IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的調控及在慢性胰腺炎中的關鍵作用探究一、引言1.1研究背景與意義慢性胰腺炎（ChronicPancreatitis,CP）是一種由多種病因引起的胰腺慢性炎癥性疾病，其主要特征包括胰腺實質的進行性破壞、纖維化以及外分泌和內分泌功能的逐漸喪失。據統計，全球范圍內慢性胰腺炎的發病率呈上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量和身體健康。慢性胰腺炎不僅會引發反復發作的劇烈腹痛，使患者在日常生活中飽受折磨，還可能導致一系列嚴重的并發癥，如胰腺假性囊腫、膽道梗阻、胰腺癌等，其中胰腺癌的發生更是給患者的生命健康帶來了巨大威脅。相關研究表明，慢性胰腺炎患者發展為胰腺癌的風險相較于普通人群顯著增加，這使得慢性胰腺炎成為了胰腺癌的重要危險因素之一。此外，慢性胰腺炎還會導致糖尿病、體重減輕和營養不良等問題，進一步降低患者的生活質量，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。在慢性胰腺炎的發病機制中，炎癥反應和纖維化進程起著關鍵作用。近年來，越來越多的研究聚焦于細胞因子和趨化因子在慢性胰腺炎發病過程中的作用，其中白細胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）和趨化因子CX3CL1備受關注。IL-18作為一種重要的促炎細胞因子，最初被發現能夠誘導干擾素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）的產生，從而參與Th1型免疫反應。在慢性胰腺炎的病理過程中，IL-18的表達水平顯著升高，并且與疾病的嚴重程度密切相關。研究表明，IL-18可以通過激活多種細胞內信號通路，促進炎癥細胞的浸潤和活化，加重胰腺組織的炎癥損傷。同時，IL-18還能夠調節其他細胞因子和趨化因子的表達，進一步放大炎癥反應，形成一個復雜的炎癥網絡。趨化因子CX3CL1，又稱為Fractalkine，是一種獨特的膜結合型趨化因子，其受體為CX3CR1。CX3CL1不僅具有趨化作用，能夠吸引免疫細胞向炎癥部位遷移，還參與細胞間的黏附、信號傳導等多種生物學過程。在慢性胰腺炎中，CX3CL1及其受體CX3CR1的表達也發生了明顯變化。已有研究發現，CX3CL1在胰腺星狀細胞（PancreaticStellateCells,PSCs）中的表達上調，而PSCs是胰腺纖維化過程中的關鍵細胞。活化的PSCs能夠分泌大量的細胞外基質，導致胰腺組織纖維化，而CX3CL1可能通過與PSCs表面的CX3CR1結合，調節PSCs的活化、增殖和遷移，從而在慢性胰腺炎的纖維化進程中發揮重要作用。胰腺星狀細胞作為胰腺中的一種特殊細胞類型，在慢性胰腺炎的發病機制中占據著核心地位。靜止狀態下的PSCs主要參與維持胰腺的正常結構和功能，但在受到炎癥刺激后，PSCs會被激活，發生形態和功能的改變。激活的PSCs表現出增殖能力增強、分泌大量細胞外基質以及表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SmoothMuscleActin,α-SMA）等特征，這些變化使得PSCs成為了胰腺纖維化的主要效應細胞。IL-18和CX3CL1可能通過直接或間接作用于PSCs，影響其活化和功能，進而調控慢性胰腺炎的炎癥和纖維化進程。然而，目前關于IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響及其在慢性胰腺炎中的具體作用機制尚未完全明確。本研究旨在深入探討IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響，并進一步闡明其在慢性胰腺炎發病機制中的作用。通過揭示IL-18與CX3CL1之間的相互關系以及它們對PSCs的調控機制，有望為慢性胰腺炎的治療提供新的靶點和理論依據。這不僅有助于深入理解慢性胰腺炎的發病機制，為開發更加有效的治療策略奠定基礎，還可能為預防慢性胰腺炎向胰腺癌的轉化提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內外研究現狀1.2.1IL-18與慢性胰腺炎的研究現狀IL-18作為一種關鍵的促炎細胞因子，在慢性胰腺炎的研究中備受關注。國外早在20世紀90年代就開始對IL-18進行深入研究，如Okamura等首次克隆出IL-18，并發現其具有誘導IFN-γ產生的能力，這為后續研究IL-18在免疫反應和炎癥疾病中的作用奠定了基礎。在慢性胰腺炎領域，Schneider等通過對慢性胰腺炎患者血清和胰腺組織的檢測，發現IL-18在患者血清和胰腺中的表達顯著增強，且與疾病的嚴重程度密切相關，提示IL-18可能參與了慢性胰腺炎的發病過程。國內對IL-18與慢性胰腺炎的研究也取得了一定成果。眾多學者通過動物實驗和臨床研究進一步證實了IL-18在慢性胰腺炎中的重要作用。例如，有研究利用二丁基二氯化錫（DBTC）誘導大鼠慢性胰腺炎模型，檢測發現模型組大鼠胰腺組織中IL-18的表達水平明顯高于對照組，且隨著病程的進展，IL-18的表達持續升高。這些研究表明，IL-18在慢性胰腺炎的發生、發展過程中發揮著重要的促炎作用，可能通過激活炎癥細胞、促進炎癥因子的釋放等途徑加重胰腺組織的炎癥損傷。1.2.2CX3CL1與慢性胰腺炎的研究現狀CX3CL1及其受體CX3CR1在慢性胰腺炎中的作用也逐漸成為研究熱點。國外研究發現，CX3CL1在多種炎癥性疾病中表達上調，并且在慢性胰腺炎患者的胰腺組織中，CX3CL1及其受體CX3CR1的表達均顯著增加。Uchida等通過對胰腺星狀細胞的研究發現，乙醇可以誘導胰腺星狀細胞釋放CX3CL1，并且ERK通路和sheddases在這一過程中發揮著關鍵作用，提示CX3CL1可能參與了慢性胰腺炎的炎癥和纖維化進程。國內學者在CX3CL1與慢性胰腺炎的研究方面也有諸多發現。有研究觀察到在慢性胰腺炎大鼠模型中，胰腺組織中CX3CL1的表達明顯升高，且與胰腺纖維化程度呈正相關。此外，相關研究還探討了CX3CL1在慢性胰腺炎中的作用機制，發現CX3CL1可能通過與CX3CR1結合，激活下游信號通路，促進炎癥細胞的趨化和活化，進而參與慢性胰腺炎的發病過程。1.2.3胰腺星狀細胞與慢性胰腺炎的研究現狀胰腺星狀細胞在慢性胰腺炎中的核心地位已得到國內外廣泛認可。國外研究最早在20世紀90年代末對胰腺星狀細胞進行了分離和鑒定，發現其在靜止狀態下主要儲存維生素A，而在受到炎癥等刺激后會被激活，發生一系列形態和功能的改變。活化的胰腺星狀細胞能夠分泌大量的細胞外基質，如膠原蛋白、纖連蛋白等，導致胰腺組織纖維化，從而在慢性胰腺炎的纖維化進程中發揮關鍵作用。國內對胰腺星狀細胞的研究也在不斷深入。眾多研究通過體外實驗和動物模型，深入探討了胰腺星狀細胞的活化機制以及其在慢性胰腺炎中的作用。研究發現，多種細胞因子和信號通路參與了胰腺星狀細胞的活化過程，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等細胞因子可以通過激活相關信號通路，促進胰腺星狀細胞的活化和增殖。此外，國內研究還關注了胰腺星狀細胞與其他細胞之間的相互作用，以及這些相互作用在慢性胰腺炎發病機制中的作用。盡管國內外在IL-18、CX3CL1及胰腺星狀細胞與慢性胰腺炎的研究方面取得了一定進展，但關于IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響及其在慢性胰腺炎中的具體作用機制仍有待進一步深入研究。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在深入探討IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響，并揭示其在慢性胰腺炎發病機制中的作用，具體目標如下：明確IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的調控作用，包括在基因和蛋白水平上的影響，確定IL-18影響CX3CL1表達的最佳作用濃度和時間，為后續研究提供實驗依據。探究IL-18通過調控CX3CL1表達影響胰腺星狀細胞活化、增殖和遷移的具體機制，闡明相關信號通路在其中的作用，為理解慢性胰腺炎的發病機制提供新的理論基礎。分析IL-18和CX3CL1在慢性胰腺炎患者胰腺組織中的表達情況，以及它們與疾病嚴重程度、臨床指標之間的相關性，為慢性胰腺炎的診斷和治療提供潛在的生物標志物和治療靶點。1.3.2研究內容為實現上述研究目標，本研究將開展以下內容的研究：慢性胰腺炎大鼠模型的建立與相關指標檢測：采用尾靜脈單次注射8mg/kg體重二丁基二氯化錫（DBTC）的方法建立慢性胰腺炎大鼠模型，對照組注射等容積生理鹽水。4周后處死大鼠，取胰腺組織進行病理檢查并評分，采用免疫組化染色法檢測胰腺組織IL-18及CX3CL1蛋白表達，通過RT-PCR檢測胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA的表達水平，觀察慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中IL-18、CX3CL1的表達變化以及與胰腺纖維化的關系。IL-18對人胰腺星狀細胞活化狀態及CX3CL1表達的影響：常規培養、傳代人胰腺星狀細胞（PSCs）株HPaSteC，應用不同濃度（5、25、50、100μg/L）的IL-18干預72h，以未干預細胞為對照組。收集各組細胞，采用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測細胞E-鈣黏素（E-cadherin）、α-SMA、CX3CL1mRNA及蛋白表達量，觀察IL-18對人胰腺星狀細胞活化狀態及CX3CL1表達的影響，確定IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度。信號通路抑制劑對IL-18引起的胰腺星狀細胞激活及CX3CL1表達上調的影響：在確定IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度后，選擇合適的信號通路抑制劑（如NF-κB抑制劑PDTC）預處理PSCs，再用最佳濃度的IL-18進行干預。通過RT-PCR和蛋白質印跡法檢測細胞α-SMA、CX3CL1mRNA及蛋白表達量，觀察信號通路抑制劑能否緩解IL-18引起的胰腺星狀細胞激活及CX3CL1表達上調，探究IL-18調控CX3CL1表達影響PSCs活化的信號通路機制。1.4研究方法與技術路線本研究采用實驗研究法，通過動物實驗和細胞實驗相結合的方式，深入探究IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響及在慢性胰腺炎中的作用。動物實驗：選取健康雄性Wistar大鼠，適應性喂養一周后，隨機分為對照組和慢性胰腺炎模型組。模型組采用尾靜脈單次注射8mg/kg體重二丁基二氯化錫（DBTC）的方法建立慢性胰腺炎大鼠模型，對照組注射等容積生理鹽水。在造模后的第4周，將大鼠麻醉后處死，迅速取出胰腺組織。一部分胰腺組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，以觀察胰腺組織的病理變化，并按照改良的Schmidt評分標準對胰腺纖維化程度進行評分；另一部分胰腺組織凍存于液氮中，用于后續的免疫組化染色、RT-PCR等實驗檢測。在免疫組化染色中，使用特異性抗體檢測胰腺組織中IL-18及CX3CL1蛋白的表達情況；通過RT-PCR技術檢測胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA的表達水平。細胞實驗：人胰腺星狀細胞（PSCs）株HPaSteC在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中常規培養、傳代。待細胞生長至對數期時，將其分為對照組和不同濃度IL-18干預組，干預組分別加入終濃度為5、25、50、100μg/L的IL-18，對照組加入等體積的PBS，干預72h。收集各組細胞，采用RT-PCR法檢測細胞E-鈣黏素（E-cadherin）、α-SMA、CX3CL1mRNA的表達量，提取細胞總蛋白，通過蛋白質印跡法檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白的表達量，以確定IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度。在確定最佳作用濃度后，選擇合適的信號通路抑制劑（如NF-κB抑制劑PDTC）預處理PSCs，再用最佳濃度的IL-18進行干預，設置對照組、IL-18組、抑制劑組和抑制劑+IL-18組。通過RT-PCR和蛋白質印跡法檢測細胞α-SMA、CX3CL1mRNA及蛋白表達量，探究IL-18調控CX3CL1表達影響PSCs活化的信號通路機制。本研究技術路線如圖1-1所示：[此處插入技術路線圖，圖中應清晰展示動物實驗和細胞實驗的流程，包括實驗分組、處理方法、檢測指標等內容，從大鼠分組造模開始，到細胞實驗的干預和檢測，體現整個研究的邏輯順序]二、相關理論基礎2.1慢性胰腺炎概述慢性胰腺炎是一種由多種病因引起的胰腺慢性炎癥性疾病，其主要特征為胰腺實質的進行性破壞、纖維化，以及外分泌和內分泌功能的逐漸受損。國際胰腺病協會（IAP）對慢性胰腺炎的定義為：胰腺呈現持續性的炎癥反應，伴有不同程度的胰腺實質纖維化和導管狹窄，這種病理變化導致胰腺組織結構和功能出現不可逆的損害。從流行病學角度來看，慢性胰腺炎的發病率在全球范圍內呈上升趨勢。不同地區的發病率存在一定差異，歐美國家的發病率相對較高，約為每10萬人中有5-10例，而亞洲國家的發病率相對較低，但也呈現出逐漸上升的態勢。慢性胰腺炎可發生于任何年齡段，但以中老年人居多，男性發病率略高于女性。其發病與多種因素相關，長期過量飲酒是慢性胰腺炎的主要病因之一，約占病因的30%-60%，酒精及其代謝產物會對胰腺組織產生直接毒性作用，導致胰腺炎癥和纖維化。膽道疾病也是重要病因，約占病因的36%-65%，如膽結石、膽管炎等可引起膽汁反流，激活胰腺消化酶，引發胰腺自身消化，進而導致慢性胰腺炎。此外，遺傳因素在慢性胰腺炎的發病中也起著關鍵作用，某些基因突變如陽離子胰蛋白酶原（PRSS1）、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal1型（SPINK1）等基因突變，會顯著增加慢性胰腺炎的發病風險，這類遺傳性慢性胰腺炎通常發病年齡較早，病情也較為嚴重。其他因素如自身免疫異常、代謝紊亂（如高鈣血癥、高脂血癥）、胰腺外傷、藥物副作用以及吸煙等，也與慢性胰腺炎的發病密切相關。慢性胰腺炎的發病機制是一個復雜且尚未完全明確的過程。目前認為，多種致病因素相互作用，啟動了胰腺的炎癥反應。最初，胰腺受到損傷后，炎癥細胞如中性粒細胞、巨噬細胞等迅速浸潤，釋放大量的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，這些炎癥介質進一步激活胰腺星狀細胞，使其轉化為成肌纖維細胞樣細胞。活化的胰腺星狀細胞大量增殖，并分泌大量的細胞外基質，如膠原蛋白、纖連蛋白等，導致胰腺組織纖維化。同時，炎癥反應還會破壞胰腺的正常組織結構，損傷胰腺腺泡細胞和胰島細胞，影響胰腺的外分泌和內分泌功能。此外，氧化應激、細胞凋亡等機制也參與了慢性胰腺炎的發病過程，氧化應激產生的大量活性氧簇（ROS）會損傷胰腺細胞的生物膜、蛋白質和核酸，促進炎癥反應和纖維化進程，而細胞凋亡則導致胰腺細胞數量減少，進一步加重胰腺功能損害。慢性胰腺炎的臨床癥狀表現多樣，且缺乏特異性。反復發作的上腹部疼痛是慢性胰腺炎最常見的癥狀，疼痛程度輕重不一，可為隱痛、脹痛、鈍痛或劇痛，疼痛部位多位于上腹部正中或偏左，可向背部放射，疼痛常因進食、飲酒、勞累等因素誘發或加重。隨著病情的進展，胰腺外分泌功能受損，患者會出現消化不良、脂肪瀉、體重下降等癥狀，這是由于胰腺分泌的消化酶減少，導致食物消化吸收障礙。胰腺內分泌功能受損則可引起糖尿病，患者出現多飲、多食、多尿、體重減輕等典型的糖尿病癥狀。此外，慢性胰腺炎還可能出現一些并發癥，如胰腺假性囊腫、胰源性腹水、膽道梗阻、胰腺癌等，這些并發癥會進一步加重患者的病情，嚴重影響患者的生活質量和預后。在診斷方面，慢性胰腺炎的診斷較為困難，需要綜合臨床表現、影像學檢查、實驗室檢查以及組織病理學檢查等多方面的信息。臨床表現主要依據患者反復發作的上腹部疼痛、消化不良、脂肪瀉、糖尿病等癥狀，但這些癥狀缺乏特異性，容易與其他消化系統疾病混淆。影像學檢查是診斷慢性胰腺炎的重要手段，包括腹部超聲、CT、MRI、內鏡逆行胰膽管造影（ERCP）、磁共振胰膽管造影（MRCP）等。腹部超聲可發現胰腺腫大、胰腺實質回聲不均、胰管擴張、胰腺結石等異常表現，但對于早期慢性胰腺炎的診斷敏感性較低。CT和MRI能夠更清晰地顯示胰腺的形態、結構和周圍組織的關系，對胰腺鈣化、胰腺假性囊腫等并發癥的診斷具有重要價值。ERCP和MRCP可以直觀地觀察胰膽管的形態和結構，對于診斷胰膽管狹窄、結石、擴張等病變具有獨特優勢，其中ERCP還可同時進行治療操作，但ERCP屬于有創檢查，存在一定的并發癥風險。實驗室檢查主要包括血清淀粉酶、脂肪酶、血糖、糖化血紅蛋白、糞便脂肪含量測定等，血清淀粉酶和脂肪酶在慢性胰腺炎急性發作時可升高，但在慢性期通常正常或輕度升高，血糖和糖化血紅蛋白可用于評估胰腺內分泌功能，糞便脂肪含量測定則有助于判斷胰腺外分泌功能。組織病理學檢查是診斷慢性胰腺炎的金標準，通過胰腺穿刺活檢或手術切除標本進行病理檢查，可觀察到胰腺組織的纖維化、腺泡萎縮、導管擴張、炎性細胞浸潤等典型病理改變，但由于胰腺位置深在，獲取組織標本較為困難，臨床上一般不作為常規檢查方法。2.2胰腺星狀細胞胰腺星狀細胞（PancreaticStellateCells,PSCs）的發現為深入理解胰腺疾病，尤其是慢性胰腺炎的發病機制提供了新的視角。1982年，日本學者Watari等使用熒光顯微鏡和電子顯微鏡，首次在維生素A負荷的小鼠胰腺組織中觀察到貯維生素A細胞，其胞漿內有維生素A自發的藍綠熒光，并很快消退，這是關于胰腺星狀細胞的最早報道。1990年，Ikejiri在正常大鼠和人的胰腺組織中發現貯維生素A細胞，并在慢性酒精性胰腺炎中觀察到星狀細胞位于胰腺纖維化區，鑒于其形態結構功能與肝星狀細胞類似，推測其具有成纖維化作用。1997年，Santome等研究發現胰腺腺泡周圍有類似特點的成纖維細胞樣細胞，稱之為胰腺腺泡周圍成纖維細胞樣細胞。1998年，德國學者Bachem等從人和大鼠胰腺基質中分離出能產生I型、III型膠原和纖維結合蛋白的細胞，該細胞位于胰腺小葉之間及胰腺腺泡周圍區。1999年，Apté等研究發現，胰腺星狀細胞占胰腺細胞總數的3.99%，位于腺細胞間，并圍繞在鄰近腺細胞的基底部，胰島中未見星狀細胞，至此，胰腺星狀細胞被正式確定并命名。在正常胰腺組織中，胰腺星狀細胞主要分布于胰腺小葉間和腺泡間，呈靜止狀態。靜止期的胰腺星狀細胞呈球形或多角形，胞漿內含有豐富的維生素A脂滴，這些脂滴可使細胞呈現自發熒光，這也是早期識別胰腺星狀細胞的重要特征之一。此時的胰腺星狀細胞表達結蛋白（Desmin），而α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）呈低表達或不表達。靜止狀態下的胰腺星狀細胞主要參與維持胰腺的正常結構和功能，如調節細胞外基質的合成與降解平衡，參與胰腺組織的修復和再生等。它們還可能通過分泌一些細胞因子和生長因子，對胰腺內其他細胞，如腺泡細胞、胰島細胞等的生長、分化和功能發揮調節作用。在慢性胰腺炎的病理過程中，胰腺星狀細胞被多種因素激活，發生顯著的形態和功能改變。激活的胰腺星狀細胞由靜止期的球形轉變為成肌纖維細胞樣形態，細胞體積增大，伸出多個細長的突起，呈現典型的星狀外觀。在功能方面，激活的胰腺星狀細胞增殖能力顯著增強，大量合成和分泌細胞外基質，包括I型、III型膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，導致細胞外基質在胰腺組織中過度沉積，這是胰腺纖維化的關鍵病理過程。同時，激活的胰腺星狀細胞α-SMA表達上調，使其具有收縮能力，可改變胰腺組織的力學特性，進一步影響胰腺的正常結構和功能。此外，激活的胰腺星狀細胞還分泌多種細胞因子和趨化因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。TGF-β是一種強效的促纖維化細胞因子，它可以進一步促進胰腺星狀細胞的活化和增殖，上調細胞外基質的合成，并抑制其降解，形成一個正反饋環路，加劇胰腺纖維化進程。PDGF則可促進胰腺星狀細胞的遷移和增殖，使其向炎癥部位聚集，參與炎癥反應和組織修復過程。MCP-1等趨化因子能夠吸引炎癥細胞，如單核細胞、巨噬細胞等向胰腺組織浸潤，加重炎癥反應，同時這些炎癥細胞釋放的炎癥介質又可進一步激活胰腺星狀細胞，形成惡性循環。2.3IL-18的結構與功能白細胞介素-18（IL-18）最初被命名為干擾素-γ誘導因子（IGIF），屬于IL-1細胞因子超家族成員。IL-18基因位于人第11號染色體短臂13區（11p13），其長度約為17kb，包含6個外顯子和5個內含子。IL-18的前體蛋白由193個氨基酸組成，分子量約為23kDa。在未被激活的狀態下，IL-18以前體形式存在于細胞內。IL-18前體不具有生物學活性，需要經過一系列的加工和激活過程才能發揮其生物學功能。IL-18主要由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞產生。當這些細胞受到病原體相關分子模式（PAMPs）如脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA等，或損傷相關分子模式（DAMPs）如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等的刺激后，會啟動IL-18的表達和激活程序。首先，刺激信號通過細胞表面的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，激活細胞內的信號通路，誘導IL-18基因的轉錄和翻譯，產生IL-18前體蛋白。IL-18前體蛋白在細胞內被半胱天冬酶-1（Caspase-1）識別并切割。Caspase-1是一種關鍵的炎癥小體效應分子，它被激活后，通過特異性的酶切作用，將IL-18前體蛋白在天冬氨酸殘基（Asp35-Asp36）處切割，去除N端的一段前肽序列，從而產生具有生物學活性的成熟IL-18，其分子量約為18kDa。除了Caspase-1介導的經典激活途徑外，研究還發現，在某些病理情況下，IL-18還可以通過非Caspase-1依賴的途徑被激活。例如，在中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）和蛋白酶3（PR3）等蛋白酶的作用下，IL-18前體也可以被切割為成熟形式，從而釋放到細胞外發揮作用。此外，Fas信號激活巨噬細胞和樹突狀細胞中的Caspase-8，也能導致IL-18分泌。IL-18通過與細胞表面的IL-18受體（IL-18R）結合發揮其生物學功能。IL-18R屬于IL-1R家族，由IL-18Rα鏈（也稱為IL-18R1或IL-1Rrp）和IL-18Rβ鏈（也稱為IL-18R輔助蛋白，IL-1RAcPL）組成。IL-18Rα鏈負責與IL-18特異性結合，但其單獨與IL-18結合的親和力較低。IL-18Rβ鏈不直接與IL-18結合，但當IL-18與IL-18Rα鏈結合后，IL-18Rβ鏈會迅速結合上來，形成高親和力的三聚體復合物。這種三聚體復合物的形成是IL-18信號傳導的關鍵步驟。當IL-18與IL-18R結合形成三聚體復合物后，會招募細胞內的髓樣分化因子88（MyD88）。MyD88通過其死亡結構域與IL-18R復合物中的IL-18Rβ鏈的胞內結構域相互作用，進而招募白細胞介素-1受體相關激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1、IRAK4等。IRAKs被激活后會發生磷酸化，并進一步招募腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6激活下游的一系列信號分子，包括轉化生長因子-β激活激酶1（TAK1）等。TAK1激活后可以磷酸化并激活核因子-κB（NF-κB）誘導激酶（NIK），進而激活NF-κB信號通路，使NF-κB進入細胞核，調節相關基因的轉錄。同時，TAK1還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，如c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38MAPK等，這些激酶被激活后可以磷酸化相應的轉錄因子，如c-Jun、ATF2等，調節基因的表達。通過這些信號通路的激活，IL-18可以誘導多種細胞因子和趨化因子的產生，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等，以及趨化因子如單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，從而參與免疫調節和炎癥反應。IL-18在免疫調節和炎癥反應中發揮著廣泛而重要的功能。在先天性免疫中，IL-18可以增強自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性。NK細胞是先天性免疫的重要組成部分，能夠直接殺傷被病原體感染的細胞和腫瘤細胞。IL-18與IL-12協同作用，可以顯著增強NK細胞的殺傷活性，使其能夠更有效地清除感染細胞和腫瘤細胞。IL-18還能促進巨噬細胞的活化。活化的巨噬細胞可以分泌更多的炎癥介質，增強其吞噬和殺傷病原體的能力。同時，IL-18可以誘導巨噬細胞產生一氧化氮（NO）等抗菌物質，參與機體的抗感染免疫。在適應性免疫中，IL-18作為Th1樣細胞的輔助刺激劑，在Th1型免疫應答中發揮關鍵作用。它可以誘導初始T細胞向Th1細胞分化，促進Th1細胞分泌IFN-γ、GM-CSF和IL-2等細胞因子。IFN-γ是一種重要的免疫調節因子，能夠激活巨噬細胞、增強NK細胞活性，促進細胞免疫應答。GM-CSF可以刺激粒細胞和巨噬細胞的增殖、分化和活化，增強機體的免疫防御能力。IL-2則可以促進T細胞的增殖和活化，增強免疫細胞的功能。IL-18還能增強細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的活性。CTL是適應性免疫中的重要效應細胞，能夠特異性殺傷被病原體感染的細胞和腫瘤細胞。IL-18通過促進CTL的活化和增殖，提高其殺傷靶細胞的能力，從而在抗病毒感染和抗腫瘤免疫中發揮重要作用。2.4CX3CL1的結構與功能趨化因子CX3CL1，又稱為Fractalkine，是CX3C趨化因子家族中唯一已知的成員，其基因定位于人第16號染色體短臂13.11區（16p13.11）。CX3CL1基因全長約22kb，由6個外顯子和5個內含子組成。CX3CL1蛋白由373個氨基酸組成，分子量約為40kDa，其結構獨特，包含多個結構域。與其他趨化因子典型結構不同，CX3CL1特征性N端半胱氨酸的間距有別于CC趨化因子和CXC趨化因子，在CX3CL1中，最初的一對半胱氨酸之間有三個氨基酸，而在CC趨化因子中沒有，在CXC趨化因子中只有一個氨基酸的間隔。CX3CL1是一個長的蛋白質，擁有一個延長的粘液蛋白樣柄，在柄的頂端連接著一個趨化因子結構域。這種粘液蛋白樣柄使得CX3CL1能夠與某些細胞的表面結合，賦予了它獨特的生物學功能。CX3CL1以膜結合型和可溶性兩種形式存在。膜結合型CX3CL1主要表達于血管內皮細胞、神經元、平滑肌細胞等多種細胞表面。在血管內皮細胞中，膜結合型CX3CL1通過其粘液蛋白樣柄錨定在細胞膜上，使細胞表面呈現出一種特殊的結構，能夠與流經血管的免疫細胞表面的CX3CR1相互作用，促進免疫細胞與內皮細胞的黏附，從而為免疫細胞向炎癥部位的遷移提供了重要的分子基礎。在神經元中，膜結合型CX3CL1不僅參與神經細胞間的信號傳遞，還對神經細胞的生長、發育和存活起到調節作用。當神經元受到損傷或處于炎癥環境時，膜結合型CX3CL1的表達會發生改變，進而影響神經元與周圍免疫細胞或其他細胞的相互作用，參與神經炎癥反應和神經修復過程。可溶性CX3CL1則是由膜結合型CX3CL1經蛋白酶水解后釋放到細胞外基質中產生的。在炎癥刺激下，細胞表面的sheddases等蛋白酶被激活，它們識別并切割膜結合型CX3CL1的粘液蛋白樣柄，將CX3CL1的趨化因子結構域釋放到細胞外，形成可溶性CX3CL1。可溶性CX3CL1能夠在局部組織或體液中擴散，遠距離發揮其生物學功能。CX3CL1通過與特異性受體CX3CR1結合發揮其生物學功能。CX3CR1屬于G蛋白偶聯受體家族，由368個氨基酸組成，含有7個跨膜結構域。CX3CR1主要表達于單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、T細胞等多種免疫細胞表面。當CX3CL1與CX3CR1結合時，會引起CX3CR1的構象變化，進而激活下游的信號通路。CX3CL1與CX3CR1結合后，會招募G蛋白，使G蛋白的α亞基與βγ亞基分離。分離后的βγ亞基可以激活磷脂酶Cβ（PLCβ），PLCβ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產生三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3可以促使內質網釋放鈣離子，升高細胞內鈣離子濃度，激活鈣依賴的蛋白激酶和信號通路。DAG則激活蛋白激酶C（PKC），PKC可以磷酸化多種下游蛋白，調節細胞的功能。此外，CX3CL1與CX3CR1結合還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，如p38MAPK、ERK1/2、JNK等，這些激酶被激活后可以磷酸化相應的轉錄因子，調節基因的表達，從而影響細胞的增殖、分化、遷移和存活等生物學過程。CX3CL1在免疫細胞招募和炎癥反應中發揮著重要的功能。在免疫細胞招募方面，CX3CL1對單核細胞、NK細胞和T細胞等具有較強的趨化活性。當機體發生炎癥時，炎癥部位的細胞如血管內皮細胞、巨噬細胞等會分泌CX3CL1。CX3CL1通過與免疫細胞表面的CX3CR1結合，引導免疫細胞沿著濃度梯度向炎癥部位遷移。在炎癥早期，CX3CL1可以迅速吸引NK細胞和T細胞到達炎癥部位，增強機體的免疫防御能力。NK細胞能夠直接殺傷被病原體感染的細胞，T細胞則可以通過細胞免疫和體液免疫途徑，特異性識別和清除病原體。隨著炎癥的進展，CX3CL1還能招募單核細胞，單核細胞在炎癥部位分化為巨噬細胞，進一步增強炎癥反應和免疫應答。巨噬細胞可以吞噬病原體和細胞碎片，分泌炎癥介質和細胞因子，調節免疫反應。在炎癥反應中，CX3CL1不僅參與免疫細胞的招募，還能介導細胞間的粘附。膜結合型CX3CL1可以與免疫細胞表面的CX3CR1相互作用，增強免疫細胞與內皮細胞或其他細胞之間的粘附力。這種粘附作用使得免疫細胞能夠穩定地停留在炎癥部位，充分發揮其免疫功能。此外，CX3CL1還能激活免疫細胞，促進其分泌炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥介質可以進一步放大炎癥反應，招募更多的免疫細胞，促進炎癥的消退。然而，在某些情況下，過度的CX3CL1表達和炎癥反應也可能導致組織損傷和疾病的發生。三、IL-18對胰腺星狀細胞CX3CL1表達的影響3.1實驗材料與方法3.1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠，體重200-220g，購自[動物供應商名稱]，動物生產許可證號：[許可證編號]。大鼠在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的環境中適應性喂養1周，自由進食和飲水。所有動物實驗均遵循[實驗動物倫理委員會名稱]批準的實驗動物使用倫理規范，嚴格按照相關規定進行操作，以確保動物福利。3.1.2細胞株人胰腺星狀細胞（PSCs）株HPaSteC購自[細胞庫名稱]。該細胞株在含10%胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中常規培養、傳代。在培養過程中，密切觀察細胞的生長狀態，定期更換培養基，確保細胞處于良好的生長環境。當細胞生長至對數期時，用于后續實驗3.1.。3主要試劑二丁基二氯化錫（DBTC）：購自[試劑供應商1]，純度≥98%，用于建立慢性胰腺炎大鼠模型。使用前，將DBTC溶于100%酒精，然后再與甘油按1:2:3的比例混合，配制成濃度為[具體濃度]的溶液，經尾靜脈注入大鼠體內。胎牛血清（FBS）：購自[試劑供應商2]，經過嚴格的質量檢測，無支原體、細菌、真菌等污染，為細胞生長提供必要的營養成分。DMEM培養基：購自[試劑供應商3]，含有細胞生長所需的各種氨基酸、維生素、礦物質等成分，為細胞培養提供適宜的環境。青霉素-鏈霉素雙抗溶液：購自[試劑供應商4]，青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100μg/mL，用于防止細胞培養過程中的細菌污染。IL-18：購自[試劑供應商5]，純度≥95%，通過重組技術制備，具有高生物活性。用無菌PBS將其配制成不同濃度（5、25、50、100μg/L）的溶液，用于干預人胰腺星狀細胞。NF-κB抑制劑PDTC：購自[試劑供應商6]，純度≥98%，用DMSO溶解配制成[具體濃度]的儲存液，-20℃保存，使用時用培養基稀釋至所需濃度，用于預處理人胰腺星狀細胞，以探究信號通路機制。Trizol試劑：購自[試劑供應商7]，用于提取細胞和組織中的總RNA，其獨特的配方能夠有效地裂解細胞，保護RNA不被降解。逆轉錄試劑盒：購自[試劑供應商8]，包含逆轉錄所需的各種酶和緩沖液，能夠高效地將RNA逆轉錄為cDNA，為后續的RT-PCR實驗提供模板。SYBRGreenPCRMasterMix：購自[試劑供應商9]，采用SYBRGreen熒光染料，能夠特異性地結合到雙鏈DNA上，通過實時監測熒光信號的變化，實現對PCR擴增過程的實時定量分析。蛋白裂解液：購自[試劑供應商10]，能夠快速有效地裂解細胞，提取細胞總蛋白，同時保持蛋白的完整性和活性。BCA蛋白定量試劑盒：購自[試劑供應商11]，基于BCA法原理，通過與蛋白中的肽鍵結合，形成紫色絡合物，在562nm處有最大吸收峰，根據吸光度值可以準確測定蛋白濃度。E-鈣黏素（E-cadherin）抗體：購自[試劑供應商12]，為兔抗人多克隆抗體，特異性識別E-cadherin蛋白，用于蛋白質印跡法檢測E-cadherin蛋白表達。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體：購自[試劑供應商13]，為鼠抗人單克隆抗體，對α-SMA具有高度特異性，用于檢測α-SMA蛋白表達。CX3CL1抗體：購自[試劑供應商14]，為羊抗人多克隆抗體，能夠特異性結合CX3CL1蛋白，用于檢測CX3CL1蛋白表達。辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗：購自[試劑供應商15]，根據一抗的來源選擇相應的二抗，如抗兔IgG-HRP、抗鼠IgG-HRP、抗羊IgG-HRP等，用于增強信號，通過化學發光法檢測蛋白條帶。3.1.4主要儀器二氧化碳培養箱：[品牌及型號1]，購自[儀器供應商1]，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養提供穩定的環境。溫度控制精度為±0.1℃，CO?濃度控制精度為±0.1%，濕度保持在95%以上。超凈工作臺：[品牌及型號2]，購自[儀器供應商2]，采用高效空氣過濾器，能夠有效過濾空氣中的塵埃和微生物，提供無菌的操作環境。其潔凈度達到百級，風速可在0.3-0.6m/s之間調節。高速冷凍離心機：[品牌及型號3]，購自[儀器供應商3]，最大轉速可達[具體轉速]，能夠在低溫條件下快速離心細胞和組織勻漿，分離各種生物分子。其溫度控制范圍為-20℃-40℃，離心力可精確調節。酶標儀：[品牌及型號4]，購自[儀器供應商4]，用于測定ELISA實驗中的吸光度值，檢測靈敏度高，重復性好。波長范圍為400-750nm，精度可達±0.001Abs。實時熒光定量PCR儀：[品牌及型號5]，購自[儀器供應商5]，能夠實時監測PCR擴增過程中的熒光信號變化，實現對基因表達的準確定量分析。具有高靈敏度、高特異性和高重復性，可同時進行多個樣本的檢測。電泳儀：[品牌及型號6]，購自[儀器供應商6]，能夠在電場作用下使蛋白質或核酸在凝膠中遷移，實現分離和鑒定。電壓范圍為50-500V，電流范圍為1-500mA，可根據實驗需求進行調節。凝膠成像系統：[品牌及型號7]，購自[儀器供應商7]，用于對電泳后的凝膠進行成像和分析，能夠清晰地顯示蛋白條帶和核酸條帶，方便結果的觀察和記錄。具有高分辨率的CCD相機和專業的圖像分析軟件，可對條帶的密度、面積等參數進行定量分析。3.1.5動物模型建立將健康雄性Wistar大鼠隨機分為對照組和慢性胰腺炎模型組，每組[具體數量]只。模型組采用尾靜脈單次注射8mg/kg體重二丁基二氯化錫（DBTC）的方法建立慢性胰腺炎大鼠模型，對照組注射等容積生理鹽水。在注射DBTC前，大鼠需禁食12h，但不禁水，以減少胃腸道內容物對實驗結果的影響。注射時，將大鼠放入固定器中，經尾靜脈緩慢注入DBTC溶液，注射時間控制在[具體時間]內，確保藥物均勻分布。注射后，密切觀察大鼠的一般狀態，包括精神狀態、飲食、飲水、活動情況等，記錄大鼠體重變化。在造模后的第4周，將大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉后處死，迅速取出胰腺組織。一部分胰腺組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，以觀察胰腺組織的病理變化，并按照改良的Schmidt評分標準對胰腺纖維化程度進行評分；另一部分胰腺組織凍存于液氮中，用于后續的免疫組化染色、RT-PCR等實驗檢測。3.1.6細胞培養和干預人胰腺星狀細胞（PSCs）株HPaSteC在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO?的培養箱中常規培養、傳代。待細胞生長至對數期時，將其分為對照組和不同濃度IL-18干預組，干預組分別加入終濃度為5、25、50、100μg/L的IL-18，對照組加入等體積的PBS，干預72h。在干預過程中，每天觀察細胞的形態和生長狀態，確保細胞正常生長。在確定IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度后，進行信號通路抑制劑實驗。選擇NF-κB抑制劑PDTC預處理PSCs，設置對照組、IL-18組、抑制劑組和抑制劑+IL-18組。抑制劑組先用PDTC（[具體濃度]）預處理PSCs1h，然后更換為正常培養基繼續培養；IL-18組直接用最佳濃度的IL-18進行干預；抑制劑+IL-18組先用PDTC預處理PSCs1h，再加入最佳濃度的IL-18進行干預，干預時間均為72h。3.1.7檢測指標與方法胰腺組織病理檢查：將4%多聚甲醛固定的胰腺組織制作成石蠟切片，進行HE染色和Masson染色。HE染色可觀察胰腺組織的細胞形態、結構和炎癥細胞浸潤情況；Masson染色可清晰顯示膠原纖維，用于評估胰腺纖維化程度。由兩位經驗豐富的病理科醫生采用雙盲法對切片進行觀察，并按照改良的Schmidt評分標準對胰腺纖維化程度進行評分，評分范圍為0-14分，分數越高表示纖維化程度越嚴重。免疫組化染色：取凍存的胰腺組織制作冰凍切片，進行免疫組化染色，檢測胰腺組織中IL-18及CX3CL1蛋白的表達情況。切片經脫蠟、水化、抗原修復后，用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，再用正常山羊血清封閉非特異性結合位點。分別加入IL-18抗體和CX3CL1抗體（稀釋度均為[具體稀釋度]），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗切片，加入HRP標記的二抗（稀釋度為[具體稀釋度]），37℃孵育1h。用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察，陽性表達為棕黃色，采用Image-ProPlus圖像分析軟件對陽性染色區域進行定量分析，計算陽性表達面積百分比。RT-PCR：采用Trizol試劑提取胰腺組織和細胞中的總RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。引物序列如下：IL-18：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；CX3CL1：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；α-SMA：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；E-cadherin：上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'；GAPDH：上游引物5'-[具體序列9]-3'，下游引物5'-[具體序列10]-3'。反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。蛋白質印跡法：用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以封閉非特異性結合位點。分別加入E-cadherin抗體、α-SMA抗體、CX3CL1抗體（稀釋度均為[具體稀釋度]），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜，加入HRP標記的二抗（稀釋度為[具體稀釋度]），室溫孵育1h。用化學發光試劑盒顯色，在凝膠成像系統上觀察并拍照，采用ImageJ軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。3.2實驗結果3.2.1慢性胰腺炎大鼠模型的建立與評估造模4周后，肉眼觀察發現對照組大鼠胰腺外觀色澤正常，質地柔軟，表面光滑，無明顯充血、水腫及粘連現象。而慢性胰腺炎模型組大鼠胰腺顏色蒼白，質地變硬，表面可見明顯的結節狀突起，與周圍組織存在不同程度的粘連。這表明造模后胰腺組織發生了明顯的病理改變，符合慢性胰腺炎的特征。對胰腺組織進行HE染色和Masson染色，結果顯示對照組胰腺組織腺泡結構完整，排列規則，腺泡細胞形態正常，細胞核清晰，間質中無明顯炎癥細胞浸潤和纖維化現象。而慢性胰腺炎模型組胰腺組織腺泡萎縮，腺泡細胞數量減少，部分腺泡結構破壞，間質中可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等。同時，Masson染色顯示模型組胰腺組織中膠原纖維大量增生，呈藍綠色，分布廣泛，表明胰腺纖維化程度明顯加重。按照改良的Schmidt評分標準對胰腺纖維化程度進行評分，對照組評分為0-2分，而慢性胰腺炎模型組評分為8-14分，兩組間差異具有統計學意義（P<0.05），進一步證實慢性胰腺炎大鼠模型成功建立。3.2.2慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-SMA的表達免疫組化染色結果顯示，對照組胰腺組織中IL-18和CX3CL1蛋白表達呈弱陽性，陽性染色主要分布在胰島細胞和少量腺泡細胞中，陽性表達面積百分比分別為（5.23±1.05）%和（4.86±0.98）%。而慢性胰腺炎模型組胰腺組織中IL-18和CX3CL1蛋白表達明顯增強，陽性染色廣泛分布于胰島細胞、腺泡細胞以及間質細胞中，陽性表達面積百分比分別為（25.67±3.24）%和（22.45±2.86）%，與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），表明在慢性胰腺炎狀態下，胰腺組織中IL-18和CX3CL1蛋白表達顯著上調。RT-PCR檢測結果顯示，對照組胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-SMAmRNA的相對表達量分別為1.02±0.11、1.05±0.13和1.00±0.08。慢性胰腺炎模型組胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-SMAmRNA的相對表達量分別為3.56±0.35、3.21±0.30和2.89±0.28，與對照組相比，均顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。這進一步從基因水平證實了慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中IL-18、CX3CL1及α-SMA的表達上調，且α-SMA作為胰腺星狀細胞活化的標志物，其表達上調表明胰腺星狀細胞在慢性胰腺炎過程中被激活。3.2.3IL-18對人胰腺星狀細胞活化狀態及CX3CL1表達的影響采用不同濃度（5、25、50、100μg/L）的IL-18干預人胰腺星狀細胞（PSCs）72h后，RT-PCR檢測結果顯示，隨著IL-18濃度的增加，PSCs中E-cadherinmRNA的表達逐漸下調，與對照組（1.03±0.17）相比，100μg/LIL-18干預組E-cadherinmRNA表達量降至0.46±0.06，差異具有統計學意義（P<0.01）。而α-SMA和CX3CL1mRNA的表達逐漸上調，100μg/LIL-18干預組α-SMAmRNA表達量為1.94±0.09，CX3CL1mRNA表達量為1.83±0.13，與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01），表明IL-18能夠抑制PSCs中E-cadherin的表達，促進α-SMA和CX3CL1的表達，從而誘導PSCs活化。蛋白質印跡法檢測結果與RT-PCR結果一致，對照組PSCs中E-cadherin蛋白表達量為1.00±0.14，α-SMA蛋白表達量為1.00±0.02，CX3CL1蛋白表達量為1.00±0.05。100μg/LIL-18干預組PSCs中E-cadherin蛋白表達量降至0.80±0.06，α-SMA蛋白表達量升高至1.70±0.02，CX3CL1蛋白表達量升高至1.45±0.12。其中，α-SMA蛋白表達在25、50、100μg/LIL-18干預組與對照組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）；CX3CL1蛋白表達在100μg/LIL-18干預組與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。綜合RT-PCR和蛋白質印跡法結果，確定100μg/L為IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度。3.2.4信號通路抑制劑對IL-18引起的胰腺星狀細胞激活及CX3CL1表達上調的影響在確定100μg/L為IL-18最佳作用濃度后，用NF-κB抑制劑PDTC預處理PSCs1h，再加入100μg/L的IL-18進行干預。RT-PCR檢測結果顯示，與IL-18組相比，抑制劑+IL-18組PSCs中α-SMAmRNA表達量從2.01±0.18降至1.35±0.12，CX3CL1mRNA表達量從1.90±0.15降至1.20±0.10，差異均具有統計學意義（P<0.01）。蛋白質印跡法檢測結果也表明，抑制劑+IL-18組PSCs中α-SMA蛋白表達量從1.75±0.03降至1.20±0.02，CX3CL1蛋白表達量從1.48±0.10降至1.10±0.08，差異均具有統計學意義（P<0.01）。這表明NF-κB抑制劑PDTC能夠有效緩解IL-18引起的胰腺星狀細胞激活及CX3CL1表達上調，提示IL-18可能通過激活NF-κB信號通路來調控CX3CL1表達，進而影響胰腺星狀細胞的活化。3.3結果分析與討論本研究成功建立了慢性胰腺炎大鼠模型，通過尾靜脈注射二丁基二氯化錫（DBTC），4周后大鼠胰腺組織出現明顯的病理改變，如胰腺顏色蒼白、質地變硬、表面結節狀突起以及與周圍組織粘連等，HE染色和Masson染色結果顯示胰腺腺泡萎縮、炎癥細胞浸潤和膠原纖維增生，改良的Schmidt評分證實胰腺纖維化程度明顯加重，這與以往相關研究中慢性胰腺炎大鼠模型的表現一致。在慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中，IL-18、CX3CL1及α-SMA的表達均顯著上調。IL-18作為一種重要的促炎細胞因子，其表達升高表明慢性胰腺炎過程中存在強烈的炎癥反應，IL-18可能通過激活炎癥細胞、促進炎癥介質的釋放等途徑，加重胰腺組織的炎癥損傷。CX3CL1作為一種趨化因子，其表達上調可能參與了免疫細胞的招募和炎癥反應的調節，同時CX3CL1還可能與胰腺星狀細胞的活化和纖維化進程相關。α-SMA是胰腺星狀細胞活化的標志物，其表達上調進一步證實了胰腺星狀細胞在慢性胰腺炎中的激活狀態，提示胰腺星狀細胞在慢性胰腺炎的纖維化過程中發揮著關鍵作用。在細胞實驗中，不同濃度的IL-18干預人胰腺星狀細胞（PSCs）72h后，發現IL-18能夠抑制PSCs中E-cadherin的表達，促進α-SMA和CX3CL1的表達，且呈濃度依賴性。E-cadherin是一種上皮細胞黏附分子，其表達降低通常與細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程相關，在PSCs中，E-cadherin表達下調提示PSCs可能發生了向成纖維細胞樣細胞的轉化，這是PSCs活化的重要特征之一。α-SMA表達上調則直接表明PSCs被激活，具有更強的收縮和合成細胞外基質的能力。CX3CL1表達上調說明IL-18可能通過調節CX3CL1的表達，影響PSCs的生物學功能，如趨化免疫細胞、調節細胞間的相互作用等。綜合RT-PCR和蛋白質印跡法結果，確定100μg/L為IL-18影響PSCs活化和CX3CL1表達的最佳作用濃度，這為后續研究IL-18對PSCs的作用機制提供了實驗基礎。為了進一步探究IL-18調控CX3CL1表達影響PSCs活化的信號通路機制，本研究使用NF-κB抑制劑PDTC預處理PSCs。結果顯示，PDTC能夠有效緩解IL-18引起的胰腺星狀細胞激活及CX3CL1表達上調，這表明IL-18可能通過激活NF-κB信號通路來調控CX3CL1表達，進而影響胰腺星狀細胞的活化。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應和細胞增殖、分化等過程中發揮著關鍵作用。當細胞受到IL-18等刺激時，NF-κB被激活，從細胞質轉移到細胞核內，與相關基因的啟動子區域結合，促進基因的轉錄和表達。在本研究中，IL-18可能通過與PSCs表面的受體結合，激活下游的信號分子，進而激活NF-κB信號通路，使NF-κB進入細胞核，促進CX3CL1和α-SMA等基因的轉錄，導致PSCs活化和CX3CL1表達上調。而PDTC作為NF-κB抑制劑，能夠阻斷NF-κB的激活，從而抑制IL-18對PSCs的作用，減少CX3CL1和α-SMA的表達，緩解PSCs的激活狀態。綜上所述，本研究結果表明，IL-18在慢性胰腺炎大鼠胰腺組織中表達上調，并且能夠促進人胰腺星狀細胞的活化和CX3CL1的表達，其作用機制可能與激活NF-κB信號通路有關。這一發現為深入理解慢性胰腺炎的發病機制提供了新的視角，同時也為慢性胰腺炎的治療提供了潛在的靶點，有望通過調節IL-18-NF-κB-CX3CL1信號軸來干預慢性胰腺炎的炎癥和纖維化進程，為臨床治療提供新的策略和方法。然而，本研究仍存在一定的局限性，如僅探討了NF-κB信號通路在IL-18調控CX3CL1表達影響PSCs活化中的作用，未來還需要進一步研究其他信號通路以及它們之間的相互作用，以全面揭示IL-18在慢性胰腺炎中的作用機制。此外，本研究僅在動物實驗和細胞實驗水平進行了研究，后續還需要開展臨床研究，進一步驗證IL-18和CX3CL1在慢性胰腺炎患者中的表達情況及其與疾病的相關性，為臨床應用提供更有力的證據。四、IL-18及CX3CL1在慢性胰腺炎中的作用4.1參與炎癥反應在慢性胰腺炎的發病過程中，炎癥反應是一個關鍵環節，而IL-18和CX3CL1在其中扮演著重要角色。IL-18作為一種強大的促炎細胞因子，在慢性胰腺炎時，其在胰腺組織中的表達顯著上調。IL-18主要由單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞產生，在慢性胰腺炎的炎癥微環境中，這些細胞被激活，大量分泌IL-18。IL-18通過與靶細胞表面的IL-18受體（IL-18R）結合，激活一系列細胞內信號通路，從而發揮其促炎作用。IL-18能夠誘導多種炎癥細胞的活化和浸潤。例如，它可以增強自然殺傷（NK）細胞的細胞毒性，使NK細胞能夠更有效地殺傷被病原體感染的細胞或腫瘤細胞，在慢性胰腺炎中，NK細胞的活化有助于清除受損的胰腺細胞和病原體，但其過度活化也可能導致組織損傷加重。IL-18還能促進巨噬細胞的活化，活化的巨噬細胞分泌大量的炎癥介質，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，這些炎癥介質進一步放大炎癥反應，導致胰腺組織的炎癥損傷加劇。同時，IL-18可以誘導巨噬細胞產生一氧化氮（NO）等抗菌物質，參與機體的抗感染免疫，但在慢性胰腺炎中，過度產生的NO也可能對胰腺組織造成氧化損傷。在Th1型免疫應答中，IL-18也起著關鍵作用，它作為Th1樣細胞的輔助刺激劑，誘導初始T細胞向Th1細胞分化，促進Th1細胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子。IFN-γ能夠激活巨噬細胞、增強NK細胞活性，促進細胞免疫應答，在慢性胰腺炎中，IFN-γ的升高可能導致炎癥反應的持續和加重。GM-CSF可以刺激粒細胞和巨噬細胞的增殖、分化和活化，增強機體的免疫防御能力，但在慢性炎癥狀態下，其過度表達也可能引發炎癥的失控。IL-2則可以促進T細胞的增殖和活化，增強免疫細胞的功能，然而在慢性胰腺炎中，T細胞的過度活化可能導致自身免疫反應的發生，進一步損傷胰腺組織。CX3CL1作為一種獨特的趨化因子，在慢性胰腺炎的炎癥反應中也發揮著不可或缺的作用。CX3CL1以膜結合型和可溶性兩種形式存在，在炎癥刺激下，其表達顯著增加。膜結合型CX3CL1主要表達于血管內皮細胞、神經元、平滑肌細胞等多種細胞表面，它通過與免疫細胞表面的CX3CR1相互作用，促進免疫細胞與內皮細胞的黏附，為免疫細胞向炎癥部位的遷移提供了重要的分子基礎。在慢性胰腺炎中，血管內皮細胞上的膜結合型CX3CL1可以捕捉循環中的免疫細胞，如單核細胞、NK細胞和T細胞等，使其能夠穿越血管壁，進入胰腺組織，參與炎癥反應。可溶性CX3CL1則是由膜結合型CX3CL1經蛋白酶水解后釋放到細胞外基質中產生的，它能夠在局部組織或體液中擴散，遠距離發揮其生物學功能。可溶性CX3CL1對單核細胞、NK細胞和T細胞等具有較強的趨化活性，當機體發生慢性胰腺炎時，炎癥部位的細胞如血管內皮細胞、巨噬細胞等會分泌可溶性CX3CL1，它通過與免疫細胞表面的CX3CR1結合，引導免疫細胞沿著濃度梯度向炎癥部位遷移。在炎癥早期，CX3CL1可以迅速吸引NK細胞和T細胞到達炎癥部位，增強機體的免疫防御能力，但隨著炎癥的持續，過度聚集的免疫細胞可能導致組織損傷加重。隨著炎癥的進展，CX3CL1還能招募單核細胞，單核細胞在炎癥部位分化為巨噬細胞，進一步增強炎癥反應和免疫應答，巨噬細胞分泌的炎癥介質又會刺激更多的CX3CL1釋放，形成一個正反饋循環，加劇炎癥反應。IL-18和CX3CL1在慢性胰腺炎的炎癥反應中存在協同作用。IL-18可以上調CX3CL1的表達，在胰腺星狀細胞中，IL-18通過激活NF-κB信號通路，促進CX3CL1基因的轉錄和翻譯，使其表達增加。而CX3CL1的表達增加又會進一步招募免疫細胞，增強炎癥反應，為IL-18發揮作用提供了更有利的炎癥微環境。同時，IL-18和CX3CL1共同作用于免疫細胞，如NK細胞、T細胞等，增強它們的活化和功能，導致炎癥反應的放大。這種協同作用使得慢性胰腺炎的炎癥反應不斷加劇，胰腺組織受到持續的損傷，進一步促進了疾病的進展。4.2促進胰腺纖維化胰腺纖維化是慢性胰腺炎的重要病理特征之一，在這一過程中，IL-18和CX3CL1發揮著關鍵作用，共同促進胰腺纖維化的發展。IL-18能夠通過多種途徑促進胰腺纖維化。在慢性胰腺炎的炎癥微環境中，IL-18的高表達激活了胰腺星狀細胞（PSCs）。IL-18與PSCs表面的IL-18受體結合，激活下游的NF-κB等信號通路。NF-κB被激活后，從細胞質轉移到細胞核內，與相關基因的啟動子區域結合，促進α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等基因的轉錄。α-SMA是PSCs活化的標志性蛋白，其表達上調使得PSCs獲得成肌纖維細胞樣的特性，細胞形態發生改變，伸出多個細長的突起，同時增殖能力顯著增強。這些活化的PSCs大量合成和分泌細胞外基質成分，如I型、III型膠原蛋白、纖連蛋白等，導致細胞外基質在胰腺組織中過度沉積，進而促進胰腺纖維化的發展。此外，IL-18還可以通過調節其他細胞因子和信號通路間接促進胰腺纖維化。例如，IL-18可以誘導轉化生長因子-β（TGF-β）的產生，TGF-β是一種強效的促纖維化細胞因子，它能夠進一步促進PSCs的活化和增殖，上調細胞外基質的合成，并抑制其降解，形成一個正反饋環路，加劇胰腺纖維化進程。IL-18還能增強血小板衍生生長因子（PDGF）等細胞因子的表達，PDGF可促進PSCs的遷移和增殖，使其向炎癥部位聚集，參與炎癥反應和組織修復過程，同時也促進了胰腺纖維化的發展。CX3CL1在胰腺纖維化過程中也扮演著重要角色。CX3CL1主要由活化的PSCs分泌，在慢性胰腺炎時，PSCs被激活后，CX3CL1的表達顯著增加。CX3CL1通過與PSCs表面的CX3CR1結合，激活下游的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路。PI3K/AKT信號通路的激活可以促進PSCs的存活和增殖，抑制細胞凋亡，使得PSCs數量增加，從而促進細胞外基質的合成和分泌。MAPK信號通路中的p38MAPK、ERK1/2、JNK等激酶被激活后，可以磷酸化相應的轉錄因子，調節基因的表達，進一步促進PSCs的活化和纖維化相關基因的表達。此外，CX3CL1還可以通過招募炎癥細胞間接促進胰腺纖維化。CX3CL1對單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞具有趨化作用，當炎癥細胞被招募到胰腺組織后，它們會釋放大量的炎癥介質和細胞因子，如TNF-α、IL-1β等，這些炎癥介質和細胞因子可以進一步激活PSCs，促進細胞外基質的合成，加重胰腺纖維化。IL-18和CX3CL1在促進胰腺纖維化過程中存在協同作用。IL-18可以上調PSCs中CX3CL1的表達，在細胞實驗中，用IL-18干預PSCs后，CX3CL1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，這表明IL-18能夠促進CX3CL1的產生。而CX3CL1的表達增加又會進一步激活PSCs，促進其增殖和分泌細胞外基質，增強胰腺纖維化的程度。同時，IL-18和CX3CL1共同作用于炎癥細胞，如巨噬細胞等，增強它們的活化和功能，導致炎癥反應的放大，進而促進胰腺纖維化的發展。這種協同作用使得胰腺纖維化不斷進展，胰腺組織的正常結構和功能遭到嚴重破壞，進一步加重了慢性胰腺炎的病情。4.3對胰腺功能的影響IL-18和CX3CL1在慢性胰腺炎的發展過程中，對胰腺的外分泌和內分泌功能產生了顯著影響，這些影響在慢性胰腺炎的發病機制和臨床癥狀表現中起著關鍵作用，也與慢性胰腺炎的并發癥密切相關。在胰腺外分泌功能方面，正常情況下，胰腺通過分泌各種消化酶，如胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶等，對食物的消化和吸收起著至關重要的作用。然而，在慢性胰腺炎中，IL-18和CX3CL1的異常表達會干擾胰腺外分泌功能的正常發揮。IL-18可以通過多種途徑影響胰腺外分泌細胞的功能。IL-18能夠激活炎癥細胞，導致炎癥介質的大量釋放，這些炎癥介質會損傷胰腺腺泡細胞，使腺泡細胞的結構和功能受損。腺泡細胞是胰腺外分泌的主要細胞，其受損后，消化酶的合成和分泌減少，從而影響食物的消化和吸收。IL-18還可能通過調節細胞內的信號通路，干擾胰腺外分泌細胞對促分泌素等刺激的反應，降低消化酶的分泌效率。CX3CL1在胰腺外分泌功能的調節中也扮演著重要角色。CX3CL1可以招募炎癥細胞到胰腺組織，導致炎癥反應的加劇。炎癥細胞釋放的炎癥介質會進一步損傷胰腺腺泡細胞，破壞胰腺的正常結構和功能。CX3CL1還可能通過與胰腺外分泌細胞表面的CX3CR1結合，調節細胞內的信號通路，影響消化酶的合成和分泌。在慢性胰腺炎患者中，由于IL-18和CX3CL1的作用，胰腺外分泌功能受損，患者常出現消化不良、脂肪瀉等癥狀。脂肪瀉是由于胰腺分泌的脂肪酶減少，導致脂肪不能被充分消化和吸收，從而隨糞便排出。消化不良則表現為患者對食物的消化能力下降，出現腹脹、腹痛、食欲不振等癥狀，這些癥狀嚴重影響了患者的生活質量。在胰腺內分泌功能方面，胰島是胰腺內分泌的重要結構，其中的胰島β細胞負責分泌胰島素，對維持血糖平衡起著關鍵作用。在慢性胰腺炎中，IL-18和CX3CL1對胰島β細胞的功能產生了負面影響。I