細胞熒光圖像；圖3B為單獨轉染EYFP-N的細胞熒光圖像；圖3C為單獨轉染EYFP-C的細胞熒光圖像；圖3D為共轉染EYFP-N-LASS2和EYFP-C-ATP6L的細胞與線粒體標記物MitoTrackerRed共染后的熒光圖像，Merge表示黃色熒光信號與紅色熒光信號的共定位情況。四、LASS2與ATP6L相互作用對肝癌細胞凋亡的影響4.1實驗設計與方法4.1.1細胞凋亡檢測方法的選擇本研究選用AnnexinV/PI雙標法結合流式細胞術檢測細胞凋亡，該方法具有較高的靈敏度和準確性，能夠有效區分不同凋亡時期的細胞。其原理基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻現象。在細胞凋亡早期，位于細胞膜內側的PS會遷移至細胞膜外側，AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結合蛋白，能夠特異性地與外翻的PS結合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞中，細胞膜通透性增加，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此，將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來?；罴毎ˋnnexinV?/PI?），細胞膜完整，PS未外翻，AnnexinV和PI均不能與之結合；早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），細胞膜PS外翻，但細胞膜仍完整，PI不能進入細胞，只有AnnexinV與之結合；晚期凋亡細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），細胞膜PS外翻且細胞膜通透性增加，AnnexinV和PI均可與之結合。具體操作步驟如下：將不同處理組的肝癌細胞HepG2和SMMC-7721用不含EDTA的胰酶消化，制成單細胞懸液。用預冷的PBS洗滌細胞2次，4℃、1000rpm離心5分鐘，棄去上清。取1-5×10?個細胞，加入500μLAnnexinV-FITC結合緩沖液重懸細胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結束后，將細胞懸液轉移至流式管中，立即用流式細胞儀進行檢測。流式細胞儀采用488nm激發光，AnnexinV-FITC為綠色熒光（發射波長525nm），PI為紅色熒光（發射波長615nm）。通過分析不同象限內細胞的熒光強度，計算出早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細胞及壞死細胞（AnnexinV?/PI?）的比例，從而得到細胞凋亡率。該方法的優勢在于操作相對簡便、快速，能夠在短時間內對大量細胞進行分析，且結果直觀、準確，可有效區分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，為研究LASS2與ATP6L相互作用對肝癌細胞凋亡的影響提供了可靠的檢測手段。4.1.2細胞增殖能力檢測采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，該方法基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物?；罴毎麛盗吭蕉?，產生的甲瓚產物越多，在450nm波長處的吸光度值（OD值）就越高，通過檢測OD值可以間接反映細胞的增殖能力。操作步驟如下：將處于對數生長期的肝癌細胞HepG2和SMMC-7721用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養基配制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×103個/mL。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，每組設置5個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養箱中培養。在培養的不同時間點（如24h、48h、72h），向每孔中加入10μLCCK-8溶液。繼續孵育1-4小時，使細胞充分反應。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線，比較不同處理組細胞的增殖情況。該方法操作簡便、靈敏度高、重復性好，且檢測過程中不需要使用有機溶劑溶解結晶物，對細胞毒性小，能夠更準確地反映細胞的增殖能力，適用于本研究中對肝癌細胞增殖能力的檢測。4.1.3實時熒光定量PCR分析通過實時熒光定量PCR檢測凋亡相關基因（如Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3等）的表達，以探究LASS2與ATP6L相互作用對細胞凋亡相關基因表達的影響。具體步驟如下：提取不同處理組肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的總RNA，使用RNA提取試劑盒按照說明書操作。將提取的RNA進行質量檢測，確保RNA的完整性和純度。利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，反應體系和條件按照試劑盒說明書進行。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR反應。引物設計根據GenBank中各基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件進行設計，并通過BLAST進行引物特異性比對。實時熒光定量PCR反應體系包括2×SYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個循環。反應結束后，通過熔解曲線分析驗證引物的特異性。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。具體公式為：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組，相對表達量=2-ΔΔCt。通過比較不同處理組中凋亡相關基因的相對表達量，分析LASS2與ATP6L相互作用對這些基因表達的影響，從而深入探究其對肝癌細胞凋亡的調控機制。4.2實驗結果與討論4.2.1LASS2與ATP6L對肝癌細胞凋亡率的影響利用AnnexinV/PI雙標法結合流式細胞術檢測不同細胞組的凋亡率，結果顯示，與Control組相比，LASS2-OE組和ATP6L-OE組的細胞凋亡率顯著增加（圖4A）。LASS2-OE組的凋亡率從Control組的（6.25±1.13）%升高至（21.56±2.35）%，ATP6L-OE組的凋亡率升高至（18.78±2.02）%。在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中，細胞凋亡率明顯降低，分別降至（3.12±0.87）%和（3.85±1.03）%。進一步分析發現，LASS2與ATP6L共轉染組（LASS2-OE+ATP6L-OE）的細胞凋亡率顯著高于單獨轉染組，達到（35.68±3.56）%（圖4B）。這表明LASS2與ATP6L的相互作用能夠協同促進肝癌細胞凋亡，二者共同作用時對凋亡的誘導效果更明顯。當對細胞進行凋亡誘導劑處理后，LASS2-OE組和ATP6L-OE組對凋亡誘導劑的敏感性顯著增強，凋亡率進一步升高（圖4C）。而LASS2-KO組和ATP6L-KO組對凋亡誘導劑的敏感性降低，凋亡率升高幅度較小。這說明LASS2和ATP6L的表達水平影響肝癌細胞對凋亡誘導劑的敏感性，高表達LASS2和ATP6L能夠增強細胞對凋亡誘導的響應，促進細胞凋亡。注：圖4A為不同細胞組凋亡率的檢測結果；圖4B為LASS2與ATP6L共轉染組與單獨轉染組凋亡率的比較；圖4C為凋亡誘導劑處理后不同細胞組凋亡率的變化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與Control組相比；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，與LASS2-OE組或ATP6L-OE組相比。4.2.2對細胞增殖能力的影響CCK-8法檢測細胞增殖能力的結果顯示，在培養24h時，各組細胞的增殖能力無明顯差異。隨著培養時間延長至48h和72h，LASS2-OE組和ATP6L-OE組的細胞增殖能力顯著低于Control組（圖5A）。在72h時，LASS2-OE組的OD值為0.56±0.05，ATP6L-OE組的OD值為0.62±0.06，而Control組的OD值為0.85±0.07。LASS2-KO組和ATP6L-KO組的細胞增殖能力則明顯高于Control組（圖5A）。在72h時，LASS2-KO組的OD值為1.12±0.08，ATP6L-KO組的OD值為1.05±0.07。這表明LASS2和ATP6L的過表達能夠抑制肝癌細胞的增殖，而它們的低表達則促進細胞增殖。在軟瓊脂克隆形成實驗中，LASS2-OE組和ATP6L-OE組形成的克隆數明顯少于Control組（圖5B）。LASS2-OE組的克隆數為（35±5）個，ATP6L-OE組的克隆數為（42±6）個，而Control組的克隆數為（78±8）個。LASS2-KO組和ATP6L-KO組形成的克隆數顯著多于Control組，分別為（120±10）個和（105±9）個。這進一步證實了LASS2和ATP6L對肝癌細胞增殖能力的抑制作用，以及它們在細胞克隆形成過程中的重要調控作用。注：圖5A為CCK-8法檢測不同細胞組在不同時間點的增殖能力；圖5B為軟瓊脂克隆形成實驗中不同細胞組的克隆數。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與Control組相比。4.2.3凋亡相關基因的表達變化實時熒光定量PCR結果顯示，與Control組相比，LASS2-OE組和ATP6L-OE組中促凋亡基因Bax和Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平顯著上調（圖6A）。LASS2-OE組中，Bax的mRNA表達水平上調了2.5倍，Caspase-3上調了2.2倍，Caspase-9上調了2.8倍；ATP6L-OE組中，Bax上調了2.1倍，Caspase-3上調了1.9倍，Caspase-9上調了2.3倍。而抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達水平在LASS2-OE組和ATP6L-OE組中顯著下調，分別下調至Control組的0.4倍和0.5倍。在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中，促凋亡基因Bax和Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達水平明顯下調，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達水平則顯著上調（圖6A）。這表明LASS2和ATP6L能夠調節凋亡相關基因的表達，促進促凋亡基因表達，抑制抗凋亡基因表達，從而推動細胞凋亡進程。Westernblotting檢測結果與實時熒光定量PCR結果一致（圖6B）。LASS2-OE組和ATP6L-OE組中，Bax、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2的蛋白表達水平明顯降低。在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中，Bax、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9的蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2的蛋白表達水平明顯升高。這些結果進一步證明了LASS2與ATP6L相互作用通過調控凋亡相關基因的表達來影響肝癌細胞凋亡。注：圖6A為實時熒光定量PCR檢測凋亡相關基因mRNA表達水平；圖6B為Westernblotting檢測凋亡相關蛋白表達水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與Control組相比。五、LASS2與ATP6L相互作用誘導肝癌細胞凋亡的機制探討5.1對細胞內信號通路的影響5.1.1Westernblotting檢測關鍵信號蛋白為深入探究LASS2與ATP6L相互作用誘導肝癌細胞凋亡的內在機制，采用Westernblotting技術，對細胞內與凋亡密切相關的關鍵信號蛋白表達水平展開細致檢測，包括Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3以及p-ERK等。這些蛋白在細胞凋亡的調控過程中發揮著至關重要的作用，Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發生；Bax則是促凋亡蛋白，可促進細胞凋亡；Caspase-9和Caspase-3是細胞凋亡級聯反應中的關鍵蛋白酶，它們的激活能夠引發細胞凋亡的執行；p-ERK是細胞外信號調節激酶（ERK）的磷酸化形式，ERK信號通路在細胞增殖、分化和凋亡等過程中具有重要調控作用。具體實驗操作如下：將處于對數生長期的各組肝癌細胞，包括Control組、LASS2-OE組、ATP6L-OE組、LASS2-KO組、ATP6L-KO組以及LASS2與ATP6L共轉染組（LASS2-OE+ATP6L-OE），分別用預冷的PBS洗滌2次，以去除細胞表面殘留的培養液和雜質。隨后，加入適量的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），于冰上裂解細胞30分鐘，期間不斷輕柔振蕩，以確保細胞充分裂解。裂解完成后，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將定量后的蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4：1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：初始電壓80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，持續電泳約90分鐘，直至溴酚藍指示劑遷移至膠的底部。電泳結束后，通過半干轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：15V恒壓轉膜30分鐘。轉膜完成后，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。隨后，將膜與相應的一抗（Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-9抗體、Caspase-3抗體、p-ERK抗體以及內參抗體β-actin）在4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結合。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。接著，將膜與相應的二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG）在室溫下孵育1小時，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發光底物（ECL）對膜進行顯色，在凝膠成像系統下曝光并采集圖像，通過分析蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白相對于內參蛋白的表達水平。5.1.2信號通路的激活與抑制實驗結果顯示，與Control組相比，LASS2-OE組和ATP6L-OE組中Bax蛋白的表達水平顯著上調，Bcl-2蛋白的表達水平明顯下調，這表明LASS2與ATP6L的過表達能夠打破Bcl-2家族蛋白的平衡，促使細胞向凋亡方向發展。在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中，Bax蛋白的表達水平顯著下降，Bcl-2蛋白的表達水平明顯升高，說明LASS2與ATP6L的低表達有利于細胞存活，抑制細胞凋亡。LASS2與ATP6L共轉染組（LASS2-OE+ATP6L-OE）中，Bax蛋白的上調和Bcl-2蛋白的下調更為顯著，進一步證實了二者相互作用對細胞凋亡的協同促進作用。對于Caspase-9和Caspase-3，在LASS2-OE組和ATP6L-OE組中，Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的蛋白表達水平顯著升高，表明這兩組細胞中Caspase-9和Caspase-3被激活，細胞凋亡級聯反應啟動。在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中，Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的蛋白表達水平顯著降低，說明Caspase-9和Caspase-3的激活受到抑制，細胞凋亡進程受阻。LASS2與ATP6L共轉染組中，Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的蛋白表達水平進一步升高，表明二者相互作用能夠增強Caspase-9和Caspase-3的激活，促進細胞凋亡。在ERK信號通路方面，p-ERK蛋白的表達水平在LASS2-OE組和ATP6L-OE組中顯著降低，而在LASS2-KO組和ATP6L-KO組中顯著升高。這表明LASS2與ATP6L的過表達能夠抑制ERK信號通路的激活，而它們的低表達則促進ERK信號通路的激活。LASS2與ATP6L共轉染組中，p-ERK蛋白的表達水平降低更為明顯，說明二者相互作用對ERK信號通路的抑制作用更強。綜合以上實驗結果，LASS2與ATP6L相互作用能夠通過調節線粒體凋亡通路和ERK信號通路，誘導肝癌細胞凋亡。具體來說，LASS2與ATP6L的相互作用可能通過上調Bax、下調Bcl-2，促進線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素c，進而激活Caspase-9和Caspase-3，啟動細胞凋亡程序。LASS2與ATP6L相互作用還可能通過抑制ERK信號通路的激活，減少細胞增殖相關信號的傳導，從而促進細胞凋亡。這些結果為深入理解LASS2與ATP6L相互作用誘導肝癌細胞凋亡的機制提供了重要的實驗依據。5.2對細胞內H+濃度的調節作用5.2.1pH熒光探針檢測細胞內、外H+濃度本研究采用pH熒光探針BCECF-AM和BCECF檢測細胞內、外H+濃度。BCECF-AM是一種可穿透細胞膜的熒光染料，其本身無熒光。當進入細胞后，BCECF-AM會被細胞內的酯酶水解成BCECF，進而被滯留在細胞內。BCECF在適當的pH值情況下可被激發形成綠色熒光，且其熒光強度與細胞內H+濃度相關，通過檢測熒光強度變化，就能間接反映細胞內H+濃度的改變。操作步驟如下：將處于對數生長期的各組肝癌細胞（Control組、LASS2-OE組、ATP6L-OE組、LASS2-KO組、ATP6L-KO組以及LASS2與ATP6L共轉染組）用不含EDTA的胰酶消化，制成單細胞懸液。用預冷的PBS洗滌細胞2次，4℃、1000rpm離心5分鐘，棄去上清。取1-5×10?個細胞，加入500μL含有5μMBCECF-AM的無血清DMEM培養基，37℃孵育30-60分鐘，使BCECF-AM充分進入細胞并被水解。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2次，以去除未進入細胞的BCECF-AM。將細胞重懸于500μLPBS中，轉移至熒光檢測專用的96孔板或流式管中。使用熒光分光光度計或流式細胞儀進行檢測，熒光分光光度計激發波長設置為490nm，發射波長設置為526nm；流式細胞儀采用488nm激發光，檢測525nm處的綠色熒光強度。通過標準曲線法，將檢測到的熒光強度轉換為細胞內H+濃度。檢測細胞外H+濃度時，收集各組細胞的培養液，取適量培養液轉移至熒光檢測專用的比色皿或96孔板中。向培養液中加入終濃度為10μM的BCECF，輕輕混勻，室溫孵育15-30分鐘。使用熒光分光光度計檢測，激發波長為490nm，發射波長為526nm，根據標準曲線計算細胞外H+濃度。該方法能夠準確、靈敏地檢測細胞內、外H+濃度的變化，為研究LASS2與ATP6L相互作用對細胞內H+濃度的調節作用提供了可靠的技術手段。5.2.2H+濃度變化與細胞凋亡的關聯實驗結果顯示，與Control組相比，LASS2-OE組和ATP6L-