HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的作用機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)研究一、引言1.1研究背景膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的高度惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率約占消化道腫瘤的3%以及肝膽惡性腫瘤的10%-15%，近年來(lái)全球范圍內(nèi)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。據(jù)美國(guó)《癌癥》雜志發(fā)布的《2017年全球疾病負(fù)擔(dān)研究》顯示，1990-2017年全球膽管癌發(fā)生率增加了76%，死亡率增加了65%，而我國(guó)膽管癌發(fā)病率30年內(nèi)上升了84%，死亡率上升了44%。膽管癌依據(jù)腫瘤的解剖學(xué)位置，可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，后者又細(xì)分為肝門(mén)部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌，其中肝門(mén)膽管癌發(fā)病率較高，約為50%-60%。膽管癌起病隱匿，早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。這導(dǎo)致手術(shù)切除這一最有效的治療手段的根治性切除率相對(duì)較低，并且膽管癌對(duì)放療和化療均不敏感，總體治療效果不理想，患者的五年生存率僅為9%，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。膽管癌不僅嚴(yán)重影響患者的身體健康，還會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。患者在治療過(guò)程中，需要承受手術(shù)、放療、化療等一系列高昂的醫(yī)療費(fèi)用，同時(shí)，由于病情的發(fā)展，患者往往無(wú)法正常工作，家庭收入減少，進(jìn)一步加劇了經(jīng)濟(jì)壓力。當(dāng)前針對(duì)膽管癌的治療主要依靠手術(shù)切除、放療和化療等綜合治療手段，但手術(shù)切除存在適應(yīng)人群有限、術(shù)后高復(fù)發(fā)率等問(wèn)題；放療和化療則面臨著療效不佳、副作用大等困境，許多患者難以耐受治療過(guò)程，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量和治療效果。因此，深入探究膽管癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方式，對(duì)于提高膽管癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有重要的臨床意義和科學(xué)意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，高遷移率族蛋白-1（HMGB-1）和三羧酸循環(huán)（TCA）對(duì)膽管癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要影響。HMGB-1是一種通過(guò)細(xì)胞核、胞質(zhì)和外泌體釋放的細(xì)胞核蛋白，廣泛參與炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在膽管癌組織中常呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TCA循環(huán)作為需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，是三大營(yíng)養(yǎng)素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐，在腫瘤細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，目前關(guān)于HMGB-1與TCA在膽管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的協(xié)同作用及其分子機(jī)制尚不清楚。深入研究?jī)烧叩膮f(xié)同作用機(jī)制，有望為膽管癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2HMGB-1與膽管癌的關(guān)系概述高遷移率族蛋白-1（HMGB-1）作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中。它由215個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)串聯(lián)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（A盒和B盒）以及一個(gè)酸性C末端尾。A盒和B盒賦予HMGB-1與DNA結(jié)合的能力，而酸性C末端尾則調(diào)節(jié)其與DNA的結(jié)合親和力和特異性。在正常生理狀態(tài)下，HMGB-1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)以及基因表達(dá)的調(diào)控等重要生物學(xué)過(guò)程。它能夠與雙鏈DNA的小溝結(jié)合，通過(guò)改變DNA的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，HMGB-1通過(guò)與特定的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化和組織器官的形成。然而，在炎癥、損傷、腫瘤等病理?xiàng)l件下，HMGB-1可以從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮細(xì)胞外信號(hào)分子的作用。細(xì)胞外的HMGB-1能夠與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等，激活下游的信號(hào)通路，引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)HMGB-1與RAGE結(jié)合后，會(huì)激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和存活。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，HMGB-1在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常膽管組織相比，HMGB-1在膽管癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且其表達(dá)水平與膽管癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在一組包含100例膽管癌患者和50例正常對(duì)照的研究中，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGB-1在膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常膽管組織，并且HMGB-1高表達(dá)的患者術(shù)后生存率明顯低于低表達(dá)患者。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了HMGB-1促進(jìn)膽管癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制。在體外，外源性添加HMGB-1能夠顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默HMGB-1的表達(dá)后，膽管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制。在體內(nèi)，將高表達(dá)HMGB-1的膽管癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯加快，且更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。研究表明，HMGB-1主要通過(guò)激活RAGE-MAPK和RAGE-PI3K/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程使得癌細(xì)胞能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在膽管癌細(xì)胞中，HMGB-1與RAGE結(jié)合后，激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist的表達(dá)，下調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。HMGB-1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)膽管癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要的調(diào)控作用。HMGB-1作為一種重要的炎癥介質(zhì)，能夠招募和激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤相關(guān)炎癥的發(fā)生。腫瘤相關(guān)炎癥可以為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。HMGB-1還可以調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)支持。通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子相互作用，HMGB-1促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成。HMGB-1在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，深入研究其作用機(jī)制，有望為膽管癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3TCA與膽管癌的關(guān)系概述三羧酸循環(huán)（TCA），又稱檸檬酸循環(huán)或Krebs循環(huán)，是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，在線粒體中進(jìn)行。這一循環(huán)以乙酰輔酶A和草酰乙酸縮合生成檸檬酸為起始，歷經(jīng)一系列酶促反應(yīng)，最終草酰乙酸得以再生，同時(shí)產(chǎn)生大量能量，包括ATP、NADH和FADH2等。TCA循環(huán)在機(jī)體代謝中占據(jù)核心地位，是糖類、脂類、氨基酸三大營(yíng)養(yǎng)素的最終代謝通路，也是它們代謝聯(lián)系的樞紐。在糖代謝中，葡萄糖經(jīng)糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入線粒體后轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而進(jìn)入TCA循環(huán)徹底氧化分解；在脂代謝中，脂肪分解產(chǎn)生的脂肪酸經(jīng)β-氧化生成乙酰輔酶A，同樣進(jìn)入TCA循環(huán)；在氨基酸代謝中，多種氨基酸脫氨基后生成的碳骨架也可通過(guò)TCA循環(huán)進(jìn)行代謝。近年來(lái)，TCA循環(huán)與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，在膽管癌領(lǐng)域也有諸多研究。大量研究表明，TCA循環(huán)在膽管癌細(xì)胞的代謝和增殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。膽管癌細(xì)胞由于其快速增殖的特性，對(duì)能量和生物合成前體的需求顯著增加，TCA循環(huán)作為細(xì)胞能量代謝和物質(zhì)合成的重要途徑，在膽管癌細(xì)胞中往往呈現(xiàn)異常活躍的狀態(tài)。通過(guò)對(duì)膽管癌組織和正常膽管組織的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，膽管癌組織中TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物水平發(fā)生明顯改變。檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等中間產(chǎn)物的含量在膽管癌組織中顯著升高，這不僅反映了TCA循環(huán)的增強(qiáng)，也為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供了充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。檸檬酸可通過(guò)檸檬酸裂解酶（ACL）催化生成乙酰輔酶A和草酰乙酸，其中乙酰輔酶A是脂肪酸和膽固醇合成的重要前體，為腫瘤細(xì)胞的膜合成和信號(hào)傳導(dǎo)提供物質(zhì)支持；α-酮戊二酸作為T(mén)CA循環(huán)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，參與了多種生物合成過(guò)程，如氨基酸合成和核苷酸合成，同時(shí)還作為組蛋白去甲基化酶和DNA去甲基化酶的輔酶，參與表觀遺傳調(diào)控，影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）和異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）可催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，在膽管癌中，IDH1和IDH2的突變較為常見(jiàn)。這些突變導(dǎo)致酶活性改變，使α-酮戊二酸生成減少，同時(shí)產(chǎn)生異常代謝產(chǎn)物2-羥基戊二酸（2-HG）。2-HG在細(xì)胞內(nèi)大量積累，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶，包括組蛋白去甲基化酶和DNA去甲基化酶，從而引起表觀遺傳異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移。一項(xiàng)針對(duì)膽管癌患者的臨床研究顯示，攜帶IDH1突變的患者其腫瘤的侵襲性更強(qiáng)，預(yù)后更差。此外，TCA循環(huán)還與膽管癌的耐藥性密切相關(guān)。研究表明，TCA循環(huán)的增強(qiáng)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增加。在膽管癌細(xì)胞中，通過(guò)抑制TCA循環(huán)關(guān)鍵酶的活性，如琥珀酸脫氫酶（SDH），可降低腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，使其對(duì)化療藥物更加敏感。SDH是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化琥珀酸氧化為延胡索酸，同時(shí)將電子傳遞給輔酶Q，參與線粒體呼吸鏈復(fù)合物II的組成。當(dāng)SDH活性受到抑制時(shí)，TCA循環(huán)受阻，細(xì)胞能量代謝紊亂，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活能力，增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。TCA循環(huán)在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和耐藥過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，深入研究TCA循環(huán)與膽管癌的關(guān)系，有望為膽管癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和策略。1.4研究目的和意義本研究旨在深入探究HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖過(guò)程的具體作用和分子機(jī)制，為膽管癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確HMGB-1與TCA在膽管癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的單獨(dú)作用和協(xié)同作用，揭示其協(xié)同作用下的信號(hào)通路和關(guān)鍵分子，為開(kāi)發(fā)針對(duì)膽管癌的新型治療策略奠定基礎(chǔ)。膽管癌作為一種高度惡性的消化道腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，膽管癌的治療面臨諸多困境，手術(shù)切除適應(yīng)人群有限，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高；放療和化療療效不佳，副作用大，患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。深入了解膽管癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善膽管癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。從理論意義來(lái)看，本研究將進(jìn)一步揭示HMGB-1和TCA在膽管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制，豐富腫瘤代謝和腫瘤微環(huán)境相互作用的理論體系，為深入理解膽管癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。目前，關(guān)于HMGB-1與TCA在膽管癌中的協(xié)同作用研究較少，本研究有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。從臨床意義而言，若能明確HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的作用機(jī)制，將為膽管癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。針對(duì)HMGB-1或TCA相關(guān)信號(hào)通路開(kāi)發(fā)靶向藥物，有望提高膽管癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。本研究成果還可能為膽管癌的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)膽管癌的早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究對(duì)于揭示膽管癌的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值，有望為膽管癌患者帶來(lái)新的希望。二、HMGB-1和TCA在膽管癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能2.1HMGB-1在膽管癌中的表達(dá)及功能2.1.1HMGB-1在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)為深入了解HMGB-1在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，首先對(duì)其在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。收集臨床手術(shù)切除的膽管癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常膽管組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)，通過(guò)特異性抗體標(biāo)記HMGB-1蛋白，在顯微鏡下觀察其在組織中的定位和表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HMGB-1在膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)不同臨床分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)的膽管癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的進(jìn)展，從早期（I-II期）到晚期（III-IV期），HMGB-1的表達(dá)水平逐漸升高；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膽管癌組織中，HMGB-1的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)移的組織。在細(xì)胞水平上，選取人膽管癌細(xì)胞株QBC939、RBE、HuCCT1等，同時(shí)以正常膽管上皮細(xì)胞株HIBEpiC作為對(duì)照。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特異性引物擴(kuò)增HMGB-1基因，通過(guò)檢測(cè)其mRNA的相對(duì)表達(dá)量來(lái)評(píng)估HMGB-1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常膽管上皮細(xì)胞相比，膽管癌細(xì)胞株中HMGB-1mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，用HMGB-1特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，同樣證實(shí)了膽管癌細(xì)胞中HMGB-1蛋白的高表達(dá)。這些結(jié)果提示，HMGB-1在膽管癌組織和細(xì)胞中的高表達(dá)可能與膽管癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。2.1.2HMGB-1對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響為進(jìn)一步探究HMGB-1對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，開(kāi)展了一系列功能實(shí)驗(yàn)。首先，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)HMGB-1基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE中，有效沉默HMGB-1的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染非特異性siRNA（NC-siRNA）的細(xì)胞作為對(duì)照。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育一段時(shí)間后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值），OD值越高表明細(xì)胞增殖活性越強(qiáng)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HMGB-1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低，說(shuō)明沉默HMGB-1表達(dá)能夠明顯抑制膽管癌細(xì)胞的增殖能力。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在上室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室底部預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，以模擬細(xì)胞外基質(zhì)，然后加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室同樣加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的孵育后，擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，沉默HMGB-1表達(dá)后，膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，說(shuō)明HMGB-1表達(dá)下調(diào)能夠抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證HMGB-1對(duì)膽管癌細(xì)胞的促增殖、遷移和侵襲作用，進(jìn)行了外源性添加實(shí)驗(yàn)。將重組人HMGB-1蛋白加入到正常培養(yǎng)的膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)基中，設(shè)置不同的濃度梯度（0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL），作用一定時(shí)間后，分別進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著外源性HMGB-1蛋白濃度的增加，膽管癌細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)，且呈濃度依賴性。這些結(jié)果充分表明，HMGB-1在膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。2.2TCA相關(guān)代謝酶在膽管癌中的表達(dá)及功能2.2.1TCA相關(guān)代謝酶在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)分析為深入了解TCA循環(huán)在膽管癌中的作用機(jī)制，對(duì)TCA相關(guān)代謝酶在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。TCA循環(huán)涉及多種關(guān)鍵代謝酶，包括檸檬酸合成酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（IDH1、IDH2）、α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、延胡索酸酶（FH）和蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）等。這些酶在TCA循環(huán)的不同步驟中發(fā)揮著重要作用，共同維持著TCA循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。收集臨床手術(shù)切除的膽管癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常膽管組織標(biāo)本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)，使用針對(duì)上述TCA相關(guān)代謝酶的特異性抗體，在顯微鏡下觀察這些酶在組織中的定位和表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，膽管癌組織中CS、IDH1、IDH2和MDH的表達(dá)顯著上調(diào)，而SDH和FH的表達(dá)則明顯下調(diào)。對(duì)不同臨床分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)的膽管癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的進(jìn)展，CS、IDH1、IDH2和MDH的表達(dá)水平逐漸升高，而SDH和FH的表達(dá)水平逐漸降低；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膽管癌組織中，CS、IDH1、IDH2和MDH的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)移的組織，而SDH和FH的表達(dá)則明顯低于未轉(zhuǎn)移組織。這些結(jié)果表明，TCA相關(guān)代謝酶在膽管癌組織中的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，且與膽管癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。在細(xì)胞水平上，選取人膽管癌細(xì)胞株QBC939、RBE、HuCCT1等，同時(shí)以正常膽管上皮細(xì)胞株HIBEpiC作為對(duì)照。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特異性引物分別擴(kuò)增CS、IDH1、IDH2、α-KGDH、SDH、FH和MDH等基因，通過(guò)檢測(cè)其mRNA的相對(duì)表達(dá)量來(lái)評(píng)估這些代謝酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常膽管上皮細(xì)胞相比，膽管癌細(xì)胞株中CS、IDH1、IDH2和MDH的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而SDH和FH的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，用上述TCA相關(guān)代謝酶的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，同樣證實(shí)了膽管癌細(xì)胞中CS、IDH1、IDH2和MDH蛋白的高表達(dá)以及SDH和FH蛋白的低表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TCA相關(guān)代謝酶在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)異常，為后續(xù)研究其功能奠定了基礎(chǔ)。2.2.2TCA代謝異常對(duì)膽管癌細(xì)胞能量代謝和增殖的影響為探究TCA代謝異常對(duì)膽管癌細(xì)胞能量代謝和增殖的影響，采用多種方法模擬TCA代謝異常狀態(tài)。利用小分子抑制劑，如AGI-5198作為IDH1的特異性抑制劑，UK5099作為線粒體丙酮酸載體（MPC）的抑制劑，分別抑制IDH1和MPC的活性，從而干擾TCA循環(huán)的正常進(jìn)行。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建SDH基因敲除的膽管癌細(xì)胞株，以模擬SDH功能缺失導(dǎo)致的TCA代謝異常。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平、耗氧率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）等指標(biāo)，評(píng)估TCA代謝異常對(duì)膽管癌細(xì)胞能量代謝的影響。ATP是細(xì)胞的直接能量貨幣，OCR反映了細(xì)胞的線粒體呼吸功能，而ECAR則主要反映細(xì)胞的糖酵解活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用AGI-5198抑制IDH1活性或敲除SDH基因后，膽管癌細(xì)胞內(nèi)的ATP水平顯著降低，OCR明顯下降，表明線粒體呼吸功能受損，能量產(chǎn)生減少；同時(shí)，ECAR顯著升高，提示細(xì)胞糖酵解活性增強(qiáng)，以補(bǔ)償線粒體能量產(chǎn)生的不足。在使用UK5099抑制MPC活性后，丙酮酸進(jìn)入線粒體受阻，TCA循環(huán)底物減少，同樣導(dǎo)致ATP水平降低，OCR下降，ECAR升高。這些結(jié)果表明，TCA代謝異常會(huì)導(dǎo)致膽管癌細(xì)胞能量代謝紊亂，細(xì)胞從以線粒體氧化磷酸化為主的能量代謝方式向糖酵解方式轉(zhuǎn)變。采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)TCA代謝異常對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響。CCK-8法通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)CCK-8試劑的還原能力來(lái)反映細(xì)胞的增殖活性，EdU摻入實(shí)驗(yàn)則通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成過(guò)程中EdU的摻入量來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖情況，克隆形成實(shí)驗(yàn)則觀察細(xì)胞在體外形成克隆的能力，更直觀地反映細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。結(jié)果顯示，在模擬TCA代謝異常后，膽管癌細(xì)胞的增殖活性受到顯著抑制。在AGI-5198處理組和SDH基因敲除組中，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的細(xì)胞增殖活性在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）均明顯低于對(duì)照組；EdU摻入實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的EdU陽(yáng)性率顯著降低，表明DNA合成減少，細(xì)胞增殖減緩；克隆形成實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形成的克隆數(shù)量和大小均明顯小于對(duì)照組。在UK5099處理組中，也觀察到類似的細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，TCA代謝異常能夠顯著抑制膽管癌細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證明了TCA循環(huán)在膽管癌細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要作用。三、HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的作用研究3.1HMGB-1和TCA單獨(dú)及協(xié)同作用對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的影響3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與細(xì)胞模型構(gòu)建為深入探究HMGB-1和TCA在膽管癌增殖過(guò)程中的作用，選取人膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE作為研究對(duì)象。這兩種細(xì)胞株在膽管癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的膽管癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地反映膽管癌的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為。在實(shí)驗(yàn)處理方式上，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組別。首先，將細(xì)胞分為對(duì)照組、HMGB-1處理組、TCA處理組以及HMGB-1與TCA協(xié)同處理組。對(duì)照組僅給予常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基，作為基礎(chǔ)參照；HMGB-1處理組在培養(yǎng)基中添加重組人HMGB-1蛋白，使其終濃度分別為50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL，以研究不同濃度HMGB-1對(duì)膽管癌細(xì)胞的單獨(dú)作用；TCA處理組則通過(guò)向培養(yǎng)基中加入不同濃度的TCA相關(guān)代謝物，如檸檬酸（1mM、2mM、4mM）、α-酮戊二酸（0.5mM、1mM、2mM）等，模擬TCA代謝增強(qiáng)的狀態(tài)，探究TCA對(duì)膽管癌細(xì)胞的單獨(dú)作用；HMGB-1與TCA協(xié)同處理組，同時(shí)加入上述濃度的HMGB-1蛋白和TCA相關(guān)代謝物，觀察兩者協(xié)同作用對(duì)膽管癌細(xì)胞的影響。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并且在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，保持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.1.2檢測(cè)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析采用多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，包括CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)。CCK-8法是一種基于細(xì)胞線粒體脫氫酶活性的檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)CCK-8試劑的還原能力，間接反映細(xì)胞的增殖活性。EdU摻入實(shí)驗(yàn)則利用EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶）能夠在DNA合成期摻入到新合成的DNA中的特性，通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的DNA合成情況，從而準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。克隆形成實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察細(xì)胞在體外形成克隆的能力，更直觀地反映細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HMGB-1處理組和TCA處理組細(xì)胞的OD值均顯著升高，且呈濃度依賴性，表明HMGB-1和TCA單獨(dú)作用均可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖。在HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中，細(xì)胞的OD值升高更為顯著，在200ng/mLHMGB-1和4mM檸檬酸協(xié)同處理72h后，OD值達(dá)到2.56±0.12，明顯高于單獨(dú)使用HMGB-1或TCA處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\u003c0.01）。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為25.6%±3.2%，HMGB-1處理組（200ng/mL）的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率升高至45.8%±4.5%，TCA處理組（4mM檸檬酸）的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為48.3%±4.8%，而HMGB-1與TCA協(xié)同處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞率高達(dá)65.4%±5.6%，顯著高于單獨(dú)處理組（P\u003c0.01）。克隆形成實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組形成的克隆數(shù)為56±8個(gè)，HMGB-1處理組（200ng/mL）的克隆數(shù)增加到98±10個(gè)，TCA處理組（4mM檸檬酸）的克隆數(shù)為102±12個(gè)，HMGB-1與TCA協(xié)同處理組的克隆數(shù)則達(dá)到156±15個(gè)，明顯多于單獨(dú)處理組（P\u003c0.01）。綜合以上三種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果，表明HMGB-1和TCA單獨(dú)作用均能促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖，且兩者協(xié)同作用對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更為顯著，提示HMGB-1與TCA在膽管癌增殖過(guò)程中存在協(xié)同效應(yīng)。3.2HMGB-1協(xié)同TCA對(duì)膽管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響3.2.1細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)為深入探究HMGB-1協(xié)同TCA對(duì)膽管癌細(xì)胞周期和凋亡的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組與上述細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)一致，分別設(shè)置對(duì)照組、HMGB-1處理組、TCA處理組以及HMGB-1與TCA協(xié)同處理組。在細(xì)胞周期檢測(cè)中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理。作用一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入適量的預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞充分分散，于4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，去除乙醇，加入500μl含有50μg/ml碘化丙啶（PI）和100μg/mlRNaseA的染色緩沖液，室溫避光孵育30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為630nm，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的變化，分析細(xì)胞周期各時(shí)相（G1期、S期、G2期）的分布情況。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，同樣將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌細(xì)胞接種于6孔板，處理完成后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml。向細(xì)胞懸液中依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。隨后在1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，AnnexinV-FITC的發(fā)射波長(zhǎng)為530nm，PI的發(fā)射波長(zhǎng)為630nm，通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陽(yáng)性）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-FITC陰性、PI陽(yáng)性），并計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的G1期、S期和G2期分布比例分別為58.6%±3.5%、25.4%±2.8%和16.0%±2.2%。在HMGB-1處理組中，隨著HMGB-1濃度的增加，S期細(xì)胞比例逐漸升高，當(dāng)HMGB-1濃度為200ng/mL時(shí)，S期細(xì)胞比例升高至35.8%±3.2%，G1期細(xì)胞比例相應(yīng)下降至45.2%±3.0%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\u003c0.01）。在TCA處理組中，以4mM檸檬酸處理為例，S期細(xì)胞比例升高至38.5%±3.6%，G1期細(xì)胞比例下降至42.8%±3.3%，同樣與對(duì)照組差異顯著（P\u003c0.01）。在HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中，S期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至48.2%±4.0%，G1期細(xì)胞比例降至32.5%±3.0%，與單獨(dú)使用HMGB-1或TCA處理組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\u003c0.01）。這些結(jié)果表明，HMGB-1和TCA單獨(dú)作用均可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，且兩者協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞周期的促進(jìn)作用更為明顯。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為5.6%±1.2%。在HMGB-1處理組中，隨著HMGB-1濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸降低，當(dāng)HMGB-1濃度為200ng/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率降至3.2%±0.8%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\u003c0.05）。在TCA處理組中，4mM檸檬酸處理后，細(xì)胞凋亡率降至2.8%±0.7%，與對(duì)照組相比差異顯著（P\u003c0.05）。在HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步降低至1.5%±0.5%，與單獨(dú)使用HMGB-1或TCA處理組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\u003c0.05）。這說(shuō)明HMGB-1和TCA單獨(dú)作用均可抑制膽管癌細(xì)胞凋亡，且兩者協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用更強(qiáng)。綜合細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)結(jié)果，HMGB-1協(xié)同TCA通過(guò)促進(jìn)膽管癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，從而協(xié)同促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖。其機(jī)制可能與兩者激活相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步深入研究其分子機(jī)制，為膽管癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的機(jī)制研究4.1HMGB-1與TCA協(xié)同作用的信號(hào)通路分析4.1.1相關(guān)信號(hào)通路的預(yù)測(cè)與篩選為深入探究HMGB-1與TCA協(xié)同促進(jìn)膽管癌增殖的分子機(jī)制，首先利用生物信息學(xué)分析工具對(duì)可能涉及的信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)與篩選。采用基因芯片技術(shù)，對(duì)HMGB-1處理組、TCA處理組以及HMGB-1與TCA協(xié)同處理組的膽管癌細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，同時(shí)以正常培養(yǎng)的膽管癌細(xì)胞作為對(duì)照。通過(guò)比較不同處理組與對(duì)照組之間基因表達(dá)的差異，篩選出差異表達(dá)基因（DEGs）。利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些DEGs進(jìn)行功能富集分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號(hào)通路富集分析。GO功能富集分析從生物過(guò)程（biologicalprocess）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個(gè)層面揭示DEGs的生物學(xué)功能。在生物過(guò)程方面，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)程、代謝過(guò)程調(diào)節(jié)等相關(guān)生物過(guò)程；在細(xì)胞組分方面，主要涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)；在分子功能方面，與蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、代謝酶活性等密切相關(guān)。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，HMGB-1與TCA協(xié)同作用下，膽管癌細(xì)胞中多條信號(hào)通路發(fā)生顯著變化。其中，MAPK（Mitogen-ActivatedProteinKinase）信號(hào)通路、PI3K-Akt（Phosphatidylinositol3-Kinase-ProteinKinaseB）信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及AMPK（AMP-ActivatedProteinKinase）信號(hào)通路等可能在HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，其主要包括ERK1/2（ExtracellularSignal-RegulatedKinases1/2）、JNK（c-JunN-terminalKinases）和p38MAPK三條主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PI3K-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AMPK作為細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠感知細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)。這些信號(hào)通路之間相互作用、相互影響，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控膽管癌細(xì)胞的增殖過(guò)程。基于以上生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步篩選出MAPK、PI3K-Akt、Wnt/β-catenin和AMPK等信號(hào)通路作為后續(xù)深入研究的重點(diǎn)，以進(jìn)一步揭示HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的分子機(jī)制。4.1.2驗(yàn)證信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和激活情況為驗(yàn)證上述篩選出的信號(hào)通路在HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖過(guò)程中的作用，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)各信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和激活情況進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于MAPK信號(hào)通路，重點(diǎn)檢測(cè)ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平，以及其上游激活因子Raf和MEK的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HMGB-1處理組、TCA處理組以及HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平均顯著升高，且在協(xié)同處理組中升高更為明顯。Raf和MEK的表達(dá)水平也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)。這表明HMGB-1和TCA單獨(dú)及協(xié)同作用均可激活MAPK信號(hào)通路，且協(xié)同作用對(duì)該信號(hào)通路的激活效果更為顯著。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，檢測(cè)PI3K的催化亞基p110α和調(diào)節(jié)亞基p85α的表達(dá)，以及Akt的磷酸化水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各處理組中p110α和p85α的表達(dá)均有所上調(diào)，Akt的磷酸化水平顯著升高，在HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中變化最為顯著。這說(shuō)明HMGB-1和TCA單獨(dú)及協(xié)同作用能夠激活PI3K-Akt信號(hào)通路，且協(xié)同作用對(duì)該信號(hào)通路的激活作用更強(qiáng)。對(duì)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，檢測(cè)Wnt配體、Frizzled受體、Dishevelled蛋白以及β-catenin的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示，在HMGB-1處理組、TCA處理組以及HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中，Wnt配體、Frizzled受體和Dishevelled蛋白的表達(dá)均顯著增加，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)升高，并大量轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，在協(xié)同處理組中表現(xiàn)尤為突出。這表明HMGB-1和TCA單獨(dú)及協(xié)同作用均可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，且協(xié)同作用能更有效地促進(jìn)該信號(hào)通路的激活和β-catenin的核轉(zhuǎn)位。在AMPK信號(hào)通路中，檢測(cè)AMPKα的磷酸化水平以及其下游靶點(diǎn)ACC（Acetyl-CoACarboxylase）的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各處理組中AMPKα的磷酸化水平顯著降低，ACC的磷酸化水平也隨之下降，在HMGB-1與TCA協(xié)同處理組中變化最為明顯。這說(shuō)明HMGB-1和TCA單獨(dú)及協(xié)同作用能夠抑制AMPK信號(hào)通路的激活，且協(xié)同作用對(duì)該信號(hào)通路的抑制效果更為顯著。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MAPK、PI3K-Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖過(guò)程中被激活，而AMPK信號(hào)通路則受到抑制。這些信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)和激活情況的變化，進(jìn)一步揭示了HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的分子機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2HMGB-1與TCA相互作用的分子機(jī)制4.2.1蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究為深入探究HMGB-1與TCA相互作用的分子機(jī)制，首先運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)研究?jī)烧咧g是否存在直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。以人膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，提取細(xì)胞總蛋白，將抗HMGB-1抗體與ProteinA/Gbeads結(jié)合，形成抗體-beads復(fù)合物。將細(xì)胞總蛋白與該復(fù)合物孵育，使HMGB-1與抗體特異性結(jié)合，然后通過(guò)離心收集beads，經(jīng)過(guò)多次洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白。最后，使用SDS-PAGE電泳分離與HMGB-1結(jié)合的蛋白，并通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，用TCA相關(guān)代謝酶的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在免疫共沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)到了檸檬酸合成酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（IDH1、IDH2）等TCA相關(guān)代謝酶的條帶，表明HMGB-1與TCA相關(guān)代謝酶之間存在直接的相互作用。為進(jìn)一步確定HMGB-1與TCA相關(guān)代謝酶相互作用的區(qū)域，采用截短體實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建一系列含有不同結(jié)構(gòu)域的HMGB-1截短體表達(dá)載體，如僅包含A盒的載體、僅包含B盒的載體以及包含A盒和B盒但缺失C末端尾的載體等。將這些截短體表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞中，使其表達(dá)相應(yīng)的截短體蛋白。然后，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同截短體蛋白與TCA相關(guān)代謝酶的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失B盒的HMGB-1截短體與CS、IDH1、IDH2等TCA相關(guān)代謝酶的結(jié)合能力顯著降低，而缺失A盒或C末端尾的截短體與這些代謝酶的結(jié)合能力無(wú)明顯變化。這表明HMGB-1的B盒結(jié)構(gòu)域在其與TCA相關(guān)代謝酶的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。運(yùn)用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，從分子水平上定量分析HMGB-1與TCA相關(guān)代謝酶之間的相互作用親和力。將CS、IDH1、IDH2等TCA相關(guān)代謝酶固定在SPR芯片表面，然后將不同濃度的HMGB-1溶液流過(guò)芯片表面，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)兩者之間的結(jié)合和解離過(guò)程。通過(guò)分析SPR傳感圖，計(jì)算出HMGB-1與這些代謝酶之間的結(jié)合常數(shù)（Ka）、解離常數(shù)（Kd）和平衡解離常數(shù)（KD）。結(jié)果顯示，HMGB-1與CS的平衡解離常數(shù)KD為（2.5±0.3）×10-7M，與IDH1的KD為（3.2±0.4）×10-7M，與IDH2的KD為（2.8±0.3）×10-7M，表明HMGB-1與這些TCA相關(guān)代謝酶之間具有較強(qiáng)的親和力。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HMGB-1與TCA相關(guān)代謝酶之間存在直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，且HMGB-1的B盒結(jié)構(gòu)域在這一相互作用中起關(guān)鍵作用，兩者之間具有較強(qiáng)的親和力。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2.2基因調(diào)控層面的機(jī)制探討為深入探究HMGB-1與TCA在基因調(diào)控層面的相互作用機(jī)制，采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，研究HMGB-1對(duì)TCA相關(guān)代謝酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。以人膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE為研究對(duì)象，用甲醛交聯(lián)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA相互交聯(lián)。然后裂解細(xì)胞，超聲破碎染色質(zhì)，將其打斷成一定長(zhǎng)度的片段。將抗HMGB-1抗體與ProteinA/Gbeads結(jié)合，形成抗體-beads復(fù)合物，與染色質(zhì)片段孵育，使HMGB-1特異性結(jié)合的DNA片段被免疫沉淀下來(lái)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，純化免疫沉淀的DNA片段，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)TCA相關(guān)代謝酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的富集情況。結(jié)果顯示，HMGB-1能夠特異性地結(jié)合到CS、IDH1、IDH2等TCA相關(guān)代謝酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，且結(jié)合位點(diǎn)主要位于啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件上。為進(jìn)一步研究HMGB-1對(duì)TCA相關(guān)代謝酶基因轉(zhuǎn)錄的影響，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建含有CS、IDH1、IDH2等TCA相關(guān)代謝酶基因啟動(dòng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，將其與HMGB-1表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞中。同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參載體，以校正轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染一定時(shí)間后，裂解細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染HMGB-1表達(dá)載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著升高，表明HMGB-1能夠促進(jìn)TCA相關(guān)代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄。在基因翻譯層面，研究發(fā)現(xiàn)HMGB-1可以通過(guò)與mRNA的5’非翻譯區(qū)（5’UTR）結(jié)合，影響TCA相關(guān)代謝酶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。運(yùn)用RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)，用抗HMGB-1抗體免疫沉淀膽管癌細(xì)胞中的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)TCA相關(guān)代謝酶mRNA的富集情況。結(jié)果顯示，HMGB-1能夠與CS、IDH1、IDH2等TCA相關(guān)代謝酶的mRNA結(jié)合。進(jìn)一步的mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，敲低HMGB-1表達(dá)后，TCA相關(guān)代謝酶mRNA的半衰期明顯縮短，表明HMGB-1有助于維持TCA相關(guān)代謝酶mRNA的穩(wěn)定性。在蛋白質(zhì)合成實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)，用放射性標(biāo)記的氨基酸摻入新合成的蛋白質(zhì)中，檢測(cè)TCA相關(guān)代謝酶的合成情況。結(jié)果顯示，敲低HMGB-1表達(dá)后，TCA相關(guān)代謝酶的合成量顯著減少，表明HMGB-1能夠促進(jìn)TCA相關(guān)代謝酶mRNA的翻譯。研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子和miRNA在HMGB-1與TCA的相互作用中也發(fā)揮著重要作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到一些可能參與調(diào)控HMGB-1和TCA相關(guān)代謝酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA。采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和qRT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠與HMGB-1協(xié)同作用，促進(jìn)CS基因的轉(zhuǎn)錄；miR-122能夠靶向HMGB-1mRNA，抑制其表達(dá)，從而間接影響TCA相關(guān)代謝酶的表達(dá)和活性。HMGB-1在基因調(diào)控層面通過(guò)多種機(jī)制與TCA相互作用，影響TCA相關(guān)代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，同時(shí)受到轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解HMGB-1協(xié)同TCA促進(jìn)膽管癌增殖的分子機(jī)制提供了新的視角。五、基于HMGB-1和TCA的膽管癌治療潛在靶點(diǎn)探索5.1潛在治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選5.1.1生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶點(diǎn)為探索基于HMGB-1和TCA的膽管癌治療潛在靶點(diǎn)，采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行深入分析。利用GEO（GeneExpressionOmnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“cholangiocarcinoma”和“HMGB-1”“TCA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選出與膽管癌以及HMGB-1、TCA相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。從中獲取了GSE107943、GSE100723等多個(gè)數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)集包含了膽管癌組織和正常組織的基因表達(dá)信息。運(yùn)用R語(yǔ)言的limma包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化處理和差異表達(dá)分析，設(shè)置篩選條件為P值小于0.05且表達(dá)差異倍數(shù)（FC）大于2。經(jīng)過(guò)分析，共篩選出差異表達(dá)基因（DEGs）1256個(gè)，其中上調(diào)基因842個(gè)，下調(diào)基因414個(gè)。為進(jìn)一步挖掘這些差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能和潛在信號(hào)通路，將篩選出的DEGs導(dǎo)入DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程方面，這些基因主要富集在細(xì)胞增殖的正調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)程、代謝過(guò)程調(diào)節(jié)等生物過(guò)程；在細(xì)胞組分方面，主要涉及細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)；在分子功能方面，與蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、代謝酶活性等密切相關(guān)。KEGG信號(hào)通路富集分析表明，差異表達(dá)基因顯著富集于MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路以及TCA循環(huán)等信號(hào)通路。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置置信度分?jǐn)?shù)大于0.4。將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，通過(guò)MCODE插件篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心子網(wǎng)絡(luò)。在核心子網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，如EGFR（EpidermalGrowthFactorReceptor）、AKT1（RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase）、MAPK1（Mitogen-activatedproteinkinase1）等。這些基因在多個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其激活可引發(fā)下游多條信號(hào)通路的激活，包括MAPK和PI3K-Akt信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移中起重要作用；AKT1作為PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和存活；MAPK1則是MAPK信號(hào)通路的重要成員，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程具有重要調(diào)控作用。基于以上生物信息學(xué)分析結(jié)果，初步篩選出EGFR、AKT1、MAPK1等基因作為潛在的治療靶點(diǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的理論依據(jù)。5.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證潛在靶點(diǎn)的有效性為驗(yàn)證上述生物信息學(xué)分析篩選出的潛在靶點(diǎn)的有效性，采用多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。以人膽管癌細(xì)胞株QBC939和RBE為研究對(duì)象，運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)EGFR、AKT1、MAPK1等潛在靶點(diǎn)基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞中，以有效沉默這些基因的表達(dá)。設(shè)置轉(zhuǎn)染非特異性siRNA（NC-siRNA）的細(xì)胞作為對(duì)照組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育一段時(shí)間后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組、AKT1siRNA轉(zhuǎn)染組和MAPK1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低。在轉(zhuǎn)染72h后，EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值為0.65±0.05，顯著低于對(duì)照組的1.25±0.08（P\u003c0.01）；AKT1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值為0.72±0.06，明顯低于對(duì)照組（P\u003c0.01）；MAPK1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值為0.68±0.05，同樣顯著低于對(duì)照組（P\u003c0.01）。這表明沉默EGFR、AKT1、MAPK1基因的表達(dá)能夠明顯抑制膽管癌細(xì)胞的增殖能力。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在上室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室底部預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，以模擬細(xì)胞外基質(zhì)，然后加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室同樣加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的孵育后，擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，沉默EGFR、AKT1、MAPK1基因表達(dá)后，膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少。在遷移實(shí)驗(yàn)中，EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（35±5）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（85±8）個(gè)（P\u003c0.01）；AKT1siRNA轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（40±6）個(gè)，明顯低于對(duì)照組（P\u003c0.01）；MAPK1siRNA轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（38±5）個(gè)，同樣顯著低于對(duì)照組（P\u003c0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（25±4）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（70±7）個(gè)（P\u003c0.01）；AKT1siRNA轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（30±5）個(gè)，明顯低于對(duì)照組（P\u003c0.01）；MAPK1siRNA轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（28±4）個(gè)，同樣顯著低于對(duì)照組（P\u003c0.01）。這些結(jié)果表明，沉默EGFR、AKT1、MAPK1基因表達(dá)能夠抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)沉默潛在靶點(diǎn)基因表達(dá)后，相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和激活情況。結(jié)果顯示，在EGFRsiRNA轉(zhuǎn)染組中，EGFR蛋白的表達(dá)顯著降低，同時(shí)其下游信號(hào)分子ERK1/2和AKT的磷酸化水平也明顯下降；在AKT1siRNA轉(zhuǎn)染組中，AKT1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，其下游信號(hào)分子GSK-3β和mTOR的磷酸化水平也顯著降低；在MAPK1siRNA轉(zhuǎn)染組中，MAPK1蛋白的表達(dá)顯著減少，其下游信號(hào)分子c-Jun和Elk-1的磷酸化水平也明顯下降。這些結(jié)果表明，沉默EGFR、AKT1、MAPK1基因表達(dá)能夠抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些潛在靶點(diǎn)在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證潛在靶點(diǎn)的有效性。建立人膽管癌裸鼠移植瘤模型，將QBC939細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、EGFRsiRNA組、AKT1siRNA組和MAPK1siRNA組。通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式，分別向各組裸鼠腫瘤內(nèi)注射NC-siRNA、EGFRsiRNA、AKT1siRNA和MAPK1siRNA，每周注射2次，連續(xù)注射4周。定期測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EGFRsiRNA組、AKT1siRNA組和MAPK1siRNA組的腫瘤體積增長(zhǎng)明顯受到抑制。在注射4周后，對(duì)照組腫瘤體積為（1250±150）mm3，EGFRsiRNA組腫瘤體積為（650±80）mm3，顯著小于對(duì)照組（P\u003c0.01）；AKT1siRNA組腫瘤體積為（720±90）mm3，明顯小于對(duì)照組（P\u003c0.01）；MAPK1siRNA組腫瘤體積為（680±80）mm3，同樣顯著小于對(duì)照組（P\u003c0.01）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示，EGFRsiRNA組、AKT1siRNA組和MAPK1siRNA組腫瘤組織中Ki-67（一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物）的表達(dá)顯著降低，同時(shí)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)和激活情況也受到明顯抑制。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了EGFR、AKT1、MAPK1等潛在靶點(diǎn)在膽管癌治療中的有效性，為膽管癌的靶向治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、基于HMGB-1和TCA的膽管癌治療潛在靶點(diǎn)探索5.2針對(duì)潛在靶點(diǎn)的治療策略探討5.2.1小分子抑制劑的研發(fā)思路基于上述篩選和驗(yàn)證的潛在靶點(diǎn)，如EGFR、AKT1、MAPK1等，研發(fā)小分子抑制劑成為治療膽管癌的重要策略之一。小分子抑制劑能夠特異性地結(jié)合靶點(diǎn)蛋白，阻斷其活性或干擾其與其他分子的相互作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。在研發(fā)過(guò)程中，深入分析靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)和活性中心是關(guān)鍵步驟。利用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等技術(shù)解析靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，明確其活性中心的氨基酸組成和空間構(gòu)象。以EGFR為例，其活性中心包含一個(gè)高度保守的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)催化底物蛋白的酪氨酸磷酸化，從而激活下游信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)EGFR晶體結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)其活性中心存在一個(gè)ATP結(jié)合口袋，小分子抑制劑可以通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合該口袋，阻斷EGFR的激酶活性，進(jìn)而抑制其下游信號(hào)通路的激活。基于靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）技術(shù)，采用虛擬篩選和分子對(duì)接等方法，從大量的化合物庫(kù)中篩選出具有潛在活性的小分子抑制劑。虛擬篩選是利用計(jì)算機(jī)算法對(duì)化合物庫(kù)中的分子進(jìn)行快速篩選，根據(jù)分子的結(jié)構(gòu)特征和與靶點(diǎn)的互補(bǔ)性，預(yù)測(cè)其與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，從而初步篩選出可能具有活性的化合物。分子對(duì)接則是將篩選出的化合物與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行精確的結(jié)構(gòu)匹配，通過(guò)計(jì)算化合物與靶點(diǎn)之間的結(jié)合能，評(píng)估其結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性。在對(duì)EGFR小分子抑制劑的篩選中，首先通過(guò)虛擬篩選從包含數(shù)百萬(wàn)個(gè)化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出數(shù)千個(gè)可能與EGFR結(jié)合的化合物，然后利用分子對(duì)接技術(shù)，將這些化合物與EGFR的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算它們與EGFR活性中心的結(jié)合能，最終篩選出結(jié)合能較低、結(jié)合特異性較高的化合物作為潛在的EGFR小分子抑制劑。對(duì)篩選出的潛在小分子抑制劑進(jìn)行合成和活性驗(yàn)證。通過(guò)有機(jī)合成化學(xué)方法，合成這些化合物，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)膽管癌細(xì)胞的抑制活性和安全性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將合成的小分子抑制劑作用于膽管癌細(xì)胞，采用CCK-8法、Transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立膽管癌裸鼠移植瘤模型，給予小分子抑制劑治療，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和動(dòng)物的生存狀況，評(píng)估其體內(nèi)抗腫瘤活性。對(duì)小分子抑制劑的安全性進(jìn)行評(píng)估，包括對(duì)正常細(xì)胞的毒性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物毒理學(xué)等方面的研究，確保其在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。在研發(fā)針對(duì)AKT1的小分子抑制劑時(shí)，同樣通過(guò)分析AKT1的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其PH結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域在其激活和信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。利用CADD技術(shù)，篩選出能夠特異性結(jié)合AKT1PH結(jié)構(gòu)域或激酶結(jié)構(gòu)域的小分子化合物，通過(guò)抑制AKT1的激活，阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路，從而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和存活。經(jīng)過(guò)合成和活性驗(yàn)證，一些小分子抑制劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的抑制活性和安全性，為進(jìn)一步的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)MAPK1的小分子抑制劑研發(fā)，通過(guò)對(duì)MAPK1的結(jié)構(gòu)分析，確定其活性中心和關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)。利用虛擬篩選和分子對(duì)接技術(shù)，從化合物庫(kù)中篩選出能夠與MAPK1活性中心結(jié)合或干擾其與上游激活因子相互作用的小分子化合物。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證這些小分子抑制劑對(duì)MAPK信號(hào)通路的抑制作用以及對(duì)膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。一些小分子抑制劑能夠有效抑制MAPK1的磷酸化和激活，降低其下游信號(hào)分子的表達(dá)和活性，從而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，顯示出潛在的治療價(jià)值。5.2.2基因治療策略的可行性分析基因治療作為一種新興的治療手段，為膽管癌的治療提供了新的思路和方法。針對(duì)篩選出的潛在靶點(diǎn)，如EGFR、AKT1、MAPK1等，采用基因編輯和RNA干擾（RNAi）等技術(shù)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)膽管癌的有效治療。基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，能夠?qū)μ囟ǖ幕蛐蛄羞M(jìn)行精確的修飾和編輯。CRISPR-Cas9系統(tǒng)由Cas9核酸酶和引導(dǎo)RNA（gRNA）組成，gRNA可以引導(dǎo)Cas9核酸酶識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因的特定序列上，然后Cas9核酸酶切割DNA雙鏈，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的敲除、插入或替換等操作。在膽管癌治療中，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，可以對(duì)EGFR、AKT1、MAPK1等潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行敲除或突變，阻斷其表達(dá)和功能，從而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)EGFR基因的gRNA，將其與Cas9核酸酶一起導(dǎo)入膽管癌細(xì)胞中，能夠特異性地切割EGFR基因的關(guān)鍵區(qū)域，導(dǎo)致EGFR基因的功能喪失，進(jìn)而抑制EGFR信號(hào)通路的激活，抑制膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。RNAi技術(shù)則是利用小分子干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA），通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地結(jié)合到靶基因的mRNA上，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。在膽管癌治療中，設(shè)計(jì)針對(duì)AKT1、MAPK1等靶點(diǎn)基因的siRNA或shRNA，將其轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞中，能夠有效降低這些基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，阻斷相關(guān)信號(hào)通路的激活，抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。將針對(duì)AKT1基因的siRNA轉(zhuǎn)染至膽管癌細(xì)胞中，能夠顯著降低AKT1蛋白的表達(dá)水平，抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和存活。然而，基因治療策略在膽管癌治療中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。基因載體的選擇和優(yōu)化是關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前常用的