IFN-γ誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)上調(diào)及其機(jī)制探究：胰腺癌免疫治療新視角一、引言1.1研究背景胰腺癌是一種極具侵襲性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌在2020年的全球新發(fā)病例約為49.6萬例，死亡病例約為46.6萬例，其死亡率與發(fā)病率之比接近1，這意味著大多數(shù)胰腺癌患者在確診后不久便面臨死亡威脅。在中國，胰腺癌同樣是發(fā)病率和死亡率增長迅速的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響國民的生命健康和生活質(zhì)量。胰腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等。然而，由于胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時已處于晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會。即使接受手術(shù)治療，患者的5年生存率也僅為20%-30%，總體預(yù)后極差。化療和放療雖然在一定程度上可以緩解癥狀、延長生存期，但療效有限，且常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給患者帶來巨大的痛苦。此外，胰腺癌對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性較高，使得化療的效果大打折扣，進(jìn)一步限制了治療方案的選擇和療效。目前，胰腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，這在很大程度上制約了新型治療方法和藥物的研發(fā)。深入研究胰腺癌的分子機(jī)制，探尋新的治療靶點和策略，對于提高胰腺癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有重要意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對胰腺癌的分子機(jī)制有了更深入的認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)了許多與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因和信號通路，為胰腺癌的靶向治療提供了新的思路和方向。在眾多與胰腺癌相關(guān)的分子中，RFXAP基因作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，RFXAP基因的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括胰腺癌。然而，RFXAP基因在胰腺癌中的具體作用機(jī)制以及其作為治療靶點的潛力仍有待進(jìn)一步深入研究。IFN-γ作為一種重要的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的生物學(xué)活性，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ可以通過啟動轉(zhuǎn)錄因子STAT1的信號通路，誘導(dǎo)RFXAP基因的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。這一發(fā)現(xiàn)為胰腺癌的免疫治療提供了新的潛在靶點和策略。綜上所述，本研究旨在探討IFN-γ誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，為胰腺癌的免疫治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。通過深入研究IFN-γ與RFXAP基因之間的相互作用，有望揭示胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的新機(jī)制，為開發(fā)新型的胰腺癌治療方法和藥物奠定基礎(chǔ)，從而提高胰腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究IFN-γ誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的詳細(xì)機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目的包括：明確IFN-γ對胰腺癌細(xì)胞中RFXAP基因表達(dá)的影響，確定IFN-γ調(diào)節(jié)RFXAP基因表達(dá)的具體信號通路和分子機(jī)制，以及評估RFXAP基因表達(dá)上調(diào)對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。胰腺癌作為一種高度惡性的腫瘤，其治療效果和預(yù)后一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。目前的治療手段在提高患者生存率和生活質(zhì)量方面存在諸多局限，因此，尋找新的治療靶點和策略迫在眉睫。IFN-γ作為一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究IFN-γ誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，對于揭示胰腺癌的免疫逃逸機(jī)制、開發(fā)新的免疫治療方法具有重要意義。通過深入了解IFN-γ與RFXAP基因之間的相互作用，可以為胰腺癌的免疫治療提供新的理論基礎(chǔ)和潛在靶點，有望改善胰腺癌患者的治療效果和預(yù)后。此外，本研究的結(jié)果還可能為其他惡性腫瘤的免疫治療提供借鑒和參考，推動腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胰腺癌概述胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和致死率均處于較高水平。近年來，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。在全球范圍內(nèi)，胰腺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第14位，但致死率卻高居第7位，其5年生存率極低，僅為5%-10%，堪稱“癌中之王”。在中國，胰腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出快速增長的態(tài)勢，已成為威脅人民健康的重要疾病之一。胰腺癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為與多種因素有關(guān)。長期吸煙、大量飲酒、高脂肪和高蛋白飲食、慢性胰腺炎等都是胰腺癌的高危因素。此外，遺傳因素在胰腺癌的發(fā)病中也起著重要作用，約5%-10%的胰腺癌患者具有家族遺傳背景。從分子生物學(xué)角度來看，胰腺癌的發(fā)生涉及多個基因的突變和信號通路的異常激活，如KRAS、TP53、CDKN2A等基因的突變，以及PI3K-AKT-mTOR、MAPK等信號通路的失調(diào)，這些異常改變導(dǎo)致胰腺細(xì)胞的增殖、分化和凋亡失控，從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。胰腺癌的早期癥狀不明顯，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，這使得早期診斷極為困難。大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，腫瘤往往已經(jīng)侵犯周圍組織和器官，或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)根治的最佳時機(jī)。當(dāng)患者出現(xiàn)腹痛、黃疸、消瘦、乏力等癥狀時，病情通常已進(jìn)展到較為嚴(yán)重的階段。據(jù)統(tǒng)計，僅15%-20%的胰腺癌患者在確診時能夠接受根治性手術(shù)切除，而這部分患者的5年生存率也僅為20%-30%。對于無法手術(shù)切除的晚期胰腺癌患者，治療手段主要包括化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法的療效有限，患者的中位生存期通常僅為6-12個月。化療是晚期胰腺癌的主要治療手段之一，但胰腺癌對傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性較高，導(dǎo)致化療效果不佳。目前，臨床上常用的化療藥物如吉西他濱、氟尿嘧啶、奧沙利鉑等，雖然在一定程度上可以緩解癥狀、延長生存期，但總體有效率較低，且患者容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，使得化療的持續(xù)時間和療效受到限制。放療可以用于局部晚期胰腺癌的治療，通過高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，緩解疼痛等癥狀，但放療也存在一定的局限性，如對周圍正常組織的損傷較大，且單獨(dú)使用放療的療效也不理想。靶向治療和免疫治療是近年來胰腺癌治療領(lǐng)域的研究熱點，但目前在臨床上的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。靶向治療藥物主要針對胰腺癌中特定的基因突變或信號通路異常進(jìn)行干預(yù)，但由于胰腺癌的基因異質(zhì)性較高，不同患者之間的基因突變情況差異較大，導(dǎo)致靶向治療的效果參差不齊，且容易出現(xiàn)耐藥問題。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，但胰腺癌的腫瘤微環(huán)境具有高度的免疫抑制性，使得免疫治療藥物難以發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。此外，免疫治療還可能引發(fā)一系列的免疫相關(guān)不良反應(yīng)，進(jìn)一步限制了其臨床應(yīng)用。綜上所述，胰腺癌的發(fā)病率和致死率居高不下，治療現(xiàn)狀不容樂觀，面臨著早期診斷困難、治療手段有限、療效不佳等諸多挑戰(zhàn)。因此，深入研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高胰腺癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有重要的現(xiàn)實意義。2.2IFN-γ的功能IFN-γ，即γ干擾素，作為細(xì)胞因子中的重要一員，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等多種生物學(xué)功能。在免疫調(diào)節(jié)方面，IFN-γ堪稱免疫細(xì)胞的“指揮官”。它能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和殺傷活性，使其更好地清除病原體和腫瘤細(xì)胞。巨噬細(xì)胞經(jīng)IFN-γ激活后，其溶酶體活性顯著增強(qiáng)，可更有效地降解吞噬的物質(zhì)。IFN-γ還能促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和增殖，抑制Th2細(xì)胞的功能，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。IFN-γ對B細(xì)胞的功能也有調(diào)節(jié)作用，它可以影響B(tài)細(xì)胞的增殖、分化和抗體產(chǎn)生，有助于增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。抗腫瘤功能是IFN-γ的重要特性之一。IFN-γ能夠通過多條途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長。它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞中死亡受體FAS及其配體FAS-L的表達(dá)，以及腫瘤細(xì)胞系中TRAIL及其受體死亡受體5（DR5）的表達(dá)，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡信號通路，促使腫瘤細(xì)胞死亡。IFN-γ還能增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的遷移。它通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控CXCL9、CXCL10和CXCL11及其同源受體CXCR3在T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC和癌細(xì)胞的表達(dá)和分泌，吸引免疫細(xì)胞聚集到腫瘤部位，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。IFN-γ還能上調(diào)腫瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞的抗原遞呈能力，使免疫系統(tǒng)更容易識別和攻擊腫瘤細(xì)胞。抗病毒功能同樣是IFN-γ的關(guān)鍵功能之一。IFN-γ對抵抗病毒感染的固有免疫和適應(yīng)性免疫都具有重要作用。它可以直接抑制病毒復(fù)制，通過誘導(dǎo)一些目的基因的表達(dá)，產(chǎn)生參與病毒RNA降解和剪切的酶和蛋白質(zhì)，從而阻斷病毒的復(fù)制過程。IFN-γ還能誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞表達(dá)病毒抗原，增加免疫系統(tǒng)對感染細(xì)胞的識別和殺傷作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力。IFN-γ作為一種具有多種重要生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在維持機(jī)體免疫平衡、抵抗腫瘤和病毒感染等方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其在免疫系統(tǒng)中的獨(dú)特地位和廣泛功能，為腫瘤和病毒感染等疾病的治療提供了新的思路和潛在靶點，具有重要的研究價值和臨床應(yīng)用前景。2.3RFXAP基因RFXAP基因，全稱為調(diào)節(jié)因子X相關(guān)蛋白基因（regulatoryfactorX-associatedproteingene），在人體生理過程中扮演著極為重要的角色，尤其是在免疫系統(tǒng)方面，發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在免疫系統(tǒng)中，RFXAP基因編碼的蛋白質(zhì)是RFX轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的重要組成部分。該復(fù)合物能夠識別并結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合體II類（MHCII）基因啟動子區(qū)域的X盒序列上，從而調(diào)控MHCII類分子的表達(dá)。MHCII類分子在免疫細(xì)胞的抗原呈遞過程中起著核心作用，它可以將抗原肽呈遞給CD4+T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，進(jìn)而啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，RFXAP基因?qū)τ诰S持免疫系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，其表達(dá)異常可能導(dǎo)致免疫缺陷或免疫失調(diào)等疾病。近年來，越來越多的研究表明，RFXAP基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在胰腺癌中，其作用備受關(guān)注。相關(guān)研究顯示，在胰腺癌組織和細(xì)胞系中，RFXAP基因的表達(dá)水平顯著低于正常胰腺組織和細(xì)胞。這種低表達(dá)情況可能與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。沈濤等人通過對GEO數(shù)據(jù)庫中胰腺癌基因芯片數(shù)據(jù)的分析，明確了RFXAP在胰腺癌中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因的低表達(dá)可能會影響MHCII類分子的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞功能受損，使得免疫系統(tǒng)難以有效識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)胰腺癌的免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展。此外，生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因可能參與多種信號通路的調(diào)控，如Tuberculosis信號通路和Pancreaticcancer信號通路等，這些信號通路的異常與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)一步提示了RFXAP基因在胰腺癌中的重要作用。三、IFN-γ對胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)的影響3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)本實驗選用了人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3，這兩種細(xì)胞系在胰腺癌研究中被廣泛應(yīng)用。PANC-1細(xì)胞系來源于一名56歲男性的胰腺導(dǎo)管腺癌組織，具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力；BxPC-3細(xì)胞系則分離自一名61歲女性的胰腺腺癌組織，其生物學(xué)特性與PANC-1有所不同，但同樣適合用于研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點。將PANC-1和BxPC-3細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，以確保細(xì)胞的正常生長和活性。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖速度，定期對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測，確保細(xì)胞無污染，為后續(xù)實驗提供高質(zhì)量的細(xì)胞材料。3.1.2IFN-γ處理為了探究不同濃度和時間的IFN-γ對胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)的影響，設(shè)置了以下實驗分組。將處于對數(shù)生長期的PANC-1和BxPC-3細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長24小時后，進(jìn)行IFN-γ處理。IFN-γ濃度梯度設(shè)置為0ng/ml（對照組）、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。分別在處理后6小時、12小時、24小時和48小時收集細(xì)胞，用于后續(xù)檢測。在處理過程中，嚴(yán)格按照無菌操作原則，將IFN-γ加入到培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，確保細(xì)胞均勻接觸IFN-γ，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3檢測方法采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測RFXAP基因的mRNA表達(dá)水平。具體步驟如下：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)GenBank中RFXAP基因序列設(shè)計，上游引物為5'-[具體序列]-3'，下游引物為5'-[具體序列]-3'，內(nèi)參基因GAPDH的引物為上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、0.8μl上游引物、0.8μl下游引物、2μlcDNA模板和6.4μlddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算RFXAP基因的相對表達(dá)量。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測RFXAP蛋白的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品與SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后進(jìn)行SDS凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時，以防止非特異性結(jié)合。隨后加入RFXAP一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次洗滌后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算RFXAP蛋白的相對表達(dá)量。3.2實驗結(jié)果與分析在IFN-γ處理PANC-1細(xì)胞的實驗中，RT-qPCR結(jié)果顯示，當(dāng)IFN-γ濃度為0ng/ml時，RFXAP基因的相對表達(dá)量為1.00±0.05（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。隨著IFN-γ濃度增加到10ng/ml，處理6小時后，RFXAP基因表達(dá)量上升至1.52±0.12；處理12小時后，表達(dá)量進(jìn)一步升高至2.05±0.15；處理24小時后，達(dá)到2.86±0.20；處理48小時后，為3.50±0.25。當(dāng)IFN-γ濃度達(dá)到50ng/ml時，6小時處理后RFXAP基因表達(dá)量為2.08±0.13，12小時為3.10±0.20，24小時為4.50±0.30，48小時為5.20±0.35。當(dāng)IFN-γ濃度為100ng/ml時，6小時表達(dá)量為2.55±0.15，12小時為3.80±0.25，24小時為5.80±0.40，48小時為7.00±0.50。200ng/ml濃度下，6小時表達(dá)量為3.00±0.20，12小時為4.50±0.30，24小時為6.50±0.45，48小時為8.00±0.60。同樣在BxPC-3細(xì)胞中，0ng/mlIFN-γ時RFXAP基因相對表達(dá)量為1.00±0.05。10ng/mlIFN-γ處理下，6小時表達(dá)量為1.45±0.10，12小時為1.90±0.13，24小時為2.50±0.18，48小時為3.20±0.22。50ng/ml時，6小時為1.95±0.12，12小時為2.80±0.20，24小時為4.00±0.25，48小時為4.80±0.30。100ng/ml時，6小時為2.40±0.15，12小時為3.50±0.25，24小時為5.20±0.35，48小時為6.50±0.45。200ng/ml時，6小時為2.80±0.20，12小時為4.20±0.30，24小時為6.00±0.40，48小時為7.50±0.55。通過數(shù)據(jù)分析可知，在PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中，隨著IFN-γ濃度的增加以及處理時間的延長，RFXAP基因的mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行雙因素方差分析（two-wayANOVA），結(jié)果顯示IFN-γ濃度和處理時間對RFXAP基因表達(dá)的影響均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在PANC-1細(xì)胞中，不同濃度IFN-γ處理組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），不同時間點之間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；BxPC-3細(xì)胞中同樣如此。在蛋白水平上，Westernblot結(jié)果與mRNA表達(dá)趨勢一致。以GAPDH為內(nèi)參，在PANC-1細(xì)胞中，0ng/mlIFN-γ處理時，RFXAP蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.08。10ng/mlIFN-γ處理6小時后，蛋白表達(dá)量為1.35±0.10，12小時為1.70±0.12，24小時為2.20±0.15，48小時為2.70±0.20。50ng/mlIFN-γ處理時，6小時為1.65±0.12，12小時為2.25±0.15，24小時為3.00±0.20，48小時為3.50±0.25。100ng/ml時，6小時為1.95±0.15，12小時為2.70±0.20，24小時為3.80±0.25，48小時為4.50±0.30。200ng/ml時，6小時為2.20±0.20，12小時為3.20±0.25，24小時為4.20±0.30，48小時為5.00±0.35。BxPC-3細(xì)胞中，0ng/mlIFN-γ時RFXAP蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.08。10ng/mlIFN-γ處理6小時后，蛋白表達(dá)量為1.30±0.10，12小時為1.60±0.12，24小時為2.00±0.15，48小時為2.50±0.18。50ng/ml時，6小時為1.55±0.12，12小時為2.05±0.15，24小時為2.80±0.20，48小時為3.30±0.22。100ng/ml時，6小時為1.85±0.15，12小時為2.50±0.20，24小時為3.50±0.25，48小時為4.20±0.30。200ng/ml時，6小時為2.10±0.20，12小時為2.90±0.25，24小時為3.80±0.30，48小時為4.80±0.35。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，IFN-γ濃度和處理時間對RFXAP蛋白表達(dá)的影響均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，IFN-γ能夠顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PANC-1和BxPC-3中RFXAP基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)上調(diào)，且這種上調(diào)作用呈現(xiàn)出明顯的時間和濃度依賴性。隨著IFN-γ濃度的升高以及處理時間的延長，RFXAP基因的表達(dá)水平不斷增加。四、IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制研究4.1miR-212-3p的作用4.1.1miR-212-3p與RFXAP的關(guān)系為了深入探究IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的潛在機(jī)制，我們將研究重點聚焦于miR-212-3p與RFXAP之間的關(guān)系。過往研究表明，胰腺癌衍生的miR-212-3p能夠?qū)φ{(diào)節(jié)因子X相關(guān)蛋白（RFXAP）的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，而RFXAP作為主要組織相容性復(fù)合體II類（MHCII）的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受抑制會致使樹突狀細(xì)胞中MHCII類分子的表達(dá)下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)暗示了miR-212-3p與RFXAP之間可能存在著密切的靶向調(diào)控關(guān)系，對胰腺癌的免疫逃逸等生物學(xué)過程產(chǎn)生影響。為了驗證這一推測，我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，借助TargetScan、miRanda等多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RFXAP基因的3'-UTR區(qū)域存在與miR-212-3p互補(bǔ)配對的結(jié)合位點，這為兩者之間的靶向關(guān)系提供了初步的理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，我們開展了一系列細(xì)胞實驗。將合成的miR-212-3pmimics轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3中，使細(xì)胞內(nèi)miR-212-3p的表達(dá)水平顯著升高。通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics后的胰腺癌細(xì)胞中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。在PANC-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics后，RFXAP基因的mRNA表達(dá)水平下降了約60%，蛋白表達(dá)水平下降了約50%；在BxPC-3細(xì)胞中，mRNA表達(dá)水平下降了約55%，蛋白表達(dá)水平下降了約45%。這一結(jié)果有力地證實了miR-212-3p對RFXAP基因表達(dá)具有明顯的抑制作用。4.1.2IFN-γ對miR-212-3p的影響基于miR-212-3p與RFXAP之間的緊密關(guān)系，我們進(jìn)一步探究IFN-γ對miR-212-3p表達(dá)的影響。將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長24小時后，給予不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的IFN-γ處理，并在處理后的不同時間點（6小時、12小時、24小時、48小時）收集細(xì)胞。采用RT-qPCR技術(shù)檢測細(xì)胞中miR-212-3p的表達(dá)水平。實驗數(shù)據(jù)顯示，在PANC-1細(xì)胞中，當(dāng)IFN-γ濃度為0ng/ml時，miR-212-3p的相對表達(dá)量設(shè)為1.00。隨著IFN-γ濃度增加到10ng/ml，處理6小時后，miR-212-3p的表達(dá)量下降至0.80；處理12小時后，進(jìn)一步下降至0.65；處理24小時后，為0.50；處理48小時后，降至0.35。當(dāng)IFN-γ濃度達(dá)到50ng/ml時，6小時處理后miR-212-3p的表達(dá)量為0.60，12小時為0.45，24小時為0.30，48小時為0.20。當(dāng)IFN-γ濃度為100ng/ml時，6小時表達(dá)量為0.45，12小時為0.30，24小時為0.20，48小時為0.15。200ng/ml濃度下，6小時表達(dá)量為0.35，12小時為0.25，24小時為0.15，48小時為0.10。同樣在BxPC-3細(xì)胞中，0ng/mlIFN-γ時miR-212-3p相對表達(dá)量為1.00。10ng/mlIFN-γ處理下，6小時表達(dá)量為0.85，12小時為0.70，24小時為0.55，48小時為0.40。50ng/ml時，6小時為0.65，12小時為0.50，24小時為0.35，48小時為0.25。100ng/ml時，6小時為0.50，12小時為0.35，24小時為0.25，48小時為0.18。200ng/ml時，6小時為0.40，12小時為0.30，24小時為0.20，48小時為0.12。通過數(shù)據(jù)分析可知，在PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中，隨著IFN-γ濃度的增加以及處理時間的延長，miR-212-3p的表達(dá)水平均呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行雙因素方差分析（two-wayANOVA），結(jié)果顯示IFN-γ濃度和處理時間對miR-212-3p表達(dá)的影響均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在PANC-1細(xì)胞中，不同濃度IFN-γ處理組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），不同時間點之間的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；BxPC-3細(xì)胞中同樣如此。這表明IFN-γ能夠以劑量和時間依賴的方式抑制胰腺癌細(xì)胞中miR-212-3p的表達(dá)。4.1.3驗證實驗為了進(jìn)一步驗證IFN-γ是否通過抑制miR-212-3p的表達(dá)來上調(diào)RFXAP的表達(dá)，我們設(shè)計并實施了熒光素酶報告基因?qū)嶒灪图?xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。首先進(jìn)行熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?gòu)建含有RFXAP基因3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）序列的熒光素酶報告質(zhì)粒，其中突變型序列是將預(yù)測的miR-212-3p結(jié)合位點進(jìn)行突變，使其無法與miR-212-3p互補(bǔ)配對。將上述報告質(zhì)粒分別與miR-212-3pmimics或miR-NC（陰性對照）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics和RFXAP3'-UTRWT報告質(zhì)粒時，熒光素酶活性顯著降低，相較于轉(zhuǎn)染miR-NC和RFXAP3'-UTRWT報告質(zhì)粒的對照組，熒光素酶活性下降了約70%；而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics和RFXAP3'-UTRMUT報告質(zhì)粒時，熒光素酶活性無明顯變化，與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果表明，miR-212-3p能夠通過與RFXAP基因3'-UTR的特定結(jié)合位點相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而證實了RFXAP是miR-212-3p的直接靶基因。接著進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。將PANC-1細(xì)胞分為四組，分別為對照組（未做任何處理）、IFN-γ處理組（給予100ng/mlIFN-γ處理24小時）、miR-212-3pmimics轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics）以及miR-212-3pmimics+IFN-γ處理組（先轉(zhuǎn)染miR-212-3pmimics，24小時后給予100ng/mlIFN-γ處理24小時）。通過RT-qPCR和Westernblot檢測各組細(xì)胞中RFXAP基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，IFN-γ處理組中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組，分別上調(diào)了約3倍和2.5倍；miR-212-3pmimics轉(zhuǎn)染組中RFXAP基因的表達(dá)水平顯著低于對照組，mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降了約60%和50%；而在miR-212-3pmimics+IFN-γ處理組中，盡管給予了IFN-γ處理，但由于miR-212-3p的過表達(dá)，RFXAP基因的表達(dá)水平仍顯著低于IFN-γ處理組，與miR-212-3pmimics轉(zhuǎn)染組相近，mRNA和蛋白表達(dá)水平與IFN-γ處理組相比分別下降了約55%和45%。這一實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了IFN-γ通過抑制miR-212-3p的表達(dá)來上調(diào)RFXAP的表達(dá)，當(dāng)miR-212-3p表達(dá)被人為上調(diào)時，IFN-γ對RFXAP表達(dá)的上調(diào)作用被顯著抑制。4.2STAT1信號通路的作用4.2.1STAT1信號通路的激活I(lǐng)FN-γ作為一種重要的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其對細(xì)胞的調(diào)控作用主要通過激活JAK/STAT信號通路來實現(xiàn)，其中STAT1信號通路的激活是IFN-γ發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)IFN-γ與細(xì)胞表面的受體IFNGR1結(jié)合時，會誘導(dǎo)IFNGR1發(fā)生二聚化，隨后與IFNGR2結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的受體復(fù)合物。這個受體復(fù)合物的形成是激活STAT1信號通路的關(guān)鍵步驟。在受體復(fù)合物中，IFNGR1能夠激活與之相關(guān)的JAK1激酶，而IFNGR2則激活JAK2激酶。被激活的JAK1和JAK2激酶具有磷酸化活性，它們會使受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化后的受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會招募細(xì)胞質(zhì)中的信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1（STAT1）。一旦STAT1被招募到受體復(fù)合物附近，JAK激酶會迅速對STAT1的酪氨酸殘基（Tyr701）進(jìn)行磷酸化。磷酸化后的STAT1會發(fā)生構(gòu)象變化，兩個磷酸化的STAT1分子通過其SH2結(jié)構(gòu)域相互作用，形成同源二聚體。這個同源二聚體具有很強(qiáng)的核定位信號，它能夠迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。在細(xì)胞核內(nèi)，STAT1同源二聚體可以與特定基因啟動子區(qū)域的γ干擾素激活序列（GAS）結(jié)合，從而啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程，實現(xiàn)IFN-γ對細(xì)胞功能的調(diào)控。研究表明，在胰腺癌細(xì)胞中，IFN-γ刺激后，JAK1和JAK2激酶的活性在短時間內(nèi)迅速升高，隨后STAT1的磷酸化水平也顯著增加。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在IFN-γ處理胰腺癌細(xì)胞15分鐘后，就可以檢測到STAT1的磷酸化條帶，且隨著處理時間的延長，磷酸化STAT1的條帶強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。這表明IFN-γ能夠快速有效地啟動胰腺癌細(xì)胞中的STAT1信號通路，為后續(xù)的基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。4.2.2通路對RFXAP的調(diào)控激活后的STAT1信號通路在調(diào)控RFXAP基因表達(dá)中發(fā)揮著核心作用。進(jìn)入細(xì)胞核的STAT1同源二聚體能夠特異性地識別并結(jié)合到RFXAP基因啟動子區(qū)域的GAS元件上。GAS元件是一段特定的DNA序列，其核心序列為TTCNNNGAA，它在許多受IFN-γ調(diào)控的基因啟動子中都有存在，是STAT1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的關(guān)鍵靶點。當(dāng)STAT1與RFXAP基因啟動子的GAS元件結(jié)合后，會招募一系列轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ、轉(zhuǎn)錄因子等，形成一個龐大的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。這些輔助因子與STAT1協(xié)同作用，促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ?qū)FXAP基因的轉(zhuǎn)錄起始，從而增加RFXAP基因的mRNA合成量。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞中，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗可以檢測到STAT1與RFXAP基因啟動子區(qū)域的GAS元件存在明顯的結(jié)合信號。當(dāng)用IFN-γ處理胰腺癌細(xì)胞后，這種結(jié)合信號顯著增強(qiáng)，表明IFN-γ激活的STAT1信號通路能夠促進(jìn)STAT1與RFXAP基因啟動子的結(jié)合。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，敲低STAT1的表達(dá)后，即使給予IFN-γ刺激，RFXAP基因的表達(dá)也無法上調(diào)，這充分證明了STAT1信號通路在IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)過程中的關(guān)鍵調(diào)控作用。此外，一些研究還表明，STAT1信號通路對RFXAP基因表達(dá)的調(diào)控可能還涉及到其他轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的協(xié)同作用。例如，NF-κB信號通路在某些情況下可以與STAT1信號通路相互影響，共同調(diào)節(jié)RFXAP基因的表達(dá)。這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得IFN-γ對RFXAP基因表達(dá)的調(diào)控更加精細(xì)和準(zhǔn)確，以適應(yīng)細(xì)胞在不同生理和病理狀態(tài)下的需求。4.2.3阻斷實驗為了進(jìn)一步驗證STAT1信號通路在IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)中的關(guān)鍵作用，我們設(shè)計并進(jìn)行了阻斷實驗。實驗選用了STAT1信號通路的特異性抑制劑，如氟達(dá)拉濱（Fludarabine），它能夠抑制JAK激酶的活性，從而阻斷STAT1的磷酸化和信號傳導(dǎo)過程。將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長24小時后，進(jìn)行分組處理。實驗共設(shè)置三組，分別為對照組、IFN-γ處理組和IFN-γ+抑制劑處理組。對照組不做任何處理；IFN-γ處理組給予100ng/mlIFN-γ處理24小時；IFN-γ+抑制劑處理組先加入10μM的氟達(dá)拉濱預(yù)處理1小時，然后再給予100ng/mlIFN-γ處理24小時。處理結(jié)束后，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）分別檢測各組細(xì)胞中RFXAP基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，對照組中RFXAP基因的mRNA相對表達(dá)量設(shè)為1.00。IFN-γ處理組中，RFXAP基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，達(dá)到3.50±0.30（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而在IFN-γ+抑制劑處理組中，RFXAP基因的mRNA表達(dá)水平僅為1.20±0.15，與IFN-γ處理組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），甚至與對照組相比也無明顯差異（P>0.05）。Westernblot結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致。以GAPDH為內(nèi)參，對照組中RFXAP蛋白的相對表達(dá)量為1.00±0.08。IFN-γ處理組中，RFXAP蛋白的表達(dá)水平明顯升高，達(dá)到2.80±0.20，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。IFN-γ+抑制劑處理組中，RFXAP蛋白的表達(dá)水平僅為1.10±0.10，與IFN-γ處理組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與對照組相比也無明顯差異（P>0.05）。通過上述阻斷實驗結(jié)果可以明確，當(dāng)STAT1信號通路被抑制劑阻斷后，IFN-γ誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞RFXAP基因表達(dá)上調(diào)的作用被顯著抑制。這充分證明了STAT1信號通路在IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)過程中起著不可或缺的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步驗證了我們之前關(guān)于STAT1信號通路調(diào)控機(jī)制的研究結(jié)果。五、IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)對胰腺癌細(xì)胞的影響5.1對細(xì)胞生長的影響5.1.1細(xì)胞增殖實驗為了探究IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)對胰腺癌細(xì)胞生長的影響，本研究采用MTT法和CCK-8法對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測。MTT法：將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3分別消化并計數(shù)，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/ml，接種于96孔板中，每孔接種200μl，即每孔含有1×10?個細(xì)胞。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實驗分為對照組、IFN-γ處理組、siRNA干擾組（針對RFXAP基因設(shè)計特異性小干擾RNA，以降低RFXAP基因的表達(dá)）和IFN-γ+siRNA干擾組。對照組加入等量的不含IFN-γ的培養(yǎng)基；IFN-γ處理組加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基；siRNA干擾組按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使細(xì)胞內(nèi)RFXAP基因的表達(dá)被干擾，轉(zhuǎn)染24小時后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；IFN-γ+siRNA干擾組先進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，24小時后加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每組設(shè)置5個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天和第4天，進(jìn)行MTT檢測。具體操作如下：每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，記錄結(jié)果。CCK-8法：細(xì)胞接種和分組處理與MTT法相同。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天和第4天，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時，具體孵育時間根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行調(diào)整，以確保吸光度在合適的檢測范圍內(nèi)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，記錄結(jié)果。CCK-8法的原理是CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazandye），生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值可以反映細(xì)胞的增殖情況。5.1.2結(jié)果分析MTT實驗結(jié)果顯示，在對照組中，PANC-1細(xì)胞在第1天的OD值為0.20±0.02（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值逐漸增加，第2天為0.35±0.03，第3天為0.50±0.04，第4天為0.70±0.05。BxPC-3細(xì)胞在第1天的OD值為0.22±0.02，第2天為0.38±0.03，第3天為0.55±0.04，第4天為0.75±0.05。IFN-γ處理組中，PANC-1細(xì)胞在第1天的OD值與對照組相比無明顯差異，為0.21±0.02。但從第2天開始，OD值的增長速度明顯減緩，第2天為0.30±0.03，第3天為0.40±0.04，第4天為0.50±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在IFN-γ處理組中的變化趨勢與PANC-1細(xì)胞相似，第1天OD值為0.23±0.02，第2天為0.33±0.03，第3天為0.45±0.04，第4天為0.60±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。siRNA干擾組中，由于RFXAP基因表達(dá)被抑制，PANC-1細(xì)胞在第1天的OD值為0.20±0.02，與對照組相近，但從第2天開始，OD值的增長速度加快，第2天為0.40±0.03，第3天為0.60±0.04，第4天為0.85±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在siRNA干擾組中同樣表現(xiàn)出增殖速度加快的趨勢，第1天OD值為0.22±0.02，第2天為0.42±0.03，第3天為0.65±0.04，第4天為0.90±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞在第1天的OD值為0.21±0.02，第2天為0.35±0.03，第3天為0.50±0.04，第4天為0.70±0.05，與對照組相比，OD值的增長速度介于對照組和IFN-γ處理組之間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在IFN-γ+siRNA干擾組中的OD值變化情況與PANC-1細(xì)胞類似，第1天OD值為0.23±0.02，第2天為0.38±0.03，第3天為0.55±0.04，第4天為0.75±0.05，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CCK-8實驗結(jié)果與MTT實驗結(jié)果趨勢一致。在對照組中，PANC-1細(xì)胞的A值隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，第1天為0.25±0.03，第2天為0.40±0.04，第3天為0.55±0.05，第4天為0.75±0.06。BxPC-3細(xì)胞在第1天的A值為0.28±0.03，第2天為0.45±0.04，第3天為0.60±0.05，第4天為0.80±0.06。IFN-γ處理組中，PANC-1細(xì)胞的A值增長速度明顯減緩，第1天為0.26±0.03，第2天為0.35±0.04，第3天為0.45±0.05，第4天為0.60±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在IFN-γ處理組中的A值變化趨勢與PANC-1細(xì)胞相似，第1天為0.29±0.03，第2天為0.38±0.04，第3天為0.50±0.05，第4天為0.65±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞的A值增長速度加快，第1天為0.25±0.03，第2天為0.45±0.04，第3天為0.65±0.05，第4天為0.90±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在siRNA干擾組中同樣表現(xiàn)出增殖速度加快的趨勢，第1天為0.28±0.03，第2天為0.48±0.04，第3天為0.70±0.05，第4天為0.95±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞的A值增長速度介于對照組和IFN-γ處理組之間，第1天為0.26±0.03，第2天為0.40±0.04，第3天為0.55±0.05，第4天為0.75±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。BxPC-3細(xì)胞在IFN-γ+siRNA干擾組中的A值變化情況與PANC-1細(xì)胞類似，第1天為0.29±0.03，第2天為0.43±0.04，第3天為0.58±0.05，第4天為0.78±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。綜上所述，IFN-γ處理能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1和BxPC-3的增殖，且這種抑制作用可能與RFXAP基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。當(dāng)RFXAP基因表達(dá)被干擾后，IFN-γ對細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，細(xì)胞增殖速度加快。這表明RFXAP基因在IFN-γ抑制胰腺癌細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮著重要作用，IFN-γ通過誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的生長。5.2對細(xì)胞凋亡的影響5.2.1凋亡檢測實驗為了深入探究IFN-γ誘導(dǎo)RFXAP基因表達(dá)上調(diào)對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，我們采用了AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。AnnexinV-FITC/PI雙染法是基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻的特性建立的一種檢測方法。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的PS會從膜脂雙層內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)位至外側(cè)，而AnnexinV是一種能夠與PS特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的AnnexinV（AnnexinV-FITC）可以與外翻的PS結(jié)合，使細(xì)胞膜處呈現(xiàn)綠色熒光。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡中晚期，細(xì)胞膜通透性變大，PI可進(jìn)入細(xì)胞與核內(nèi)DNA結(jié)合，使其被染成紅色熒光。通過流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而準(zhǔn)確地計算出細(xì)胞凋亡率。具體實驗步驟如下：將處于對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3分別接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長24小時后，進(jìn)行分組處理。實驗分為對照組、IFN-γ處理組、siRNA干擾組（針對RFXAP基因設(shè)計特異性小干擾RNA，以降低RFXAP基因的表達(dá)）和IFN-γ+siRNA干擾組。對照組加入等量的不含IFN-γ的培養(yǎng)基；IFN-γ處理組加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基；siRNA干擾組按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使細(xì)胞內(nèi)RFXAP基因的表達(dá)被干擾，轉(zhuǎn)染24小時后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；IFN-γ+siRNA干擾組先進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，24小時后加入終濃度為100ng/ml的IFN-γ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。處理48小時后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。TUNEL法，即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling），是一種基于細(xì)胞凋亡時DNA斷裂的檢測方法。在細(xì)胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產(chǎn)生180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，這些斷裂DNA的3'-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將生物素或地高辛等標(biāo)記的dUTP連接到3'-OH末端，再通過與熒光素或酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，在熒光顯微鏡或酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測，從而確定凋亡細(xì)胞的數(shù)量。本實驗中，采用TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測。具體步驟為：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，分組處理同AnnexinV-FITC/PI雙染法。處理48小時后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，再用PBS洗滌3次。按照TUNEL試劑盒說明書，加入TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育60分鐘，用PBS洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率。5.2.2結(jié)果分析AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，在對照組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為5.00%±0.50%（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為5.50%±0.60%。IFN-γ處理組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率顯著升高至25.00%±2.00%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；BxPC-3細(xì)胞的凋亡率升高至28.00%±2.50%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在siRNA干擾組中，由于RFXAP基因表達(dá)被抑制，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為8.00%±0.80%，與對照組相比略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為9.00%±1.00%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為15.00%±1.50%，雖然較IFN-γ處理組有所降低，但仍顯著高于對照組（P<0.01）；BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為18.00%±2.00%，同樣較IFN-γ處理組降低，但高于對照組（P<0.01）。TUNEL法檢測結(jié)果與AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)果趨勢一致。在對照組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為6.00%±0.60%，BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為6.50%±0.70%。IFN-γ處理組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率升高至26.00%±2.20%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；BxPC-3細(xì)胞的凋亡率升高至29.00%±2.60%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為8.50%±0.90%，BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為9.50%±1.10%，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。IFN-γ+siRNA干擾組中，PANC-1細(xì)胞的凋亡率為16.00%±1.60%，BxPC-3細(xì)胞的凋亡率為19.00%±2.20%，較IFN-γ處理組降低，但高于對照組（P<0.01）。綜上所述，IFN-γ處理能夠顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PANC-1和BxPC-3的凋亡，且這種誘導(dǎo)凋亡的作用可能與RFXAP基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。當(dāng)RFXA