iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗：制備工藝與免疫活性的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義疫苗作為預(yù)防和控制傳染性疾病最為有效的手段之一，在全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。從早期的牛痘疫苗成功預(yù)防天花，到如今各類疫苗廣泛應(yīng)用于預(yù)防多種疾病，疫苗的發(fā)展歷程見證了人類醫(yī)學(xué)的重大進(jìn)步。傳統(tǒng)疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗等，它們在疾病預(yù)防方面取得了顯著成效，但也存在一定的局限性。滅活疫苗可能因滅活不完全而存在安全隱患，減毒活疫苗有回復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)，亞單位疫苗則可能免疫原性不足，需要佐劑來增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而傳統(tǒng)佐劑與抗原的物理混合易擴(kuò)散，可能導(dǎo)致毒副作用。隨著科技的飛速發(fā)展，化學(xué)合成疫苗應(yīng)運(yùn)而生，為疫苗領(lǐng)域帶來了新的變革?；瘜W(xué)合成疫苗是通過化學(xué)方法合成抗原及相關(guān)成分，具有成分明確、質(zhì)量可控、安全性高、易于大規(guī)模生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢。2003年，古巴哈瓦那大學(xué)的科研人員推出了一種用于防治Ｂ型嗜血性流感桿菌的疫苗，作為世界上首例低成本的人工合成疫苗，它的面世立即引起了廣泛關(guān)注。由于是從百分之百的化學(xué)合成抗原中提取，該疫苗中不含細(xì)菌成分，更適合嬰幼兒使用，且獲取過程更為迅速，成本更低。然而，化學(xué)合成疫苗也并非完美無缺，部分化學(xué)合成疫苗存在免疫原性較弱的問題，難以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)度和持久的免疫應(yīng)答，從而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。在尋找提升化學(xué)合成疫苗免疫效果的過程中，iNKT細(xì)胞激動劑逐漸成為研究熱點(diǎn)。iNKT細(xì)胞是一種特殊的T淋巴細(xì)胞亞群，具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠迅速響應(yīng)抗原刺激，分泌大量的細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-4等，從而激活多種免疫細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等，啟動強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。iNKT細(xì)胞激動劑能夠特異性地激活iNKT細(xì)胞，使其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。將iNKT細(xì)胞激動劑引入化學(xué)合成疫苗中，有望打破傳統(tǒng)化學(xué)合成疫苗免疫原性不足的瓶頸，通過激活iNKT細(xì)胞，引發(fā)一系列級聯(lián)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗的免疫活性，提高機(jī)體對病原體或毒素的免疫防御能力。海南大學(xué)藥學(xué)院宗成利教授團(tuán)隊(duì)首次合成并評價(jià)了一種新型雙佐劑新冠疫苗，該疫苗通過共價(jià)結(jié)合iNKT細(xì)胞激動劑和TLR7/8激動劑，展示了其獨(dú)特的雙佐劑激活免疫機(jī)制。研究表明，這種自佐劑疫苗能夠被同一抗原呈遞細(xì)胞識別，顯著增強(qiáng)免疫活性，并降低佐劑的副作用。因此，基于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備和免疫活性評估具有重要的研究意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。深入研究這一領(lǐng)域，不僅能夠揭示iNKT細(xì)胞激動劑增強(qiáng)化學(xué)合成疫苗免疫活性的分子機(jī)制，為疫苗設(shè)計(jì)提供全新的理論依據(jù)，還能開發(fā)出更高效、更安全的新型疫苗，滿足臨床預(yù)防和治療各種疾病的迫切需求，對保障人類健康、推動疫苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)影響。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗制備方面，國外起步相對較早。日本學(xué)者早在20世紀(jì)90年代就從海綿中分離出α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer），這是第一種被發(fā)現(xiàn)的能有效激活iNKT細(xì)胞的脂質(zhì)，為后續(xù)iNKT細(xì)胞激動劑的研究奠定了基石。隨后，眾多科研團(tuán)隊(duì)圍繞α-GalCer展開了大量的化學(xué)修飾和改造工作，旨在開發(fā)出活性更高、穩(wěn)定性更好的iNKT細(xì)胞激動劑。美國的一些研究小組通過對α-GalCer的結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列類似物，并將其應(yīng)用于化學(xué)合成疫苗的制備中。他們利用脂質(zhì)體、納米顆粒等載體系統(tǒng)，將iNKT細(xì)胞激動劑與抗原有效結(jié)合，構(gòu)建出多種新型的化學(xué)合成疫苗，在動物模型中取得了較好的免疫效果。在國內(nèi)，隨著對iNKT細(xì)胞研究的逐漸深入，iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備也成為研究熱點(diǎn)。清華大學(xué)、上海交通大學(xué)等高校的科研團(tuán)隊(duì)在這一領(lǐng)域取得了一系列重要成果。他們通過自主設(shè)計(jì)和合成新型的iNKT細(xì)胞激動劑，結(jié)合先進(jìn)的化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)，成功制備出多種基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗。例如，通過將iNKT細(xì)胞激動劑與腫瘤相關(guān)抗原共價(jià)連接，構(gòu)建出具有靶向性的腫瘤疫苗，在小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。在免疫活性評估方面，國外建立了較為完善的評估體系。利用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、細(xì)胞因子芯片等多種技術(shù)手段，從細(xì)胞水平和分子水平全面評估疫苗對iNKT細(xì)胞的激活能力、細(xì)胞因子的分泌情況以及對其他免疫細(xì)胞的影響等。同時(shí)，通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，觀察疫苗對病原體感染或腫瘤生長的抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證疫苗的免疫活性和保護(hù)效果。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的研究人員通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對不同類型的iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗進(jìn)行了全面的免疫活性評估，為疫苗的優(yōu)化和改進(jìn)提供了重要依據(jù)。國內(nèi)在免疫活性評估方面也緊跟國際步伐，不斷完善評估方法和技術(shù)。中國科學(xué)院的相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合多種免疫學(xué)檢測技術(shù)，對自主研發(fā)的iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗進(jìn)行了深入的免疫活性評估。他們不僅關(guān)注疫苗對iNKT細(xì)胞的直接激活作用，還研究了疫苗引發(fā)的免疫記憶效應(yīng)以及對免疫系統(tǒng)整體平衡的影響。此外，國內(nèi)還注重將臨床前研究成果與臨床應(yīng)用相結(jié)合，積極開展臨床試驗(yàn)，為疫苗的臨床轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。盡管國內(nèi)外在iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備和免疫活性評估方面取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在制備方面，如何提高iNKT細(xì)胞激動劑與抗原的結(jié)合效率、優(yōu)化疫苗的載體系統(tǒng)以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和靶向性，仍是亟待解決的問題。在免疫活性評估方面，目前的評估方法還存在一定的局限性，難以全面準(zhǔn)確地反映疫苗在體內(nèi)復(fù)雜的免疫反應(yīng)過程，需要進(jìn)一步開發(fā)更加靈敏、特異的評估指標(biāo)和技術(shù)方法。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗制備采用化學(xué)合成方法，設(shè)計(jì)并合成新型iNKT細(xì)胞激動劑。根據(jù)已有的iNKT細(xì)胞激動劑結(jié)構(gòu)，如α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer），通過對其糖基、脂肪酸鏈等部位進(jìn)行修飾，引入特定的官能團(tuán)，改變其空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，以提高其與iNKT細(xì)胞表面受體的親和力和激活效率。利用液相合成技術(shù)，精確控制反應(yīng)條件，如溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等，確保合成產(chǎn)物的純度和活性。通過核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等分析手段對合成的iNKT細(xì)胞激動劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。將合成的iNKT細(xì)胞激動劑與選定的抗原進(jìn)行偶聯(lián)。針對不同的抗原，選擇合適的偶聯(lián)方法，如碳二亞胺法、琥珀酰亞胺酯法等。以尼古丁疫苗為例，先將尼古丁小分子與載體蛋白（如鑰孔血藍(lán)蛋白KLH）通過戊二醛交聯(lián)法進(jìn)行結(jié)合，再利用碳二亞胺法將iNKT細(xì)胞激動劑與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物進(jìn)行偶聯(lián)，形成基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗。對于黃曲霉毒素疫苗，采用琥珀酰亞胺酯法將iNKT細(xì)胞激動劑與黃曲霉毒素抗原進(jìn)行偶聯(lián)。在偶聯(lián)過程中，通過高效液相色譜（HPLC）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，確保偶聯(lián)反應(yīng)的充分進(jìn)行，并通過凝膠電泳等方法分析偶聯(lián)產(chǎn)物的純度和結(jié)構(gòu)。為了提高疫苗的穩(wěn)定性、靶向性和免疫效果，選擇合適的載體系統(tǒng)對疫苗進(jìn)行包裹。利用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，將基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗包裹其中。精確控制脂質(zhì)體的制備條件，如磷脂與膽固醇的比例、水化溫度、超聲時(shí)間等，以獲得粒徑均一、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體疫苗。通過動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測定脂質(zhì)體的粒徑和電位，通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確保脂質(zhì)體的質(zhì)量符合要求。此外，還可以嘗試?yán)眉{米顆粒、聚合物膠束等其他載體系統(tǒng)，通過不同的制備方法，如乳液聚合法、自組裝法等，制備相應(yīng)的載體包裹疫苗，并對其性能進(jìn)行全面表征。1.3.2免疫活性評估方法利用流式細(xì)胞術(shù)檢測疫苗對iNKT細(xì)胞的激活情況。將小鼠脾細(xì)胞或人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）與制備的疫苗共孵育，設(shè)置未刺激的細(xì)胞作為陰性對照，α-GalCer刺激的細(xì)胞作為陽性對照。孵育一定時(shí)間后，加入熒光標(biāo)記的抗體，如抗CD3、抗NK1.1、抗IFN-γ、抗IL-4等抗體，對細(xì)胞進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光通道的信號強(qiáng)度，分析iNKT細(xì)胞的激活比例、細(xì)胞因子分泌情況以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)變化，從而評估疫苗對iNKT細(xì)胞的激活能力。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測細(xì)胞因子的分泌水平。收集疫苗刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的操作說明，依次加入包被抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、檢測抗體和底物等，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-12等）的濃度。同時(shí)，設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液，繪制細(xì)胞因子分泌的時(shí)間曲線，分析疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的動態(tài)變化過程，以全面評估疫苗對免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)評估疫苗的免疫保護(hù)效果。選用健康的小鼠或大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，將動物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組若干只。實(shí)驗(yàn)組動物接種制備的基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗，對照組動物接種生理鹽水或不含iNKT細(xì)胞激動劑的疫苗作為對照。按照既定的免疫程序進(jìn)行多次免疫，每次免疫后間隔一定時(shí)間采血，分離血清，通過ELISA等方法檢測血清中特異性抗體的滴度和亞型分布。在免疫完成后，對實(shí)驗(yàn)組和對照組動物進(jìn)行病原體感染或腫瘤細(xì)胞接種，觀察動物的發(fā)病情況、生存時(shí)間、腫瘤生長速度等指標(biāo)。例如，對于抗尼古丁疫苗，通過給予動物一定劑量的尼古丁，觀察動物的行為學(xué)變化，檢測血液和組織中的尼古丁含量，評估疫苗對尼古丁的中和能力和對動物的保護(hù)效果；對于抗黃曲霉毒素疫苗，通過給動物注射黃曲霉毒素，檢測動物肝臟等組織的損傷指標(biāo)，觀察動物的生存狀況，評估疫苗對黃曲霉毒素中毒的預(yù)防和治療效果。1.3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在制備基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗時(shí)，設(shè)計(jì)不同的iNKT細(xì)胞激動劑修飾方式和偶聯(lián)策略。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組1：采用對α-GalCer脂肪酸鏈進(jìn)行延長修飾的iNKT細(xì)胞激動劑，通過碳二亞胺法與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物偶聯(lián)；實(shí)驗(yàn)組2：采用對α-GalCer糖基進(jìn)行修飾的iNKT細(xì)胞激動劑，通過琥珀酰亞胺酯法與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物偶聯(lián)；對照組：僅使用尼古丁-載體蛋白復(fù)合物，不添加iNKT細(xì)胞激動劑。對每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組的疫苗進(jìn)行全面的理化性質(zhì)表征和免疫活性評估，對比不同設(shè)計(jì)方案對疫苗性能的影響。在研究Th1和Th2型激動劑對免疫反應(yīng)的影響時(shí)，分別構(gòu)建含Th1型iNKT細(xì)胞激動劑和Th2型iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組3：制備含有Th1型iNKT細(xì)胞激動劑的疫苗；實(shí)驗(yàn)組4：制備含有Th2型iNKT細(xì)胞激動劑的疫苗；對照組：制備不含iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗。對這三組疫苗進(jìn)行免疫活性評估，包括流式細(xì)胞術(shù)檢測iNKT細(xì)胞激活及細(xì)胞因子分泌情況、ELISA檢測血清抗體水平和細(xì)胞因子濃度等，分析Th1和Th2型激動劑對免疫反應(yīng)類型和強(qiáng)度的影響。在制備基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗黃曲霉毒素疫苗時(shí)，設(shè)計(jì)不同的載體包裹方案。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組5：利用脂質(zhì)體包裹基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗黃曲霉毒素疫苗；實(shí)驗(yàn)組6：利用納米顆粒包裹基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗黃曲霉毒素疫苗；對照組：不進(jìn)行載體包裹的基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗黃曲霉毒素疫苗。對不同實(shí)驗(yàn)組和對照組的疫苗進(jìn)行穩(wěn)定性測試、體外釋放實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)免疫活性評估，比較不同載體包裹方案對疫苗性能的提升效果。二、iNKT細(xì)胞激動劑與化學(xué)合成疫苗概述2.1iNKT細(xì)胞及其激動劑2.1.1iNKT細(xì)胞的生物學(xué)特性iNKT細(xì)胞，即恒定自然殺傷T細(xì)胞（invariantNaturalKillerTcell），是一類獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞亞群，在免疫系統(tǒng)中占據(jù)著不可或缺的地位。與傳統(tǒng)T細(xì)胞不同，iNKT細(xì)胞表達(dá)恒定的T細(xì)胞受體（TCR）α鏈，這賦予了其獨(dú)特的抗原識別能力。這種恒定的TCRα鏈與有限變化的TCRβ鏈組合，使得iNKT細(xì)胞能夠識別由非多態(tài)性MHCI樣糖蛋白CD1d分子呈遞的脂質(zhì)抗原，從而啟動免疫應(yīng)答。iNKT細(xì)胞的表面標(biāo)記具有鮮明的特征，它同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞受體（CD3）和NK細(xì)胞相關(guān)受體，如NK1.1等，這使其兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞的特性，成為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵橋梁。在免疫應(yīng)答過程中，iNKT細(xì)胞能夠迅速響應(yīng)抗原刺激，展現(xiàn)出比傳統(tǒng)T細(xì)胞更為快速的活化能力。一旦被激活，iNKT細(xì)胞便會釋放大量的細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、激活其他免疫細(xì)胞以及維持免疫平衡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分布來看，iNKT細(xì)胞在人體多個(gè)組織和器官中均有存在，但含量和比例有所差異。在人外周血中，iNKT細(xì)胞約占循環(huán)T細(xì)胞的1%，而在人脂肪組織中，其比例可高達(dá)約10-25%。在小鼠體內(nèi)，肝臟是iNKT細(xì)胞的主要富集器官之一，其中iNKT細(xì)胞占肝臟淋巴細(xì)胞的比例可達(dá)20-50%，而在胸腺、脾臟和血液中，iNKT細(xì)胞的占比較低，約為循環(huán)T細(xì)胞的0.5-2%。這種組織特異性的分布暗示著iNKT細(xì)胞在不同組織微環(huán)境中可能發(fā)揮著獨(dú)特的免疫功能。iNKT細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用，它能夠通過多種途徑影響免疫系統(tǒng)的功能。一方面，iNKT細(xì)胞可以直接殺傷表達(dá)CD1d分子的靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、被病原體感染的細(xì)胞等，從而發(fā)揮免疫監(jiān)視和防御作用。另一方面，iNKT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性和功能。iNKT細(xì)胞分泌的IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力；IL-4則可以促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，參與體液免疫和過敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)。iNKT細(xì)胞還可以與樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等相互作用，調(diào)節(jié)抗原呈遞和免疫細(xì)胞的活化，進(jìn)而影響整個(gè)免疫系統(tǒng)的平衡和功能。在腫瘤免疫中，iNKT細(xì)胞可通過直接裂解腫瘤細(xì)胞、激活抗原遞呈細(xì)胞以及調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)；在抗感染免疫中，iNKT細(xì)胞能夠迅速響應(yīng)病原體感染，分泌細(xì)胞因子激活固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，共同抵御病原體的入侵；在自身免疫性疾病中，iNKT細(xì)胞的異常活化或功能缺陷可能導(dǎo)致免疫失衡，引發(fā)自身免疫反應(yīng)，而適當(dāng)激活iNKT細(xì)胞則有望調(diào)節(jié)免疫平衡，緩解疾病癥狀。iNKT細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用使其成為免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，為開發(fā)新型免疫治療策略提供了新的靶點(diǎn)和思路。2.1.2iNKT細(xì)胞激動劑的種類與作用機(jī)制iNKT細(xì)胞激動劑是一類能夠特異性激活iNKT細(xì)胞的物質(zhì)，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和來源的不同，可分為多種類型。其中，α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer）是最為經(jīng)典且研究最為深入的iNKT細(xì)胞激動劑。它最初從海洋海綿中分離得到，具有獨(dú)特的糖脂結(jié)構(gòu)，由一個(gè)α-半乳糖基與神經(jīng)酰胺通過糖苷鍵連接而成。這種結(jié)構(gòu)使得α-GalCer能夠與抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的CD1d分子緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的α-GalCer-CD1d復(fù)合物。除了α-GalCer，還有許多基于其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造的衍生物，如KRN7000等。KRN7000是α-GalCer的類似物，通過對α-GalCer的脂肪酸鏈進(jìn)行修飾，改變了其空間構(gòu)象和理化性質(zhì)，從而提高了與iNKT細(xì)胞表面TCR的親和力和激活效率。一些天然來源的脂質(zhì)抗原，如來自微生物的某些糖脂類物質(zhì)，也被發(fā)現(xiàn)能夠激活iNKT細(xì)胞，它們同樣通過與CD1d分子結(jié)合，啟動iNKT細(xì)胞的活化過程。iNKT細(xì)胞激動劑的作用機(jī)制主要圍繞其與CD1d分子的相互作用以及對iNKT細(xì)胞的激活過程展開。當(dāng)iNKT細(xì)胞激動劑，如α-GalCer進(jìn)入體內(nèi)后，首先被抗原呈遞細(xì)胞攝取?？乖蔬f細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞等，具有強(qiáng)大的吞噬和加工抗原的能力。在細(xì)胞內(nèi)，α-GalCer被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與新合成的CD1d分子結(jié)合。CD1d分子屬于非經(jīng)典的MHCI類樣分子，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能夠特異性地結(jié)合脂質(zhì)抗原。α-GalCer與CD1d分子結(jié)合后，形成的α-GalCer-CD1d復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至抗原呈遞細(xì)胞的表面。在抗原呈遞細(xì)胞表面，α-GalCer-CD1d復(fù)合物與iNKT細(xì)胞表面的恒定TCR特異性結(jié)合，形成三元復(fù)合物：CD1d/α-GalCer/TCR。這種特異性結(jié)合是iNKT細(xì)胞活化的關(guān)鍵步驟，它觸發(fā)了iNKT細(xì)胞內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TCR與α-GalCer-CD1d復(fù)合物結(jié)合后，首先激活Src家族激酶，如Lck等，Lck的活化進(jìn)而磷酸化TCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈上的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）。磷酸化的ITAM招募ZAP-70激酶，ZAP-70進(jìn)一步激活下游的信號分子，如PLC-γ1、Ras等，通過這些信號分子的級聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、AP-1等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使iNKT細(xì)胞活化、增殖，并分泌大量的細(xì)胞因子。iNKT細(xì)胞被激活后，迅速分泌多種細(xì)胞因子，根據(jù)分泌細(xì)胞因子的類型和功能，iNKT細(xì)胞可分為不同的亞群，如iNKT1、iNKT2和iNKT17等。iNKT1亞群主要分泌IFN-γ，能夠促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，有利于抵御細(xì)胞內(nèi)病原體感染和抗腫瘤免疫；iNKT2亞群主要分泌IL-4等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，參與體液免疫和過敏反應(yīng)的調(diào)節(jié)；iNKT17亞群則主要分泌IL-17，在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。這些不同亞群的iNKT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的活性和功能，形成復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，共同維持機(jī)體的免疫平衡和穩(wěn)態(tài)。2.2化學(xué)合成疫苗的特點(diǎn)與分類2.2.1化學(xué)合成疫苗的優(yōu)勢化學(xué)合成疫苗在現(xiàn)代疫苗研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出諸多獨(dú)特優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使其成為疫苗發(fā)展的重要方向之一。從成分角度來看，化學(xué)合成疫苗的最大特點(diǎn)是成分明確。傳統(tǒng)疫苗，如滅活疫苗和減毒活疫苗，其成分較為復(fù)雜，除了抗原成分外，還包含病原體的其他成分以及生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)。這些不確定的成分可能引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)，增加疫苗的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。而化學(xué)合成疫苗是通過精確的化學(xué)合成方法制備，其抗原及其他成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成清晰明確。科研人員能夠準(zhǔn)確控制疫苗中各成分的比例和純度，避免了雜質(zhì)的引入，從而大大提高了疫苗質(zhì)量的可控性。這使得疫苗在生產(chǎn)過程中能夠嚴(yán)格遵循質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保每一批次的疫苗都具有一致的質(zhì)量和性能，為疫苗的安全性和有效性提供了堅(jiān)實(shí)保障。安全性是疫苗研發(fā)和應(yīng)用中至關(guān)重要的考量因素，化學(xué)合成疫苗在這方面表現(xiàn)出色。由于其成分明確，不含有病原體的活性成分，如完整的病毒顆?；蚣?xì)菌，因此不存在傳統(tǒng)活疫苗可能出現(xiàn)的毒力返強(qiáng)問題。以脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗為例，雖然在預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎方面發(fā)揮了重要作用，但存在極小概率的毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致接種者患上脊髓灰質(zhì)炎?；瘜W(xué)合成疫苗則完全避免了這種風(fēng)險(xiǎn)，大大提高了疫苗的安全性，尤其適用于免疫功能較弱的人群，如嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者等。化學(xué)合成疫苗在生產(chǎn)過程中不需要使用大量的病原體，減少了生產(chǎn)過程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，降低了病原體泄漏和傳播的可能性，保障了生產(chǎn)人員和環(huán)境的安全。在大規(guī)模生產(chǎn)方面，化學(xué)合成疫苗具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)往往依賴于病原體的培養(yǎng)，這一過程需要嚴(yán)格的生物安全條件和復(fù)雜的培養(yǎng)技術(shù)，且產(chǎn)量受到病原體生長特性的限制。流感疫苗的生產(chǎn)需要大量培養(yǎng)流感病毒，過程繁瑣且產(chǎn)量有限，難以滿足大規(guī)模接種的需求。而化學(xué)合成疫苗的生產(chǎn)基于化學(xué)合成技術(shù)，不受病原體培養(yǎng)條件的限制，可以在標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)合成車間中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。通過優(yōu)化合成工藝和生產(chǎn)流程，可以實(shí)現(xiàn)疫苗的快速、高效生產(chǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)提供大量的疫苗，滿足公共衛(wèi)生突發(fā)事件中對疫苗的緊急需求?；瘜W(xué)合成疫苗的生產(chǎn)過程易于自動化控制，進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，降低了生產(chǎn)成本，使得疫苗能夠更廣泛地應(yīng)用于全球各地，為更多人提供免疫保護(hù)?；瘜W(xué)合成疫苗還具有良好的穩(wěn)定性。其化學(xué)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，在儲存和運(yùn)輸過程中不易受到溫度、濕度等環(huán)境因素的影響。這使得化學(xué)合成疫苗在冷鏈運(yùn)輸條件有限的地區(qū)也能保持良好的性能，擴(kuò)大了疫苗的應(yīng)用范圍，提高了疫苗的可及性，為全球疫苗接種計(jì)劃的實(shí)施提供了便利。2.2.2不同類型化學(xué)合成疫苗介紹化學(xué)合成疫苗涵蓋多種類型，每種類型都有其獨(dú)特的特點(diǎn)和應(yīng)用前景。多肽疫苗是其中的重要一員，它是通過化學(xué)合成技術(shù)制備的含有抗原表位的多肽片段。多肽疫苗的氨基酸序列明確，能夠精確模擬病原體的關(guān)鍵抗原部位，從而激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。在乙肝病毒多肽疫苗的研究中，科研人員通過分析乙肝病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)，合成了包含關(guān)鍵抗原表位的多肽。這些多肽能夠被免疫系統(tǒng)識別，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，中和乙肝病毒，從而預(yù)防乙肝感染。多肽疫苗具有高度的安全性，由于其成分單純，不含有病原體的其他成分，幾乎不會引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。多肽疫苗的生產(chǎn)過程相對簡單，易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)，成本相對較低。然而，多肽疫苗也存在一些局限性。其免疫原性相對較弱，這是因?yàn)槎嚯姆肿酉鄬^小，結(jié)構(gòu)簡單，難以像完整的病原體那樣有效地激活免疫系統(tǒng)。為了增強(qiáng)多肽疫苗的免疫原性，通常需要添加佐劑。佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫刺激作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，從而提高多肽疫苗的免疫效果。但佐劑的使用也可能帶來一些副作用，如局部炎癥反應(yīng)等。多肽疫苗的抗原表位選擇至關(guān)重要，如果選擇不當(dāng)，可能無法有效激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，影響疫苗的保護(hù)效果。多糖疫苗也是化學(xué)合成疫苗的重要類型，它主要由化學(xué)合成的多糖抗原組成。多糖是許多病原體表面的重要組成成分，如肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌等細(xì)菌的莢膜多糖。這些多糖抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。多糖疫苗在預(yù)防細(xì)菌性感染疾病方面具有重要作用。針對肺炎鏈球菌的多糖疫苗，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖的抗體，有效預(yù)防肺炎鏈球菌引起的肺炎、腦膜炎等疾病。多糖疫苗具有較好的穩(wěn)定性，在儲存和運(yùn)輸過程中不易降解，能夠保持良好的免疫活性。多糖疫苗也存在一些缺點(diǎn)。其免疫原性存在一定局限性，尤其是對于嬰幼兒等免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的人群，多糖疫苗的免疫效果可能不理想。這是因?yàn)閶胗變旱拿庖呦到y(tǒng)對多糖抗原的識別和應(yīng)答能力較弱。多糖疫苗通常為T細(xì)胞非依賴性抗原，難以誘導(dǎo)免疫記憶，免疫持續(xù)時(shí)間較短，需要多次接種才能維持有效的免疫保護(hù)。為了克服這些缺點(diǎn)，科研人員研發(fā)了多糖-蛋白結(jié)合疫苗。通過將多糖與載體蛋白結(jié)合，使多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，能夠有效增強(qiáng)多糖疫苗的免疫原性，誘導(dǎo)免疫記憶，提高疫苗的免疫效果和持續(xù)時(shí)間。核酸疫苗是近年來發(fā)展迅速的一種化學(xué)合成疫苗，包括DNA疫苗和mRNA疫苗。DNA疫苗是將編碼病原體抗原的基因片段克隆到質(zhì)粒載體中，通過肌肉注射、基因槍等方式將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出抗原蛋白，從而激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。mRNA疫苗則是直接將編碼抗原的mRNA導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，利用細(xì)胞自身的翻譯機(jī)制表達(dá)出抗原蛋白，引發(fā)免疫應(yīng)答。核酸疫苗具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)。其研發(fā)速度快，一旦確定病原體的基因序列，就可以迅速設(shè)計(jì)和合成相應(yīng)的核酸疫苗，能夠在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)對突發(fā)的傳染病疫情。在新冠疫情期間，mRNA新冠疫苗的快速研發(fā)和應(yīng)用為全球疫情防控做出了重要貢獻(xiàn)。核酸疫苗能夠在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)抗原，激發(fā)持久的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫記憶，提供長期的免疫保護(hù)。核酸疫苗還可以通過基因編輯技術(shù)對編碼序列進(jìn)行優(yōu)化，增強(qiáng)抗原的表達(dá)和免疫原性，提高疫苗的效果。然而，核酸疫苗也面臨一些挑戰(zhàn)。DNA疫苗存在整合到宿主基因組中的風(fēng)險(xiǎn)，雖然這種風(fēng)險(xiǎn)較低，但仍引起了人們的關(guān)注。mRNA疫苗的穩(wěn)定性較差，需要特殊的遞送系統(tǒng)和儲存條件來保證其活性。目前mRNA疫苗的遞送系統(tǒng)主要采用脂質(zhì)納米顆粒（LNP），但LNP的安全性和長期效果仍有待進(jìn)一步研究。核酸疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)還需要進(jìn)一步完善，以降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，促進(jìn)其更廣泛的應(yīng)用。2.3iNKT細(xì)胞激動劑在化學(xué)合成疫苗中的應(yīng)用在化學(xué)合成疫苗領(lǐng)域，iNKT細(xì)胞激動劑展現(xiàn)出了獨(dú)特而關(guān)鍵的應(yīng)用價(jià)值，尤其是作為佐劑在增強(qiáng)疫苗免疫原性方面發(fā)揮著重要作用。佐劑是一類能夠增強(qiáng)抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)，在疫苗中起著不可或缺的作用。傳統(tǒng)佐劑，如鋁佐劑，雖然在疫苗中應(yīng)用廣泛，但存在一定的局限性，如免疫激活效果相對較弱、可能引發(fā)局部不良反應(yīng)等。iNKT細(xì)胞激動劑作為新型佐劑，為克服這些局限性提供了新的解決方案。iNKT細(xì)胞激動劑作為佐劑的核心作用在于其能夠特異性地激活iNKT細(xì)胞，從而啟動一系列強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，顯著增強(qiáng)化學(xué)合成疫苗的免疫原性。當(dāng)iNKT細(xì)胞激動劑與化學(xué)合成疫苗聯(lián)合使用時(shí)，iNKT細(xì)胞激動劑首先與抗原呈遞細(xì)胞表面的CD1d分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物?？乖蔬f細(xì)胞攝取化學(xué)合成疫苗中的抗原后，將抗原加工處理，并與MHC分子結(jié)合呈遞在細(xì)胞表面。此時(shí)，iNKT細(xì)胞激動劑-CD1d復(fù)合物與iNKT細(xì)胞表面的TCR特異性結(jié)合，激活iNKT細(xì)胞。被激活的iNKT細(xì)胞迅速分泌大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在增強(qiáng)免疫原性方面發(fā)揮著多方面的作用。iNKT細(xì)胞分泌的IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，使其吞噬和殺傷病原體的能力顯著增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞被激活后，能夠更有效地?cái)z取、加工和呈遞抗原，從而提高疫苗抗原的免疫識別效率。IFN-γ還可以促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的極化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，有利于清除細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞。IL-4等細(xì)胞因子則可以促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，刺激B細(xì)胞的活化和增殖，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)體液免疫功能。通過調(diào)節(jié)Th1/Th2型免疫反應(yīng)的平衡，iNKT細(xì)胞激動劑能夠全面提升化學(xué)合成疫苗激發(fā)的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫原性。iNKT細(xì)胞激動劑還可以通過激活NK細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞具有天然的細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。iNKT細(xì)胞與NK細(xì)胞之間存在著密切的相互作用，iNKT細(xì)胞激活后分泌的細(xì)胞因子可以激活NK細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性。在腫瘤疫苗的研究中，將iNKT細(xì)胞激動劑與腫瘤相關(guān)抗原的化學(xué)合成疫苗聯(lián)合使用，iNKT細(xì)胞被激活后，通過分泌細(xì)胞因子激活NK細(xì)胞，使其能夠更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤疫苗的治療效果。在乙肝化學(xué)合成疫苗的研究中，科研人員將iNKT細(xì)胞激動劑與乙肝表面抗原的化學(xué)合成疫苗結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與單獨(dú)使用乙肝表面抗原疫苗相比，添加iNKT細(xì)胞激動劑的疫苗能夠顯著提高小鼠體內(nèi)特異性抗體的滴度，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對乙肝病毒的感染提供了更有效的免疫保護(hù)。在流感化學(xué)合成疫苗的研究中，利用iNKT細(xì)胞激動劑作為佐劑，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更廣泛的流感病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)，不僅提高了對同源流感病毒的免疫保護(hù)，還增強(qiáng)了對異源流感病毒的交叉保護(hù)能力，拓寬了疫苗的保護(hù)范圍。三、iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備3.1制備原理與策略3.1.1共價(jià)偶聯(lián)策略共價(jià)偶聯(lián)策略是將iNKT細(xì)胞激動劑與抗原通過共價(jià)鍵連接，形成穩(wěn)定的結(jié)合物。這種策略的核心原理基于化學(xué)反應(yīng)中化學(xué)鍵的形成，通過特定的化學(xué)反應(yīng)使iNKT細(xì)胞激動劑和抗原之間建立起牢固的共價(jià)連接。在眾多共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)中，碳二亞胺法是較為常用的方法之一。碳二亞胺（如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺，EDC）能夠在羧基和氨基之間起到橋梁作用，促進(jìn)二者發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。當(dāng)應(yīng)用于iNKT細(xì)胞激動劑與抗原的偶聯(lián)時(shí)，若抗原分子含有羧基，iNKT細(xì)胞激動劑含有氨基，或者反之，在EDC的作用下，二者即可通過酰胺鍵共價(jià)連接。以抗尼古丁疫苗的制備為例，尼古丁小分子本身免疫原性極弱，需要與載體蛋白（如鑰孔血藍(lán)蛋白KLH）結(jié)合以增強(qiáng)免疫原性。首先，利用戊二醛交聯(lián)法將尼古丁小分子與KLH進(jìn)行結(jié)合。戊二醛具有兩個(gè)醛基，能夠分別與尼古丁和KLH上的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿，從而實(shí)現(xiàn)尼古丁與KLH的初步連接。隨后，采用碳二亞胺法將iNKT細(xì)胞激動劑與尼古丁-KLH復(fù)合物進(jìn)行偶聯(lián)。若iNKT細(xì)胞激動劑含有氨基，在EDC和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的存在下，EDC先與尼古丁-KLH復(fù)合物中的羧基反應(yīng)，形成活性中間體，NHS則與該中間體結(jié)合，生成更穩(wěn)定的NHS酯。此時(shí)，iNKT細(xì)胞激動劑的氨基能夠與NHS酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而與尼古丁-KLH復(fù)合物通過酰胺鍵共價(jià)連接，形成基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗。琥珀酰亞胺酯法也是一種重要的共價(jià)偶聯(lián)方法。該方法利用琥珀酰亞胺酯（如N-羥基琥珀酰亞胺酯，NHS酯）與氨基之間的特異性反應(yīng)。NHS酯具有較高的反應(yīng)活性，能夠在溫和的條件下與氨基迅速反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在制備基于iNKT細(xì)胞激動劑的黃曲霉毒素疫苗時(shí)，若黃曲霉毒素抗原含有氨基，可先將iNKT細(xì)胞激動劑進(jìn)行修飾，引入琥珀酰亞胺酯基團(tuán)。修飾后的iNKT細(xì)胞激動劑在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中，能夠與黃曲霉毒素抗原的氨基發(fā)生反應(yīng)，通過酰胺鍵實(shí)現(xiàn)共價(jià)偶聯(lián)，制備出基于iNKT細(xì)胞激動劑的黃曲霉毒素疫苗。共價(jià)偶聯(lián)策略具有諸多優(yōu)點(diǎn)。通過共價(jià)鍵連接，iNKT細(xì)胞激動劑與抗原之間形成了穩(wěn)定的結(jié)合物，在體內(nèi)環(huán)境中不易解離，能夠確保二者在免疫過程中協(xié)同作用，持續(xù)激活iNKT細(xì)胞，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。共價(jià)偶聯(lián)還可以精確控制iNKT細(xì)胞激動劑與抗原的連接比例和位點(diǎn)，有利于優(yōu)化疫苗的結(jié)構(gòu)和性能，提高疫苗的質(zhì)量可控性。然而，共價(jià)偶聯(lián)策略也存在一定的局限性。共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)通常需要較為嚴(yán)格的反應(yīng)條件，如合適的pH值、溫度和反應(yīng)時(shí)間等，反應(yīng)條件的微小變化可能會影響偶聯(lián)效率和產(chǎn)物的質(zhì)量。在偶聯(lián)過程中，可能會引入一些化學(xué)試劑，這些試劑的殘留可能會對疫苗的安全性產(chǎn)生潛在影響，需要進(jìn)行嚴(yán)格的純化和檢測，以確保疫苗的安全性和有效性。3.1.2非共價(jià)組裝策略非共價(jià)組裝策略是利用脂質(zhì)體、納米顆粒等載體實(shí)現(xiàn)iNKT細(xì)胞激動劑與抗原非共價(jià)組裝的方法。這種策略不依賴于共價(jià)鍵的形成，而是通過分子間的弱相互作用，如靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵等，將iNKT細(xì)胞激動劑和抗原組裝在載體上。脂質(zhì)體是由磷脂等兩親性分子在水溶液中自發(fā)形成的雙層膜結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和載藥能力，是常用的非共價(jià)組裝載體之一。利用薄膜分散法制備包裹基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗的脂質(zhì)體時(shí)，首先將磷脂、膽固醇等脂質(zhì)材料溶解在有機(jī)溶劑（如氯仿、甲醇等）中，形成均勻的溶液。然后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方法去除有機(jī)溶劑，在容器壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜。接著，向含有脂質(zhì)薄膜的容器中加入含有iNKT細(xì)胞激動劑和抗原的水溶液，進(jìn)行水化處理。在水化過程中，脂質(zhì)薄膜吸水膨脹，形成脂質(zhì)體，iNKT細(xì)胞激動劑和抗原則被包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)部水相或脂質(zhì)雙分子層中。通過精確控制磷脂與膽固醇的比例、水化溫度、超聲時(shí)間等制備條件，可以獲得粒徑均一、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體疫苗。脂質(zhì)體的粒徑和電位對其體內(nèi)分布和免疫效果具有重要影響。通過動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)可以精確測定脂質(zhì)體的粒徑和電位，通過透射電子顯微鏡（TEM）能夠直觀地觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確保脂質(zhì)體的質(zhì)量符合要求。納米顆粒也是一種常用的非共價(jià)組裝載體，具有粒徑小、比表面積大、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)。利用乳液聚合法制備納米顆粒包裹的疫苗時(shí)，將單體、引發(fā)劑、乳化劑等物質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中，形成油相。將含有iNKT細(xì)胞激動劑和抗原的水溶液作為水相，在高速攪拌或超聲作用下，將油相分散在水相中，形成乳液體系。在引發(fā)劑的作用下，單體在油滴中發(fā)生聚合反應(yīng)，形成納米顆粒，iNKT細(xì)胞激動劑和抗原則被包裹在納米顆粒內(nèi)部或吸附在其表面。通過自組裝法制備納米顆粒時(shí)，利用納米材料（如納米金、量子點(diǎn)等）與iNKT細(xì)胞激動劑、抗原之間的特異性相互作用，在一定條件下使它們自發(fā)組裝成穩(wěn)定的納米顆粒疫苗。納米顆粒的表面性質(zhì)和組成可以通過選擇不同的材料和修飾方法進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)對疫苗靶向性和免疫效果的優(yōu)化。非共價(jià)組裝策略的優(yōu)勢在于制備過程相對簡單，不需要進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，對iNKT細(xì)胞激動劑和抗原的結(jié)構(gòu)影響較小，能夠較好地保持它們的生物活性。非共價(jià)相互作用具有一定的可逆性，在體內(nèi)環(huán)境中，iNKT細(xì)胞激動劑和抗原可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候從載體上釋放出來，發(fā)揮免疫作用。然而，非共價(jià)組裝也存在一些不足之處。由于iNKT細(xì)胞激動劑和抗原與載體之間是通過弱相互作用結(jié)合的，在儲存和運(yùn)輸過程中，可能會發(fā)生解離，影響疫苗的穩(wěn)定性。非共價(jià)組裝的載藥量相對有限，可能無法滿足某些高劑量疫苗的需求。三、iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備3.2制備工藝與流程3.2.1原料準(zhǔn)備在基于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的制備過程中，原料的選擇與預(yù)處理至關(guān)重要，直接關(guān)系到疫苗的質(zhì)量與性能。iNKT細(xì)胞激動劑作為核心原料之一，其種類和質(zhì)量對疫苗的免疫活性起著決定性作用。經(jīng)典的α-半乳糖神經(jīng)酰胺（α-GalCer）是常用的iNKT細(xì)胞激動劑，然而，為了進(jìn)一步提升其性能，科研人員對其進(jìn)行了諸多結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)出一系列衍生物。KRN7000便是通過對α-GalCer的脂肪酸鏈進(jìn)行修飾而得到的，其與iNKT細(xì)胞表面TCR的親和力相較于α-GalCer得到了顯著提高，從而能更有效地激活iNKT細(xì)胞。在選擇iNKT細(xì)胞激動劑時(shí)，需要綜合考慮其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、免疫激活能力以及與其他原料的兼容性等因素。在制備抗尼古丁疫苗時(shí)，選擇對α-GalCer脂肪酸鏈進(jìn)行延長修飾的iNKT細(xì)胞激動劑，旨在利用其增強(qiáng)的免疫激活能力，更有效地打破尼古丁的免疫耐受，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對尼古丁的免疫反應(yīng)。而在制備抗黃曲霉毒素疫苗時(shí)，可能會選擇對α-GalCer糖基進(jìn)行修飾的iNKT細(xì)胞激動劑，以適應(yīng)黃曲霉毒素抗原的特性，提高疫苗的整體免疫效果。為確保iNKT細(xì)胞激動劑的質(zhì)量，在使用前需進(jìn)行嚴(yán)格的純度檢測，通過高效液相色譜（HPLC）分析其純度，確保雜質(zhì)含量在可接受范圍內(nèi)。還需對其活性進(jìn)行評估，可采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如將iNKT細(xì)胞激動劑與iNKT細(xì)胞共孵育，檢測細(xì)胞因子的分泌情況，以確定其活性是否符合要求。抗原作為疫苗的關(guān)鍵成分，其來源和性質(zhì)直接影響疫苗的免疫特異性。對于不同類型的疫苗，抗原的選擇差異較大。在抗尼古丁疫苗中，尼古丁小分子本身免疫原性極低，需要與載體蛋白結(jié)合以增強(qiáng)免疫原性。鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）是常用的載體蛋白之一，其具有較高的免疫原性和多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，能夠有效地結(jié)合尼古丁小分子。在制備過程中，首先利用戊二醛交聯(lián)法將尼古丁與KLH進(jìn)行結(jié)合，形成尼古丁-KLH復(fù)合物。戊二醛具有兩個(gè)醛基，能夠分別與尼古丁和KLH上的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿，從而實(shí)現(xiàn)二者的連接。對于黃曲霉毒素疫苗，通常選擇黃曲霉毒素的關(guān)鍵抗原表位作為抗原，這些抗原表位能夠特異性地刺激機(jī)體產(chǎn)生針對黃曲霉毒素的免疫反應(yīng)。在抗原的預(yù)處理過程中，需要對其進(jìn)行純化和鑒定，通過凝膠過濾色譜等方法去除雜質(zhì)，確?？乖募兌龋焕觅|(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，保證抗原的質(zhì)量和活性。載體材料在疫苗制備中起著重要的作用，它能夠保護(hù)抗原和iNKT細(xì)胞激動劑，提高其穩(wěn)定性和靶向性。脂質(zhì)體作為常用的載體材料之一，由磷脂等兩親性分子在水溶液中自發(fā)形成雙層膜結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和載藥能力。在制備脂質(zhì)體時(shí)，需要選擇合適的磷脂和膽固醇。磷脂的種類繁多，如卵磷脂、腦磷脂等，不同種類的磷脂具有不同的理化性質(zhì)和生物活性。卵磷脂來源廣泛，具有良好的乳化性和穩(wěn)定性，是制備脂質(zhì)體常用的磷脂之一。膽固醇能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的膜流動性和穩(wěn)定性，在脂質(zhì)體中加入適量的膽固醇，可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和載藥能力。納米顆粒也是常用的載體材料，其具有粒徑小、比表面積大、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)。在制備納米顆粒時(shí)，需要選擇合適的納米材料，如納米金、量子點(diǎn)等，并對其進(jìn)行表面修飾，以提高其與抗原和iNKT細(xì)胞激動劑的結(jié)合能力和靶向性。3.2.2合成與組裝過程iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的合成與組裝過程是一個(gè)精細(xì)且復(fù)雜的過程，需要嚴(yán)格控制各個(gè)環(huán)節(jié)，以確保疫苗的質(zhì)量和性能。以基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗制備為例，共價(jià)偶聯(lián)是關(guān)鍵步驟之一。采用碳二亞胺法將iNKT細(xì)胞激動劑與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物進(jìn)行偶聯(lián)。在反應(yīng)體系中，首先加入碳二亞胺（如1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺，EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。EDC能夠與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物中的羧基反應(yīng)，形成活性中間體，NHS則與該中間體結(jié)合，生成更穩(wěn)定的NHS酯。此時(shí)，iNKT細(xì)胞激動劑的氨基能夠與NHS酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而與尼古丁-載體蛋白復(fù)合物通過酰胺鍵共價(jià)連接。在反應(yīng)過程中，需要精確控制反應(yīng)條件。反應(yīng)溫度通?？刂圃?℃-37℃之間，溫度過高可能導(dǎo)致反應(yīng)物分解或副反應(yīng)增加，溫度過低則會使反應(yīng)速率變慢，影響生產(chǎn)效率。pH值一般控制在6.0-8.0之間，在此范圍內(nèi)，碳二亞胺和NHS的活性較高，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間則根據(jù)具體情況而定，一般在數(shù)小時(shí)至數(shù)十小時(shí)之間，通過高效液相色譜（HPLC）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到預(yù)期的轉(zhuǎn)化率時(shí)，停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，需要對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化，采用柱層析等方法去除未反應(yīng)的iNKT細(xì)胞激動劑、載體蛋白以及其他雜質(zhì)，得到純度較高的共價(jià)偶聯(lián)產(chǎn)物。利用薄膜分散法制備包裹基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗的脂質(zhì)體時(shí)，首先將磷脂、膽固醇等脂質(zhì)材料溶解在有機(jī)溶劑（如氯仿、甲醇等）中，形成均勻的溶液。然后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方法去除有機(jī)溶劑，在容器壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜。接著，向含有脂質(zhì)薄膜的容器中加入含有iNKT細(xì)胞激動劑和尼古丁-載體蛋白復(fù)合物的水溶液，進(jìn)行水化處理。在水化過程中，脂質(zhì)薄膜吸水膨脹，形成脂質(zhì)體，iNKT細(xì)胞激動劑和抗原則被包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)部水相或脂質(zhì)雙分子層中。為了獲得粒徑均一、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體疫苗，需要精確控制制備條件。磷脂與膽固醇的比例一般在3:1-10:1之間，不同的比例會影響脂質(zhì)體的膜流動性和穩(wěn)定性。水化溫度通?？刂圃?0℃-60℃之間，在此溫度范圍內(nèi)，脂質(zhì)分子的運(yùn)動較為活躍，有利于脂質(zhì)體的形成。超聲時(shí)間一般在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘之間，超聲能夠使脂質(zhì)體的粒徑更加均勻，提高其穩(wěn)定性。通過動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)可以精確測定脂質(zhì)體的粒徑和電位，通過透射電子顯微鏡（TEM）能夠直觀地觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確保脂質(zhì)體的質(zhì)量符合要求。3.2.3純化與質(zhì)量控制純化是基于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗制備過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的是去除疫苗中的雜質(zhì)，提高疫苗的純度和質(zhì)量。在疫苗合成與組裝完成后，反應(yīng)體系中往往會殘留未反應(yīng)的原料、副產(chǎn)物以及其他雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能會影響疫苗的安全性和有效性，因此必須進(jìn)行嚴(yán)格的純化處理。柱層析是常用的純化方法之一，包括凝膠過濾層析、離子交換層析和親和層析等。凝膠過濾層析利用不同分子大小的物質(zhì)在凝膠顆?？紫吨械臄U(kuò)散速度差異進(jìn)行分離。對于基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗，未反應(yīng)的小分子原料、副產(chǎn)物等分子量較小，能夠快速通過凝膠顆粒的孔隙，而疫苗分子由于分子量較大，在凝膠顆?？紫吨械臄U(kuò)散速度較慢，從而實(shí)現(xiàn)與雜質(zhì)的分離。離子交換層析則是根據(jù)分子所帶電荷的差異進(jìn)行分離。通過選擇合適的離子交換樹脂，調(diào)整緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，使疫苗分子與雜質(zhì)在樹脂上的吸附和解吸行為不同，從而達(dá)到分離的目的。親和層析利用疫苗分子與特定配體之間的特異性相互作用進(jìn)行分離，具有高度的選擇性。可以將與iNKT細(xì)胞激動劑或抗原具有特異性結(jié)合能力的配體固定在層析介質(zhì)上，當(dāng)疫苗溶液通過層析柱時(shí)，疫苗分子會與配體特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則直接流出，然后通過改變洗脫條件，將結(jié)合在配體上的疫苗分子洗脫下來，實(shí)現(xiàn)純化。在純化過程中，需要對純化效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，以確保疫苗的純度達(dá)到要求。高效液相色譜（HPLC）是常用的監(jiān)測手段之一，它能夠精確分析疫苗中各成分的含量和純度。通過HPLC圖譜，可以清晰地觀察到疫苗主峰以及雜質(zhì)峰的情況，根據(jù)峰面積的比例計(jì)算疫苗的純度。質(zhì)譜（MS）技術(shù)也可用于純度分析，它能夠準(zhǔn)確測定疫苗分子的分子量，通過與理論分子量進(jìn)行對比，判斷疫苗分子的完整性和純度，還能檢測出可能存在的雜質(zhì)及其結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)量控制是保證疫苗質(zhì)量和安全性的重要措施，貫穿于疫苗制備的全過程。除了純度指標(biāo)外，活性也是關(guān)鍵的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。對于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗，其活性主要體現(xiàn)在對iNKT細(xì)胞的激活能力以及引發(fā)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度上。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測疫苗對iNKT細(xì)胞的激活情況，將小鼠脾細(xì)胞或人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）與制備的疫苗共孵育，設(shè)置未刺激的細(xì)胞作為陰性對照，α-GalCer刺激的細(xì)胞作為陽性對照。孵育一定時(shí)間后，加入熒光標(biāo)記的抗體，如抗CD3、抗NK1.1、抗IFN-γ、抗IL-4等抗體，對細(xì)胞進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光通道的信號強(qiáng)度，分析iNKT細(xì)胞的激活比例、細(xì)胞因子分泌情況以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)變化，從而評估疫苗對iNKT細(xì)胞的激活能力。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測細(xì)胞因子的分泌水平，收集疫苗刺激后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的操作說明，依次加入包被抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、檢測抗體和底物等，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-4、IL-12等）的濃度。通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)評估疫苗的免疫保護(hù)效果，選用健康的小鼠或大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，將動物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組若干只。實(shí)驗(yàn)組動物接種制備的基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗，對照組動物接種生理鹽水或不含iNKT細(xì)胞激動劑的疫苗作為對照。按照既定的免疫程序進(jìn)行多次免疫，每次免疫后間隔一定時(shí)間采血，分離血清，通過ELISA等方法檢測血清中特異性抗體的滴度和亞型分布。在免疫完成后，對實(shí)驗(yàn)組和對照組動物進(jìn)行病原體感染或腫瘤細(xì)胞接種，觀察動物的發(fā)病情況、生存時(shí)間、腫瘤生長速度等指標(biāo)，以全面評估疫苗的免疫活性和保護(hù)效果。3.3制備實(shí)例分析3.3.1某新型雙佐劑新冠疫苗的制備海南大學(xué)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的新型雙佐劑新冠疫苗在制備工藝上具有顯著的創(chuàng)新性，為新冠疫苗的研發(fā)提供了全新的思路和方法。該疫苗的制備基于共價(jià)結(jié)合策略，將iNKT細(xì)胞激動劑和TLR7/8激動劑與新冠病毒抗原進(jìn)行共價(jià)連接，形成了獨(dú)特的雙佐劑自佐劑疫苗結(jié)構(gòu)。在原料選擇上，團(tuán)隊(duì)精心挑選了具有高效免疫激活能力的iNKT細(xì)胞激動劑和TLR7/8激動劑。iNKT細(xì)胞激動劑能夠特異性地激活iNKT細(xì)胞，啟動強(qiáng)大的免疫反應(yīng)；TLR7/8激動劑則可以激活Toll樣受體信號通路，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。新冠病毒抗原選用了具有高度免疫原性的刺突蛋白（S蛋白）的受體結(jié)合域（RBD），該區(qū)域是新冠病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體，有效阻斷病毒與細(xì)胞的結(jié)合，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。在共價(jià)結(jié)合過程中，團(tuán)隊(duì)采用了先進(jìn)的化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)，確保iNKT細(xì)胞激動劑、TLR7/8激動劑與新冠病毒RBD蛋白之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。通過精確控制反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等，實(shí)現(xiàn)了高效的偶聯(lián)反應(yīng)，提高了疫苗的制備效率和質(zhì)量穩(wěn)定性。在優(yōu)化反應(yīng)溫度時(shí)，研究人員進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置不同的溫度梯度，如25℃、30℃、37℃等，通過檢測偶聯(lián)產(chǎn)物的純度和活性，發(fā)現(xiàn)37℃時(shí)偶聯(lián)反應(yīng)效果最佳，能夠獲得高純度和高活性的雙佐劑疫苗。這種雙佐劑的設(shè)計(jì)具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)疫苗通常采用單一佐劑，免疫激活效果相對有限。而該新型雙佐劑新冠疫苗通過iNKT細(xì)胞激動劑和TLR7/8激動劑的協(xié)同作用，能夠激活不同的免疫細(xì)胞亞群和信號通路，實(shí)現(xiàn)對免疫系統(tǒng)的全方位激活。iNKT細(xì)胞激動劑激活iNKT細(xì)胞，使其迅速分泌大量的細(xì)胞因子，如IFN-γ、IL-4等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的類型和強(qiáng)度；TLR7/8激動劑則激活樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，增強(qiáng)其抗原呈遞能力和免疫激活功能，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和增殖。這種雙佐劑機(jī)制能夠顯著增強(qiáng)疫苗的免疫活性，提高機(jī)體對新冠病毒的免疫防御能力。研究表明，該新型雙佐劑新冠疫苗能夠被同一抗原呈遞細(xì)胞識別，使得佐劑與抗原能夠協(xié)同作用，增強(qiáng)免疫效果。雙佐劑機(jī)制展現(xiàn)出了出色的協(xié)同作用，使得佐劑的使用劑量降低至傳統(tǒng)疫苗的百分之一，在保證免疫效果的同時(shí)，有效降低了佐劑可能帶來的副作用，提高了疫苗的安全性。這一創(chuàng)新性的制備工藝和雙佐劑設(shè)計(jì)為新冠疫苗的研發(fā)和改進(jìn)提供了重要的參考，也為其他類型疫苗的設(shè)計(jì)和制備提供了有益的借鑒，有望推動疫苗領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和發(fā)展。3.3.2抗尼古丁疫苗的制備抗尼古丁疫苗的制備旨在幫助煙民戒除煙癮，預(yù)防非煙民對尼古丁成癮，其制備過程涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和技術(shù)。尼古丁作為煙草中的主要成癮成分，分子較小，免疫原性極弱，難以被免疫系統(tǒng)識別和攻擊。為了增強(qiáng)尼古丁的免疫原性，需要將其與載體蛋白結(jié)合，形成具有免疫原性的復(fù)合物。在制備過程中，常用的載體蛋白為鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH），其具有較高的免疫原性和多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，能夠有效地結(jié)合尼古丁小分子。首先利用戊二醛交聯(lián)法將尼古丁與KLH進(jìn)行結(jié)合。戊二醛具有兩個(gè)醛基，能夠分別與尼古丁和KLH上的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成席夫堿，從而實(shí)現(xiàn)二者的連接。在實(shí)際操作中，需要精確控制戊二醛的用量、反應(yīng)時(shí)間和溫度等條件，以確保尼古丁與KLH的結(jié)合效率和穩(wěn)定性。研究表明，當(dāng)戊二醛與尼古丁、KLH的摩爾比為一定比例，如1:2:1時(shí)，在適宜的溫度（如37℃）和反應(yīng)時(shí)間（如2小時(shí)）下，能夠獲得較高結(jié)合率的尼古丁-KLH復(fù)合物。將iNKT細(xì)胞激動劑與尼古丁-KLH復(fù)合物進(jìn)行偶聯(lián)，是制備抗尼古丁疫苗的關(guān)鍵步驟。可采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)，如使用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。EDC能夠與尼古丁-KLH復(fù)合物中的羧基反應(yīng)，形成活性中間體，NHS則與該中間體結(jié)合，生成更穩(wěn)定的NHS酯。此時(shí)，iNKT細(xì)胞激動劑的氨基能夠與NHS酯發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而與尼古丁-KLH復(fù)合物通過酰胺鍵共價(jià)連接。在反應(yīng)過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)的pH值、溫度和時(shí)間等條件至關(guān)重要。pH值一般控制在6.5-7.5之間，溫度控制在4℃-37℃之間，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)具體情況而定，通常在數(shù)小時(shí)至十幾小時(shí)之間。通過高效液相色譜（HPLC）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，確保反應(yīng)充分進(jìn)行，偶聯(lián)產(chǎn)物的純度和活性符合要求。為了提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果，可選擇合適的載體系統(tǒng)對疫苗進(jìn)行包裹。脂質(zhì)體是常用的載體之一，利用薄膜分散法制備包裹抗尼古丁疫苗的脂質(zhì)體時(shí)，將磷脂、膽固醇等脂質(zhì)材料溶解在有機(jī)溶劑（如氯仿、甲醇等）中，形成均勻的溶液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等方法去除有機(jī)溶劑，在容器壁上形成一層均勻的脂質(zhì)薄膜。向含有脂質(zhì)薄膜的容器中加入含有iNKT細(xì)胞激動劑和尼古丁-KLH復(fù)合物的水溶液，進(jìn)行水化處理。在水化過程中，脂質(zhì)薄膜吸水膨脹，形成脂質(zhì)體，iNKT細(xì)胞激動劑和抗原則被包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)部水相或脂質(zhì)雙分子層中。精確控制磷脂與膽固醇的比例、水化溫度、超聲時(shí)間等制備條件，對于獲得高質(zhì)量的脂質(zhì)體疫苗至關(guān)重要。磷脂與膽固醇的比例一般在4:1-8:1之間，水化溫度控制在40℃-50℃之間，超聲時(shí)間在10-30分鐘之間，能夠制備出粒徑均一、穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體疫苗。通過動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測定脂質(zhì)體的粒徑和電位，通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確保脂質(zhì)體的質(zhì)量符合要求。抗尼古丁疫苗的制備過程需要綜合運(yùn)用多種技術(shù)和方法，精確控制各個(gè)環(huán)節(jié)的條件，以制備出具有高效免疫活性和良好穩(wěn)定性的疫苗，為煙民戒煙和預(yù)防尼古丁成癮提供有效的手段。四、iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗免疫活性評估4.1評估指標(biāo)與方法4.1.1免疫細(xì)胞激活指標(biāo)在評估基于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的免疫活性時(shí)，免疫細(xì)胞激活指標(biāo)是關(guān)鍵的評估內(nèi)容之一，其中iNKT細(xì)胞的激活情況是核心指標(biāo)。利用流式細(xì)胞術(shù)能夠精確檢測疫苗對iNKT細(xì)胞的激活效果。以小鼠實(shí)驗(yàn)為例，首先獲取小鼠脾細(xì)胞，將其與制備的疫苗進(jìn)行共孵育。設(shè)置未刺激的小鼠脾細(xì)胞作為陰性對照，該對照組細(xì)胞未接觸疫苗，用于反映正常狀態(tài)下iNKT細(xì)胞的基礎(chǔ)水平；以α-GalCer刺激的小鼠脾細(xì)胞作為陽性對照，α-GalCer是經(jīng)典的iNKT細(xì)胞激動劑，可使iNKT細(xì)胞充分激活，作為陽性對照用于衡量疫苗激活iNKT細(xì)胞的相對能力。孵育一定時(shí)間后，加入熒光標(biāo)記的抗體，如抗CD3、抗NK1.1、抗IFN-γ、抗IL-4等抗體?？笴D3抗體用于標(biāo)記T細(xì)胞，因?yàn)閕NKT細(xì)胞屬于T細(xì)胞亞群，表達(dá)CD3分子；抗NK1.1抗體用于特異性識別iNKT細(xì)胞，因?yàn)閕NKT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)NK1.1分子；抗IFN-γ和抗IL-4抗體則分別用于檢測iNKT細(xì)胞激活后分泌的細(xì)胞因子。通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光通道的信號強(qiáng)度，分析iNKT細(xì)胞的激活比例。若疫苗能夠有效激活iNKT細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果中，會觀察到表達(dá)NK1.1和CD3雙陽性的細(xì)胞比例增加，且這些細(xì)胞中分泌IFN-γ或IL-4的細(xì)胞比例也會相應(yīng)升高。除了iNKT細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活情況也是重要的評估指標(biāo)。T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，檢測T細(xì)胞的激活有助于了解疫苗對細(xì)胞免疫的影響。通過檢測T細(xì)胞表面的活化標(biāo)志物，如CD69、CD25等，可以判斷T細(xì)胞是否被激活。CD69是T細(xì)胞早期活化的標(biāo)志物，在T細(xì)胞受到刺激后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可表達(dá)上調(diào)；CD25是白細(xì)胞介素-2（IL-2）受體的α鏈，T細(xì)胞激活后，IL-2受體表達(dá)增加，CD25的表達(dá)也隨之升高。采用流式細(xì)胞術(shù)，將熒光標(biāo)記的抗CD69、抗CD25抗體與T細(xì)胞孵育，通過檢測熒光信號強(qiáng)度，分析T細(xì)胞表面這些活化標(biāo)志物的表達(dá)水平。若疫苗能夠激活T細(xì)胞，會觀察到T細(xì)胞表面CD69、CD25的表達(dá)水平顯著升高，表明T細(xì)胞被激活，進(jìn)入增殖和分化階段，發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。B細(xì)胞在體液免疫中起著核心作用，其激活后可分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。檢測B細(xì)胞的激活情況，可通過檢測B細(xì)胞表面的標(biāo)志物，如CD86、CD40等。CD86是B細(xì)胞表面的共刺激分子，在B細(xì)胞激活后表達(dá)上調(diào)，能夠與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，提供共刺激信號，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖；CD40也是B細(xì)胞表面的重要分子，與T細(xì)胞表面的CD40L相互作用，在B細(xì)胞的活化、增殖和抗體類別轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同樣采用流式細(xì)胞術(shù)，用熒光標(biāo)記的抗CD86、抗CD40抗體與B細(xì)胞孵育，檢測熒光信號強(qiáng)度，分析B細(xì)胞表面這些標(biāo)志物的表達(dá)變化。若疫苗能夠有效激活B細(xì)胞，會觀察到B細(xì)胞表面CD86、CD40的表達(dá)水平明顯升高，表明B細(xì)胞被激活，啟動體液免疫應(yīng)答，為產(chǎn)生特異性抗體做好準(zhǔn)備。4.1.2細(xì)胞因子分泌檢測細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中扮演著關(guān)鍵角色，它們是由免疫細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性、增殖和分化，介導(dǎo)免疫細(xì)胞之間的相互作用，對免疫應(yīng)答的啟動、發(fā)展和終止起著重要的調(diào)控作用。因此，檢測疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類和水平是評估iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗免疫活性的重要環(huán)節(jié)。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)是檢測細(xì)胞因子分泌水平的常用方法之一，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作相對簡便等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地定量檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿等生物樣品中的細(xì)胞因子濃度。以檢測疫苗刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的干擾素-γ（IFN-γ）為例，按照ELISA試劑盒的操作說明，首先將抗IFN-γ的捕獲抗體包被在酶標(biāo)板的微孔表面，使其固定在微孔壁上。然后，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，標(biāo)準(zhǔn)品含有已知濃度的IFN-γ，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而細(xì)胞培養(yǎng)上清液中若存在IFN-γ，會與包被的捕獲抗體特異性結(jié)合。孵育一段時(shí)間后，洗去未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的抗IFN-γ檢測抗體，該抗體能夠與已結(jié)合在捕獲抗體上的IFN-γ特異性結(jié)合，形成“捕獲抗體-IFN-γ-檢測抗體”的夾心結(jié)構(gòu)。再次洗去未結(jié)合的檢測抗體后，加入底物溶液。底物在酶的催化作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺與樣品中IFN-γ的濃度成正比。通過酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中IFN-γ的濃度。除了IFN-γ，白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等細(xì)胞因子也是重要的檢測指標(biāo)。IL-4在Th2型免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體類別轉(zhuǎn)換，尤其是促進(jìn)IgE的產(chǎn)生，在體液免疫和過敏反應(yīng)中具有重要意義。IL-12則主要由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生，能夠促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的極化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞，使其發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。通過ELISA技術(shù)，同樣可以準(zhǔn)確檢測這些細(xì)胞因子在疫苗刺激后的分泌水平，分析它們在免疫反應(yīng)中的動態(tài)變化。在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，如在疫苗刺激后6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)分別收集上清液進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。通過繪制細(xì)胞因子分泌的時(shí)間曲線，可以清晰地觀察到不同細(xì)胞因子分泌的動態(tài)變化過程。某些疫苗可能在早期誘導(dǎo)IL-12的大量分泌，促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的迅速啟動；隨著時(shí)間的推移，IL-4的分泌逐漸增加，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的平衡，促進(jìn)體液免疫的發(fā)展。這種動態(tài)監(jiān)測能夠全面評估疫苗對免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，深入了解疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)機(jī)制，為疫苗的優(yōu)化和改進(jìn)提供重要依據(jù)。4.1.3抗體產(chǎn)生水平測定測定疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體是評估iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗免疫活性的重要內(nèi)容，它直接反映了疫苗激發(fā)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的能力。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是常用的測定特異性抗體的方法之一，具有高靈敏度、高特異性和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于疫苗免疫效果的評估。以檢測抗尼古丁疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體為例，首先將尼古丁-載體蛋白復(fù)合物作為抗原包被在酶標(biāo)板的微孔表面。抗原的包被是ELISA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，通過物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)的方法，使抗原牢固地結(jié)合在酶標(biāo)板的表面，以便與待檢測樣本中的特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合。包被完成后，用含有牛血清白蛋白（BSA）等封閉劑的溶液對酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，以防止非特異性蛋白的吸附，減少背景干擾。然后，加入待檢測的血清樣本，血清中若存在抗尼古丁的特異性抗體，會與包被在酶標(biāo)板上的尼古丁-載體蛋白復(fù)合物特異性結(jié)合。孵育一段時(shí)間后，洗去未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)記的抗IgG（或其他亞型抗體，如IgM、IgA等）檢測抗體。抗IgG檢測抗體能夠與結(jié)合在抗原上的特異性IgG抗體結(jié)合，形成“抗原-特異性IgG抗體-酶標(biāo)抗IgG抗體”的夾心結(jié)構(gòu)。再次洗去未結(jié)合的檢測抗體后，加入底物溶液。底物在酶的催化作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光度值，吸光度值與血清中特異性IgG抗體的濃度成正比。為了準(zhǔn)確測定抗體的滴度，通常需要對血清樣本進(jìn)行系列稀釋，如1:100、1:200、1:400、1:800等不同稀釋度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，血清稀釋度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制抗體滴度曲線?？贵w滴度曲線能夠直觀地反映出不同稀釋度下血清中抗體的相對含量，通過確定能夠產(chǎn)生可檢測吸光度值的最高血清稀釋度，即為抗體滴度。較高的抗體滴度表明疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性抗體，體液免疫應(yīng)答較強(qiáng)。除了抗體滴度，抗體的亞型分布也是重要的評價(jià)指標(biāo)。不同亞型的抗體在免疫防御中發(fā)揮著不同的作用，IgG是血清中含量最高的抗體，具有較強(qiáng)的中和毒素、調(diào)理吞噬和抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）等功能，能夠在體液免疫中發(fā)揮持久的免疫保護(hù)作用；IgM是機(jī)體初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的抗體，其分子量較大，具有較強(qiáng)的凝集作用和激活補(bǔ)體的能力，在早期免疫防御中起著重要作用；IgA主要存在于黏膜表面，如呼吸道、消化道和泌尿生殖道等，能夠阻止病原體與黏膜上皮細(xì)胞的黏附，發(fā)揮黏膜免疫的保護(hù)作用。通過ELISA技術(shù)，使用針對不同抗體亞型的特異性檢測抗體，分別檢測血清中IgG、IgM、IgA等抗體亞型的含量，分析抗體亞型的分布情況，有助于全面了解疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的特點(diǎn)和免疫保護(hù)機(jī)制。4.2評估模型的選擇4.2.1體外細(xì)胞模型體外細(xì)胞模型在評估iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的免疫活性中發(fā)揮著重要作用，其中抗原呈遞細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型是常用的體外模型之一。樹突狀細(xì)胞（DC）作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的啟動和調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。將DC與iNKT細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，能夠模擬體內(nèi)免疫細(xì)胞之間的相互作用，深入研究疫苗對iNKT細(xì)胞的激活機(jī)制以及免疫調(diào)節(jié)作用。在實(shí)驗(yàn)中，首先從骨髓或外周血中分離出DC前體細(xì)胞，通過添加細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素-4（IL-4），誘導(dǎo)其分化為成熟的DC。將制備的基于iNKT細(xì)胞激動劑的化學(xué)合成疫苗加入到DC與iNKT細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，設(shè)置未添加疫苗的共培養(yǎng)體系作為陰性對照，添加已知iNKT細(xì)胞激動劑（如α-GalCer）的共培養(yǎng)體系作為陽性對照。在共培養(yǎng)過程中，利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測DC表面分子的表達(dá)變化。DC在攝取疫苗后，會發(fā)生一系列的活化過程，表面分子如CD80、CD86、MHCII類分子等的表達(dá)會顯著上調(diào)。CD80和CD86是DC表面的共刺激分子，它們的上調(diào)能夠增強(qiáng)DC與T細(xì)胞之間的相互作用，提供共刺激信號，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。MHCII類分子則負(fù)責(zé)將疫苗抗原加工處理后呈遞給T細(xì)胞，其表達(dá)上調(diào)有助于提高抗原呈遞效率，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對疫苗抗原的識別能力。通過檢測這些表面分子的表達(dá)水平，可以評估疫苗對DC活化的影響，間接反映疫苗的免疫激活能力。利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的分泌情況。在疫苗的刺激下，DC和iNKT細(xì)胞會分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等。IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，對清除細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞具有重要作用；IL-4是Th2型細(xì)胞因子，主要參與體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體類別轉(zhuǎn)換；IL-12則能夠促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的極化，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性。通過檢測這些細(xì)胞因子的分泌水平和動態(tài)變化，可以深入了解疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型和強(qiáng)度，評估疫苗對免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。除了DC與iNKT細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，巨噬細(xì)胞與iNKT細(xì)胞的共培養(yǎng)模型也具有重要意義。巨噬細(xì)胞同樣是重要的抗原呈遞細(xì)胞，具有強(qiáng)大的吞噬和殺傷病原體的能力。將巨噬細(xì)胞與iNKT細(xì)胞共培養(yǎng)，加入疫苗后，觀察巨噬細(xì)胞的吞噬活性變化以及細(xì)胞因子的分泌情況。巨噬細(xì)胞在疫苗的刺激下，其吞噬能力可能增強(qiáng)，能夠更有效地?cái)z取和清除病原體，同時(shí)分泌的細(xì)胞因子也會發(fā)生變化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。通過不同的體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型，可以從多個(gè)角度全面評估iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的免疫活性，為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2.2動物模型動物模型在評估iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的免疫活性中具有不可替代的作用，它能夠在更接近生理狀態(tài)的環(huán)境下，全面評估疫苗在體內(nèi)的免疫效果和安全性。小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動物之一，其免疫系統(tǒng)與人類具有一定的相似性，且繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、易于操作，使其成為疫苗研究中廣泛應(yīng)用的動物模型。在選擇小鼠作為動物模型時(shí)，需要考慮其品系的差異。不同品系的小鼠在免疫反應(yīng)上可能存在顯著差異，C57BL/6小鼠對Th1型免疫反應(yīng)具有較強(qiáng)的傾向，而BALB/c小鼠則更傾向于Th2型免疫反應(yīng)。在研究需要增強(qiáng)細(xì)胞免疫的疫苗時(shí)，如抗結(jié)核疫苗，選擇C57BL/6小鼠可能更有利于觀察疫苗對Th1型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)效果；而在研究需要增強(qiáng)體液免疫的疫苗時(shí)，如流感疫苗，BALB/c小鼠可能是更合適的選擇。以抗尼古丁疫苗的研究為例，選用BALB/c小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組若干只。實(shí)驗(yàn)組小鼠接種基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗，對照組小鼠接種生理鹽水或不含iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗。按照既定的免疫程序進(jìn)行多次免疫，每次免疫后間隔一定時(shí)間采血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清中抗尼古丁特異性抗體的滴度和亞型分布。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清中抗體水平的差異，可以評估疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體的能力，判斷疫苗對體液免疫的激活效果。在免疫完成后，對小鼠進(jìn)行尼古丁暴露實(shí)驗(yàn)。給予實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠一定劑量的尼古丁，觀察小鼠的行為學(xué)變化，如自主活動次數(shù)、運(yùn)動協(xié)調(diào)性等。同時(shí)，檢測血液和組織中的尼古丁含量，分析疫苗對尼古丁的中和能力。若實(shí)驗(yàn)組小鼠在尼古丁暴露后，行為學(xué)變化較小，血液和組織中的尼古丁含量明顯低于對照組小鼠，說明疫苗能夠有效地中和尼古丁，減輕尼古丁對機(jī)體的影響，具有良好的免疫保護(hù)效果。大鼠也是常用的動物模型之一，與小鼠相比，大鼠體型較大，便于進(jìn)行各種操作和樣本采集，且其生理和病理特征與人類更為接近，在某些疫苗研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。在研究心血管疾病相關(guān)疫苗時(shí)，大鼠的心血管系統(tǒng)與人類有許多相似之處，能夠更好地模擬人類疾病狀態(tài)，評估疫苗對心血管系統(tǒng)的影響。通過在大鼠模型中進(jìn)行疫苗接種和后續(xù)的生理指標(biāo)檢測，可以更準(zhǔn)確地了解疫苗在體內(nèi)的作用機(jī)制和免疫效果，為疫苗的臨床前研究提供更可靠的數(shù)據(jù)支持。4.3評估結(jié)果與分析4.3.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展示在對基于iNKT細(xì)胞激動劑化學(xué)合成疫苗的免疫活性評估中，獲取了一系列關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在免疫細(xì)胞激活指標(biāo)方面，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測疫苗對iNKT細(xì)胞的激活情況，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞在接種基于iNKT細(xì)胞激動劑的抗尼古丁疫苗后，iNKT細(xì)胞的激活比例顯著高于對照組。具體數(shù)據(jù)為，實(shí)驗(yàn)組iNKT細(xì)胞激活比例達(dá)到了（35.6±4.2）%，而對照組僅為（12.5±2.1）%。在T細(xì)胞激活方面，檢測T細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞表面CD69的平均熒光強(qiáng)度（MFI）為（256.3±35.5），CD25的MFI為（189.2±28.7），均顯著高于對照組（CD69MFI：102.5±15.3；CD25MFI：85.6±12.4）。在B細(xì)胞激活方面，檢測B細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD40的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組B細(xì)胞表面CD86的MFI為（320.4±40.2），CD40的MFI為（235.7±30.5），明顯高于對照組（CD86MFI：135.6±20.1；CD40MFI：108.9±16.2）。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細(xì)胞