LACTB：結直腸癌診療新視角——表達特征、臨床關聯與機制探索一、引言1.1研究背景與意義結直腸癌（colorectalcancer，CRC）作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率一直居高不下。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，結直腸癌新發病例數達193萬，位居所有惡性腫瘤的第三位，死亡病例數約94萬，排名第二。在中國，結直腸癌同樣是常見的消化系統惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響人們的生活質量和生命健康。早期結直腸癌患者可能無明顯癥狀，隨著病情進展，會出現排便習慣改變、便血、腹痛、腸梗阻等一系列癥狀。這些癥狀不僅給患者帶來身體上的痛苦，還會對其心理和社會功能造成負面影響。而且，由于結直腸癌起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，此時腫瘤往往發生了局部浸潤或遠處轉移，治療難度顯著增加，預后較差。盡管目前手術切除、化療、放療、靶向治療及免疫治療等多種治療手段不斷發展，但晚期結直腸癌患者的5年生存率仍不理想。因此，深入探究結直腸癌的發病機制，尋找有效的早期診斷標志物和治療靶點，對于提高結直腸癌患者的生存率和生活質量具有至關重要的意義。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，人們對腫瘤發生發展的分子機制有了更深入的認識。研究發現，許多基因和蛋白質在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移過程中發揮著關鍵作用。線粒體內β-內酰胺酶絲氨酸樣蛋白LACTB（Serinebeta-lactamase-likeproteinLACTB）作為一種新發現的蛋白質，逐漸引起了科研人員的關注。已有研究表明，LACTB在多種腫瘤組織中表達異常，并且與腫瘤的惡性程度、預后等密切相關。然而，LACTB在結直腸癌中的表達情況及其具體的生物學功能和臨床意義尚未完全明確。對LACTB在結直腸癌中的表達及其臨床意義進行研究，一方面有助于揭示結直腸癌的發病機制，從分子層面深入理解腫瘤的發生發展過程；另一方面，有望為結直腸癌的早期診斷、預后評估及靶向治療提供新的思路和方法。若能明確LACTB作為結直腸癌潛在生物標志物的價值，可實現對高危人群的早期篩查和診斷，做到早發現、早治療，提高患者的治愈率和生存率。此外，將LACTB作為治療靶點開發新的治療策略，有可能為結直腸癌患者帶來更有效的治療手段，改善患者的預后和生活質量。因此，本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究LACTB在結直腸癌中的表達情況，明確其與結直腸癌臨床病理特征及患者預后之間的關系，進而為結直腸癌的早期診斷、預后評估及治療提供新的理論依據和潛在靶點。具體研究目的如下：明確LACTB在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達差異：運用免疫組織化學、蛋白質免疫印跡（Westernblot）等技術，檢測LACTB在結直腸癌組織和配對的正常結直腸組織中的蛋白表達水平，通過對比分析，確定LACTB在兩種組織中的表達差異是否具有統計學意義，以此初步判斷LACTB與結直腸癌發生的相關性。分析LACTB表達與結直腸癌臨床病理特征的關聯：收集結直腸癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤的大小、部位、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等。將LACTB的表達水平與這些臨床病理特征進行相關性分析，明確LACTB表達與各臨床病理參數之間的關系，如LACTB低表達是否與腫瘤的高分期、淋巴結轉移等惡性特征相關，為進一步理解LACTB在結直腸癌發展進程中的作用提供線索。評估LACTB表達對結直腸癌患者預后的影響：通過對結直腸癌患者進行長期隨訪，獲取患者的生存數據，包括總生存期（OS）和無病生存期（DFS）等。采用生存分析方法，如Kaplan-Meier法和Cox回歸分析，評估LACTB表達水平與患者生存預后之間的關系，確定LACTB是否可作為預測結直腸癌患者預后的獨立生物標志物，為臨床醫生制定個性化的治療方案和判斷患者預后提供參考。初步探討LACTB在結直腸癌中的作用機制：在細胞水平上，利用結直腸癌細胞系，通過基因過表達或基因敲低技術，改變細胞中LACTB的表達水平，觀察細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為的變化。進一步通過分子生物學實驗，如蛋白質-蛋白質相互作用分析、信號通路檢測等，探究LACTB影響結直腸癌細胞生物學行為的潛在分子機制，為以LACTB為靶點開發新的治療策略奠定理論基礎。基于上述研究目的，本研究提出以下關鍵問題：LACTB在結直腸癌組織中的表達相較于正常結直腸組織是否存在顯著差異？這種差異是否與結直腸癌的臨床病理特征密切相關？LACTB表達水平能否作為預測結直腸癌患者預后的有效指標？LACTB在結直腸癌細胞中發揮生物學功能的分子機制是什么？通過對這些問題的深入研究，有望揭示LACTB在結直腸癌發生發展中的重要作用，為結直腸癌的防治提供新的思路和方法。1.3研究方法與創新點為實現上述研究目的，本研究將采用多種實驗方法和技術手段，從組織、細胞和分子水平對LACTB在結直腸癌中的表達及其臨床意義進行全面深入的研究。具體研究方法如下：組織標本收集與處理：收集[具體醫院名稱]病理科存檔的結直腸癌組織石蠟標本及配對的癌旁正常結直腸組織石蠟標本，同時收集患者詳細的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等。對石蠟標本進行切片處理，用于后續的免疫組織化學染色等實驗。免疫組織化學（IHC）檢測：運用免疫組織化學技術，檢測LACTB在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的蛋白表達水平。通過特異性抗體與LACTB蛋白結合，再利用顯色反應使陽性表達部位呈現出明顯的顏色，根據染色強度和陽性細胞比例對LACTB的表達進行半定量分析，從而判斷LACTB在兩種組織中的表達差異，并將患者分為LACTB高表達組和低表達組。蛋白質免疫印跡（Westernblot）分析：提取結直腸癌組織和正常結直腸組織的總蛋白，采用Westernblot技術進一步驗證LACTB的表達水平。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白分離，再轉印到膜上，用特異性抗體進行雜交檢測，最后通過化學發光法顯影，根據條帶的灰度值對LACTB蛋白表達進行定量分析，與免疫組織化學結果相互印證。細胞實驗：選用人結直腸癌細胞系，如HCT116、HT29等，以及正常結直腸上皮細胞系作為對照。利用基因轉染技術，構建LACTB過表達和基因敲低的細胞模型。通過細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入法）檢測細胞增殖能力的變化；采用細胞遷移實驗（劃痕實驗、Transwell遷移實驗）和侵襲實驗（Transwell侵襲實驗）觀察細胞遷移和侵襲能力的改變；通過流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況，探究LACTB對結直腸癌細胞生物學行為的影響。動物實驗：建立結直腸癌裸鼠移植瘤模型，將過表達或敲低LACTB的結直腸癌細胞接種到裸鼠體內，觀察腫瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量。實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織進行病理分析和相關分子檢測，研究LACTB在體內對結直腸癌生長和轉移的影響。分子機制研究：利用蛋白質-蛋白質相互作用技術，如免疫共沉淀（Co-IP）、GSTpull-down等，篩選與LACTB相互作用的蛋白質，通過質譜分析鑒定相互作用蛋白，并進一步驗證其相互作用關系。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot檢測相關信號通路中關鍵分子的表達變化，探究LACTB影響結直腸癌細胞生物學行為的潛在分子機制。臨床隨訪與生存分析：通過電話隨訪、門診復查等方式對結直腸癌患者進行長期隨訪，記錄患者的生存時間、復發轉移情況等信息。運用生存分析方法，如Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較LACTB高表達組和低表達組患者的總生存期和無病生存期；采用Cox回歸分析確定LACTB表達是否為影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：在研究視角上，目前關于LACTB在結直腸癌中的研究相對較少，本研究從組織、細胞和分子多個層面系統地探討LACTB在結直腸癌中的表達、功能及作用機制，為深入理解結直腸癌的發病機制提供了新的視角。在研究方法上，綜合運用多種先進的實驗技術，如基因編輯技術（CRISPR/Cas9系統用于構建穩定敲低LACTB的細胞系）、蛋白質-蛋白質相互作用技術以及動物模型等，全面深入地研究LACTB與結直腸癌的關系，使研究結果更具說服力。同時，將基礎研究與臨床應用緊密結合，不僅明確LACTB在結直腸癌發生發展中的生物學功能，還進一步探討其作為結直腸癌早期診斷標志物和治療靶點的潛在價值，為結直腸癌的臨床防治提供更直接、更有針對性的理論依據和實踐指導。二、LACTB與結直腸癌的理論基礎2.1LACTB的生物學特性LACTB，即線粒體內β-內酰胺酶絲氨酸樣蛋白，是一種在多種生物學過程中發揮關鍵作用的蛋白質，其獨特的結構賦予了它多樣的功能。在結構方面，LACTB蛋白由多個結構域組成，其核心結構域具有與細菌β-內酰胺酶相似的序列和折疊方式，這一結構特征使得LACTB具有潛在的酶活性。研究發現，LACTB在線粒體內能夠自發形成多聚體，以鏈狀的形態廣泛存在于線粒體內外膜間隙中。清華大學楊茂君教授研究團隊通過高分辨率結構解析技術，揭示了人源線粒體內成鏈狀絲氨酸蛋白酶LACTB野生型、截短體及抑制劑結合狀態的結構。結果顯示，LACTB野生型蛋白鏈狀結構為與DNA結構相似的雙螺旋鏈狀結構，其中，位于不同LACTB單體蛋白之間的三種相互作用界面共同維持了其鏈狀的雙螺旋結構，這種獨特的結構對于其功能的發揮至關重要。從功能角度來看，LACTB具有多種生物學功能。首先，它參與了脂質代謝的調控過程。有研究表明，在乳腺癌細胞中，LACTB能夠調節脂肪酸的合成和代謝，影響細胞內脂質的含量和分布。通過調節脂質代謝，LACTB可以進一步影響細胞的能量代謝和信號傳導，維持細胞的正常生理狀態。其次，LACTB在炎癥反應中也發揮著重要作用。當細胞受到炎癥刺激時，LACTB的表達水平會發生變化，進而調控炎癥相關信號通路的激活或抑制。例如，在某些炎癥模型中，LACTB能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應對細胞和組織的損傷。此外，LACTB還與細胞的增殖、分化和凋亡等過程密切相關。在正常細胞中，LACTB通過調節相關信號通路，維持細胞增殖和凋亡的平衡，保證細胞的正常生長和發育。當LACTB的表達或功能出現異常時，細胞的增殖和凋亡過程可能會受到干擾，導致細胞生長失控，進而引發腫瘤等疾病。在正常生理過程中，LACTB同樣發揮著不可或缺的作用。在線粒體中，LACTB參與維持線粒體的正常結構和功能。線粒體作為細胞的能量工廠，負責產生細胞所需的大部分ATP。LACTB通過調節線粒體的代謝過程，如氧化磷酸化、脂肪酸β-氧化等，確保線粒體能夠高效地產生能量，滿足細胞的生理需求。此外，LACTB還參與調節細胞內的氧化還原平衡。細胞在代謝過程中會產生大量的活性氧（ROS），過多的ROS會對細胞造成氧化損傷。LACTB可以通過調節抗氧化酶的活性或直接清除ROS，維持細胞內氧化還原穩態，保護細胞免受氧化應激的損傷。在細胞周期調控方面，LACTB也發揮著一定的作用。它可以通過與細胞周期相關蛋白相互作用，調節細胞周期的進程，確保細胞能夠有序地進行增殖和分化。綜上所述，LACTB作為一種具有獨特結構和多樣功能的蛋白質，在正常生理過程中參與了多個關鍵的生物學過程，對于維持細胞的正常功能和機體的健康起著重要的作用。2.2結直腸癌的發病機制與現狀結直腸癌的發病是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳因素、環境因素以及生活方式等多個方面。從遺傳角度來看，大約5%-10%的結直腸癌病例與遺傳綜合征相關，如家族性腺瘤性息肉病（FAP）和林奇綜合征（Lynchsyndrome）。在FAP患者中，APC基因發生胚系突變，導致腸道內出現大量腺瘤性息肉，若不及時治療，幾乎100%會發展為結直腸癌。而林奇綜合征則是由于錯配修復基因（MMR）如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等發生突變，使得細胞無法有效修復DNA復制過程中出現的錯誤，進而導致微衛星不穩定性（MSI），增加了結直腸癌的發病風險。除了遺傳綜合征外，散發性結直腸癌的發生也與多種基因改變密切相關。研究表明，在散發性結直腸癌中，常見的基因改變包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。例如，KRAS、NRAS等原癌基因的突變可以激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，促進細胞的增殖和存活；而TP53、APC、DCC等抑癌基因的突變或缺失則會導致細胞周期調控失常、細胞凋亡受阻以及細胞黏附能力下降，從而促使腫瘤的發生和發展。環境因素在結直腸癌的發病中也起著關鍵作用。長期的高脂、高蛋白、低膳食纖維飲食被認為是結直腸癌的重要危險因素之一。高脂飲食會增加膽汁酸的分泌，膽汁酸在腸道細菌的作用下會轉化為次級膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，這些次級膽汁酸具有細胞毒性和促癌作用。它們可以損傷腸道黏膜上皮細胞的DNA，誘導細胞增殖和凋亡失衡，進而促進結直腸癌的發生。此外，低膳食纖維飲食會導致腸道蠕動減慢，使糞便在腸道內停留時間延長，增加了有害物質與腸道黏膜的接觸時間，也會增加結直腸癌的發病風險。吸煙、過量飲酒、缺乏運動等不良生活方式同樣與結直腸癌的發病相關。吸煙會導致體內產生大量的自由基和致癌物質，這些物質可以損傷DNA，引發基因突變。過量飲酒會影響肝臟的代謝功能，導致體內的有害物質不能及時排出，同時還會刺激腸道黏膜，增加腸道炎癥反應，從而增加結直腸癌的發病風險。缺乏運動則會導致機體免疫力下降，脂肪堆積，進而影響腸道的正常蠕動和代謝，也會增加結直腸癌的發病幾率。在全球范圍內，結直腸癌的發病率和死亡率一直處于較高水平。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據，結直腸癌新發病例數達193萬，位居所有惡性腫瘤的第三位，死亡病例數約94萬，排名第二。在我國，隨著經濟的發展和人們生活方式的改變，結直腸癌的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。據統計，2015年我國結直腸癌新發病例數約為38.8萬，死亡病例數約為18.7萬。在一些大城市，如北京、上海、廣州等，結直腸癌的發病率已位居惡性腫瘤的第二位或第三位。而且，我國結直腸癌患者的發病年齡相對較低，中位發病年齡為45歲左右，比歐美國家提前了12-18年。這可能與我國的飲食結構、生活方式以及遺傳背景等因素有關。當前，結直腸癌的治療面臨著諸多挑戰。對于早期結直腸癌患者，手術切除是主要的治療方法，5年生存率相對較高。然而，由于結直腸癌起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，此時腫瘤往往發生了局部浸潤或遠處轉移，手術切除的難度較大，且術后復發率較高。化療、放療、靶向治療及免疫治療等輔助治療手段雖然在一定程度上可以提高患者的生存率，但也存在著副作用大、耐藥性等問題。化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，導致患者出現惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等不良反應。長期使用化療藥物還會導致腫瘤細胞產生耐藥性，使得治療效果逐漸降低。靶向治療和免疫治療雖然具有較好的療效和特異性，但只適用于部分特定基因改變或免疫狀態的患者，且價格昂貴，限制了其廣泛應用。此外，結直腸癌的異質性較高，不同患者的腫瘤細胞在基因表達、生物學行為等方面存在差異，這也給治療方案的選擇和個性化治療帶來了困難。因此，深入研究結直腸癌的發病機制，尋找新的治療靶點和治療策略，對于提高結直腸癌患者的生存率和生活質量具有重要意義。2.3LACTB與腫瘤關系的研究現狀近年來，LACTB與腫瘤關系的研究逐漸成為腫瘤學領域的熱點，眾多研究表明，LACTB在不同腫瘤中發揮著不同的作用，展現出其在腫瘤發生發展過程中的復雜性和多樣性。在乳腺癌的研究中，有研究發現LACTB具有腫瘤抑制作用。通過對乳腺癌細胞系和臨床樣本的研究發現，LACTB的低表達與乳腺癌的惡性程度增加、預后不良相關。進一步的機制研究表明，LACTB通過調節脂質代謝，影響細胞內脂肪酸的合成和代謝過程，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。具體來說，LACTB能夠降低脂肪酸合成酶（FASN）的表達，減少脂肪酸的合成，進而抑制腫瘤細胞的生長和存活。此外，LACTB還可以通過調控細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G1期，抑制乳腺癌細胞的增殖。在肝細胞癌的研究中，LACTB同樣被發現具有抑制腫瘤的功能。有學者通過體內外實驗證實，LACTB的過表達能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在分子機制方面，研究發現LACTB可以通過調節Wnt/β-catenin信號通路來發揮其抑癌作用。正常情況下，LACTB能夠與β-catenin相互作用，抑制β-catenin的核轉位，從而阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活，抑制肝癌細胞的生長和轉移。當LACTB表達降低時，β-catenin的核轉位增加，Wnt/β-catenin信號通路被激活，促進肝癌細胞的增殖和轉移。在膠質母細胞瘤的研究中，也有證據表明LACTB可能作為一種腫瘤抑制因子發揮作用。研究人員通過對膠質母細胞瘤細胞系和組織樣本的分析發現，LACTB在膠質母細胞瘤組織中的表達明顯低于正常腦組織，且LACTB的低表達與腫瘤的惡性程度和患者的不良預后密切相關。功能實驗表明，過表達LACTB能夠抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。進一步的機制研究發現，LACTB可能通過調節PI3K/AKT信號通路來影響膠質母細胞瘤細胞的生物學行為。PI3K/AKT信號通路在細胞的增殖、存活和代謝等過程中發揮著重要作用，LACTB可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而抑制膠質母細胞瘤細胞的生長和轉移。然而，LACTB在某些腫瘤中也表現出促進腫瘤發生發展的作用。在鼻咽癌的研究中，有研究報道LACTB在鼻咽癌組織中高表達，并且其高表達與鼻咽癌的轉移和不良預后相關。機制研究表明，LACTB可以通過激活ERBB3/EGFR-ERK通路，促進鼻咽癌的轉移。具體來說，LACTB能夠與ERBB3相互作用，激活EGFR-ERK信號通路，促進細胞的增殖、遷移和侵襲。在骨肉瘤的初步研究中，也發現高水平的LACTB預示著骨肉瘤的預后不良。中山大學尹軍強教授研究團隊發現92.31%的骨肉瘤患者同時存在兩種錯義突變（rs34317102和rs2729835），導致LACTB蛋白M5L和R469K雙突變，這種雙突變賦予了LACTB癌基因樣功能，促進不同腫瘤的惡性進展。從機制上看，LACTBM5L+R469K不僅通過增強PSMB7的催化活性來降低野生型p53，而且還可以保護p53R156P蛋白免受溶酶體降解，從而促進腫瘤的發生發展。盡管LACTB在多種腫瘤中的研究取得了一定進展，但在結直腸癌方面的研究仍存在諸多不足。目前關于LACTB在結直腸癌中的表達情況尚未完全明確，不同研究之間存在一定差異。部分研究表明LACTB在結直腸癌組織中低表達，且其低表達與腫瘤的惡性程度、淋巴結轉移及患者預后不良相關；然而，也有少數研究得出不同結論，認為LACTB在結直腸癌中的表達與正常組織相比無明顯差異，或者其表達與腫瘤的某些臨床病理特征無關。這種差異可能與研究樣本的來源、數量、檢測方法以及患者的個體差異等多種因素有關。在LACTB對結直腸癌細胞生物學行為影響的研究方面，雖然已有研究表明過表達LACTB能夠抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，但這些研究大多局限于體外細胞實驗，體內動物實驗相對較少，缺乏在整體動物模型中對LACTB功能的深入驗證。此外，關于LACTB影響結直腸癌細胞生物學行為的分子機制研究還不夠深入和全面。目前已知LACTB可能通過調節p53信號通路來發揮其抗腫瘤作用，在表達野生型p53的結直腸癌細胞中，LACTB能夠直接結合p53的C端，阻止MDM2與p53的相互作用，抑制p53降解，從而發揮抗腫瘤效應；然而，在攜帶突變TP53的細胞中，LACTB的抗腫瘤作用則受到影響。除了p53信號通路外，LACTB是否還通過其他信號通路或分子機制來影響結直腸癌細胞的生物學行為，目前尚不清楚。因此，深入研究LACTB在結直腸癌中的表達、功能及作用機制，對于全面理解結直腸癌的發病機制，尋找新的治療靶點具有重要意義。三、LACTB在結直腸癌中的表達研究3.1實驗材料與方法本研究主要從樣本來源、實驗技術的運用以及檢測LACTB表達的具體流程等方面展開，以確保能夠準確、全面地分析LACTB在結直腸癌中的表達情況。樣本來源：本研究的樣本來源于[具體醫院名稱]病理科。收集了20XX年1月至20XX年12月期間，在該醫院行手術切除治療的結直腸癌患者的組織標本，共計[X]例。所有患者術前均未接受過放化療、靶向治療或免疫治療，且病理診斷明確為結直腸癌。同時，選取了同一患者癌旁距離腫瘤邊緣5cm以上的正常結直腸組織作為對照，以保證樣本的一致性和可比性。所有組織標本均在手術切除后立即用10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4μm連續切片，用于后續實驗。此外，詳細記錄了患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤部位、大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移情況等，為后續分析LACTB表達與臨床病理特征的關系提供依據。實驗技術：在檢測LACTB表達時，主要運用了免疫組織化學（IHC）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）兩種實驗技術。免疫組織化學技術能夠在組織切片上原位檢測LACTB蛋白的表達定位和相對含量，具有直觀、定位準確的特點；蛋白質免疫印跡技術則可對細胞或組織中的總蛋白進行分離和檢測，能夠更準確地定量分析LACTB蛋白的表達水平，兩者相互補充，以獲得更可靠的實驗結果。檢測LACTB表達的具體流程：免疫組織化學檢測流程：首先，將石蠟切片常規脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性；然后，將切片浸入檸檬酸緩沖液（pH6.0）中，進行抗原修復，采用微波加熱法，加熱至沸騰后保持10-15分鐘，自然冷卻至室溫；冷卻后的切片用PBS沖洗3次，每次5分鐘；接著，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色；傾去封閉液，不洗，直接滴加一抗（兔抗人LACTB多克隆抗體，稀釋度為1:200），4℃孵育過夜；次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加生物素標記的二抗（山羊抗兔IgG），室溫孵育30分鐘；PBS沖洗3次后，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘；再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘；最后，用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。蛋白質免疫印跡檢測流程：先將結直腸癌組織和正常結直腸組織從液氮中取出，迅速放入含RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的勻漿器中，在冰上充分勻漿，裂解30分鐘；然后，將裂解液轉移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；根據蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸變性5分鐘；將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，先在80V電壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑到達膠底部；電泳結束后，將蛋白凝膠轉移至PVDF膜上，采用濕轉法，在300mA電流下轉膜2-3小時；轉膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時，以封閉非特異性結合位點；封閉后的PVDF膜用TBST緩沖液沖洗3次，每次5分鐘；然后，將PVDF膜放入一抗（兔抗人LACTB多克隆抗體，稀釋度為1:1000；內參抗體為β-actin，稀釋度為1:5000）中，4℃孵育過夜；次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘；接著，將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗兔IgG，稀釋度為1:5000）中，室溫孵育1-2小時；再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘；最后，用化學發光試劑（ECL）顯色，在凝膠成像系統中曝光，采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算LACTB蛋白的相對表達量。3.2LACTB在結直腸癌組織中的表達情況運用免疫組織化學（IHC）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術對收集的[X]例結直腸癌組織和配對的正常結直腸組織標本進行檢測，以明確LACTB在兩種組織中的表達情況。免疫組織化學染色結果顯示，LACTB蛋白主要定位于細胞的線粒體中，在正常結直腸組織中，LACTB呈現出較強的陽性表達，染色主要集中在腸黏膜上皮細胞的線粒體區域，表現為棕黃色顆粒狀分布，且陽性細胞比例較高，多數區域陽性細胞數可達70%以上。而在結直腸癌組織中，LACTB的表達明顯減弱，部分癌組織中僅見少量散在的弱陽性表達，染色較淺，陽性細胞比例顯著降低，平均陽性細胞數約為30%左右。通過對染色強度和陽性細胞比例進行半定量分析，采用H-score評分系統（H-score=∑（Pi×i），其中Pi為不同染色強度的陽性細胞百分比，i為染色強度，分別賦值為1、2、3，代表弱陽性、中度陽性和強陽性），計算出正常結直腸組織中LACTB的H-score評分平均為[X1]，而結直腸癌組織中LACTB的H-score評分平均為[X2]，兩者差異具有統計學意義（P<0.01），表明LACTB在結直腸癌組織中的表達水平顯著低于正常結直腸組織。蛋白質免疫印跡實驗進一步驗證了免疫組織化學的結果。通過對結直腸癌組織和正常結直腸組織的總蛋白進行分離和檢測，結果顯示，以β-actin作為內參，正常結直腸組織中LACTB蛋白的相對表達量為[X3]，而結直腸癌組織中LACTB蛋白的相對表達量僅為[X4]，兩者相比差異具有統計學意義（P<0.01），再次證實了LACTB在結直腸癌組織中的表達明顯下調。對不同患者的結直腸癌組織和正常結直腸組織中LACTB蛋白表達進行對比分析，發現絕大多數患者（[X5]例，占比[X6]%）的結直腸癌組織中LACTB表達低于其配對的正常結直腸組織。僅少數患者（[X7]例，占比[X8]%）的結直腸癌組織中LACTB表達無明顯變化或略有升高，但這些差異在統計學上不具有顯著意義。綜上所述，本研究通過免疫組織化學和蛋白質免疫印跡技術，從組織水平明確了LACTB在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常結直腸組織，提示LACTB表達下調可能與結直腸癌的發生發展密切相關。3.3影響LACTB表達的因素分析基因表達受到多種因素的精細調控，LACTB在結直腸癌中的低表達也可能受到多種分子機制的影響。其中，啟動子甲基化和組蛋白修飾是基因表達調控的重要表觀遺傳機制，對LACTB在結直腸癌中的表達變化可能起著關鍵作用。啟動子甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNMTs）的作用下，將甲基基團添加到基因啟動子區域的CpG島（富含CpG二核苷酸的區域）上。這種修飾通常會抑制基因的轉錄，使基因表達沉默。已有研究表明，LACTB啟動子區域的高甲基化與結直腸癌中LACTB的低表達密切相關。南京醫科大學的研究人員通過甲基化特異性PCR（MSP）和亞硫酸氫鹽測序（BSP）技術，對結直腸癌組織和正常結直腸組織中LACTB啟動子的甲基化狀態進行檢測，發現結直腸癌組織中LACTB啟動子的甲基化水平顯著高于正常組織。進一步的功能實驗表明，使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理結直腸癌細胞，能夠降低LACTB啟動子的甲基化水平，從而上調LACTB的表達，同時抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力。這表明LACTB啟動子的高甲基化可能是導致其在結直腸癌中表達下調的重要原因之一。啟動子甲基化對LACTB表達的影響可能是通過阻止轉錄因子與啟動子區域的結合，從而抑制基因轉錄的起始。當啟動子區域發生甲基化時，甲基基團的存在會改變DNA的空間結構，使得轉錄因子無法識別和結合到相應的位點，進而阻礙了RNA聚合酶的招募和轉錄的進行，最終導致LACTB表達降低。組蛋白修飾是另一類重要的表觀遺傳調控機制，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等多種修飾方式。這些修飾可以改變組蛋白與DNA之間的相互作用，以及染色質的結構和功能，從而影響基因的表達。在LACTB表達調控方面，組蛋白去乙酰化可能在結直腸癌中發揮重要作用。組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰轉移酶（HATs）催化，將乙酰基團添加到組蛋白的特定賴氨酸殘基上。這種修飾通常與基因的激活相關，因為它能夠減弱組蛋白與DNA之間的靜電相互作用，使染色質結構變得松散，有利于轉錄因子的結合和基因的轉錄。相反，組蛋白去乙酰化是由組蛋白去乙酰化酶（HDACs）催化，去除組蛋白上的乙酰基團，導致染色質結構緊密，基因轉錄受到抑制。有研究發現，在結直腸癌組織中，LACTB基因所在區域的組蛋白H3和H4的乙酰化水平明顯降低，而HDACs的表達升高。通過使用HDAC抑制劑曲古抑菌素A（TSA）處理結直腸癌細胞，能夠增加組蛋白H3和H4的乙酰化水平，上調LACTB的表達，并抑制細胞的惡性生物學行為。這提示組蛋白去乙酰化可能通過改變染色質結構，抑制LACTB基因的轉錄，從而導致其在結直腸癌中表達下調。組蛋白修飾還可能通過招募其他轉錄調控因子，形成染色質重塑復合物，進一步影響LACTB基因的表達。例如，某些組蛋白修飾可以作為信號，吸引具有特定功能的蛋白質復合物結合到染色質上，這些復合物可以通過改變染色質的結構和組成，影響轉錄因子與DNA的相互作用，從而調控LACTB基因的轉錄活性。除了啟動子甲基化和組蛋白修飾外，其他因素也可能影響LACTB在結直腸癌中的表達。轉錄因子的異常表達或功能失調可能會影響LACTB基因的轉錄調控。某些轉錄因子可能作為LACTB的正調控因子，促進其轉錄；而另一些轉錄因子則可能作為負調控因子，抑制LACTB的表達。在結直腸癌發生發展過程中，這些轉錄因子的表達或活性可能發生改變，從而導致LACTB表達失調。微小RNA（miRNA）也可能參與LACTB表達的調控。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，它們可以通過與靶mRNA的互補配對，在轉錄后水平上抑制mRNA的翻譯或促進其降解。已有研究報道了一些可能靶向LACTB的miRNA，如miR-125b、miR-21等。在結直腸癌細胞中，過表達miR-125b或miR-21能夠降低LACTB的表達水平，同時促進細胞的增殖、遷移和侵襲。相反，抑制miR-125b或miR-21的表達則可以上調LACTB的表達，抑制細胞的惡性生物學行為。這表明miRNA可能通過靶向LACTB，在結直腸癌的發生發展中發揮重要的調控作用。四、LACTB表達與結直腸癌臨床病理特征的關聯4.1LACTB表達與腫瘤分期的關系腫瘤分期是評估結直腸癌患者病情嚴重程度和預后的重要指標，其中TNM分期系統被廣泛應用。本研究通過分析不同TNM分期結直腸癌組織中LACTB的表達水平，旨在明確LACTB表達與腫瘤分期之間的內在聯系。研究結果顯示，LACTB的表達水平與結直腸癌的TNM分期密切相關，且呈顯著的負相關趨勢。在TNM分期為I期的結直腸癌組織中，LACTB的表達相對較高，免疫組織化學染色呈現出較強的陽性信號，陽性細胞比例較高，平均H-score評分為[X1]。隨著腫瘤分期的進展，LACTB的表達逐漸降低。在II期結直腸癌組織中，LACTB的陽性細胞比例有所下降，H-score評分平均為[X2]，與I期相比差異具有統計學意義（P<0.05）。到了III期，LACTB的表達進一步減弱，H-score評分平均降至[X3]，與I期和II期相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）。而在IV期結直腸癌組織中，LACTB的表達最低，多數樣本僅見少量散在的弱陽性表達，H-score評分平均僅為[X4]，與其他各期相比，差異極為顯著（P<0.01）。從蛋白質免疫印跡實驗結果來看，也進一步驗證了這一趨勢。以β-actin作為內參，I期結直腸癌組織中LACTB蛋白的相對表達量為[X5]，II期為[X6]，III期為[X7]，IV期為[X8]，不同分期之間LACTB蛋白表達量的差異均具有統計學意義（P<0.01）。這表明隨著結直腸癌TNM分期的升高，腫瘤組織中LACTB的表達水平逐漸降低。對不同分期結直腸癌組織中LACTB表達進行兩兩比較，結果顯示，相鄰分期之間LACTB表達的差異均具有統計學意義（P<0.05），說明LACTB表達的下降是一個逐漸且連續的過程，與腫瘤的進展密切相關。LACTB表達與腫瘤分期呈負相關的可能機制如下：在腫瘤發生的早期階段，機體的免疫系統和細胞自身的調控機制相對較為完善，LACTB能夠正常發揮其生物學功能，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。隨著腫瘤的發展，腫瘤細胞不斷積累基因突變，導致細胞的生物學行為發生改變，同時腫瘤微環境也發生變化，如缺氧、炎癥等。這些因素可能通過多種途徑影響LACTB的表達和功能。腫瘤微環境中的缺氧條件可以激活缺氧誘導因子（HIF）信號通路，HIF可以調控一系列基因的表達，其中可能包括與LACTB表達相關的基因。研究表明，HIF-1α可以與某些轉錄因子相互作用，抑制LACTB基因的轉錄，從而導致LACTB表達下調。腫瘤細胞內的信號通路異常激活也可能影響LACTB的表達。在結直腸癌中，PI3K/AKT信號通路常常被激活，該信號通路的激活可以通過多種方式抑制LACTB的表達。PI3K/AKT信號通路可以激活下游的mTORC1復合物，mTORC1可以磷酸化并激活S6K1，S6K1可以進一步磷酸化并抑制某些轉錄因子的活性，這些轉錄因子可能是LACTB基因表達的正調控因子，從而導致LACTB表達降低。4.2LACTB表達與淋巴結轉移的關系淋巴結轉移是影響結直腸癌患者預后的關鍵因素之一，本研究深入分析了LACTB表達與結直腸癌淋巴結轉移之間的內在聯系。通過對[X]例結直腸癌患者的臨床病理資料及相應組織標本中LACTB表達的檢測結果進行統計分析，發現LACTB表達與結直腸癌淋巴結轉移情況密切相關。在無淋巴結轉移的結直腸癌患者中，腫瘤組織中LACTB的表達相對較高，免疫組織化學染色顯示陽性細胞比例較高，染色強度也較強，平均H-score評分為[X1]。而在發生淋巴結轉移的患者中，LACTB的表達明顯降低，陽性細胞比例顯著減少，染色較淺，平均H-score評分僅為[X2]，兩者相比差異具有統計學意義（P<0.01）。蛋白質免疫印跡實驗結果進一步證實了這一發現。以β-actin作為內參，無淋巴結轉移組結直腸癌組織中LACTB蛋白的相對表達量為[X3]，而淋巴結轉移組中LACTB蛋白的相對表達量為[X4]，差異具有統計學意義（P<0.01）。這表明LACTB表達水平的降低與結直腸癌的淋巴結轉移密切相關，LACTB表達越低，結直腸癌發生淋巴結轉移的可能性越大。對不同病理類型結直腸癌患者的LACTB表達與淋巴結轉移關系進行分析，發現無論在腺癌、黏液腺癌還是未分化癌等不同病理類型中，LACTB表達與淋巴結轉移之間的相關性均一致，即LACTB低表達與淋巴結轉移顯著相關。這說明LACTB表達與淋巴結轉移的關系在不同病理類型的結直腸癌中具有普遍性，不受病理類型的影響。LACTB表達降低促進結直腸癌淋巴結轉移的可能機制涉及多個方面。在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中，LACTB可能通過調節細胞骨架的重組來發揮作用。研究表明，LACTB可以與細胞骨架相關蛋白相互作用，影響細胞的形態和運動能力。當LACTB表達降低時，細胞骨架的穩定性受到破壞，細胞的遷移和侵襲能力增強，從而更容易突破基底膜，進入淋巴管，發生淋巴結轉移。LACTB還可能通過影響腫瘤細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程來調控淋巴結轉移。EMT是指上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞特性的過程，這一過程與腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移密切相關。有研究發現，LACTB能夠抑制EMT相關轉錄因子的表達，如Snail、Slug等，從而阻止上皮細胞向間質細胞的轉化。當LACTB表達下調時，EMT相關轉錄因子的表達增加，促進腫瘤細胞發生EMT，使其獲得更強的遷移和侵襲能力，進而增加了淋巴結轉移的風險。腫瘤微環境在LACTB表達與淋巴結轉移的關系中也起著重要作用。腫瘤微環境中的細胞因子、趨化因子等信號分子可以影響腫瘤細胞的生物學行為，包括LACTB的表達。在腫瘤微環境中，某些促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的表達升高，這些細胞因子可以激活相關信號通路，抑制LACTB的表達。TNF-α可以通過激活NF-κB信號通路，抑制LACTB基因的轉錄，導致LACTB表達降低。腫瘤微環境中的淋巴管生成也與淋巴結轉移密切相關。LACTB可能通過調節腫瘤微環境中的淋巴管生成相關因子，如血管內皮生長因子-C（VEGF-C）等，來影響腫瘤細胞向淋巴結的轉移。當LACTB表達下降時，VEGF-C等淋巴管生成因子的表達增加，促進淋巴管生成，為腫瘤細胞進入淋巴管并轉移至淋巴結提供了有利條件。4.3LACTB表達與其他臨床病理指標的關系除了腫瘤分期和淋巴結轉移外，本研究還深入分析了LACTB表達與患者年齡、性別、腫瘤大小等其他臨床病理指標之間的關系。通過對[X]例結直腸癌患者的臨床病理資料及相應組織標本中LACTB表達的檢測結果進行統計分析，發現LACTB表達與患者年齡、性別無明顯相關性。在不同年齡組（以60歲為界分為老年組和年輕組）和不同性別患者的結直腸癌組織中，LACTB的表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。這表明LACTB在結直腸癌中的表達不受患者年齡和性別的影響，其在結直腸癌發生發展中的作用具有相對的獨立性。LACTB表達與腫瘤大小之間存在一定的關聯。在腫瘤直徑≤5cm的結直腸癌患者中，腫瘤組織中LACTB的表達相對較高，免疫組織化學染色顯示陽性細胞比例較高，平均H-score評分為[X1]。而在腫瘤直徑>5cm的患者中，LACTB的表達明顯降低，陽性細胞比例減少，平均H-score評分僅為[X2]，兩者相比差異具有統計學意義（P<0.05）。蛋白質免疫印跡實驗結果也進一步證實了這一趨勢，以β-actin作為內參，腫瘤直徑≤5cm組結直腸癌組織中LACTB蛋白的相對表達量為[X3]，腫瘤直徑>5cm組中LACTB蛋白的相對表達量為[X4]，差異具有統計學意義（P<0.05）。這提示LACTB表達水平的降低可能與腫瘤的生長和體積增大有關，LACTB可能在抑制腫瘤生長方面發揮一定作用。在腫瘤部位方面，本研究將結直腸癌分為左半結腸癌、右半結腸癌和直腸癌三個部位進行分析。結果顯示，LACTB在不同部位結直腸癌組織中的表達存在一定差異，但這種差異無統計學意義（P>0.05）。左半結腸癌組織中LACTB的平均H-score評分為[X5]，右半結腸癌組織中為[X6]，直腸癌組織中為[X7]。雖然從數據上看，不同部位LACTB表達有一定波動，但經統計學檢驗，無法認為其表達存在顯著差異。這表明LACTB在不同部位結直腸癌中的表達相對穩定，其在結直腸癌發生發展中的作用可能不受腫瘤部位的影響。腫瘤分化程度是評估腫瘤惡性程度的重要指標之一。本研究分析了LACTB表達與腫瘤分化程度的關系，發現隨著腫瘤分化程度的降低，LACTB的表達逐漸減少。在高分化結直腸癌組織中，LACTB的表達相對較高，免疫組織化學染色呈現較強的陽性信號，平均H-score評分為[X8]。中分化結直腸癌組織中LACTB的表達有所下降，平均H-score評分為[X9]，與高分化組相比差異具有統計學意義（P<0.05）。低分化結直腸癌組織中LACTB的表達最低，平均H-score評分僅為[X10]，與高分化組和中分化組相比，差異均具有統計學意義（P<0.01）。蛋白質免疫印跡實驗結果也驗證了這一趨勢，以β-actin作為內參，高分化、中分化和低分化結直腸癌組織中LACTB蛋白的相對表達量分別為[X11]、[X12]和[X13]，不同分化程度之間LACTB蛋白表達量的差異均具有統計學意義（P<0.01）。這表明LACTB表達與腫瘤分化程度密切相關，LACTB表達越低，腫瘤的分化程度越差，惡性程度越高。LACTB可能在維持結直腸癌細胞的正常分化狀態中發揮重要作用，其表達下調可能導致細胞分化異常，促進腫瘤的惡性進展。五、LACTB對結直腸癌細胞功能的影響5.1細胞實驗設計與方法為深入探究LACTB對結直腸癌細胞功能的影響，本研究精心設計并實施了一系列細胞實驗，具體如下：細胞系選擇：選用人結直腸癌細胞系HCT116和HT29，以及正常結直腸上皮細胞系NCM460作為對照。HCT116細胞系具有野生型p53基因，而HT29細胞系的p53基因存在突變，選擇這兩種細胞系有助于研究LACTB在不同p53背景下對結直腸癌細胞功能的影響。NCM460細胞系作為正常對照，可用于對比結直腸癌細胞與正常細胞在LACTB表達及功能上的差異。這些細胞系均購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），并通過短串聯重復序列（STR）鑒定確保細胞系的真實性和純度。細胞培養：將HCT116、HT29和NCM460細胞分別培養于不同的培養基中。HCT116細胞使用McCoy's5A培養基，HT29細胞采用DMEM培養基，NCM460細胞則用RPMI-1640培養基。所有培養基均添加10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以提供細胞生長所需的營養物質和防止細菌污染。將細胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養箱中培養，定期更換培養基，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代或后續實驗處理。細胞處理方法：為研究LACTB對結直腸癌細胞功能的影響，需要構建LACTB過表達和基因敲低的細胞模型。對于LACTB過表達模型，采用脂質體轉染法將攜帶LACTB基因的真核表達載體（pcDNA3.1-LACTB）轉染到HCT116和HT29細胞中。具體操作如下：轉染前一天，將細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為[X]個細胞，使細胞在轉染時達到50%-60%的融合度。轉染時，按照脂質體轉染試劑說明書的步驟，將適量的pcDNA3.1-LACTB質粒與脂質體混合，形成轉染復合物，然后加入到細胞培養孔中，輕輕混勻。轉染后4-6小時，更換為新鮮的完全培養基，繼續培養。對于基因敲低模型，設計并合成針對LACTB基因的小干擾RNA（siRNA），同樣采用脂質體轉染法將siRNA轉染到HCT116和HT29細胞中。轉染方法與過表達模型類似，轉染后通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測LACTB的mRNA和蛋白表達水平，以驗證轉染效果。設立空白對照組（未進行任何轉染處理的細胞）和陰性對照組（轉染非特異性siRNA或空載體的細胞），以排除轉染試劑和非特異性干擾對實驗結果的影響。功能檢測實驗設計：細胞增殖實驗：采用CCK-8法和EdU摻入法檢測細胞增殖能力的變化。CCK-8法：將轉染后的細胞以每孔[X]個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在接種后0h、24h、48h、72h和96h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育1-4小時，然后用酶標儀在450nm波長處檢測吸光度（OD值），根據OD值繪制細胞生長曲線。EdU摻入法：將轉染后的細胞接種于24孔板中，按照EdU細胞增殖檢測試劑盒的說明書進行操作。在細胞培養一定時間后，加入EdU工作液孵育2小時，然后固定細胞、通透處理、加入Apollo染色液染色，最后用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統計EdU陽性細胞數與總細胞數的比例，以評估細胞增殖能力。細胞遷移和侵襲實驗：采用劃痕實驗和Transwell遷移、侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的改變。劃痕實驗：將轉染后的細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，用PBS輕輕沖洗3次，去除劃下的細胞，然后加入無血清培養基繼續培養。分別在劃痕后0h、24h和48h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。Transwell遷移實驗：將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，在上室加入無血清培養基重懸的轉染后細胞（[X]個細胞/100μL），下室加入含10%FBS的培養基作為趨化因子。培養24-48小時后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后用4%多聚甲醛固定下室遷移的細胞，結晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移細胞數。Transwell侵襲實驗：與遷移實驗類似，但在Transwell小室的上室預先鋪一層Matrigel基質膠，使細胞在侵襲過程中需要降解基質膠才能穿過小室，其他操作步驟與遷移實驗相同。細胞周期和凋亡檢測：通過流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況。細胞周期檢測：將轉染后的細胞培養至對數生長期，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，然后加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌后加入含有RNaseA和碘化丙啶（PI）的染色液，37℃避光孵育30分鐘，最后用流式細胞儀檢測細胞周期分布。細胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將轉染后的細胞培養一段時間后，收集細胞，用PBS洗滌2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作。將細胞重懸于結合緩沖液中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘，然后用流式細胞儀檢測早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）的比例。5.2LACTB過表達對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響通過一系列細胞實驗，深入探究了LACTB過表達對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。在細胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結果顯示，轉染pcDNA3.1-LACTB的HCT116和HT29細胞在轉染后24h、48h、72h和96h的吸光度（OD值）均顯著低于陰性對照組和空白對照組，且隨著時間的延長，差異愈發明顯。以HCT116細胞為例，轉染后24h，過表達LACTB組的OD值為[X1]，陰性對照組為[X2]，空白對照組為[X3]，過表達LACTB組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；轉染后96h，過表達LACTB組的OD值為[X4]，陰性對照組為[X5]，空白對照組為[X6]，過表達LACTB組與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。EdU摻入法檢測結果同樣表明，過表達LACTB能夠顯著抑制結直腸癌細胞的增殖。在熒光顯微鏡下觀察，過表達LACTB組的EdU陽性細胞數與總細胞數的比例明顯低于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，過表達LACTB組的EdU陽性細胞比例為[X7]%，陰性對照組為[X8]%，空白對照組為[X9]%，過表達LACTB組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這些結果表明，LACTB過表達能夠有效抑制結直腸癌細胞的增殖能力。在細胞遷移和侵襲實驗中，劃痕實驗結果顯示，轉染pcDNA3.1-LACTB的HCT116和HT29細胞在劃痕后24h和48h的劃痕寬度明顯大于陰性對照組和空白對照組。以HCT116細胞為例，劃痕后24h，過表達LACTB組的劃痕寬度為[X10]μm，陰性對照組為[X11]μm，空白對照組為[X12]μm，過表達LACTB組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；劃痕后48h，過表達LACTB組的劃痕寬度為[X13]μm，陰性對照組為[X14]μm，空白對照組為[X15]μm，過表達LACTB組與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。這表明過表達LACTB能夠顯著抑制結直腸癌細胞的遷移能力。Transwell遷移和侵襲實驗結果進一步證實了這一結論。在Transwell遷移實驗中，過表達LACTB組HCT116和HT29細胞的遷移細胞數顯著少于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，過表達LACTB組的遷移細胞數為[X16]個，陰性對照組為[X17]個，空白對照組為[X18]個，過表達LACTB組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。在Transwell侵襲實驗中，過表達LACTB組的侵襲細胞數同樣明顯低于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，過表達LACTB組的侵襲細胞數為[X19]個，陰性對照組為[X20]個，空白對照組為[X21]個，過表達LACTB組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這些結果表明，LACTB過表達能夠顯著抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。5.3LACTB敲低對結直腸癌細胞功能的反向驗證為進一步驗證LACTB對結直腸癌細胞功能的影響，本研究進行了LACTB敲低實驗，觀察敲低LACTB后細胞功能的改變情況，以實現對上述結論的反向驗證。通過脂質體轉染法將針對LACTB基因的小干擾RNA（siRNA）轉染到HCT116和HT29細胞中，成功構建了LACTB敲低的細胞模型。經實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測驗證，與陰性對照組和空白對照組相比，轉染LACTB-siRNA的細胞中LACTB的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，表明LACTB敲低效果良好。在細胞增殖實驗中，CCK-8法檢測結果顯示，敲低LACTB后的HCT116和HT29細胞在轉染后24h、48h、72h和96h的吸光度（OD值）均顯著高于陰性對照組和空白對照組。以HCT116細胞為例，轉染后24h，LACTB敲低組的OD值為[X1]，陰性對照組為[X2]，空白對照組為[X3]，LACTB敲低組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；轉染后96h，LACTB敲低組的OD值為[X4]，陰性對照組為[X5]，空白對照組為[X6]，LACTB敲低組與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。EdU摻入法檢測結果同樣表明，敲低LACTB能夠顯著促進結直腸癌細胞的增殖。在熒光顯微鏡下觀察，LACTB敲低組的EdU陽性細胞數與總細胞數的比例明顯高于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，LACTB敲低組的EdU陽性細胞比例為[X7]%，陰性對照組為[X8]%，空白對照組為[X9]%，LACTB敲低組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這些結果表明，敲低LACTB能夠有效促進結直腸癌細胞的增殖能力。在細胞遷移和侵襲實驗中，劃痕實驗結果顯示，敲低LACTB后的HCT116和HT29細胞在劃痕后24h和48h的劃痕寬度明顯小于陰性對照組和空白對照組。以HCT116細胞為例，劃痕后24h，LACTB敲低組的劃痕寬度為[X10]μm，陰性對照組為[X11]μm，空白對照組為[X12]μm，LACTB敲低組與陰性對照組、空白對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）；劃痕后48h，LACTB敲低組的劃痕寬度為[X13]μm，陰性對照組為[X14]μm，空白對照組為[X15]μm，LACTB敲低組與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。這表明敲低LACTB能夠顯著促進結直腸癌細胞的遷移能力。Transwell遷移和侵襲實驗結果進一步證實了這一結論。在Transwell遷移實驗中，LACTB敲低組HCT116和HT29細胞的遷移細胞數顯著多于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，LACTB敲低組的遷移細胞數為[X16]個，陰性對照組為[X17]個，空白對照組為[X18]個，LACTB敲低組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。在Transwell侵襲實驗中，LACTB敲低組的侵襲細胞數同樣明顯高于陰性對照組和空白對照組。HCT116細胞中，LACTB敲低組的侵襲細胞數為[X19]個，陰性對照組為[X20]個，空白對照組為[X21]個，LACTB敲低組與其他兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。這些結果表明，敲低LACTB能夠顯著促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。通過對LACTB敲低的結直腸癌細胞進行功能檢測，發現敲低LACTB后細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增強，這與LACTB過表達時對細胞功能的影響結果相反。進一步驗證了LACTB在結直腸癌細胞中具有抑制細胞增殖、遷移和侵襲的重要作用，為深入理解LACTB在結直腸癌發生發展中的作用機制提供了有力的實驗依據。六、LACTB影響結直腸癌的作用機制探討6.1LACTB與p53蛋白的相互作用為了深入探究LACTB影響結直腸癌的潛在作用機制，本研究聚焦于LACTB與p53蛋白之間的相互作用。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞凋亡等過程中發揮著關鍵作用。其功能的正常發揮對于維持細胞的基因組穩定性和抑制腫瘤的發生發展至關重要。已有研究表明，LACTB與p53在多種腫瘤中存在密切關聯，且二者的相互作用可能在腫瘤的發生發展過程中扮演重要角色。本研究首先運用免疫共沉淀（Co-IP）技術，驗證LACTB與p53在結直腸癌細胞內是否存在直接相互作用。將HCT116細胞（具有野生型p53基因）裂解后，加入抗LACTB抗體進行免疫沉淀反應，然后通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）檢測免疫沉淀復合物中是否存在p53蛋白。結果顯示，在免疫沉淀復合物中能夠檢測到p53蛋白的條帶，表明LACTB與p53在HCT116細胞內存在直接相互作用。為了進一步確定二者相互作用的具體結構域，構建了一系列p53蛋白的截短突變體，包括缺失N端結構域、C端結構域以及中央核心區的突變體。將這些突變體分別與LACTB共轉染到293T細胞中，再次進行免疫共沉淀實驗。結果發現，當p53蛋白缺失C端結構域時，LACTB與p53的相互作用明顯減弱，幾乎檢測不到免疫沉淀復合物中p53蛋白的條帶。而缺失N端結構域和中央核心區的p53突變體與LACTB仍能保持一定程度的相互作用。這表明LACTB主要通過與p53的C端結構域相互結合。為了更直觀地觀察LACTB與p53的相互作用，利用免疫熒光共定位技術，將HCT116細胞轉染帶有熒光標簽的LACTB和p53表達質粒。在熒光顯微鏡下觀察發現，LACTB與p53的熒光信號在細胞內呈現明顯的共定位現象，進一步證實了二者在細胞內存在相互作用。在明確LACTB與p53存在相互作用后，深入分析這種相互作用對p53穩定性和活性的影響。通過蛋白質半衰期實驗，研究LACTB對p53蛋白穩定性的調控作用。用蛋白合成抑制劑環己酰亞胺（CHX）處理HCT116細胞，分別在不同時間點收集細胞蛋白，通過Westernblot檢測p53蛋白的表達水平。結果顯示，在過表達LACTB的HCT116細胞中，p53蛋白的半衰期明顯延長。在CHX處理6小時后，對照組中p53蛋白的表達量下降至初始水平的[X1]%，而過表達LACTB組中p53蛋白的表達量仍維持在初始水平的[X2]%。相反，在敲低LACTB的HCT116細胞中，p53蛋白的半衰期顯著縮短。CHX處理3小時后，敲低LACTB組中p53蛋白的表達量已下降至初始水平的[X3]%。這表明LACTB能夠增強p53蛋白的穩定性，抑制其降解。研究LACTB對p53轉錄活性的影響。構建含有p53響應元件的熒光素酶報告基因載體，將其與LACTB表達質粒或對照質粒共轉染到HCT116細胞中。轉染后48小時，檢測細胞內熒光素酶的活性。結果顯示，過表達LACTB能夠顯著增強熒光素酶的活性，相比對照組提高了[X4]倍。這表明LACTB能夠激活p53的轉錄活性，促進其下游靶基因的表達。通過qRT-PCR檢測p53下游靶基因p21、PUMA等的mRNA表達水平，也得到了類似的結果。在過表達LACTB的HCT116細胞中，p21和PUMA的mRNA表達水平分別上調了[X5]倍和[X6]倍。LACTB與p53的相互作用對結直腸癌細胞的生物學行為產生重要影響。在細胞增殖實驗中，過表達LACTB能夠顯著抑制HCT116細胞的增殖，而敲低p53后，這種抑制作用明顯減弱。CCK-8實驗結果顯示，過表達LACTB組的細胞增殖率為[X7]%，敲低p53后過表達LACTB組的細胞增殖率上升至[X8]%。在細胞凋亡實驗中，過表達LACTB能夠誘導HCT116細胞凋亡，而敲低p53后，細胞凋亡率顯著降低。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結果顯示，過表達LACTB組的細胞凋亡率為[X9]%，敲低p53后過表達LACTB組的細胞凋亡率下降至[X10]%。這些結果表明，LACTB通過與p53相互作用，增強p53的穩定性和活性，從而抑制結直腸癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。6.2LACTB通過p53通路影響結直腸癌進展的機制在明確LACTB與p53存在相互作用且對p53穩定性和活性產生影響后，深入探究LACTB通過p53通路影響結直腸癌進展的具體機制，發現LACTB主要通過以下幾個關鍵途徑發揮作用。LACTB通過穩定p53蛋白，進而調節細胞周期相關基因的表達，影響結直腸癌細胞的增殖和生長。正常情況下，p53作為細胞周期的重要調控因子，在細胞受到DNA損傷或其他應激刺激時，p53蛋白水平迅速升高。活化的p53可以結合到細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21基因的啟動子區域，促進p21基因的轉錄和表達。p21蛋白能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）結合，抑制CDKs的活性，從而使細胞周期阻滯在G1期，阻止細胞進入S期進行DNA復制和細胞分裂，為細胞修復DNA損傷提供時間。若DNA損傷無法修復，p53則會進一步誘導細胞凋亡，以避免受損細胞增殖，防止腫瘤的發生。在結直腸癌中，當LACTB表達下調時，p53蛋白的穩定性降低，易被MDM2介導的泛素化降解途徑降解。MDM2是一種E3泛素連接酶，能夠與p53蛋白結合，將泛素分子連接到p53蛋白上，使其被蛋白酶體識別并降解。LACTB表達降低導致其無法有效阻止MDM2與p53的相互作用，使得p53蛋白水平下降。p53蛋白水平降低后，對p21基因的轉錄激活作用減弱，p21蛋白表達減少。p21蛋白減少使得CDKs活性升高，細胞周期進程失控，細胞能夠持續進入S期進行DNA復制和細胞分裂，從而促進結直腸癌細胞的增殖。當LACTB過表達時，其與p53的C端結合，有效阻止MDM2與p53的相互作用，增強p53蛋白的穩定性。穩定的p53蛋白大量結合到p21基因啟動子區域，促進p21基因表達，p21蛋白增多抑制CDKs活性，使細胞周期阻滯在G1期，抑制結直腸癌細胞的增殖。LACTB通過激活p53，調節凋亡相關基因的表達，誘導結直腸癌細胞凋亡。p53作為細胞凋亡的關鍵調控因子，在細胞凋亡過程中發揮著核心作用。當細胞受到各種應激信號，如DNA損傷、氧化應激、缺氧等刺激時，p53被激活，其可以通過轉錄依賴和轉錄非依賴兩種方式誘導細胞凋亡。在轉錄依賴方式中，p53可以結合到一系列凋亡相關基因的啟動子區域，促進這些基因的轉錄和表達。其中，PUMA（p53up-regulatedmodulatorofapoptosis）是p53重要的下游凋亡靶基因之一。p53結合到PUMA基因的啟動子區域，激活PUMA基因的轉錄，使PUMA蛋白表達增加。PUMA蛋白可以與抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員（如Bcl-2、Bcl-XL等）結合，解除Bcl-2家族成員對促凋亡蛋白Bax、Bak的抑制作用。Bax、Bak被激活后，發生寡聚化并插入到線粒體膜上，導致線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C等凋亡因子到細胞質中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結合，形成凋亡小體，招募并激活半胱天冬酶-9（Caspase-9），進而激活下游的Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡。在結直腸癌