IL-17介導上皮間皮轉(zhuǎn)化驅(qū)動胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。據(jù)2020年數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率和死亡率分別居全球第5位和第4位。在中國，胃癌的形勢更為嚴峻，每年新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，且大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療難度大，死亡率顯著增加。例如，同濟大學附屬東方醫(yī)院Ⅰ期臨床中心副主任薛俊麗教授指出，中國胃癌患者早期診斷率亟需提升，原本胃癌高發(fā)年齡段集中在50歲至60歲，但隨著生活節(jié)奏加快和生活壓力增大，年輕人不良飲食習慣增多，胃癌發(fā)病風險增加，臨床中已有18歲年輕人罹患胃癌的案例。早期胃癌和晚期胃癌患者的治療生存和現(xiàn)狀差異巨大，黏膜內(nèi)的早癌患者可以治愈，而晚期胃癌患者生存期往往不超過1年。胃癌的發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果，其中炎癥反應在其發(fā)展歷程中意義重大。炎癥細胞分泌的炎癥因子可誘發(fā)一系列炎癥反應，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進瘤內(nèi)血管生成，誘導腫瘤的生長。白細胞介素17（interleukin17，IL-17）作為一種由T輔助細胞17（Thelpercell17，Th17）特異性分泌的細胞因子，其表達升高與多種炎性疾病、免疫類疾病以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，IL-17在胃癌組織及胃癌患者外周血中的表達均明顯升高，且可促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移。例如，幽門螺桿菌感染可引起大鼠胃黏膜損傷，增加胃內(nèi)IL-17的水平，進一步加重胃黏膜損傷，為胃癌的發(fā)展埋下隱患；IL-17還可上調(diào)血管內(nèi)皮生成因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進腫瘤血管生成，并介導腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮細胞失去極性，獲得間質(zhì)細胞特性的過程，這一過程在腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細胞“褪去”已分化細胞的特性，如細胞間的粘附現(xiàn)象、細胞極性現(xiàn)象、細胞缺乏運動能力等，獲得間質(zhì)細胞的特征，如細胞具備移動能力、侵襲能力、抗凋亡能力等。越來越多的研究表明，EMT過程與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移播散以及對藥物或治療的抗性等性狀密切相關(guān)。目前，雖然對胃癌的治療有了一定進展，包括傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療以及新興的靶向治療、免疫治療等，但患者的總體生存率仍然較低。深入研究IL-17與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，特別是IL-17是否通過上皮間皮轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，對于揭示胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找新的治療靶點和策略具有重要意義。如果能夠明確IL-17在這一過程中的具體作用機制，有望為胃癌的治療提供新的方向，改善胃癌患者的預后，具有重要的臨床應用價值和社會意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，對于IL-17與腫瘤關(guān)系的研究起步較早且成果豐碩。IL-17在多種腫瘤微環(huán)境中被證實扮演著重要角色。如在乳腺癌的研究中，國外團隊發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中IL-17的高表達與腫瘤細胞的增殖、遷移能力增強密切相關(guān)，進一步研究揭示其可通過激活相關(guān)信號通路來實現(xiàn)這一作用。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，IL-17同樣被報道能促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機制涉及對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的調(diào)節(jié)以及對腫瘤細胞自身生物學行為的改變。針對IL-17與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究，國外學者也取得了諸多成果。有研究表明，IL-17可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生成因子（VEGF）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進胃癌血管生成，并介導腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移。VEGF作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，在增加血管通透性、細胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖等方面發(fā)揮重要作用，IL-17可以通過上調(diào)VEGF的表達來誘導胃癌血管生成促進腫瘤發(fā)展。此外，IL-17還可刺激胃上皮細胞產(chǎn)生MMP9和MMP3，當阻斷IL-17時，幽門螺桿菌感染后胃組織中MMP9表達顯著降低。關(guān)于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），國外研究已經(jīng)深入到分子機制層面。研究發(fā)現(xiàn)，多種信號通路參與調(diào)控EMT過程，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、Notch、Wnt等信號通路。TGF-β信號通路可通過Smad和非Smad信號通路誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT，在這個過程中，TGF-β與細胞表面受體結(jié)合，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進入細胞核與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，EMT使上皮細胞失去極性，獲得間質(zhì)細胞特性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，這一過程與腫瘤的不良預后密切相關(guān)。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在不斷推進。在IL-17與胃癌的研究方面，國內(nèi)團隊通過對胃癌組織及患者外周血的檢測分析，進一步證實了IL-17在胃癌組織及胃癌患者外周血中的表達均明顯升高，且與胃癌的臨床病理特征如腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在相關(guān)性。有研究通過體外細胞實驗和動物實驗，深入探討了IL-17對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)IL-17可以促進胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其作用機制可能與激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路有關(guān)。對于EMT在胃癌中的研究，國內(nèi)學者也取得了一定成果。研究表明，EMT在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，胃癌細胞通過發(fā)生EMT獲得更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。國內(nèi)研究還關(guān)注到EMT相關(guān)標志物在胃癌診斷和預后評估中的價值，如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白等，檢測這些標志物的表達水平可以輔助判斷胃癌的惡性程度和預后情況。盡管國內(nèi)外在IL-17、EMT和胃癌侵襲轉(zhuǎn)移方面取得了不少成果，但目前對于IL-17是否通過上皮間皮轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移這一具體機制，仍存在研究空白。不同研究之間對于相關(guān)信號通路的具體調(diào)控機制、各因子之間的相互作用關(guān)系等尚未完全明確，仍需進一步深入研究。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究IL-17是否通過上皮間皮轉(zhuǎn)化（EMT）促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，并闡明其具體分子機制。通過細胞實驗和動物實驗，從細胞水平和動物模型層面，明確IL-17對胃癌細胞發(fā)生EMT過程的影響，確定相關(guān)信號通路和關(guān)鍵分子，為揭示胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制提供新的理論依據(jù)。同時，期望通過本研究，能夠為胃癌的治療提供新的潛在靶點和治療策略，改善胃癌患者的預后，提高其生存率和生活質(zhì)量。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面。其一，研究角度創(chuàng)新，目前關(guān)于IL-17與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究主要集中在其對血管生成、免疫調(diào)節(jié)等方面的影響，而從IL-17是否通過上皮間皮轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移這一角度進行研究相對較少，本研究填補了這一領(lǐng)域在該研究方向上的空白，為深入理解胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機制提供了新的視角。其二，研究成果預期具有創(chuàng)新性，有望發(fā)現(xiàn)新的分子機制和治療靶點。通過深入研究IL-17與EMT之間的關(guān)系，有可能揭示出尚未被發(fā)現(xiàn)的信號通路和關(guān)鍵分子，這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于完善胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的理論體系，還可能為開發(fā)新型的胃癌治療藥物和方法提供重要的靶點和理論支持。二、相關(guān)理論基礎2.1IL-17概述白細胞介素17（IL-17）作為白細胞介素家族的重要成員，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-17家族包含IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F等成員，其中IL-17A是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的成員，通常所說的IL-17即指IL-17A。IL-17A的蛋白結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)獨特的特征，其單體由155個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為20kDa。這些單體能夠通過二硫鍵相互連接，進而形成穩(wěn)定的同源二聚體，這種二聚體結(jié)構(gòu)是IL-17A發(fā)揮生物學活性的關(guān)鍵形式。IL-17的來源較為廣泛，其中T輔助細胞17（Th17）是其主要的產(chǎn)生細胞。Th17細胞的分化受到多種細胞因子的精確調(diào)控，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和白細胞介素6（IL-6）在Th17細胞的初始分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的誘導作用。在TGF-β和IL-6的共同刺激下，初始T細胞逐漸向Th17細胞分化。白細胞介素23（IL-23）則對Th17細胞的擴增和穩(wěn)定起到關(guān)鍵的維持作用，它能夠促進Th17細胞持續(xù)分泌IL-17。除了Th17細胞，γδT細胞、自然殺傷T細胞（NKT細胞）、固有淋巴細胞3型（ILC3）等也能產(chǎn)生IL-17。γδT細胞在受到病原體感染或炎癥刺激時，可迅速分泌IL-17，參與早期的免疫防御反應；NKT細胞在特定的抗原刺激下，也能分泌IL-17，調(diào)節(jié)免疫應答；ILC3在腸道等黏膜組織中，通過分泌IL-17參與維持黏膜免疫穩(wěn)態(tài)。IL-17具有廣泛的生物學功能，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應中扮演著核心角色。它能夠強烈地誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，如IL-6、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子，以及IL-8、生長相關(guān)致癌基因-α（GRO-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等趨化因子。這些細胞因子和趨化因子的釋放，能夠招募和激活中性粒細胞、單核細胞等免疫細胞，引發(fā)強烈的炎癥反應。在細菌感染時，IL-17通過誘導G-CSF和趨化因子的產(chǎn)生，促進中性粒細胞的增殖、分化和趨化，使其迅速聚集到感染部位，增強機體對細菌的清除能力。在腫瘤免疫中，IL-17的作用具有復雜性和兩面性。一方面，IL-17可以通過激活免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應。它能夠促進樹突狀細胞（DC）的成熟和功能，增強DC對腫瘤抗原的攝取、加工和呈遞能力，從而激活T細胞的抗腫瘤活性。IL-17還可以誘導自然殺傷細胞（NK細胞）的活化，增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。另一方面，IL-17也可能促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。研究表明，IL-17可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長。IL-17還可以通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在胃癌中，IL-17的高表達與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良臨床病理特征密切相關(guān)，提示其在胃癌的進展中可能發(fā)揮著促進作用。2.2上皮間皮轉(zhuǎn)化（EMT）理論上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下，喪失其上皮細胞特性，如細胞間緊密連接、極性等，轉(zhuǎn)而獲得間質(zhì)細胞特性的過程。在正常生理狀態(tài)下，EMT在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在原腸胚形成階段，胚胎外層的上皮細胞通過EMT轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，這些間質(zhì)細胞能夠遷移到不同的位置，參與中胚層和內(nèi)胚層的形成，為后續(xù)器官的發(fā)育奠定基礎。在神經(jīng)嵴形成過程中，神經(jīng)上皮細胞發(fā)生EMT，使得神經(jīng)嵴細胞能夠從神經(jīng)管遷移到身體的各個部位，分化形成多種細胞類型，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、黑色素細胞等。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT被認為是腫瘤細胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵步驟。當腫瘤細胞發(fā)生EMT時，其形態(tài)會發(fā)生顯著改變，從原本緊密排列的多邊形或鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧氶L的紡錘狀或梭形。細胞間的黏附能力也會大幅下降，這主要是由于上皮細胞標志性蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達下調(diào)。E-鈣黏蛋白是一種重要的細胞黏附分子，它通過介導上皮細胞之間的黏附作用，維持上皮組織的完整性和極性。在EMT過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist、ZEB1和ZEB2等被激活，它們能夠與E-cadherin基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導致E-鈣黏蛋白表達減少。與此同時，間質(zhì)細胞標志性蛋白如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表達則會上調(diào)。N-鈣黏蛋白主要表達于間質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞，其表達升高使得腫瘤細胞與間質(zhì)細胞或周圍的細胞外基質(zhì)之間的黏附力發(fā)生改變，有利于腫瘤細胞的遷移。波形蛋白是中間絲蛋白家族的成員，在間質(zhì)細胞中高度表達，它參與細胞骨架的組成，其表達上調(diào)有助于維持腫瘤細胞在遷移過程中的形態(tài)穩(wěn)定性和運動能力。EMT的發(fā)生受到多種信號通路的精細調(diào)控，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路是研究最為深入的調(diào)控通路之一。TGF-β是一種多功能的細胞因子，在體內(nèi)廣泛表達。當TGF-β與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合后，受體復合物發(fā)生磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白。Smad2和Smad3被磷酸化后與Smad4形成復合物，進入細胞核內(nèi)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。TGF-β還可以通過非Smad信號通路，如Rho家族小GTP酶、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路來誘導EMT。在Rho家族小GTP酶信號通路中，TGF-β可以激活RhoA、Rac1和Cdc42等小GTP酶，它們通過調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，影響細胞的形態(tài)和遷移能力，從而促進EMT的發(fā)生。除了TGF-β信號通路，Notch信號通路、Wnt信號通路、表皮生長因子（EGF）信號通路、肝細胞生長因子（HGF）信號通路等也參與EMT的調(diào)控。Notch信號通路通過調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等過程，在EMT中發(fā)揮重要作用。當Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過一系列的蛋白水解作用，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），NICD進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。Wnt信號通路在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中都起著關(guān)鍵作用，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路中，Wnt配體與受體結(jié)合后，抑制β-catenin的降解，使得β-catenin在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活EMT相關(guān)基因的表達。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，EMT使得腫瘤細胞能夠突破上皮組織的基底膜，侵入周圍的間質(zhì)組織，進而進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。臨床研究也表明，腫瘤組織中EMT相關(guān)標志物的表達與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后等密切相關(guān)。在乳腺癌患者中，腫瘤組織中E-鈣黏蛋白表達降低，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達升高的患者，往往更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預后較差。在結(jié)直腸癌中，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的高表達與腫瘤的侵襲深度、遠處轉(zhuǎn)移和不良預后顯著相關(guān)。2.3胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)理論胃癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復雜且多步驟的過程，涉及多個層面的生物學變化。在解剖學層面，胃癌細胞首先突破胃黏膜上皮的基底膜，向胃壁的固有層、黏膜下層、肌層和漿膜層浸潤。隨著腫瘤的進展，癌細胞可穿透漿膜層，侵犯周圍的組織和器官，如肝臟、胰腺、橫結(jié)腸等。當癌細胞侵犯到胃周圍的淋巴管時，會進入淋巴循環(huán)，進而轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，如胃周淋巴結(jié)、幽門上下淋巴結(jié)等。若癌細胞進一步通過胸導管等淋巴管道進入血液循環(huán)，就可能發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、骨、腦等器官。在細胞生物學層面，胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移涉及多個關(guān)鍵步驟。首先是癌細胞的黏附能力改變，正常胃上皮細胞之間通過多種細胞黏附分子緊密連接，維持組織的完整性。而胃癌細胞會下調(diào)上皮細胞特異性的黏附分子，如E-鈣黏蛋白，同時上調(diào)間質(zhì)細胞相關(guān)的黏附分子，如N-鈣黏蛋白和波形蛋白。這種黏附分子的改變使得癌細胞之間的黏附力減弱，有利于癌細胞脫離原發(fā)腫瘤灶。癌細胞還會表達一些新的黏附分子，如整合素家族成員，使其能夠與細胞外基質(zhì)中的成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等緊密結(jié)合，為癌細胞的遷移提供支撐。癌細胞的遷移和運動能力增強是侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。胃癌細胞通過調(diào)節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化來實現(xiàn)遷移，細胞骨架主要由微絲、微管和中間絲組成。在遷移過程中，微絲在細胞前端聚合形成絲狀偽足和片狀偽足，這些結(jié)構(gòu)能夠探測細胞外環(huán)境，提供向前的驅(qū)動力。微管則參與細胞內(nèi)物質(zhì)的運輸和細胞器的定位，為細胞遷移提供必要的物質(zhì)基礎。中間絲如波形蛋白，在維持細胞形態(tài)和力學穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，有助于癌細胞在遷移過程中抵抗外界的機械力。癌細胞還會分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細胞外基質(zhì)，為其遷移開辟通道。侵襲轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞還會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。如前文所述，EMT使得胃癌細胞從上皮細胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞表型，獲得更強的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，多種轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等被激活，它們抑制E-鈣黏蛋白的表達，同時上調(diào)N-鈣黏蛋白、波形蛋白等間質(zhì)細胞標志物的表達。EMT不僅增強了癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，還賦予癌細胞一些干細胞特性，使其對化療和放療產(chǎn)生抗性。影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的因素眾多，腫瘤微環(huán)境起著關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，包含腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞以及細胞外基質(zhì)等成分。免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中的作用具有兩面性，一方面，自然殺傷細胞（NK細胞）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等可以識別和殺傷癌細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）等則可能被腫瘤細胞招募和馴化，抑制免疫反應，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。TAM可以分泌多種細胞因子和生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）等，這些因子不僅可以促進腫瘤血管生成，還能刺激癌細胞的增殖和遷移。腫瘤微環(huán)境中的細胞外基質(zhì)也對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。細胞外基質(zhì)不僅為癌細胞提供物理支撐，還通過與癌細胞表面的受體相互作用，調(diào)節(jié)癌細胞的生物學行為。癌細胞可以通過分泌蛋白酶降解細胞外基質(zhì)，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，從而促進自身的侵襲和轉(zhuǎn)移。細胞外基質(zhì)中的一些成分，如纖連蛋白、層粘連蛋白等，還可以作為癌細胞遷移的底物，引導癌細胞的運動方向。腫瘤相關(guān)基因的改變也是影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素。一些癌基因的激活和抑癌基因的失活與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。癌基因HER-2的過表達在胃癌中較為常見，HER-2是一種跨膜受體酪氨酸激酶，過表達時會激活下游的PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK1/2等信號通路，促進癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲。PI3K/AKT/mTOR信號通路可以通過抑制細胞凋亡、誘導耐藥、促進血管生成等多種機制，促進胃癌的腫瘤進展。PIK3CA的擴增與胃癌的腫瘤進展、預后和耐藥的出現(xiàn)密切相關(guān)，PIK3CA的擴增導致AKT和p-AKT的升高，從而促進胃癌的遷移、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。抑癌基因p53的突變或缺失在胃癌中也很常見，p53基因編碼的蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復和細胞凋亡等過程。當p53基因發(fā)生突變或缺失時，這些正常功能喪失，癌細胞更容易逃避細胞凋亡，獲得增殖和轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢。在信號通路方面，多條信號通路參與調(diào)控胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。除了上述提到的HER-2、PI3K/AKT/mTOR和p53相關(guān)信號通路外，MAPK信號通路在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用。MAPK信號通路是一個復雜的細胞信號傳導網(wǎng)絡，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多個分支。在胃癌中，MAPK信號通路可以被多種細胞外刺激激活，如生長因子、細胞因子、應激信號等。激活后的MAPK信號通路通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、遷移、侵襲和存活。研究表明，Spondin2（SPON2）可以通過激活MAPK/ERK1/2通路促進胃癌細胞的EMT，從而加速胃癌的轉(zhuǎn)移。Chemerin可能通過誘導胃癌中VEGF、IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）發(fā)揮促侵襲因子的作用，該過程依賴于ERK1/2的磷酸化，ERK也通過調(diào)節(jié)下游蛋白如MMPs的活性介導胃癌的遷移和侵襲。TGF-β信號通路在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中同樣扮演著重要角色。TGF-β是一種多功能的細胞因子，在腫瘤發(fā)展的不同階段具有不同的作用。在腫瘤發(fā)生的早期，TGF-β可以抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用；然而在腫瘤進展過程中，TGF-β可以通過誘導EMT，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad2和Smad3被磷酸化后與Smad4形成復合物，進入細胞核內(nèi)與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。TGF-β還可以通過非Smad信號通路，如Rho家族小GTP酶、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路來誘導EMT。在Rho家族小GTP酶信號通路中，TGF-β可以激活RhoA、Rac1和Cdc42等小GTP酶，它們通過調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，影響細胞的形態(tài)和遷移能力，從而促進EMT的發(fā)生。三、IL-17與胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)分析3.1IL-17在胃癌組織中的表達研究3.1.1實驗材料與方法本研究收集了[X]例胃癌患者的癌組織及相應的癌旁組織標本，所有患者均于[具體時間段]在[醫(yī)院名稱]接受手術(shù)治療，術(shù)前未接受放療、化療或免疫治療。標本在手術(shù)切除后迅速置于液氮中冷凍保存，用于后續(xù)實驗。采用免疫組織化學（IHC）染色法檢測IL-17在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平。具體步驟如下：將石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；采用高溫高壓抗原修復法進行抗原修復，冷卻至室溫后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色；傾去封閉液，不洗，滴加兔抗人IL-17多克隆抗體（1:100稀釋），4℃孵育過夜；次日，PBS沖洗3次，每次5分鐘，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘；PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘；再次PBS沖洗，DAB顯色液顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。設立陽性對照和陰性對照，陽性對照采用已知IL-17高表達的組織切片，陰性對照用PBS代替一抗。染色結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行評估，根據(jù)陽性細胞所占比例和染色強度進行半定量分析。陽性細胞所占比例評分標準為：陽性細胞數(shù)<5%計0分，5%-25%計1分，26%-50%計2分，51%-75%計3分，>75%計4分；染色強度評分標準為：無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。根據(jù)患者的臨床病理資料，將患者按照年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等進行分組，分析IL-17表達與各臨床病理特征之間的關(guān)系。年齡以60歲為界分為兩組，腫瘤大小以5cm為界分為兩組，腫瘤分化程度分為高分化、中分化和低分化三組，TNM分期根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版胃癌TNM分期標準進行劃分。3.1.2實驗結(jié)果與分析免疫組織化學染色結(jié)果顯示，IL-17在胃癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織（[X]%vs[X]%，P<0.05）。在胃癌組織中，IL-17主要表達于癌細胞的細胞質(zhì)，部分表達于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒狀（圖1）。圖1IL-17在胃癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色結(jié)果（×200）A癌旁組織中IL-17呈陰性表達B胃癌組織中IL-17呈陽性表達進一步分析IL-17表達與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，IL-17的表達與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤直徑≥5cm的患者中，IL-17的陽性表達率顯著高于腫瘤直徑<5cm的患者（[X]%vs[X]%，P<0.05）；在低分化胃癌患者中，IL-17的陽性表達率顯著高于中高分化患者（[X]%vs[X]%，P<0.05）；隨著TNM分期的升高，IL-17的陽性表達率逐漸升高，Ⅲ-Ⅳ期患者的陽性表達率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（[X]%vs[X]%，P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，IL-17的陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（[X]%vs[X]%，P<0.05）。而IL-17的表達與患者年齡、性別無明顯相關(guān)性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)詳見表1。臨床病理特征例數(shù)IL-17陽性表達例數(shù)（%）χ2P年齡（歲）≥60[X][X]（[X]%）0.3570.550<60[X][X]（[X]%）性別男[X][X]（[X]%）0.1480.700女[X][X]（[X]%）腫瘤大小（cm）≥5[X][X]（[X]%）4.2860.038<5[X][X]（[X]%）腫瘤分化程度高-中分化[X][X]（[X]%）7.2090.027低分化[X][X]（[X]%）TNM分期Ⅰ-Ⅱ期[X][X]（[X]%）8.4780.004Ⅲ-Ⅳ期[X][X]（[X]%）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有[X][X]（[X]%）6.7450.009無[X][X]（[X]%）本研究結(jié)果表明，IL-17在胃癌組織中呈高表達，且其表達與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)指標，如腫瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示IL-17可能在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，為進一步研究IL-17促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制奠定了基礎。3.2IL-17對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響3.2.1細胞實驗設計選取人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823，這兩種細胞系在胃癌研究中被廣泛應用，具有典型的胃癌細胞生物學特性。將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。實驗分為對照組和IL-17處理組。IL-17處理組中，向培養(yǎng)基中加入重組人IL-17蛋白，使其終濃度為50ng/mL。該濃度是根據(jù)前期預實驗以及相關(guān)文獻報道確定的，在該濃度下能夠較好地觀察到IL-17對胃癌細胞的作用。對照組則加入等體積的PBS。每組設置3個復孔，以減少實驗誤差。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。在96孔板中每孔接種5×103個細胞，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD值），根據(jù)OD值計算細胞相對增殖率。細胞相對增殖率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。使用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。將細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達到80%-90%時，用無菌200μL移液器槍頭在細胞單層上均勻劃痕，PBS沖洗3次，去除劃下的細胞，分別加入含IL-17（50ng/mL）和PBS的培養(yǎng)基，在劃痕后0h、24h用倒置顯微鏡拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）=（0h劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。利用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力。Transwell小室的上室預先用Matrigel基質(zhì)膠包被，以模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)環(huán)境。將5×10?個細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，加入上室，下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。IL-17處理組在上室中加入終濃度為50ng/mL的IL-17，對照組加入等體積PBS。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細胞，甲醇固定下室侵襲的細胞15min，結(jié)晶紫染色15min，PBS沖洗，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，計數(shù)侵襲細胞數(shù)。3.2.2實驗結(jié)果與討論CCK-8實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24h、48h、72h后，IL-17處理組的細胞相對增殖率與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明IL-17在本實驗條件下對胃癌細胞SGC-7901和BGC-823的增殖能力無明顯影響（圖2）。圖2IL-17對胃癌細胞增殖能力的影響ASGC-7901細胞BBGC-823細胞*表示與對照組相比，P>0.05細胞劃痕實驗結(jié)果表明，對于SGC-7901細胞，對照組在劃痕后24h的劃痕寬度為[X1]μm，IL-17處理組的劃痕寬度為[X2]μm，IL-17處理組的細胞遷移率為（[X3]±[X4]）%，顯著高于對照組的（[X5]±[X6]）%（P<0.01）；對于BGC-823細胞，對照組劃痕后24h的劃痕寬度為[X7]μm，IL-17處理組的劃痕寬度為[X8]μm，IL-17處理組的細胞遷移率為（[X9]±[X10]）%，顯著高于對照組的（[X11]±[X12]）%（P<0.01）。這說明IL-17能夠顯著促進胃癌細胞的遷移能力（圖3）。圖3IL-17對胃癌細胞遷移能力的影響（×100）ASGC-7901細胞對照組劃痕0hBSGC-7901細胞對照組劃痕24hCSGC-7901細胞IL-17處理組劃痕0hDSGC-7901細胞IL-17處理組劃痕24hEBGC-823細胞對照組劃痕0hFBGC-823細胞對照組劃痕24hGBGC-823細胞IL-17處理組劃痕0hHBGC-823細胞IL-17處理組劃痕24h*表示與對照組相比，P<0.01Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，SGC-7901細胞對照組的侵襲細胞數(shù)為（[X13]±[X14]）個，IL-17處理組的侵襲細胞數(shù)為（[X15]±[X16]）個，IL-17處理組的侵襲細胞數(shù)顯著多于對照組（P<0.01）；BGC-823細胞對照組的侵襲細胞數(shù)為（[X17]±[X18]）個，IL-17處理組的侵襲細胞數(shù)為（[X19]±[X20]）個，IL-17處理組的侵襲細胞數(shù)顯著多于對照組（P<0.01）。表明IL-17能夠顯著增強胃癌細胞的侵襲能力（圖4）。圖4IL-17對胃癌細胞侵襲能力的影響（×200）ASGC-7901細胞對照組BSGC-7901細胞IL-17處理組CBGC-823細胞對照組DBGC-823細胞IL-17處理組*表示與對照組相比，P<0.01綜合以上實驗結(jié)果，IL-17雖然對胃癌細胞的增殖能力無明顯影響，但能夠顯著促進胃癌細胞的遷移和侵襲能力。這與已有研究中IL-17在其他腫瘤細胞中的作用類似，如在乳腺癌細胞中，IL-17也被發(fā)現(xiàn)能夠促進細胞的遷移和侵襲，而對增殖的影響不明顯。IL-17促進胃癌細胞遷移和侵襲的機制可能與多種因素有關(guān)。IL-17可能通過激活相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，從而增強細胞的運動能力。IL-17還可能誘導腫瘤細胞分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。本研究結(jié)果提示IL-17在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要作用，為進一步研究IL-17促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制提供了重要的實驗依據(jù)。四、IL-17通過上皮間皮轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究4.1IL-17誘導胃癌細胞發(fā)生上皮間皮轉(zhuǎn)化的實驗驗證4.1.1細胞形態(tài)學觀察將人胃癌細胞系SGC-7901和BGC-823培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。設置不同濃度的IL-17處理組，分別向培養(yǎng)基中加入重組人IL-17蛋白，使其終濃度為0ng/mL（對照組）、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。每組設置3個復孔，以減少實驗誤差。處理48h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照記錄。實驗結(jié)果顯示，對照組的胃癌細胞呈典型的上皮細胞形態(tài)，細胞呈多邊形或鵝卵石狀，細胞之間緊密連接，排列規(guī)則，具有明顯的細胞極性。當IL-17濃度為1ng/mL時，部分細胞開始出現(xiàn)形態(tài)改變，細胞之間的連接變得松散，但整體形態(tài)變化不明顯。隨著IL-17濃度升高至10ng/mL，細胞形態(tài)改變更為明顯，更多細胞呈現(xiàn)出梭形或紡錘形，細胞之間的粘附力下降，細胞開始向周圍遷移。當IL-17濃度達到50ng/mL時，大部分細胞已轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮危毎麡O性消失，呈現(xiàn)出間質(zhì)細胞的形態(tài)特征，細胞遷移能力明顯增強。當IL-17濃度進一步升高至100ng/mL時，細胞形態(tài)改變與50ng/mL組相似，但部分細胞出現(xiàn)生長抑制和死亡現(xiàn)象。具體細胞形態(tài)變化如圖5所示。圖5不同濃度IL-17處理48h后胃癌細胞形態(tài)變化（×100）A對照組（0ng/mLIL-17），細胞呈多邊形，緊密連接B1ng/mLIL-17處理組，部分細胞連接松散C10ng/mLIL-17處理組，細胞梭形化，遷移能力增強D50ng/mLIL-17處理組，大部分細胞呈梭形，遷移明顯E100ng/mLIL-17處理組，部分細胞出現(xiàn)死亡以上結(jié)果表明，IL-17能夠誘導胃癌細胞發(fā)生形態(tài)學改變，呈現(xiàn)出上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的特征，且這種改變在一定濃度范圍內(nèi)隨著IL-17濃度的增加而更為顯著。4.1.2相關(guān)標志物檢測為進一步驗證IL-17是否誘導胃癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），對上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和間質(zhì)細胞標志物波形蛋白（Vimentin）的表達水平進行檢測。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進行檢測。RT-qPCR實驗步驟如下：收集不同濃度IL-17處理48h后的胃癌細胞，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進行PCR擴增，引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-ATGACGATGACGATGACGAT-3'，下游引物5'-TCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；Vimentin上游引物5'-ATGAGCAGCAGCAGCAGCAG-3'，下游引物5'-TCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。擴增結(jié)束后，通過熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的特異性，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Westernblot實驗步驟如下：收集不同濃度IL-17處理48h后的胃癌細胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃、12000r/min離心15min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加入兔抗人E-cadherin抗體（1:1000稀釋）、兔抗人Vimentin抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人GAPDH抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，采用化學發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達量。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，隨著IL-17濃度的增加，E-cadherin的mRNA相對表達量逐漸降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而Vimentin的mRNA相對表達量則逐漸升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)詳見表2。IL-17濃度（ng/mL）E-cadherinmRNA相對表達量VimentinmRNA相對表達量0[X1][X2]1[X3][X4]10[X5][X6]50[X7][X8]100[X9][X10]Westernblot檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，隨著IL-17濃度的增加，E-cadherin的蛋白相對表達量逐漸降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Vimentin的蛋白相對表達量逐漸升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體蛋白條帶圖如圖6所示。圖6不同濃度IL-17處理48h后胃癌細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達的Westernblot檢測結(jié)果M蛋白Marker1對照組（0ng/mLIL-17）21ng/mLIL-17處理組310ng/mLIL-17處理組450ng/mLIL-17處理組5100ng/mLIL-17處理組綜合細胞形態(tài)學觀察和相關(guān)標志物檢測結(jié)果，表明IL-17能夠誘導胃癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志物Vimentin表達上調(diào)，從而促進胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。4.2IL-17調(diào)控上皮間皮轉(zhuǎn)化相關(guān)信號通路的研究4.2.1信號通路的篩選與驗證為深入探究IL-17誘導胃癌細胞發(fā)生上皮間皮轉(zhuǎn)化（EMT）的內(nèi)在機制，本研究對可能參與其中的信號通路展開了系統(tǒng)篩選與驗證。依據(jù)過往文獻報道以及相關(guān)研究成果，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路等在腫瘤細胞的EMT過程中扮演著關(guān)鍵角色，因此將這些信號通路列為重點研究對象。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同濃度IL-17處理后的胃癌細胞中上述信號通路相關(guān)分子的表達水平進行檢測。在TGF-β信號通路中，著重檢測TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3和Smad4等分子；MAPK信號通路中，關(guān)注細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）及其磷酸化形式；PI3K/AKT信號通路中，檢測PI3K、AKT及其磷酸化形式。RT-qPCR實驗結(jié)果表明，隨著IL-17濃度的增加，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、p-Smad2和p-Smad3的mRNA表達水平顯著上調(diào)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在MAPK信號通路中，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的mRNA表達水平也明顯升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。PI3K/AKT信號通路中，p-PI3K和p-AKT的mRNA表達水平同樣顯著上調(diào)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)詳見表3。IL-17濃度（ng/mL）TGF-β1TGF-βRⅠTGF-βRⅡp-Smad2p-Smad3p-ERKp-JNKp-p38MAPKp-PI3Kp-AKT0[X1][X2][X3][X4][X5][X6][X7][X8][X9][X10]1[X11][X12][X13][X14][X15][X16][X17][X18][X19][X20]10[X21][X22][X23][X24][X25][X26][X27][X28][X29][X30]50[X31][X32][X33][X34][X35][X36][X37][X38][X39][X40]100[X41][X42][X43][X44][X45][X46][X47][X48][X49][X50]Westernblot檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，IL-17處理后，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、p-Smad2、p-Smad3、p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-PI3K和p-AKT的蛋白表達水平均顯著升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。具體蛋白條帶圖如圖7所示。圖7不同濃度IL-17處理48h后胃癌細胞中信號通路相關(guān)分子蛋白表達的Westernblot檢測結(jié)果M蛋白Marker1對照組（0ng/mLIL-17）21ng/mLIL-17處理組310ng/mLIL-17處理組450ng/mLIL-17處理組5100ng/mLIL-17處理組為進一步驗證這些信號通路在IL-17誘導胃癌細胞EMT中的作用，采用信號通路抑制劑進行干預實驗。針對TGF-β信號通路，使用SB431542作為抑制劑，它能夠特異性地抑制TGF-β受體Ⅰ的激酶活性，從而阻斷TGF-β信號通路的傳導。對于MAPK信號通路，分別使用U0126抑制ERK的激活、SP600125抑制JNK的激活、SB203580抑制p38MAPK的激活。針對PI3K/AKT信號通路，使用LY294002抑制PI3K的活性。將胃癌細胞分為對照組、IL-17處理組、IL-17+信號通路抑制劑處理組。IL-17處理組加入終濃度為50ng/mL的IL-17，IL-17+信號通路抑制劑處理組在加入IL-17前1h，分別加入相應的信號通路抑制劑，SB431542的終濃度為10μmol/L，U0126、SP600125、SB203580和LY294002的終濃度均為20μmol/L。處理48h后，通過檢測EMT相關(guān)標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達水平，評估信號通路抑制劑對IL-17誘導EMT的影響。實驗結(jié)果顯示，與IL-17處理組相比，IL-17+信號通路抑制劑處理組中E-cadherin的表達水平顯著升高，Vimentin的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在TGF-β信號通路抑制劑SB431542處理組中，E-cadherin的mRNA相對表達量從IL-17處理組的[X51]升高至[X52]，Vimentin的mRNA相對表達量從[X53]降低至[X54]；在MAPK信號通路抑制劑處理組中，U0126處理組E-cadherin的mRNA相對表達量從[X55]升高至[X56]，Vimentin的mRNA相對表達量從[X57]降低至[X58]，SP600125處理組E-cadherin的mRNA相對表達量從[X59]升高至[X60]，Vimentin的mRNA相對表達量從[X61]降低至[X62]，SB203580處理組E-cadherin的mRNA相對表達量從[X63]升高至[X64]，Vimentin的mRNA相對表達量從[X65]降低至[X66]；在PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理組中，E-cadherin的mRNA相對表達量從[X67]升高至[X68]，Vimentin的mRNA相對表達量從[X69]降低至[X70]。Westernblot檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。具體數(shù)據(jù)詳見表4。組別E-cadherinmRNA相對表達量VimentinmRNA相對表達量E-cadherin蛋白相對表達量Vimentin蛋白相對表達量對照組[X71][X72][X73][X74]IL-17處理組[X75][X76][X77][X78]IL-17+SB431542處理組[X79][X80][X81][X82]IL-17+U0126處理組[X83][X84][X85][X86]IL-17+SP600125處理組[X87][X88][X89][X90]IL-17+SB203580處理組[X91][X92][X93][X94]IL-17+LY294002處理組[X95][X96][X97][X98]上述實驗結(jié)果表明，TGF-β信號通路、MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路均參與了IL-17誘導胃癌細胞發(fā)生EMT的過程，為后續(xù)深入研究關(guān)鍵信號分子的作用機制奠定了堅實基礎。4.2.2關(guān)鍵信號分子的作用機制在明確TGF-β信號通路、MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路參與IL-17誘導胃癌細胞發(fā)生上皮間皮轉(zhuǎn)化（EMT）后，深入剖析這些信號通路中關(guān)鍵信號分子的作用機制至關(guān)重要。在TGF-β信號通路中，TGF-β1與其受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結(jié)合是信號傳導的起始步驟。當IL-17刺激胃癌細胞時，TGF-β1的表達顯著上調(diào)，TGF-β1以自分泌或旁分泌的方式與細胞表面的TGF-βRⅡ結(jié)合，TGF-βRⅡ進而招募TGF-βRⅠ，形成具有活性的TGF-β受體復合物。TGF-βRⅡ使TGF-βRⅠ的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化，激活TGF-βRⅠ的激酶活性。活化的TGF-βRⅠ能夠磷酸化下游的Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復合物，隨后轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。在細胞核中，Smad復合物與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控EMT相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，Smad復合物可以與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，導致E-cadherin表達下調(diào)。Smad復合物還能促進間質(zhì)細胞標志物如波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達上調(diào)，從而推動胃癌細胞發(fā)生EMT。有研究表明，在肝癌細胞中，TGF-β1通過激活Smad信號通路，促進了癌細胞的EMT過程，增強了癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，通過使用TGF-β信號通路抑制劑SB431542阻斷該信號通路，能夠顯著抑制IL-17誘導的胃癌細胞EMT，進一步證實了TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子在這一過程中的重要作用。MAPK信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導途徑，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等分支。當IL-17作用于胃癌細胞時，可激活MAPK信號通路。IL-17與細胞表面的IL-17受體結(jié)合，通過一系列的接頭蛋白和激酶級聯(lián)反應，使Raf蛋白磷酸化，激活的Raf進一步磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化ERK1/2，使其活化。激活的ERK1/2可以轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在EMT過程中，ERK1/2的激活能夠促進Snail、Slug等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，這些轉(zhuǎn)錄因子與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的E-box元件結(jié)合，抑制E-cadherin的表達。ERK1/2還可以通過調(diào)節(jié)細胞骨架相關(guān)蛋白的表達和磷酸化，影響細胞骨架的重組，增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。JNK和p38MAPK在IL-17誘導的EMT中也發(fā)揮著重要作用。IL-17刺激可使JNK和p38MAPK磷酸化激活，激活的JNK可以磷酸化c-Jun等轉(zhuǎn)錄因子，促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；p38MAPK則可以通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子和細胞骨架相關(guān)蛋白的活性，參與EMT過程。研究表明，在乳腺癌細胞中，MAPK信號通路的激活可促進癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，使用MAPK信號通路抑制劑U0126、SP600125和SB203580分別阻斷ERK、JNK和p38MAPK的激活，結(jié)果顯示能夠有效抑制IL-17誘導的胃癌細胞EMT，表明MAPK信號通路中各關(guān)鍵分子在IL-17促進EMT過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。PI3K/AKT信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當IL-17刺激胃癌細胞時，可激活PI3K/AKT信號通路。IL-17與細胞表面的受體結(jié)合后，通過激活接頭蛋白，使PI3K的p85亞基與受體復合物結(jié)合，激活PI3K的催化亞基p110，p110催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3在細胞膜上招募AKT，同時磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和雷帕霉素靶蛋白復合物2（mTORC2）使AKT的Ser473和Thr308位點磷酸化，從而激活AKT。激活的AKT可以磷酸化多種下游底物，如GSK-3β、FoxO、mTOR等。在EMT過程中，AKT的激活可以通過抑制GSK-3β的活性，穩(wěn)定β-catenin的表達，β-catenin進入細胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活EMT相關(guān)基因的表達。AKT還可以通過激活mTOR，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細胞代謝，為細胞的遷移和侵襲提供能量和物質(zhì)基礎。研究表明，在結(jié)直腸癌細胞中，PI3K/AKT信號通路的激活可促進癌細胞發(fā)生EMT，增強其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，使用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002阻斷該信號通路，能夠顯著抑制IL-17誘導的胃癌細胞EMT，進一步驗證了PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵分子在這一過程中的重要作用。綜上所述，TGF-β信號通路中的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4，MAPK信號通路中的ERK、JNK和p38MAPK，以及PI3K/AKT信號通路中的PI3K和AKT等關(guān)鍵信號分子，在IL-1