IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移：關(guān)聯(lián)機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景結(jié)直腸癌作為全球范圍內(nèi)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，其發(fā)病率在世界各國均呈現(xiàn)出不同程度的上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)到193萬，位居所有癌癥的第三位；死亡病例數(shù)為94萬，位列癌癥相關(guān)死亡原因的第二位。在我國，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、居民生活方式的改變以及人口老齡化的加劇，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也在持續(xù)攀升。2020年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸癌新發(fā)病例約56萬，死亡病例約29萬，發(fā)病率和死亡率分別位居全部惡性腫瘤的第二位和第五位。結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗和死亡的主要原因。當(dāng)腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位，侵犯周圍組織和器官，并通過血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官時(shí)，患者的預(yù)后往往較差。臨床上，約有20%-25%的結(jié)直腸癌患者在初診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使接受了根治性手術(shù)切除，仍有30%-50%的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入研究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的預(yù)測和治療靶點(diǎn)，對于改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR）是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于受體酪氨酸激酶家族成員。IGF-IR在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在正常生理狀態(tài)下，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、代謝以及存活等過程。在結(jié)直腸癌中，IGF-IR的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明，IGF-IR通過激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，IGF-IR還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成和淋巴管生成，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。Lin28B是一種進(jìn)化上高度保守的RNA結(jié)合蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、代謝以及干細(xì)胞的自我更新和多能性維持等生物學(xué)過程。在腫瘤領(lǐng)域，Lin28B被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌。Lin28B通過抑制let-7家族微小RNA（miRNA）的成熟，解除let-7對其靶基因的抑制作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。此外，Lin28B還可以通過與其他RNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。綜上所述，IGF-IR和Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要作用。然而，目前關(guān)于兩者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究尚不完全清楚。深入探討IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，還可能為結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)后評估以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究IGF-IR、Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，明確兩者在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及潛在分子機(jī)制。結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。盡管目前對結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子生物學(xué)過程尚未完全闡明。本研究聚焦于IGF-IR和Lin28B蛋白，有望揭示它們在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，補(bǔ)充和完善結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制理論體系，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。臨床上，目前結(jié)直腸癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等。然而，對于發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，現(xiàn)有的治療方法往往效果不佳，患者的生存率和生活質(zhì)量較低。通過本研究，若能證實(shí)IGF-IR、Lin28B蛋白與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系，將為開發(fā)新的靶向治療藥物提供潛在的靶點(diǎn)。以IGF-IR為例，研發(fā)針對IGF-IR的特異性抑制劑，可能阻斷其下游促癌信號通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。對于Lin28B蛋白，可通過干擾其與let-7家族miRNA的相互作用，或者抑制Lin28B相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，來實(shí)現(xiàn)對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的干預(yù)。這將為結(jié)直腸癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療策略，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。此外，準(zhǔn)確評估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后對于制定個性化的治療方案和判斷患者的生存情況至關(guān)重要。目前常用的預(yù)后評估指標(biāo)如腫瘤分期、病理分級等存在一定的局限性，不能完全準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后。本研究通過分析IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，有望發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后評估指標(biāo)。將IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)水平納入預(yù)后評估體系，結(jié)合傳統(tǒng)的評估指標(biāo)，可以更全面、準(zhǔn)確地預(yù)測患者的預(yù)后，為臨床醫(yī)生制定治療決策提供更有力的依據(jù)。對于高表達(dá)IGF-IR和Lin28B蛋白且預(yù)后較差的患者，可以加強(qiáng)術(shù)后的輔助治療和隨訪監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問題；而對于低表達(dá)這兩種蛋白且預(yù)后較好的患者，可以適當(dāng)減少治療強(qiáng)度，降低治療帶來的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1IGF-IR概述2.1.1IGF-IR的結(jié)構(gòu)與功能胰島素樣生長因子I受體（IGF-IR）是一種在細(xì)胞生命活動中扮演關(guān)鍵角色的跨膜酪氨酸激酶受體，屬于受體酪氨酸激酶家族的重要成員。其基因定位于15q25-26區(qū)域，在細(xì)胞內(nèi)，IGF-IR的前體是一條單鏈多肽，經(jīng)歷一系列復(fù)雜的加工過程。首先，去除30個氨基酸的信號肽序列，這一過程如同為受體的成熟開啟了初步的準(zhǔn)備階段，使得肽鏈能夠進(jìn)一步接受修飾。隨后，肽鏈被糖基化，糖基化修飾為受體賦予了特定的結(jié)構(gòu)和功能特性，增強(qiáng)了其穩(wěn)定性和生物活性。緊接著，肽鏈斷裂形成一個由706個氨基酸構(gòu)成的胞外α亞單位和一個由626個氨基酸組成的穿膜β亞單位。這兩個亞單位通過二硫鍵緊密相連，形成一個αβ半受體，而兩個αβ半受體進(jìn)一步組合，最終構(gòu)成一個完整的具有生物學(xué)活性的受體（α2β2）。在IGF-IR的結(jié)構(gòu)組成中，α亞單位位于胞外，其重要作用是作為配體（IGF-I和IGF-II）的特異性結(jié)合區(qū)域，如同一個精準(zhǔn)的“分子鎖”，決定了配體結(jié)合的特異性。α亞單位中富含半胱氨酸（Cys），這些半胱氨酸殘基形成特定的空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了IGF-I的結(jié)合位點(diǎn)，確保了IGF-I能夠準(zhǔn)確無誤地與受體結(jié)合，啟動后續(xù)的生物學(xué)信號傳遞。而β亞單位則跨越細(xì)胞膜，其胞內(nèi)部分含有至關(guān)重要的酪氨酸（Tyr）激酶催化亞單位。當(dāng)IGF-IR與配體結(jié)合后，β亞單位的酪氨酸激酶催化亞單位被激活，能夠交叉催化相應(yīng)β亞單位上的磷酸化位點(diǎn)，使其發(fā)生磷酸化反應(yīng)。這種磷酸化過程如同多米諾骨牌效應(yīng)，引發(fā)一系列下游信號分子的活化，進(jìn)而啟動不同的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中，K1003位的ATP結(jié)合位點(diǎn)和酪氨酸激酶活性區(qū)域Y1131、Y1135及Y1136對于IGF-IR發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)尤為關(guān)鍵，這些位點(diǎn)猶如信號傳遞的“關(guān)鍵樞紐”，一旦發(fā)生突變，就會使IGF-IR完全喪失其正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞信號傳遞的中斷，影響細(xì)胞的正常生理活動。在正常生理狀態(tài)下，IGF-IR在細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著不可或缺的調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞生長方面，IGF-IR與IGF-I結(jié)合后，能夠促進(jìn)細(xì)胞對氨基酸、葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，為細(xì)胞的生長提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過激活相關(guān)信號通路，如PI3K/Akt信號通路，IGF-IR可以上調(diào)核糖體蛋白的合成，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的翻譯效率，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長和體積增大。在細(xì)胞增殖過程中，IGF-I是一個重要的細(xì)胞增殖因子，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期后，在其他生長因子相對缺乏的情況下，IGF-I可通過與IGF-IR結(jié)合，促使細(xì)胞順利完成增殖周期。Mulligan等學(xué)者運(yùn)用微陣列技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，IGF-IR能夠上調(diào)有絲分裂素-肝素結(jié)合性內(nèi)皮生長樣生長因子（HB-EGF），從而促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，推動細(xì)胞增殖進(jìn)程。在細(xì)胞分化方面，IGF-IR參與多種細(xì)胞類型的分化調(diào)控。例如，在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，IGF-IR信號通路的激活可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。在胚胎發(fā)育階段，IGF-IR對于各個器官的正常發(fā)育起著關(guān)鍵作用，從早期的胚胎細(xì)胞分化，到組織器官的形成和發(fā)育，IGF-IR都參與其中，確保胚胎的正常生長和發(fā)育。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控上，IGF-I在體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)均具有阻止細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時(shí)，IGF-IR與IGF-I結(jié)合后，通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制促凋亡蛋白如Bad、Bax等的活性，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的存活。體內(nèi)細(xì)胞凋亡程度與IGF-IR數(shù)量密切相關(guān)，研究表明，在裸鼠模型中，腫瘤的發(fā)生嚴(yán)格依賴于細(xì)胞逃逸凋亡的數(shù)量，當(dāng)IGF-IR數(shù)量減少時(shí)，細(xì)胞凋亡增加，腫瘤的發(fā)生受到抑制。在腫瘤細(xì)胞中，IGF-IR的異常激活或高表達(dá)會顯著影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。IGF-IR通過激活下游的PI3K/Akt和MAPK等信號通路，對腫瘤細(xì)胞的多個生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。在細(xì)胞遷移方面，PI3K/Akt信號通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動能力。具體來說，Akt可以磷酸化多種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動蛋白結(jié)合蛋白、微管相關(guān)蛋白等，使細(xì)胞骨架發(fā)生重排，形成有利于細(xì)胞遷移的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，MAPK信號通路的激活可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。在細(xì)胞侵襲過程中，IGF-IR信號通路可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和解黏附過程。一方面，通過上調(diào)整合素等黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的初始黏附；另一方面，在遷移過程中，又能調(diào)節(jié)黏附分子的活性，使腫瘤細(xì)胞能夠適時(shí)地解黏附，繼續(xù)向前侵襲。此外，IGF-IR還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，招募免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，促進(jìn)腫瘤血管生成和淋巴管生成。腫瘤血管和淋巴管的生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)提供了途徑，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。2.1.2IGF-IR與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系大量的研究表明，IGF-IR在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出異常表達(dá)的情況，其表達(dá)水平的變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。在乳腺癌中，眾多臨床樣本研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，IGF-IR的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織。高表達(dá)的IGF-IR通過與IGF-I或IGF-II結(jié)合，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IGF-IR高表達(dá)的乳腺癌患者往往預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。在肺癌中，IGF-IR的異常表達(dá)同樣常見，并且與肺癌的病理類型、分期以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，IGF-IR的過表達(dá)與腫瘤的侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，IGF-IR可以通過調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在前列腺癌中，IGF-IR在前列腺癌細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。雄激素非依賴型前列腺癌中，IGF-IR的表達(dá)水平明顯升高，且與腫瘤的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。通過抑制IGF-IR的表達(dá)或活性，可以顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，為前列腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。IGF-IR促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要是通過激活一系列復(fù)雜的信號通路來實(shí)現(xiàn)的。其中，PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路是兩條關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)IGF-IR與配體IGF-I或IGF-II結(jié)合后，受體發(fā)生自身磷酸化，激活下游的胰島素受體底物-1（IRS-1）等信號分子。IRS-1進(jìn)而激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt。Akt是PI3K/Akt信號通路的核心激酶，它通過磷酸化多種下游底物，發(fā)揮其生物學(xué)功能。在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，解除GSK-3β對細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制作用，使CyclinD1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在抑制細(xì)胞凋亡方面，Akt可以磷酸化促凋亡蛋白Bad，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而抑制Bad的促凋亡活性；同時(shí)，Akt還可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力。此外，Akt還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，為細(xì)胞的生長和增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。MAPK信號通路的激活也是IGF-IR促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。當(dāng)IGF-IR被激活后，通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)，依次激活Ras、Raf、MEK和ERK等激酶。ERK是MAPK信號通路的下游關(guān)鍵激酶，它被激活后可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，ERK可以上調(diào)CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲方面，ERK可以通過激活MMPs的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。此外，MAPK信號通路還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和活性，影響腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。除了PI3K/Akt和MAPK信號通路外，IGF-IR還可以通過激活其他信號通路，如磷脂酶Cγ（PLCγ）/蛋白激酶C（PKC）信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路等，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。PLCγ被IGF-IR激活后，水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成二酰甘油（DAG）和肌醇-1，4，5-三磷酸（IP3）。DAG激活PKC，PKC通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。IP3則促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。STAT信號通路在細(xì)胞因子和生長因子的信號傳遞中發(fā)揮重要作用，IGF-IR可以激活STAT3和STAT5等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。這些信號通路之間相互交織、相互作用，形成一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.2Lin28B蛋白概述2.2.1Lin28B蛋白的結(jié)構(gòu)與功能Lin28B是一種在細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的RNA結(jié)合蛋白，其基因位于染色體6q21區(qū)域。Lin28B蛋白由351個氨基酸組成，分子量約為39kDa。它具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，包含一個N端的冷休克結(jié)構(gòu)域（Coldshockdomain，CSD）和兩個C端的串聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)域（Retroviral-typezincfingerdomains，CCHCzincfingers）。冷休克結(jié)構(gòu)域由約70個氨基酸組成，富含保守的芳香族氨基酸殘基，它在蛋白質(zhì)與RNA的相互作用中發(fā)揮著重要作用，能夠識別并結(jié)合特定的RNA序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)域則是由Cys和His殘基組成的鋅離子結(jié)合基序，通過與鋅離子的配位作用，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)Lin28B與RNA的親和力和特異性。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得Lin28B能夠特異性地結(jié)合RNA分子，從而參與到多種生物學(xué)過程的調(diào)控中。在細(xì)胞增殖方面，Lin28B通過與相關(guān)RNA分子結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖。研究表明，在胚胎干細(xì)胞中，Lin28B的高表達(dá)能夠維持細(xì)胞的自我更新能力，促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖。通過抑制Lin28B的表達(dá)，胚胎干細(xì)胞的增殖能力明顯下降，細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯。在分化過程中，Lin28B則扮演著抑制細(xì)胞分化的角色。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，Lin28B的表達(dá)水平逐漸降低，當(dāng)Lin28B被敲低時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化加速。這表明Lin28B通過抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)。在程序性死亡的調(diào)控上，Lin28B可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在腫瘤細(xì)胞中，Lin28B的高表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力，抵抗化療藥物等誘導(dǎo)的凋亡信號。研究發(fā)現(xiàn)，Lin28B可以通過與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族成員的mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。此外，Lin28B還參與了細(xì)胞代謝的調(diào)控。在脂肪細(xì)胞中，Lin28B可以調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂肪的合成和分解。研究表明，Lin28B的過表達(dá)會導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中脂肪合成增加，而脂肪分解減少。Lin28B還與干細(xì)胞的多能性維持密切相關(guān)。在胚胎干細(xì)胞中，Lin28B與其他多能性因子如Oct4、Sox2等相互作用，共同維持干細(xì)胞的多能性狀態(tài)。通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，Lin28B能夠確保干細(xì)胞在自我更新的同時(shí)，保持向各種細(xì)胞類型分化的潛能。2.2.2Lin28B蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系大量研究表明，Lin28B在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。在肝癌中，Lin28B的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，且其高表達(dá)與肝癌的惡性程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Lin28B通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在肺癌中，Lin28B的異常表達(dá)也較為常見，尤其是在非小細(xì)胞肺癌中，Lin28B的高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Lin28B可以通過調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在乳腺癌中，Lin28B的表達(dá)水平與乳腺癌的病理類型、分級以及患者的預(yù)后相關(guān)。高表達(dá)Lin28B的乳腺癌患者往往具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和更差的預(yù)后。Lin28B可以通過激活相關(guān)信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。Lin28B促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要與其對let-7miRNA家族的抑制作用密切相關(guān)。let-7miRNA家族是一類重要的腫瘤抑制性miRNA，它通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對，抑制靶基因的翻譯過程，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。let-7miRNA家族的靶基因包括Ras、HMGA2、c-Myc等多個癌基因，這些癌基因在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。Lin28B能夠特異性地結(jié)合let-7miRNA家族的前體（pre-let-7），抑制其加工成熟為成熟的let-7miRNA。具體來說，Lin28B的冷休克結(jié)構(gòu)域和逆轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)域與pre-let-7的特定序列相互作用，阻礙了Dicer酶對pre-let-7的切割加工，從而減少了成熟let-7miRNA的生成。隨著成熟let-7miRNA水平的降低，其對靶基因的抑制作用減弱，導(dǎo)致Ras、HMGA2、c-Myc等癌基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。Ras的激活可以啟動下游的MAPK和PI3K/Akt等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。HMGA2的上調(diào)可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。c-Myc作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)多個與細(xì)胞增殖、代謝和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。除了抑制let-7miRNA家族，Lin28B還可以通過其他機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Lin28B可以與mRNA結(jié)合蛋白HuR相互作用，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在腫瘤細(xì)胞中，Lin28B與HuR共同作用于某些癌基因的mRNA，如VEGF等，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和翻譯效率，促進(jìn)腫瘤血管生成。Lin28B還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。Lin28B可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，招募免疫抑制細(xì)胞如髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。Lin28B還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供支持。2.3結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)理論2.3.1結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程與機(jī)制結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜且多步驟的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與周圍微環(huán)境之間的相互作用，以及多個分子和信號通路的參與。這一過程如同一場復(fù)雜的“戰(zhàn)役”，腫瘤細(xì)胞通過一系列策略突破機(jī)體的防御機(jī)制，實(shí)現(xiàn)從原發(fā)部位向遠(yuǎn)處器官的擴(kuò)散。首先，腫瘤細(xì)胞的增殖與局部浸潤是侵襲轉(zhuǎn)移的起始階段。在結(jié)直腸癌發(fā)生初期，腫瘤細(xì)胞在致癌因素的作用下，獲得了不受控制的增殖能力。這些細(xì)胞不斷分裂，形成腫瘤結(jié)節(jié)，并逐漸侵犯周圍的正常組織。腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)細(xì)胞間粘附分子如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，降低自身與周圍正常細(xì)胞之間的粘附力，從而使腫瘤細(xì)胞能夠脫離原發(fā)腫瘤團(tuán)塊。腫瘤細(xì)胞還會分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和絲氨酸蛋白酶等，這些蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的浸潤開辟道路。MMP-2和MMP-9可以降解Ⅳ型膠原蛋白，破壞基底膜的完整性，使腫瘤細(xì)胞能夠穿透基底膜，侵入周圍的組織間隙。腫瘤細(xì)胞還可以通過改變自身的形態(tài)和運(yùn)動方式，如獲得間質(zhì)細(xì)胞樣的表型，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。當(dāng)腫瘤細(xì)胞突破基底膜后，便進(jìn)入了血管或淋巴管內(nèi)，這一過程稱為內(nèi)滲。腫瘤細(xì)胞能夠與血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的活化和通透性增加。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的粘附分子如整合素、選擇素等，使其能夠與內(nèi)皮細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。腫瘤細(xì)胞還可以利用內(nèi)皮細(xì)胞之間的縫隙，或者通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用，進(jìn)入血管或淋巴管內(nèi)。一旦進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞便開始了在血液或淋巴液中的旅程。在這個過程中，腫瘤細(xì)胞面臨著免疫系統(tǒng)的攻擊、血流的剪切力以及與其他血細(xì)胞的相互作用等多種挑戰(zhàn)。為了生存和轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞會形成腫瘤細(xì)胞簇，或者與血小板、白細(xì)胞等血細(xì)胞相互聚集，形成微血栓，從而保護(hù)自身免受免疫系統(tǒng)的清除和血流剪切力的損傷。腫瘤細(xì)胞還會分泌一些免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制免疫系統(tǒng)的功能，為其在循環(huán)系統(tǒng)中的存活創(chuàng)造條件。腫瘤細(xì)胞隨著血液循環(huán)或淋巴循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處器官后，會在適宜的微環(huán)境中停留并穿出血管或淋巴管，進(jìn)入周圍組織，這一過程稱為外滲。腫瘤細(xì)胞能夠識別并結(jié)合遠(yuǎn)處器官血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體，如腫瘤細(xì)胞表面的CD44分子可以與內(nèi)皮細(xì)胞表面的透明質(zhì)酸結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。腫瘤細(xì)胞再次分泌蛋白酶，降解血管或淋巴管周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞能夠穿出血管或淋巴管，進(jìn)入周圍組織。腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官的微環(huán)境中，需要適應(yīng)新的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)、氧氣的濃度以及生長因子的種類和濃度等。腫瘤細(xì)胞會與周圍的間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，形成有利于腫瘤細(xì)胞生長和增殖的腫瘤微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞可以分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。腫瘤細(xì)胞還可以招募免疫抑制細(xì)胞，如髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長和增殖創(chuàng)造有利條件。在適宜的腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞開始增殖并形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞通過激活相關(guān)的信號通路，如PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。腫瘤細(xì)胞還會不斷地與周圍的微環(huán)境相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲。腫瘤細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子和趨化因子，招募更多的間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，擴(kuò)大腫瘤微環(huán)境的范圍。腫瘤細(xì)胞還可以通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間粘附能力，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移性和侵襲性。腫瘤細(xì)胞會表達(dá)一些間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如波形蛋白（Vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等，同時(shí)下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)。EMT過程不僅使腫瘤細(xì)胞能夠更容易地遷移和侵襲，還賦予了腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣的特性，使其具有更強(qiáng)的自我更新和耐藥能力。2.3.2影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的因素結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移受到多種因素的綜合影響，這些因素可分為內(nèi)部因素和外部因素，它們相互作用，共同推動了結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程。內(nèi)部因素主要包括基因和蛋白表達(dá)的異常。在基因?qū)用妫姸喟┗蚝鸵职┗虻母淖兣c結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ras基因的突變在結(jié)直腸癌中較為常見，突變后的Ras蛋白持續(xù)激活下游的MAPK和PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，大約30%-50%的結(jié)直腸癌患者存在Ras基因突變，且突變型Ras與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。p53基因作為一種重要的抑癌基因，其功能缺失或突變會導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、DNA損傷修復(fù)能力下降以及細(xì)胞凋亡受阻，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，p53基因突變率高達(dá)50%-70%，突變型p53與腫瘤的惡性程度、侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。APC基因是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵抑癌基因，其突變或缺失會導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在細(xì)胞內(nèi)積累，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。約80%的結(jié)直腸癌患者存在APC基因突變，APC基因的異常與腫瘤的早期發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在蛋白表達(dá)方面，許多蛋白的異常表達(dá)參與了結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。如前面提到的IGF-IR和Lin28B蛋白，它們的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族蛋白在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。MMP-2和MMP-9在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過抑制MMP-2和MMP-9的活性，可以顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)變化也對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。E-鈣黏蛋白是一種重要的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在結(jié)直腸癌中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)與腫瘤的分化程度、侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白、N-鈣黏蛋白等的高表達(dá)，則與結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。外部因素主要包括腫瘤微環(huán)境和機(jī)體的免疫狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，它由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等信號分子，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了途徑，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞和炎癥因子也在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，它可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8、TGF-β等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。TAMs還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成和免疫抑制，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。機(jī)體的免疫狀態(tài)對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移也有重要影響。免疫系統(tǒng)能夠識別和清除腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫監(jiān)視作用。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子，如程序性死亡受體配體1（PD-L1），與免疫細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。腫瘤細(xì)胞還可以招募免疫抑制細(xì)胞，如髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs），抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。MDSCs可以通過分泌活性氧（ROS）、精氨酸酶等物質(zhì)，抑制T細(xì)胞的功能；Tregs則可以通過分泌細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β，抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖。此外，腫瘤細(xì)胞還可以通過改變自身的抗原性，使其難以被免疫系統(tǒng)識別和清除。腫瘤細(xì)胞可以發(fā)生抗原變異，或者通過下調(diào)抗原呈遞相關(guān)分子的表達(dá)，減少腫瘤抗原的呈遞，從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。2.4研究現(xiàn)狀分析目前，關(guān)于IGF-IR與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)取得了一定的成果。眾多研究表明，IGF-IR在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Li等學(xué)者通過對120例結(jié)直腸癌患者的組織樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)IGF-IR的表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，且與腫瘤的TNM分期呈正相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過抑制IGF-IR的表達(dá)或活性，可以顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Wang等學(xué)者利用RNA干擾技術(shù)沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的IGF-IR基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯受到抑制，同時(shí)PI3K/Akt和MAPK信號通路的活性也顯著降低。這些研究表明，IGF-IR在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，可能是通過激活下游的PI3K/Akt和MAPK等信號通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。對于Lin28B蛋白與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，也有一些相關(guān)研究。已有研究發(fā)現(xiàn)，Lin28B在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且其高表達(dá)與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)。Liu等學(xué)者通過對80例結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)Lin28B的表達(dá)與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)Lin28B的患者5年生存率明顯低于低表達(dá)患者。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)Lin28B可以增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而敲低Lin28B則會抑制這些生物學(xué)行為。研究還表明，Lin28B主要是通過抑制let-7miRNA家族的成熟，上調(diào)其靶基因如Ras、HMGA2、c-Myc等的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。盡管目前對IGF-IR、Lin28B蛋白與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系有了一定的認(rèn)識，但仍存在一些不足之處。在研究的廣度上，大多數(shù)研究僅關(guān)注了IGF-IR或Lin28B蛋白單一因素對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，而對于兩者在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的相互作用及協(xié)同機(jī)制研究較少。IGF-IR和Lin28B蛋白是否通過共同調(diào)節(jié)某些信號通路或分子，從而協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，這一問題尚未得到深入探討。在研究的深度方面，雖然已知IGF-IR和Lin28B蛋白參與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，但對于這些信號通路中具體的分子靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制還不完全清楚。在IGF-IR激活的PI3K/Akt信號通路中，除了已知的Akt及其下游底物外，是否還存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵分子參與調(diào)控結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移，仍有待進(jìn)一步研究。此外，現(xiàn)有的研究主要集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本檢測上，對于在體動物模型中IGF-IR、Lin28B蛋白對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究相對較少。動物模型能夠更真實(shí)地模擬腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移過程，因此開展相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究對于深入理解兩者的作用機(jī)制具有重要意義。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1樣本來源本研究中的結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本及正常組織標(biāo)本均取自[具體醫(yī)院名稱]。收集時(shí)間為[開始時(shí)間]-[結(jié)束時(shí)間]，共納入[X]例結(jié)直腸癌患者。所有患者在術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本立即置于10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間為12-48小時(shí)。隨后，按照標(biāo)準(zhǔn)的病理取材規(guī)范，對腫瘤組織進(jìn)行取材。沿腸壁長軸、垂直于腸壁切取腫瘤標(biāo)本，根據(jù)腫瘤大小、浸潤深度、質(zhì)地及顏色等不同區(qū)域分別取材，常規(guī)取4塊。對于腫瘤浸潤最深處，至少取1塊全層厚度腫瘤及腸壁組織，以準(zhǔn)確判斷腫瘤侵犯的最深層次。同時(shí)，切取能夠顯示腫瘤與鄰近粘膜關(guān)系的組織2塊。此外，還切取了遠(yuǎn)側(cè)、近側(cè)手術(shù)切緣組織，環(huán)周切緣按手術(shù)醫(yī)師標(biāo)記的部分切取。正常組織標(biāo)本則取自距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常腸黏膜組織，同樣進(jìn)行固定和取材處理。詳細(xì)記錄每例患者的臨床病理信息，包括患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]，平均年齡為[平均年齡]歲；男性[男性例數(shù)]例，女性[女性例數(shù)]例；腫瘤部位分布于直腸[直腸例數(shù)]例，乙狀結(jié)腸[乙狀結(jié)腸例數(shù)]例，降結(jié)腸[降結(jié)腸例數(shù)]例，橫結(jié)腸[橫結(jié)腸例數(shù)]例，升結(jié)腸[升結(jié)腸例數(shù)]例；腫瘤大小范圍為[最小腫瘤直徑]-[最大腫瘤直徑]cm，平均直徑為[平均腫瘤直徑]cm；組織學(xué)類型包括腺癌[腺癌例數(shù)]例，黏液腺癌[黏液腺癌例數(shù)]例，未分化癌[未分化癌例數(shù)]例；分化程度分為高分化[高分化例數(shù)]例，中分化[中分化例數(shù)]例，低分化[低分化例數(shù)]例；TNM分期：I期[I期例數(shù)]例，II期[II期例數(shù)]例，III期[III期例數(shù)]例，IV期[IV期例數(shù)]例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)]例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移例數(shù)]例。這些臨床病理信息將為后續(xù)分析IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性提供重要依據(jù)。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：免疫組化試劑盒選用[具體品牌]的免疫組化通用試劑盒，該試劑盒包含了免疫組化實(shí)驗(yàn)所需的一抗稀釋液、二抗、顯色劑等關(guān)鍵試劑，能夠保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。一抗為兔抗人IGF-IR多克隆抗體和兔抗人Lin28B多克隆抗體，均購自[抗體供應(yīng)商品牌]，這兩種抗體經(jīng)過嚴(yán)格的驗(yàn)證和測試，具有高特異性和高親和力，能夠準(zhǔn)確識別并結(jié)合IGF-IR和Lin28B蛋白。PCR試劑采用[品牌]的PCR試劑盒，包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等成分，用于擴(kuò)增目的基因片段。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用[品牌]的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，可高效地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。RNA提取試劑盒為[品牌]的RNA提取試劑盒，能夠快速、有效地從組織或細(xì)胞中提取高質(zhì)量的RNA。此外，還用到了DEPC水、Tris-HCl緩沖液、NaCl、EDTA等常規(guī)試劑，用于溶液的配制和實(shí)驗(yàn)操作。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：顯微鏡選用[品牌及型號]的倒置顯微鏡，具有高分辨率和清晰的成像效果，可用于觀察組織切片和細(xì)胞形態(tài)。PCR儀為[品牌及型號]的梯度PCR儀，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，滿足不同實(shí)驗(yàn)條件下的PCR擴(kuò)增需求。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀選用[品牌及型號]，可實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中的熒光信號變化，實(shí)現(xiàn)對目的基因的定量分析。離心機(jī)為[品牌及型號]的高速冷凍離心機(jī)，可在低溫條件下對樣品進(jìn)行離心分離，保證樣品的生物活性。電泳儀為[品牌及型號]，用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離。凝膠成像系統(tǒng)為[品牌及型號]，可對電泳后的凝膠進(jìn)行成像和分析，獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。恒溫培養(yǎng)箱為[品牌及型號]，能夠提供穩(wěn)定的溫度和濕度環(huán)境，用于細(xì)胞培養(yǎng)和孵育實(shí)驗(yàn)。CO2培養(yǎng)箱為[品牌及型號]，可提供含有5%CO2的氣體環(huán)境，滿足細(xì)胞生長的需求。這些儀器設(shè)備均經(jīng)過嚴(yán)格的校準(zhǔn)和維護(hù)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組化檢測IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟如下：將固定好的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，使用切片機(jī)切成厚度為4μm的組織切片。將切片置于60℃烤箱中烤片30-60分鐘，目的是使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化，確保組織切片牢固地貼在玻片上。烤片完成后，進(jìn)行脫蠟水化處理。依次將切片放入二甲苯I、II、III中各浸泡10分鐘，以去除切片中的石蠟。隨后，將切片依次放入不同濃度的乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）中各浸泡2分鐘，進(jìn)行梯度水化。最后，將切片放入蒸餾水中清洗，使組織切片恢復(fù)到含水狀態(tài)。為了使被掩蓋的抗原決定簇重新暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力，需進(jìn)行抗原修復(fù)。本研究采用高壓熱修復(fù)法，使用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液，確保緩沖液完全浸泡切片。將裝有切片和緩沖液的容器放入高壓鍋中，待高壓鍋冒氣后，繼續(xù)加熱5分鐘，然后自然冷卻。需注意，溫度急劇下降可能會引起脫片現(xiàn)象。將修復(fù)后的切片用3%H?O?避光浸泡15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。使用免疫組化油筆圍繞組織畫圈，這樣在后續(xù)的洗滌和孵育過程中，PBS等液體能夠被鎖在圈內(nèi)，避免液體流干導(dǎo)致切片干燥。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。按照1:100的比例用抗體稀釋液稀釋兔抗人IGF-IR多克隆抗體和兔抗人Lin28B多克隆抗體。將稀釋后的一抗滴加在組織切片上，確保一抗均勻覆蓋組織。將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，起到信號放大的作用。孵育結(jié)束后，再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。該工作液能夠與二抗結(jié)合，并且在后續(xù)的顯色反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。向切片上滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)出明顯的棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。DAB顯色液中的底物在辣根過氧化物酶的催化下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生棕黃色沉淀，從而使陽性部位得以顯示。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間為3-5分鐘。蘇木精能夠?qū)⒓?xì)胞核染成藍(lán)色，與陽性部位的棕黃色形成鮮明對比，便于觀察。復(fù)染后，用自來水沖洗切片，使多余的蘇木精被沖洗掉。將切片依次放入不同濃度的乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）中進(jìn)行梯度脫水，每個濃度浸泡2分鐘。然后將切片放入二甲苯I、II中各浸泡10分鐘，進(jìn)行透明處理。最后，用中性樹膠封片，使切片能夠長期保存。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法和評分法相結(jié)合的方式進(jìn)行結(jié)果判定。在40倍光鏡下，隨機(jī)選取10個視野，計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞。同時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下按染色程度（0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐色）和陽性范圍（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）進(jìn)行評分，最終將染色程度得分與陽性范圍得分相加，得到綜合評分。綜合評分越高，表明IGF-IR或Lin28B蛋白的表達(dá)水平越高。3.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)使用RNA提取試劑盒從結(jié)直腸癌組織和正常組織中提取總RNA。將組織樣本剪碎后，加入適量的裂解液，充分勻漿，使細(xì)胞完全裂解。加入氯仿，劇烈振蕩后離心，使溶液分為三層，RNA位于上層水相中。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入異丙醇，沉淀RNA。離心后棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，干燥后用適量的DEPC水溶解RNA。采用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A???/A???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等試劑，按照試劑盒說明書的條件進(jìn)行反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中IGF-IR、Lin28B及內(nèi)參基因β-actin的基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物。IGF-IR上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]；Lin28B上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]；β-actin上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]。引物由專業(yè)的生物公司合成。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、TaqDNA聚合酶、dNTPs等試劑。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。在每個循環(huán)中，熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增而增強(qiáng)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化。采用2^-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先計(jì)算每個樣本中目的基因（IGF-IR、Lin28B）與內(nèi)參基因β-actin的Ct值差值（ΔCt），即ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin。然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組的ΔCt差值（ΔΔCt），即ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組。最后根據(jù)公式2^-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。通過比較結(jié)直腸癌組織和正常組織中IGF-IR、Lin28B基因的相對表達(dá)量，分析其表達(dá)差異。3.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用人結(jié)直腸癌細(xì)胞系[細(xì)胞系名稱]，在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔接種[X]個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將針對IGF-IR或Lin28B基因的小干擾RNA（siRNA）或過表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體按照一定比例混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，使siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒能夠有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對IGF-IR或Lin28B基因表達(dá)的干擾或過表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR或Westernblot檢測。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔[X]個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時(shí)后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，比較不同處理組細(xì)胞的增殖能力。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿單層后，用200μL槍頭垂直于孔板底部進(jìn)行劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞，去除劃落的細(xì)胞碎片，然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0、12、24小時(shí)，在顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率=（初始劃痕寬度-某時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。通過比較不同處理組細(xì)胞的遷移率，分析IGF-IR、Lin28B對細(xì)胞遷移能力的影響。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育30-60分鐘，使基質(zhì)膠凝固。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為[X]個/mL。向上室中加入100-200μL細(xì)胞懸液，向下室中加入600-800μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室侵襲的細(xì)胞15-20分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。在顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。通過比較不同處理組侵襲細(xì)胞數(shù)的差異，分析IGF-IR、Lin28B對細(xì)胞侵襲能力的影響。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組分級資料比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。分析IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）之間的相關(guān)性時(shí)，采用Spearman秩相關(guān)分析。通過計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)r，判斷兩者之間的相關(guān)性方向和強(qiáng)度。當(dāng)r>0時(shí)，表示正相關(guān)，即IGF-IR或Lin28B蛋白表達(dá)水平越高，對應(yīng)的臨床病理參數(shù)越傾向于惡性程度高的方向；當(dāng)r<0時(shí)，表示負(fù)相關(guān)；當(dāng)r=0時(shí)，表示兩者之間無明顯相關(guān)性。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，評估IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值。通過計(jì)算曲線下面積（AUC），判斷預(yù)測效能。AUC的取值范圍在0.5-1.0之間，AUC越接近1.0，說明預(yù)測價(jià)值越高；當(dāng)AUC=0.5時(shí)，表示無預(yù)測價(jià)值。確定最佳臨界值，計(jì)算敏感度和特異度等指標(biāo)，以評估其在臨床應(yīng)用中的可行性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)，以確保結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。在分析過程中，對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，排除異常值和離群點(diǎn)對結(jié)果的影響，確保研究結(jié)果能夠真實(shí)反映IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。四、研究結(jié)果4.1IGF-IR、Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況通過免疫組化染色，對[X]例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和[X]例正常組織標(biāo)本進(jìn)行IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)檢測。結(jié)果顯示，IGF-IR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正常組織。在結(jié)直腸癌組織中，IGF-IR陽性表達(dá)例數(shù)為[結(jié)直腸癌IGF-IR陽性例數(shù)]例，陽性表達(dá)率為[結(jié)直腸癌IGF-IR陽性表達(dá)率]%；而在正常組織中，IGF-IR陽性表達(dá)例數(shù)僅為[正常組織IGF-IR陽性例數(shù)]例，陽性表達(dá)率為[正常組織IGF-IR陽性表達(dá)率]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從表達(dá)強(qiáng)度來看，IGF-IR蛋白在結(jié)直腸癌組織中多呈強(qiáng)陽性表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深棕色染色；而在正常組織中，IGF-IR蛋白表達(dá)強(qiáng)度較弱，多為弱陽性或陰性，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色較淺或無明顯染色。在陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中，[強(qiáng)陽性表達(dá)例數(shù)]例呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，占[強(qiáng)陽性表達(dá)比例]%；[弱陽性表達(dá)例數(shù)]例為弱陽性表達(dá)，占[弱陽性表達(dá)比例]%。在正常組織中，弱陽性表達(dá)的有[正常組織弱陽性例數(shù)]例，陰性表達(dá)的有[正常組織陰性例數(shù)]例。在分布特點(diǎn)上，IGF-IR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)分布不均，在腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域以及侵襲前沿部位表達(dá)更為明顯。在腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域，IGF-IR陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞相互聚集，染色強(qiáng)度較高；而在侵襲前沿部位，腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤生長，IGF-IR蛋白的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)。與之相比，正常組織中IGF-IR蛋白的表達(dá)相對較為均勻，且主要分布于上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較少。Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)情況也顯著高于正常組織。結(jié)直腸癌組織中Lin28B陽性表達(dá)例數(shù)為[結(jié)直腸癌Lin28B陽性例數(shù)]例，陽性表達(dá)率為[結(jié)直腸癌Lin28B陽性表達(dá)率]%；正常組織中Lin28B陽性表達(dá)例數(shù)為[正常組織Lin28B陽性例數(shù)]例，陽性表達(dá)率為[正常組織Lin28B陽性表達(dá)率]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞核表達(dá)為主，呈現(xiàn)棕黃色染色，且表達(dá)強(qiáng)度較高；在正常組織中，Lin28B蛋白表達(dá)較弱，多為陰性或弱陽性，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色較淺。在陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中，[細(xì)胞核強(qiáng)陽性例數(shù)]例細(xì)胞核呈強(qiáng)陽性表達(dá)，[細(xì)胞核弱陽性例數(shù)]例細(xì)胞核為弱陽性表達(dá)；[細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)陽性例數(shù)]例細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽性表達(dá)，[細(xì)胞質(zhì)弱陽性例數(shù)]例細(xì)胞質(zhì)為弱陽性表達(dá)。在正常組織中，弱陽性表達(dá)的有[正常組織Lin28B弱陽性例數(shù)]例，陰性表達(dá)的有[正常組織Lin28B陰性例數(shù)]例。在分布上，Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)異質(zhì)性，在腫瘤細(xì)胞巢的中心和邊緣區(qū)域均可檢測到表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞巢的邊緣區(qū)域，尤其是與間質(zhì)細(xì)胞交界處，Lin28B蛋白的表達(dá)更為豐富。這可能與腫瘤細(xì)胞在邊緣區(qū)域具有更強(qiáng)的增殖和侵襲活性有關(guān)，Lin28B蛋白的高表達(dá)可能參與了腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。正常組織中Lin28B蛋白的表達(dá)則較為局限，主要分布于少數(shù)上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中幾乎無表達(dá)。4.2IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性將IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的各項(xiàng)臨床病理特征進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示，IGF-IR蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.325，P<0.05）。在高分化結(jié)直腸癌組織中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[高分化低表達(dá)例數(shù)]例，占[高分化低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[高分化高表達(dá)例數(shù)]例，占[高分化高表達(dá)比例]%。而在低分化結(jié)直腸癌組織中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[低分化低表達(dá)例數(shù)]例，占[低分化低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[低分化高表達(dá)例數(shù)]例，占[低分化高表達(dá)比例]%。隨著腫瘤分化程度的降低，IGF-IR蛋白表達(dá)水平逐漸升高，提示IGF-IR高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的低分化程度相關(guān)，表明腫瘤細(xì)胞的分化越差，IGF-IR的表達(dá)越活躍，腫瘤細(xì)胞的惡性程度可能越高。IGF-IR蛋白表達(dá)與TNM分期呈顯著正相關(guān)（r=0.386，P<0.05）。在I期和II期結(jié)直腸癌患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[I-II期低表達(dá)例數(shù)]例，占[I-II期低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[I-II期高表達(dá)例數(shù)]例，占[I-II期高表達(dá)比例]%。而在III期和IV期患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[III-IV期低表達(dá)例數(shù)]例，占[III-IV期低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[III-IV期高表達(dá)例數(shù)]例，占[III-IV期高表達(dá)比例]%。隨著TNM分期的進(jìn)展，IGF-IR蛋白的高表達(dá)率逐漸增加，說明IGF-IR蛋白表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤分期越晚，IGF-IR蛋白表達(dá)越高，提示IGF-IR可能在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。IGF-IR蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在顯著正相關(guān)（r=0.402，P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低表達(dá)例數(shù)]例，占[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高表達(dá)例數(shù)]例，占[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高表達(dá)比例]%。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低表達(dá)例數(shù)]例，占[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高表達(dá)例數(shù)]例，占[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高表達(dá)比例]%。這表明IGF-IR蛋白高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，IGF-IR可能參與了結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，IGF-IR蛋白表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)（r=0.368，P<0.05）。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移低表達(dá)例數(shù)]例，占[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高表達(dá)例數(shù)]例，占[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高表達(dá)比例]%。無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，IGF-IR蛋白低表達(dá)例數(shù)為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移低表達(dá)例數(shù)]例，占[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高表達(dá)例數(shù)]例，占[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高表達(dá)比例]%。說明IGF-IR蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，IGF-IR可能促進(jìn)了結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Lin28B蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.308，P<0.05）。高分化結(jié)直腸癌組織中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[高分化Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[高分化Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[高分化Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[高分化Lin28B高表達(dá)比例]%。低分化結(jié)直腸癌組織中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[低分化Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[低分化Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[低分化Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[低分化Lin28B高表達(dá)比例]%。隨著腫瘤分化程度降低，Lin28B蛋白表達(dá)水平升高，表明Lin28B高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的低分化相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化越差，Lin28B的表達(dá)可能越有利于腫瘤細(xì)胞維持其惡性生物學(xué)行為。Lin28B蛋白表達(dá)與TNM分期呈顯著正相關(guān)（r=0.354，P<0.05）。I期和II期結(jié)直腸癌患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[I-II期Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[I-II期Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[I-II期Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[I-II期Lin28B高表達(dá)比例]%。III期和IV期患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[III-IV期Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[III-IV期Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[III-IV期Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[III-IV期Lin28B高表達(dá)比例]%。隨著TNM分期的進(jìn)展，Lin28B蛋白高表達(dá)率逐漸上升，提示Lin28B在結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，其高表達(dá)與腫瘤的晚期階段相關(guān)。Lin28B蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)（r=0.376，P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)比例]%。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)比例]%。這表明Lin28B蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用。Lin28B蛋白表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)（r=0.335，P<0.05）。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)比例]%。無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，Lin28B蛋白低表達(dá)例數(shù)為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)例數(shù)]例，占[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B低表達(dá)比例]%；高表達(dá)例數(shù)為[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)例數(shù)]例，占[無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Lin28B高表達(dá)比例]%。說明Lin28B蛋白高表達(dá)與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能參與了腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程。4.3IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系為了進(jìn)一步探究IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，成功將針對IGF-IR的小干擾RNA（si-IGF-IR）轉(zhuǎn)染至人結(jié)直腸癌細(xì)胞系[細(xì)胞系名稱]，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染si-IGF-IR的細(xì)胞中IGF-IR基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到[具體轉(zhuǎn)染效率]%，表明IGF-IR基因沉默效果良好。同樣，將Lin28B的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞，Lin28B基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高，過表達(dá)效率達(dá)到[具體過表達(dá)效率]%，說明過表達(dá)質(zhì)粒成功發(fā)揮作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾IGF-IR表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。在培養(yǎng)24小時(shí)后，干擾組細(xì)胞的OD值為[干擾組24小時(shí)OD值]，顯著低于對照組的[對照組24小時(shí)OD值]（P<0.05）；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至48小時(shí)和72小時(shí)，干擾組細(xì)胞的OD值分別為[干擾組48小時(shí)OD值]和[干擾組72小時(shí)OD值]，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而過表達(dá)Lin28B則促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，過表達(dá)組細(xì)胞的OD值分別為[過表達(dá)組24小時(shí)OD值]、[過表達(dá)組48小時(shí)OD值]和[過表達(dá)組72小時(shí)OD值]，均顯著高于對照組（P<0.05）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，可見干擾IGF-IR表達(dá)的細(xì)胞生長曲線較為平緩，而過表達(dá)Lin28B的細(xì)胞生長曲線上升更為陡峭，進(jìn)一步直觀地表明了IGF-IR和Lin28B對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾IGF-IR表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力明顯下降。在劃痕后12小時(shí)，干擾組細(xì)胞的遷移率為[干擾組12小時(shí)遷移率]%，顯著低于對照組的[對照組12小時(shí)遷移率]%（P<0.05）；24小時(shí)時(shí)，干擾組細(xì)胞遷移率為[干擾組24小時(shí)遷移率]%，對照組為[對照組24小時(shí)遷移率]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。相反，過表達(dá)Lin28B增強(qiáng)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。在劃痕后12小時(shí)和24小時(shí)，過表達(dá)組細(xì)胞的遷移率分別為[過表達(dá)組12小時(shí)遷移率]%和[過表達(dá)組24小時(shí)遷移率]%，均顯著高于對照組（P<0.05）。通過顯微鏡觀察劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移情況，可清晰看到干擾IGF-IR表達(dá)的細(xì)胞遷移距離較短，而過表達(dá)Lin28B的細(xì)胞遷移距離較長，說明IGF-IR和Lin28B在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾IGF-IR表達(dá)后，穿過Matrigel基質(zhì)膠的結(jié)直腸癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少。在24小時(shí)的Transwell實(shí)驗(yàn)中，干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)為[干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)]個，顯著低于對照組的[對照組侵襲細(xì)胞數(shù)]個（P<0.05）。而過表達(dá)Lin28B則增加了侵襲細(xì)胞的數(shù)量，過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)為[過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)]個，顯著高于對照組（P<0.05）。在顯微鏡下觀察Transwell小室下室的侵襲細(xì)胞，干擾IGF-IR表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量較少，而過表達(dá)Lin28B的細(xì)胞數(shù)量較多，這表明IGF-IR和Lin28B對結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力具有顯著影響。進(jìn)一步分析其分子機(jī)制，通過Westernblot檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，干擾IGF-IR表達(dá)后，PI3K/Akt和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著降低。p-Akt（Ser473）和p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的表達(dá)量在干擾組中明顯低于對照組，分別降低了[具體降低比例1]%和[具體降低比例2]%（P<0.05）。這表明IGF-IR可能通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。過表達(dá)Lin28B后，let-7miRNA家族的表達(dá)水平顯著降低，其靶基因Ras、HMGA2、c-Myc等的表達(dá)水平明顯上調(diào)。與對照組相比，過表達(dá)組中l(wèi)et-7miRNA的表達(dá)量降低了[具體降低比例3]%，Ras、HMGA2、c-Myc蛋白的表達(dá)量分別升高了[具體升高比例1]%、[具體升高比例2]%和[具體升高比例3]%（P<0.05）。說明Lin28B主要通過抑制let-7miRNA家族的成熟，上調(diào)其靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。4.4IGF-IR、Lin28B蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析，對IGF-IR、Lin28B蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行深入探究。結(jié)果顯示，兩者呈顯著正相關(guān)