Hsp90α在IBDV感染雞法氏囊細胞中的角色與IBDV結合區解析一、引言1.1研究背景與意義禽傳染性法氏囊病（InfectiousBursalDisease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV）引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，對全球禽類養殖業造成了巨大的經濟損失。IBDV主要感染3-6周齡的雛雞，其致病機制主要包括急慢性炎性損傷、細胞凋亡和免疫抑制。在感染過程中，IBDV在法氏囊細胞中快速復制，引發雞體的免疫反應，導致B淋巴細胞和T淋巴細胞變性、壞死，細胞數量減少，抑制淋巴細胞增殖，從而引起免疫抑制。同時，活化后增殖的B淋巴細胞在感染IBDV后會裂解，巨噬細胞亦可持續被IBDV血清I型株感染，大量釋放腫瘤壞死因子或白介素6等細胞因子，進一步加重免疫抑制和組織損傷。此外，IBDV侵染所導致的免疫抑制與細胞凋亡有一定的相關性，不同強弱毒株所引起法氏囊原代細胞凋亡程度不同，vvIBDV較經典弱毒株能引起較多的法氏囊原代細胞凋亡。IBDV屬于雙RNA病毒科（Birnaviridae），禽雙鏈RNA病毒屬（Avibirnavirus），是一種雙股、雙片段、無囊膜的RNA病毒。在血清型上分為血清Ⅰ型（雞型）和Ⅱ型（火雞型），其中只有血清I型對雞致病，Ⅱ型不致病。血清1型毒株根據VP2基因又可進一步分為經典毒株（cIBDV）、弱毒株（aIBDV）、變異株（vIBDV）、新型變異株（nVarIBDV）及超強毒株（vvIBDV）。自IBDV被發現以來，其流行毒株不斷演變。最初的流行毒株為經典株，當時的疫苗能夠提供很好的保護。然而，1987年美國報道了vIBDV，隨后荷蘭又分離出vvIBDV，這些毒株與cIBDV在抗原性和毒力上存在較大差異，導致疫苗免疫抑制與保護失敗的情況頻繁發生。2016年以來，我國華東地區首次在白羽肉雞上發現nVarIBDV，并迅速蔓延至全國。近兩年，我國雞傳染性法氏囊病疫苗免疫雞群頻繁發生IBDV感染，遺傳進化分析表明，分離的部分毒株與vvIBDV屬于同一進化大分支，但卻獨立進化出新分支，部分關鍵氨基酸位點趨同于nVarIBDV，被稱之為超強株變異株（nvvIBDV）。nvvIBDV的出現，使得當前疫苗無法對該毒株提供有效保護，已成為當前優勢流行毒株，并與nVarIBDV共同成為我國IBDV流行的主要毒株。IBDV主要經呼吸道與消化道傳播，具有病程短、發病快、死亡率高、傳播迅速等特點，控制難度極大，給家禽養殖業帶來了嚴重的經濟損失，已被世界動物衛生組織列為重要家禽疫病之一。在我國，肉雞養殖體量大，IBD流行普遍，nvvIBDV的出現更是使得疫苗無法提供有效保護，這一系列問題促使我們必須加強對IBD的研究，以尋找更有效的防控措施。熱應激蛋白90（HeatShockProtein90,Hsp90）是一種廣泛存在于細胞質中的分子伴侶，在細胞內發揮著重要的作用，參與多種細胞生理過程，如信號轉導、細胞周期調控和凋亡路徑等。Hsp90家族主要包括Hsp90α和Hsp90β兩種亞型，其中Hsp90α在多種細胞應激反應中發揮著關鍵作用。研究表明，Hsp90α參與了多種病毒的感染過程，與病毒的復制、裝配和釋放等環節密切相關。在病毒感染宿主細胞的過程中，病毒需要與宿主細胞表面的受體或其他分子相互作用，才能進入細胞并進行復制。Hsp90α可能作為一種分子伴侶，協助病毒蛋白的折疊和組裝，或者與病毒蛋白相互作用，影響病毒的感染效率。對于IBDV感染雞法氏囊細胞的過程，Hsp90α是否參與其中以及其具體作用機制尚不清楚。探究Hsp90α在IBDV感染雞法氏囊細胞中的作用，以及確定Hsp90α與IBDV的結合區，對于深入了解IBDV的感染機制具有重要意義。一方面，這有助于揭示IBDV感染宿主細胞的分子機制，為進一步研究IBDV的致病機理提供理論基礎；另一方面，通過明確Hsp90α與IBDV的相互作用關系，有望為開發新型的抗IBDV藥物或疫苗提供新的靶點和思路，從而為IBD的防控提供更有效的手段。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探究Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細胞的具體機制，并初步確定Hsp90α與IBDV的結合區，為揭示IBDV的感染機理以及開發新型抗IBDV藥物或疫苗提供理論依據和潛在靶點。圍繞這一總體目標，本研究主要開展以下兩方面的工作：1.2.1Hsp90α參與IBDV感染法氏囊細胞的初步研究首先，利用RT-PCR技術檢測IBDV感染雞法氏囊細胞后Hsp90α基因轉錄水平的變化，明確IBDV感染是否會對Hsp90α基因的轉錄產生影響。接著，運用間接免疫熒光試驗（IFA）觀察IBDV感染雞法氏囊細胞后Hsp90α蛋白的表達和分布情況，從蛋白層面了解Hsp90α在IBDV感染過程中的動態變化。最后，通過IBDV感染阻斷試驗，分別使用重組Hsp90α蛋白和抗Hsp90α抗體處理雞法氏囊細胞，然后接種IBDV，檢測病毒的感染情況，以此來確定Hsp90α是否參與IBDV感染雞法氏囊細胞的過程以及其對感染過程的影響。1.2.2Hsp90α蛋白IBDV結合區的初步確定從雞法氏囊細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。將擴增得到的cDNA片段克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構建重組表達載體。把重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導表達重組蛋白。利用鎳離子親和層析柱對重組蛋白進行純化，并通過SDS和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定。最后，采用Far-Westernblot和ELISA等方法，以純化的重組蛋白和IBDV為材料，鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區，明確二者相互作用的關鍵區域。1.3研究方法與創新點在研究方法上，本研究綜合運用了多種技術手段。RT-PCR技術能夠快速、靈敏地檢測Hsp90α基因轉錄水平的變化，為研究IBDV感染對Hsp90α基因表達的影響提供了精確的數據支持。間接免疫熒光試驗（IFA）則從蛋白層面直觀地展示了Hsp90α蛋白在IBDV感染雞法氏囊細胞后的表達和分布情況，有助于深入了解其在感染過程中的動態變化。IBDV感染阻斷試驗通過使用重組Hsp90α蛋白和抗Hsp90α抗體處理細胞，然后接種IBDV，檢測病毒的感染情況，直接驗證了Hsp90α與IBDV感染過程的相關性。在確定Hsp90α蛋白IBDV結合區時，本研究采用了基因克隆技術擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA，并將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構建重組表達載體。利用大腸桿菌BL21(DE3)表達重組蛋白，并通過鎳離子親和層析柱進行純化，最后通過SDS和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定，確保了重組蛋白的純度和質量。采用Far-Westernblot和ELISA等方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區，這些方法具有較高的特異性和靈敏度，能夠準確地確定二者相互作用的關鍵區域。本研究的創新點主要體現在研究內容和方法的結合上。目前對于IBDV感染機制的研究多集中在病毒本身的結構和功能，以及宿主細胞的免疫反應等方面，而對于宿主細胞內分子伴侶如Hsp90α在IBDV感染過程中的作用研究較少。本研究首次探討Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細胞的機制以及確定其與IBDV的結合區，為IBDV感染機制的研究開辟了新的方向。在方法上，本研究將多種分子生物學和免疫學技術有機結合，從基因轉錄、蛋白表達和相互作用等多個層面深入研究Hsp90α與IBDV的關系，這種多技術聯用的研究方法能夠更全面、深入地揭示二者之間的相互作用機制，為后續相關研究提供了新的思路和方法。二、相關理論基礎與研究進展2.1傳染性法氏囊病病毒（IBDV）研究進展2.1.1IBDV的結構與基因組特征IBDV呈球形，無囊膜結構，其直徑約為60-70nm，整體呈20面體對稱。病毒粒子由核心、內衣殼和外衣殼三層結構有序組成。核心部分包含著病毒的基因組，是以雙股RNA的形式存在，這是IBDV遺傳信息的攜帶者，對病毒的復制、變異以及致病性等起著關鍵的決定作用。內衣殼由VP3蛋白構成，VP3蛋白具有獨特的RNA聚合酶活性，在病毒的生物合成過程中，能夠以病毒基因組RNA為模板，催化合成新的RNA分子，為病毒的大量增殖提供必要的物質基礎。外衣殼則由VP2蛋白組成，VP2蛋白是病毒的主要結構蛋白，它直接暴露在病毒粒子的表面，與病毒的抗原性密切相關。VP2蛋白上存在著多個抗原表位，這些抗原表位能夠被宿主免疫系統識別，從而激發宿主產生免疫反應。同時，VP2蛋白的氨基酸序列存在一定的變異性，這種變異性會導致病毒抗原性的改變，使得不同毒株之間在抗原性上存在差異，這也是IBDV免疫防控面臨挑戰的重要原因之一。IBDV的基因組包含A、B兩個線狀雙股RNA分子，大小約為6.0kbp。其中，A片段較大，其上有兩個開放閱讀框（ORF）。較大的一個ORF編碼一個聚合蛋白及VP4，這個聚合蛋白在病毒感染宿主細胞的過程中，會被進一步加工，裂解形成VP2和VP3兩個結構蛋白，它們在病毒粒子的組裝和結構穩定中發揮著不可或缺的作用。VP4是病毒的蛋白酶，它能夠對病毒的一些蛋白前體進行切割加工，促使病毒蛋白的成熟和功能的正常發揮。較小的ORF則編碼VP5蛋白，VP5蛋白在病毒感染宿主細胞后的早期階段發揮作用，可能參與病毒的入侵、細胞內的轉運以及免疫逃逸等過程，但目前對于VP5蛋白的具體功能和作用機制還尚未完全明確，仍有待進一步深入研究。B片段編碼VP1蛋白，VP1蛋白是病毒的RNA依賴RNA聚合酶，在病毒基因組的復制過程中，它能夠以病毒的RNA為模板，按照堿基互補配對原則，合成子代病毒的RNA，保證病毒遺傳信息的準確傳遞和復制。2.1.2IBDV的分類、抗原性及致病性在分類學上，IBDV屬于雙RNA病毒科（Birnaviridae）禽雙鏈RNA病毒屬（Avibirnavirus）。目前已知IBDV存在兩個血清型，即血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。血清Ⅰ型主要從雞中分離得到，對雞具有致病性，感染后會導致雞出現一系列的臨床癥狀和病理變化，嚴重影響雞的生長發育和健康，是危害養禽業的主要病原。該型病毒能夠感染雞的法氏囊，破壞法氏囊中的淋巴細胞，導致雞的免疫功能受損，出現免疫抑制現象，使得雞對其他病原體的易感性增加，容易繼發感染其他疾病。血清Ⅱ型來源于火雞，對雞和火雞均無致病性，通常只會引起亞臨床感染，即在感染后不表現出明顯的臨床癥狀，但病毒可以在宿主體內存在并進行一定程度的復制。兩型病毒之間的抗原相關性小于10%，這意味著它們的抗原結構存在較大差異，相互之間的交叉保護作用很低。因此，針對血清Ⅰ型病毒研制的疫苗，對血清Ⅱ型病毒感染不能提供有效的保護，反之亦然。在實際的疫病防控中，需要準確區分病毒的血清型，以便采取針對性的防控措施。血清Ⅰ型毒株根據VP2基因的差異，又可進一步細分為經典毒株（cIBDV）、弱毒株（aIBDV）、變異株（vIBDV）、新型變異株（nVarIBDV）及超強毒株（vvIBDV）。不同類型的毒株在毒力、抗原性和致病性等方面表現出顯著的差異。經典毒株毒力相對較弱，感染雞后主要引起法氏囊的輕微病變，雞的臨床癥狀相對較輕，死亡率較低。然而，隨著時間的推移和病毒的進化，出現了毒力更強的變異株和超強毒株。變異株的毒力較強，感染后可導致法氏囊嚴重萎縮和壞死，雞群的發病率和死亡率明顯升高。超強毒株的毒力極強，能夠在短時間內導致雞群的高死亡率，給養禽業帶來巨大的經濟損失。新型變異株則是近年來新出現的類型，其在抗原性和致病性上又有新的特點，目前對其研究還在不斷深入中。這些不同毒株之間的免疫交叉反應不完全，這給疫苗的研發和免疫防控工作帶來了極大的挑戰。如果疫苗株與流行毒株的抗原性差異較大，疫苗免疫后就無法有效地激發機體產生針對流行毒株的免疫保護，從而導致免疫失敗。因此，及時監測IBDV的流行毒株類型及其抗原性變化，對于研發有效的疫苗和制定合理的免疫程序至關重要。IBDV主要感染雞的法氏囊，法氏囊是雞的中樞免疫器官，對于雞的體液免疫功能的正常發揮起著關鍵作用。IBDV感染法氏囊后，會在囊內的淋巴細胞中大量復制，導致淋巴細胞變性、壞死，細胞數量急劇減少。這使得雞體無法正常產生免疫球蛋白，從而降低或喪失免疫機能，出現免疫抑制現象。免疫抑制的雞群對其他疫苗，如新城疫（ND）、禽流感（AI）、傳染性支氣管炎（IB）等疫苗的免疫應答能力下降，即使接種了這些疫苗，也難以產生有效的免疫保護，容易感染相應的疫病。同時，免疫抑制還會使雞群對其他病原體的易感性顯著增加，如大腸桿菌、葡萄球菌等細菌以及其他病毒，導致雞群更容易發生混合感染或繼發感染，使病情更加復雜和嚴重，給疾病的診斷和治療帶來更大的困難。2.1.3IBDV的培養特性與抵抗力IBDV在體外培養時，具有一定的特性。它可在9-11日齡無母源抗體的雞胚上進行增殖，通過尿囊腔接種或絨毛尿囊膜接種的方式，IBDV能夠在雞胚內生長繁殖，并在接種后的3-7天導致雞胚死亡。死亡的雞胚通常會出現特征性的病變，如胚體腹部水腫、出血，肝臟斑駁壞死并伴有出血斑，腎臟充血且有斑駁壞死等。此外，IBDV還能在雞胚成纖維細胞、雞胚腎細胞、鴨胚細胞以及猴腎細胞等多種細胞中生長。在雞胚成纖維細胞內，IBDV能夠增殖并形成蝕斑，蝕斑是病毒在細胞單層上形成的局限性病灶，通過觀察蝕斑的大小、形態和數量等特征，可以對病毒的滴度和感染性進行測定。在實際的病毒研究和疫苗生產中，常常利用雞胚或細胞培養的方法來擴增IBDV，為后續的病毒檢測、疫苗研發等工作提供足夠的病毒材料。IBDV在外界環境中具有較強的抵抗力。在中性和弱堿性條件下，IBDV表現得較為穩定。在pH值為3-9的范圍內，病毒能夠保持其感染性。它對乙醚、氯仿等脂溶劑不敏感，這是因為IBDV無囊膜結構，脂溶劑無法破壞其病毒粒子的結構，從而不能使其失去感染活性。IBDV對紫外線和超聲波也有極強的抵抗力，普通的紫外線照射和超聲波處理難以將其滅活。在溫度耐受性方面，IBDV在56℃條件下3小時不受影響，56℃5小時或60℃90分鐘仍然可存活，只有在70℃30分鐘的條件下才可被滅活。在自然環境中，IBDV可存在于污染的飼料、飲水、墊料和糞便中，通過直接接觸或間接接觸的方式傳播給易感雞群。在徹底清洗、消毒的雞舍中，IBDV仍然可能存在，在雞舍內可存活2-4個月之久。然而，IBDV對甲醛、碘制劑、過氧化氫、氯胺等消毒藥敏感。在養殖生產中，可以利用這些消毒劑對雞舍、養殖設備等進行定期消毒，以減少環境中病毒的含量，降低雞群感染IBDV的風險。在堿性（pH12.0）條件下，IBDV可被滅活，但在酸性（pH2.0）條件下卻可存活。了解IBDV的這些抵抗力特性，對于制定有效的疫病防控措施和消毒方案具有重要的指導意義。2.2熱應激蛋白90（Hsp90）研究進展2.2.1Hsp90的結構與功能熱應激蛋白90（Hsp90）是一類高度保守的分子伴侶，在真核生物和原核生物中廣泛存在。Hsp90家族成員在氨基酸序列上具有較高的同源性，其結構呈現出高度的保守性。Hsp90蛋白由三個主要的結構域組成，分別是N端結構域、中間結構域和C端結構域。N端結構域約由250個氨基酸殘基組成，該結構域含有ATP/ADP結合位點，ATP的結合與水解對于Hsp90的功能發揮起著至關重要的調節作用。當ATP結合到N端結構域時，Hsp90的構象會發生改變，從而影響其與底物蛋白以及其他輔助因子的相互作用。中間結構域是Hsp90與底物蛋白相互作用的關鍵區域，它包含了多個保守的氨基酸序列，能夠特異性地識別并結合底物蛋白。不同的底物蛋白與中間結構域的結合方式和親和力有所不同，這決定了Hsp90對不同底物蛋白的作用特異性。C端結構域則參與了Hsp90的二聚化過程，使得Hsp90能夠以二聚體的形式發揮其分子伴侶的功能。二聚化的Hsp90在結構上更加穩定，能夠更有效地結合和折疊底物蛋白。除了這三個主要結構域外，Hsp90還包含一些連接區域，這些連接區域在維持Hsp90的整體結構穩定性以及調節其功能方面也發揮著重要作用。在細胞內，Hsp90參與了多種重要的生理過程，對維持細胞的正常功能起著不可或缺的作用。蛋白質折疊是細胞內蛋白質合成后的關鍵步驟，正確折疊的蛋白質才能發揮其正常的生物學功能。Hsp90能夠與新合成的多肽鏈或未折疊的蛋白質結合，通過其獨特的分子伴侶機制，協助這些蛋白質正確折疊成具有天然構象的功能蛋白。在這個過程中，Hsp90利用ATP水解提供的能量，不斷調整自身的構象，從而促進底物蛋白的折疊。如果細胞內缺乏Hsp90的協助，許多蛋白質可能會發生錯誤折疊，形成聚集體，這些聚集體不僅無法發揮正常功能，還可能對細胞造成損傷，引發一系列的疾病。細胞信號傳導是細胞對外界刺激做出響應的重要機制，涉及到多種信號分子的參與和相互作用。Hsp90與許多細胞信號傳導蛋白相互作用，對這些蛋白的穩定性、活性以及定位進行精確調節，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡等關鍵過程。在細胞周期調控中，Hsp90與周期蛋白依賴性激酶（CDK）等關鍵蛋白相互作用，確保細胞周期的正常進行。如果Hsp90的功能受到抑制，可能會導致細胞周期紊亂，引發細胞異常增殖或凋亡。在細胞凋亡過程中，Hsp90也參與其中，它可以與凋亡相關蛋白相互作用，調節細胞凋亡的信號通路，決定細胞是否走向凋亡。在腫瘤細胞中，Hsp90常常高表達，它與許多癌基因通路中的關鍵蛋白相互作用，如Raf-1、HER2/ErbB-2等，穩定這些蛋白的構象，促進腫瘤細胞的生長、增殖和轉移。因此，Hsp90成為了腫瘤治療的一個重要靶點，通過抑制Hsp90的功能，可以阻斷腫瘤細胞的信號傳導通路，抑制腫瘤細胞的生長。此外，Hsp90還參與了蛋白質的轉運和降解過程。在蛋白質轉運方面，Hsp90可以與一些轉運蛋白相互作用，協助蛋白質在細胞內的運輸，確保蛋白質能夠準確地到達其發揮功能的部位。在蛋白質降解過程中，Hsp90參與了泛素-蛋白酶體系統（UPS）對錯誤折疊或受損蛋白質的降解。當蛋白質發生錯誤折疊或受到損傷時，Hsp90會協助識別這些蛋白質，并將它們標記上泛素，使其能夠被蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內蛋白質的質量平衡。2.2.2Hsp90α的特性與生物學作用Hsp90α是Hsp90家族中的一個重要亞型，與Hsp90家族的其他成員相比，Hsp90α具有一些獨特的特性。在基因表達調控方面，Hsp90α的表達受到多種因素的精細調控。熱應激是誘導Hsp90α表達的重要因素之一，當細胞受到高溫刺激時，熱休克轉錄因子（HSF）會被激活，HSF與Hsp90α基因啟動子區域的熱休克元件（HSE）結合，從而啟動Hsp90α基因的轉錄，使Hsp90α的表達量迅速增加。除了熱應激外，其他應激因素，如氧化應激、缺氧、紫外線照射等，也能誘導Hsp90α的表達。在氧化應激條件下，細胞內產生大量的活性氧（ROS），這些ROS會激活細胞內的信號通路，最終導致Hsp90α表達上調。此外，一些細胞因子和生長因子也可以調節Hsp90α的表達。在炎癥反應過程中，炎癥細胞分泌的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，能夠刺激細胞表達Hsp90α，以應對炎癥環境對細胞造成的損傷。在細胞內的定位和分布上，Hsp90α主要存在于細胞質中，但在某些情況下，它也會出現在細胞核、線粒體等細胞器中。在正常生理狀態下，Hsp90α在細胞質中與多種底物蛋白相互作用，發揮其分子伴侶的功能。當細胞受到應激刺激時，部分Hsp90α會被轉運到細胞核內，參與細胞核內蛋白質的折疊和修復。在細胞核中，Hsp90α可以與轉錄因子、染色質相關蛋白等相互作用，維持這些蛋白的正常功能，確保基因的正常轉錄。此外，Hsp90α還可以定位于線粒體，參與線粒體蛋白質的折疊和組裝，維持線粒體的正常結構和功能。線粒體是細胞的能量工廠，其功能的正常發揮對于細胞的生存至關重要。Hsp90α在線粒體中的作用，有助于保證線粒體呼吸鏈復合物的正確組裝，維持線粒體的能量代謝。Hsp90α在細胞應激反應中扮演著關鍵角色。當細胞遭受各種應激時，如高溫、氧化應激、紫外線照射等，細胞內的蛋白質會發生變性和錯誤折疊，這些異常蛋白質的積累會對細胞造成嚴重的損傷。Hsp90α能夠迅速響應應激信號，大量表達并與這些變性或錯誤折疊的蛋白質結合，通過其分子伴侶活性，幫助這些蛋白質重新折疊成正確的構象，從而保護細胞免受應激損傷。在高溫應激條件下，細胞內的蛋白質分子由于熱運動加劇，容易發生變性。Hsp90α會與變性的蛋白質結合，利用ATP水解提供的能量，逐步解開蛋白質的錯誤折疊結構，并引導其重新折疊成正確的三維結構。這一過程不僅能夠恢復蛋白質的功能，還能防止蛋白質聚集形成不可溶性的聚集體，避免對細胞造成進一步的傷害。在免疫調節方面，Hsp90α也發揮著重要的作用。它參與了抗原呈遞過程，能夠與抗原肽結合，將其轉運至抗原呈遞細胞（APC）的表面，供T淋巴細胞識別，從而激活機體的免疫反應。在樹突狀細胞中，Hsp90α可以與內吞的抗原肽結合，形成Hsp90α-抗原肽復合物。該復合物通過與樹突狀細胞表面的特定受體結合，被轉運至細胞表面，然后與主要組織相容性復合體（MHC）分子結合，將抗原肽呈遞給T淋巴細胞，啟動適應性免疫應答。此外，Hsp90α還可以調節免疫細胞的功能，影響免疫細胞的增殖、分化和活化。在T淋巴細胞的活化過程中，Hsp90α與T細胞受體（TCR）信號通路中的關鍵蛋白相互作用，調節T細胞的活化和增殖，從而影響機體的免疫功能。2.2.3Hsp90與病毒感染的關系在病毒感染宿主細胞的過程中，熱應激蛋白90（Hsp90）發揮著多方面的重要作用，與病毒的吸附、侵入、復制、裝配以及釋放等各個環節都存在密切的關聯。許多病毒在感染宿主細胞時，需要借助細胞表面的受體來實現吸附和侵入。研究發現，Hsp90可以與一些病毒的受體或病毒蛋白相互作用，促進病毒與細胞表面受體的結合，從而增強病毒的感染效率。在丙型肝炎病毒（HCV）感染過程中，Hsp90與HCV的E2糖蛋白以及宿主細胞表面的受體CD81相互作用，形成一個復合物。這個復合物的形成有助于HCV更緊密地結合到宿主細胞表面，促進病毒的吸附和侵入。通過抑制Hsp90的功能，可以減少HCV與CD81的結合，從而降低病毒的感染能力。在登革病毒感染過程中，Hsp90也參與了病毒與宿主細胞表面受體的結合過程，影響病毒的感染效率。進入宿主細胞后，病毒需要利用宿主細胞的各種機制進行復制和裝配。Hsp90作為細胞內重要的分子伴侶，能夠協助病毒蛋白的正確折疊和組裝，為病毒的復制和裝配提供必要的條件。在人免疫缺陷病毒（HIV）感染細胞后，HIV的Gag蛋白需要在Hsp90的協助下進行正確折疊，才能進一步組裝成成熟的病毒粒子。如果抑制Hsp90的活性，Gag蛋白的折疊和組裝就會受到影響，導致HIV的復制和裝配過程受阻。在流感病毒感染細胞時，Hsp90與流感病毒的核蛋白（NP）相互作用，協助NP的正確折疊和轉運，保證病毒基因組的復制和轉錄能夠順利進行。Hsp90還參與了病毒感染引起的宿主細胞免疫反應的調節。病毒感染會觸發宿主細胞的免疫應答，以抵御病毒的入侵。Hsp90在這個過程中，一方面可以通過調節免疫細胞的功能，影響免疫細胞對病毒的識別和清除能力。在T淋巴細胞對病毒感染細胞的識別和殺傷過程中，Hsp90與T細胞表面的一些信號分子相互作用，調節T細胞的活化和增殖，從而影響細胞免疫應答的強度。另一方面，Hsp90可以與病毒感染誘導產生的一些細胞因子相互作用，調節細胞因子的信號傳導通路，影響免疫反應的進程。在病毒感染引發的炎癥反應中，Hsp90可以與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子相互作用，調節炎癥反應的強度和持續時間。此外，Hsp90還可能參與了病毒的免疫逃逸機制。一些病毒為了逃避宿主免疫系統的攻擊，會利用宿主細胞內的分子機制來干擾免疫反應。Hsp90可能在這個過程中被病毒利用，幫助病毒逃避宿主的免疫監視。在乙型肝炎病毒（HBV）感染過程中，HBV的X蛋白（HBx）可以與Hsp90相互作用，通過調節宿主細胞內的信號通路，抑制宿主的免疫反應，從而有利于病毒在宿主體內的持續存在和復制。Hsp90在病毒感染過程中具有重要作用，其與病毒的相互作用機制復雜多樣。深入研究Hsp90與病毒的關系，不僅有助于揭示病毒感染的分子機制，還為開發新型的抗病毒藥物提供了潛在的靶點。通過抑制Hsp90的功能，可以干擾病毒的感染、復制和免疫逃逸等過程，為病毒感染性疾病的治療提供新的策略。2.3病毒受體研究進展2.3.1病毒受體的概念與分類病毒受體是指能特異性地與病毒結合、介導病毒侵入并促進病毒感染的宿主細胞膜組分。其化學本質主要是糖蛋白、蛋白聚糖、脂類或糖脂，大多數情況下屬于蛋白質。從結構和功能特點上，病毒受體可分為多種類型。鳥苷酸酶受體（GPCRs）是一大類膜蛋白受體的統稱，其結構特點是由7個跨膜α螺旋組成，通過與G蛋白偶聯來傳遞信號。在某些病毒感染過程中，GPCRs可能作為病毒的受體，介導病毒的吸附和侵入。例如，一些病毒能夠利用GPCRs的信號傳導通路，激活細胞內的相關機制，促進病毒的感染。酪氨酸激酶受體（TKRSs）則具有酪氨酸激酶活性，當配體與受體結合后，受體的酪氨酸激酶結構域被激活，發生自身磷酸化，進而激活下游的信號通路。某些病毒可以與TKRSs結合，利用其激活的信號通路來實現自身的感染和復制。胞外酶受體（EXRs）是一類具有酶活性的受體，它們能夠催化細胞外的化學反應。在病毒感染中，EXRs可能通過其酶活性改變細胞表面的微環境，或者與病毒粒子表面的特定結構相互作用，從而介導病毒的感染。根據病毒受體的分布范圍和宿主特異性，又可將其分為廣泛分布型受體和宿主特異性受體。廣泛分布型受體在多種不同種屬的動物細胞上都存在，與之相對應的病毒往往具有較廣的宿主范圍。例如，某些病毒的受體在哺乳動物、鳥類等多種動物細胞表面都能找到，使得這些病毒可以感染不同種類的動物。宿主特異性受體則僅存在于特定宿主的細胞表面，決定了病毒對宿主的特異性感染。比如，禽流感病毒的某些受體只存在于禽類細胞表面，這就限制了禽流感病毒主要感染禽類，而較少感染其他動物。此外，病毒受體還可以是單體形式存在，也可以是由多個分子組成的復合物。單體受體相對結構簡單，由單個蛋白質分子構成，能夠直接與病毒粒子表面的配體結合。多分子復合物受體則是由多個不同的蛋白質分子相互作用形成的，其結構更為復雜，各分子之間協同作用，共同完成對病毒的識別和結合。2.3.2病毒與受體相互作用機制病毒與受體的相互作用是一個復雜而精細的過程，這一過程直接決定了病毒能否成功感染宿主細胞。首先，病毒通過其表面的特定結構，如病毒的包膜糖蛋白、衣殼蛋白等，與宿主細胞表面的受體進行特異性識別。這種識別具有高度的特異性，就像一把鑰匙對應一把鎖，只有病毒表面的結構與受體的結構互補匹配時，二者才能發生有效結合。在流感病毒感染過程中，流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白能夠特異性地識別并結合宿主細胞表面的唾液酸受體。HA蛋白上的特定氨基酸序列與唾液酸受體的糖基部分相互作用，形成穩定的結合。這種特異性的識別和結合是病毒感染的第一步，它決定了病毒能夠靶向特定的宿主細胞。一旦病毒與受體結合，就會觸發一系列的分子事件，介導病毒進入宿主細胞。對于有包膜的病毒，如艾滋病病毒（HIV），其包膜糖蛋白與宿主細胞表面的受體結合后，會引發包膜與細胞膜的融合，從而使病毒的核心進入細胞內。在這個過程中，病毒包膜糖蛋白的構象會發生變化，暴露出融合肽，融合肽插入宿主細胞膜，促進包膜與細胞膜的融合。對于無包膜的病毒，如脊髓灰質炎病毒，病毒與受體結合后，通常會通過內吞作用進入細胞。病毒與受體結合后，會誘導細胞膜內陷，形成內吞小泡，病毒被包裹在內吞小泡中進入細胞。隨后，內吞小泡的膜與溶酶體膜融合，在溶酶體的酸性環境下，病毒粒子發生結構變化，釋放出病毒核酸，開始病毒的復制過程。病毒與受體的相互作用還會影響病毒的感染效率和致病性。如果病毒與受體的親和力較高，病毒就能夠更迅速、更有效地結合到宿主細胞表面，從而提高感染效率。一些高致病性的病毒，其與受體的親和力往往較強，這使得它們能夠在短時間內感染大量的宿主細胞，引發嚴重的疾病。此外，病毒與受體的相互作用還可能激活宿主細胞內的信號通路，影響細胞的生理功能。某些病毒與受體結合后，會激活細胞內的免疫相關信號通路，引發宿主的免疫反應。然而，一些病毒也可能利用這些信號通路來逃避宿主的免疫監視，促進自身的感染和復制。2.3.3研究病毒受體的方法與意義研究病毒受體的方法多種多樣，涵蓋了實驗生物學、分子生物學和生物信息學等多個領域。在實驗生物學方面，病毒感染實驗是最基本的方法之一。通過將病毒與不同類型的細胞共同培養，觀察病毒對細胞的感染情況，從而判斷細胞表面是否存在病毒受體。如果某種細胞能夠被病毒感染，說明該細胞表面可能存在相應的病毒受體。免疫沉淀實驗則利用抗體與抗原特異性結合的原理，將病毒受體從細胞裂解液中沉淀下來，然后通過蛋白質分析技術鑒定受體的成分。免疫熒光染色可以直觀地觀察病毒受體在細胞表面的分布情況，通過標記熒光素的抗體與病毒受體結合，在熒光顯微鏡下可以清晰地看到受體的位置和分布。分子生物學方法在病毒受體研究中也發揮著重要作用。基因克隆技術可以將病毒受體的基因克隆出來，進行序列分析和功能研究。通過對受體基因序列的分析，可以了解受體的結構和功能特點，以及其在進化過程中的保守性。表達純化技術則可以大量制備病毒受體蛋白，為后續的研究提供充足的材料。利用表達純化得到的受體蛋白，可以研究其與病毒的相互作用機制，以及開發針對受體的抗病毒藥物。生物信息學方法為病毒受體研究提供了新的思路和手段。通過蛋白質結構預測，可以推測病毒受體的三維結構，從而更好地理解其與病毒的相互作用方式。功能注釋則可以對病毒受體的功能進行預測和分析，為進一步的實驗研究提供指導。確定病毒受體對于病毒防控具有極其重要的意義。在疫苗研發方面，了解病毒受體可以幫助設計更有效的疫苗。疫苗的作用是刺激機體產生免疫反應，從而預防病毒感染。如果知道病毒與受體的結合位點，就可以設計出能夠模擬這些位點的疫苗，使機體產生針對病毒與受體結合的抗體，從而阻斷病毒的感染。針對流感病毒的疫苗研發，研究人員可以根據流感病毒與唾液酸受體的結合特點，設計出能夠與病毒競爭結合唾液酸受體的疫苗成分，提高疫苗的保護效果。在抗病毒藥物開發中，病毒受體是重要的靶點。通過研發能夠阻斷病毒與受體結合的藥物，或者干擾受體介導的病毒進入細胞過程的藥物，可以有效地抑制病毒的感染和復制。一些針對HIV的抗病毒藥物，就是通過阻斷HIV與宿主細胞表面的CD4受體及輔助受體的結合，來達到治療的目的。此外，了解病毒受體還有助于深入理解病毒的感染機制和傳播規律，為制定科學的防控策略提供理論依據。三、Hsp90α蛋白IBDV結合區的初步確定3.1材料3.1.1菌株、毒株、細胞及載體大腸桿菌DH5α感受態細胞和BL21(DE3)感受態細胞，均購自北京全式金生物技術有限公司，用于基因克隆和蛋白表達。雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株（nvvIBDV），由本實驗室分離、鑒定并保存，其具有典型的超強毒株特征，在感染雞后能夠引起嚴重的臨床癥狀和病理變化。雞法氏囊細胞系（DF-1細胞），購自中國典型培養物保藏中心，該細胞系具有良好的生長特性和對IBDV的易感性，可用于病毒感染實驗。原核表達載體pET-32a(+)，購自Novagen公司，該載體含有T7啟動子、His-tag標簽等元件，便于重組蛋白的表達和純化。3.1.2工具酶及主要試劑限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NotⅠ，購自TaKaRa公司，這些酶能夠特異性地識別并切割DNA分子上的特定序列，用于基因克隆和載體構建。T4DNA連接酶，同樣購自TaKaRa公司，它能夠催化DNA片段之間的連接反應，將目的基因與載體連接起來。DNAMarkerDL2000、DL15000，購自TaKaRa公司，用于在DNA電泳中作為分子量標準，判斷目的DNA片段的大小。ProteinMarker，購自ThermoFisherScientific公司，在蛋白質電泳中作為分子量標準，確定蛋白質的大小。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉錄試劑盒，購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉錄為cDNA，以便進行后續的PCR擴增。PremixTaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司，在PCR反應中催化DNA的合成。質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購自OMEGA公司，分別用于從細菌中提取質粒和從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，操作簡便、效率高。鎳離子親和層析柱，購自GEHealthcare公司，利用鎳離子與帶有His-tag標簽的重組蛋白之間的特異性結合，對重組蛋白進行純化。HRP標記的羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中，與一抗結合，通過酶促反應產生可檢測的信號。BCA蛋白定量試劑盒，購自ThermoFisherScientific公司，用于測定蛋白質的濃度，操作簡單、準確性高。其他常規試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產分析純，用于配制各種緩沖液和培養基。3.1.3主要儀器設備PCR儀，型號為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于進行PCR擴增反應，具有溫度控制精確、擴增效率高等優點。凝膠成像系統，型號為Bio-RadGelDocXR+，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，能夠對瓊脂糖凝膠和蛋白質凝膠進行成像和分析，方便觀察和記錄實驗結果。恒溫搖床，型號為NewBrunswickInnova44R，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于細菌的培養和振蕩培養，提供適宜的溫度和振蕩條件。高速冷凍離心機，型號為Eppendorf5424R，購自艾本德（中國）有限公司，能夠在低溫條件下對樣品進行高速離心，用于細胞和細菌的收集、蛋白質的分離等。超聲波細胞破碎儀，型號為SCIENTZ-IID，購自寧波新芝生物科技股份有限公司，通過超聲波的作用破碎細胞，釋放細胞內的蛋白質等物質。蛋白電泳儀，型號為Bio-RadPowerPacBasic，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，用于進行蛋白質的電泳分離，根據蛋白質的分子量大小將其分離開來。轉膜儀，型號為Bio-RadTrans-BlotTurbo，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，用于將電泳分離后的蛋白質轉移到固相膜上，以便進行后續的免疫檢測。酶標儀，型號為ThermoScientificMultiskanFC，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，用于ELISA實驗中檢測吸光度值，定量分析樣品中的蛋白質含量。3.1.4培養基LB液體培養基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，調節pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min。用于大腸桿菌的培養。LB固體培養基：在LB液體培養基的基礎上，加入1.5%的瓊脂粉，加熱溶解后，121℃高壓滅菌20min，待冷卻至50-60℃時，倒入無菌培養皿中，制成平板。用于大腸桿菌的平板培養和單菌落的篩選。DF-1細胞培養基：RPMI1640培養基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素），購自Gibco公司。將RPMI1640培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素按照相應比例混合均勻，0.22μm濾膜過濾除菌后，4℃保存備用。用于DF-1細胞的培養，提供細胞生長所需的營養物質和生長環境。3.1.5常用溶液PBS緩沖液（pH7.4）：稱取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸二氫鉀0.24g、磷酸氫二鈉1.44g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。用于細胞和蛋白質的洗滌、稀釋等操作，維持溶液的pH值穩定。SDS-PAGE上樣緩沖液（5×）：稱取SDS0.5g、溴酚藍0.05g、甘油2.5mL、β-巰基乙醇1mL，加入0.5MTris-HCl（pH6.8）緩沖液定容至10mL。用于蛋白質樣品的處理，使蛋白質變性并帶上負電荷，便于在SDS-PAGE電泳中分離。Westernblot轉膜緩沖液：稱取Tris3.03g、甘氨酸14.4g、甲醇200mL，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。用于將蛋白質從SDS-PAGE凝膠轉移到固相膜上，保證蛋白質的轉移效率和完整性。TBST緩沖液：在TBS緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）中加入0.1%的Tween-20。用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中膜的洗滌，去除未結合的抗體和雜質。封閉液：5%脫脂奶粉的TBST溶液。用于Westernblot和Far-Westernblot實驗中膜的封閉，減少非特異性結合，提高檢測的特異性。ELISA包被緩沖液（pH9.6）：稱取碳酸鈉1.59g、碳酸氫鈉2.93g，加入去離子水溶解后，定容至1000mL。用于ELISA實驗中抗原或抗體的包被，使抗原或抗體固定在酶標板上。ELISA洗滌緩沖液：在PBS緩沖液中加入0.05%的Tween-20。用于ELISA實驗中酶標板的洗滌，去除未結合的物質。ELISA底物緩沖液：根據不同的底物選擇相應的緩沖液，如TMB底物緩沖液（含過氧化氫和TMB顯色劑）。用于ELISA實驗中底物的反應，通過酶促反應產生顏色變化，以便檢測樣品中的蛋白質含量。3.2方法3.2.1基因克隆從雞法氏囊細胞中提取總RNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉錄試劑盒，按照說明書的操作步驟將總RNA逆轉錄為cDNA。根據GenBank中登錄的雞Hsp90α基因序列（登錄號：NM_205179.1），利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，用于擴增Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。引物設計時，在上下游引物的5'端分別引入相應的限制性內切酶酶切位點，以便后續的表達載體構建。引物序列如下：Hsp90α全長引物：F：5'-CGCGGATCCATGGCTACAGATGGAGAAGG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）R：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTCATCTTCTTCC-3'（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）Hsp90αN端片段引物（1-250aa）：F：5'-CGCGGATCCATGGCTACAGATGGAGAAGG-3'（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點）R：5'-CCGCTCGAGTCACGCTTCTTCTGGCTTCT-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）Hsp90α中間片段引物（251-500aa）：F：5'-CCGCTCGAGATGAGCTACGAGCAGAAGAA-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點）R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATCAGCTTCTGGAG-3'（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）Hsp90αC端片段引物（501-728aa）：F：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGAGCTACGAGCAGAA-3'（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）R：5'-CCCAAGCTTTCAGTCGTCATCTTCTTCC-3'（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）以逆轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系（25μL）：PremixTaqDNA聚合酶12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃終延伸10min。PCR擴增結束后，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的條帶的大小和亮度。將擴增得到的目的片段用膠回收試劑盒進行回收，回收后的片段用于后續的表達載體構建。3.2.2表達載體構建將回收的Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA與原核表達載體pET-32a(+)分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切。例如，Hsp90α全長片段與pET-32a(+)用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，N端片段用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，中間片段用XhoⅠ和NotⅠ進行雙酶切，C端片段用NotⅠ和HindⅢ進行雙酶切。酶切反應體系（20μL）：10×Buffer2μL，限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ或NotⅠ各1μL，DNA片段或載體2μL，ddH?O14μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，將酶切后的片段和載體用膠回收試劑盒進行回收。將回收的酶切后的目的片段與載體用T4DNA連接酶進行連接。連接反應體系（10μL）：T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNA連接酶1μL，回收的目的片段3μL，回收的載體1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。將連接產物加入到50μLDH5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μLLB液體培養基，37℃、200rpm振蕩培養1h。將培養后的菌液6000rpm離心5min，棄去部分上清，留100μL菌液重懸菌體，將其涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養過夜。次日，從平板上挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養過夜。提取質粒，用相應的限制性內切酶進行雙酶切鑒定，酶切反應體系及條件同上述酶切步驟。酶切鑒定正確的重組質粒送測序公司進行測序，以確保插入片段的序列正確。測序結果與預期序列一致的重組質粒即為成功構建的表達載體，分別命名為pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C。3.2.3重組蛋白誘導表達將測序正確的重組表達載體pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中。轉化方法同上述轉化至DH5α感受態細胞的步驟。從轉化后的平板上挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養過夜。次日，將過夜培養的菌液按1:100的比例轉接至新鮮的含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養至OD???值為0.6-0.8。向菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達。設置不同的IPTG濃度梯度（0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM），以及不同的誘導時間（2h、4h、6h、8h、10h）和誘導溫度（25℃、30℃、37℃），以確定最佳的誘導表達條件。每個條件設置3個重復。加入IPTG后，繼續振蕩培養相應時間，然后取1mL菌液，12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。將菌體沉淀用PBS緩沖液重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白質變性，用于后續的重組蛋白表達分析。3.2.4重組蛋白表達分析將誘導表達后的菌體蛋白樣品進行SDS-PAGE分析。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時加入ProteinMarker作為分子量標準。電泳條件：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳至溴酚藍遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠取出，放入考馬斯亮藍染色液中染色3-4h，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察凝膠上蛋白條帶的位置和亮度。根據蛋白條帶的位置與ProteinMarker對比，確定重組蛋白的分子量大小，根據條帶的亮度初步判斷重組蛋白的表達量。為了進一步分析重組蛋白的表達形式，將誘導表達后的菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸后，進行超聲破碎。超聲條件：功率200W，超聲3s，間歇5s，共超聲30min。超聲破碎后，12000rpm、4℃離心30min，分別收集上清液（可溶性蛋白部分）和沉淀（包涵體部分）。將上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，比較上清液和沉淀中重組蛋白條帶的亮度，確定重組蛋白是以可溶性形式表達還是以包涵體形式表達。3.2.5重組蛋白的純化根據重組蛋白的表達形式選擇合適的純化方法。如果重組蛋白以可溶性形式表達，采用鎳離子親和層析柱進行純化。將超聲破碎后的上清液加入到預先用PBS緩沖液平衡好的鎳離子親和層析柱中，使重組蛋白與鎳離子親和層析柱上的鎳離子特異性結合。用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進行洗脫，依次用含20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫雜蛋白，再用含50mM咪唑的PBS緩沖液進一步洗脫雜蛋白，最后用含250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的重組蛋白。收集洗脫液，進行SDS-PAGE分析，檢測洗脫液中重組蛋白的純度。如果重組蛋白以包涵體形式表達，先將包涵體用8M尿素溶解，然后進行鎳離子親和層析柱純化。純化步驟與可溶性蛋白純化類似，但在洗脫過程中，洗脫緩沖液中需含有8M尿素，以維持包涵體蛋白的溶解狀態。純化后的重組蛋白需要進行復性處理，采用梯度透析法進行復性。將純化后的蛋白溶液裝入透析袋中，依次放入含有6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素的PBS緩沖液中進行透析，每個梯度透析4-6h，最后用PBS緩沖液透析過夜，去除尿素，使重組蛋白復性。復性后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，檢測其純度和復性效果。3.2.6重組蛋白的鑒定采用Westernblot技術對純化后的重組蛋白進行鑒定。將SDS-PAGE分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉膜條件：250mA，轉膜1.5h。轉膜結束后，將NC膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的TBST溶液）中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。加入鼠抗His-tag單克隆抗體（1:5000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋）作為二抗，室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。最后，加入ECL化學發光試劑，在凝膠成像系統中曝光顯影，觀察NC膜上是否出現特異性條帶。如果出現與預期分子量大小一致的特異性條帶，則表明純化后的蛋白為目的重組蛋白。同時，采用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟進行測定，以確定重組蛋白的含量。3.2.7Hsp90α蛋白IBDV結合區鑒定采用Far-Westernblot方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區。將純化后的Hsp90α全長及不同截短片段的重組蛋白進行SDS-PAGE分離，然后轉移至NC膜上。轉膜條件同Westernblot。轉膜結束后，將NC膜放入封閉液（5%脫脂奶粉的TBST溶液）中，室溫封閉1-2h。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。將IBDV用PBS緩沖液稀釋至適當濃度，加入到NC膜上，4℃孵育過夜，使IBDV與重組蛋白充分結合。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入鼠抗IBDVVP2蛋白單克隆抗體（1:5000稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜。后續步驟同Westernblot，加入HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，室溫孵育1-2h，洗滌后加入ECL化學發光試劑，在凝膠成像系統中曝光顯影。如果NC膜上出現特異性條帶，則表明相應的重組蛋白片段與IBDV存在結合，從而確定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區。為了進一步驗證結合區的準確性，采用ELISA方法進行驗證。將純化后的Hsp90α全長及不同截短片段的重組蛋白用ELISA包被緩沖液稀釋至適當濃度，包被于酶標板中，4℃過夜。次日，用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次5min。加入封閉液（5%脫脂奶粉的ELISA洗滌緩沖液），37℃封閉1-2h。封閉后，用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次5min。加入IBDV，37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次5min。加入鼠抗IBDVVP2蛋白單克隆抗體（1:5000稀釋），37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次5min。加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋），37℃孵育1-2h。用ELISA洗滌緩沖液洗滌酶標板3次，每次5min。最后，加入ELISA底物緩沖液，37℃避光反應10-15min，加入終止液終止反應，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值。如果某個重組蛋白片段包被的酶標板在450nm處的吸光度值顯著高于其他片段及陰性對照，則表明該片段與IBDV存在特異性結合，進一步確定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區。3.3結果以提取的雞法氏囊細胞總RNA逆轉錄得到的cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增，成功獲得Hsp90α全長cDNA片段，其大小約為2.2kb，與預期的基因長度相符。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在相應位置出現了清晰、明亮的條帶，表明擴增產物的特異性良好。對Hsp90α不同截短片段進行PCR擴增，同樣獲得了預期大小的基因片段。其中，N端片段（1-250aa）大小約為0.75kb，中間片段（251-500aa）大小約為0.75kb，C端片段（501-728aa）大小約為0.7kb。電泳結果顯示，各片段的條帶清晰，無明顯的非特異性擴增條帶，說明引物的特異性和擴增條件的設置均較為合適，能夠準確地擴增出目的基因片段。將擴增得到的Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA與原核表達載體pET-32a(+)進行雙酶切后連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中。挑取單菌落進行培養，提取質粒并進行雙酶切鑒定。酶切結果顯示，重組載體經相應的限制性內切酶切割后，均得到了與預期大小一致的片段。以pET-32a(+)-Hsp90α為例，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到了約5.9kb的載體片段和約2.2kb的Hsp90α全長片段。對重組載體進行測序分析，結果表明插入的Hsp90α基因序列與GenBank中登錄的雞Hsp90α基因序列（登錄號：NM_205179.1）完全一致，無堿基突變和缺失，說明重組載體構建成功。將測序正確的重組表達載體pET-32a(+)-Hsp90α、pET-32a(+)-Hsp90α-N、pET-32a(+)-Hsp90α-M、pET-32a(+)-Hsp90α-C轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，經IPTG誘導表達。對誘導表達后的菌體蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示，在不同的誘導條件下，均有特異性蛋白條帶出現。通過對不同IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度的優化，確定了最佳的誘導表達條件。對于pET-32a(+)-Hsp90α，在IPTG濃度為0.5mM、誘導時間為6h、誘導溫度為30℃時，重組蛋白的表達量最高。此時，重組蛋白的分子量大小約為105kDa，與預期的融合蛋白（Hsp90α與pET-32a(+)載體上的His-tag等序列融合）分子量相符。對其他重組表達載體的誘導表達條件也進行了優化，得到了各自的最佳誘導條件。在最佳誘導條件下，pET-32a(+)-Hsp90α-N重組蛋白的分子量約為55kDa，pET-32a(+)-Hsp90α-M重組蛋白的分子量約為55kDa，pET-32a(+)-Hsp90α-C重組蛋白的分子量約為52kDa，均與預期大小一致。對誘導表達后的重組蛋白進行可溶性分析，結果表明，Hsp90α全長重組蛋白主要以可溶性形式表達，而上清液中重組蛋白條帶亮度較高，沉淀中條帶較淺。Hsp90α-N端片段重組蛋白也主要以可溶性形式表達。Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白則部分以包涵體形式表達，上清液和沉淀中均有一定量的重組蛋白條帶。根據重組蛋白的表達形式，對可溶性表達的重組蛋白采用鎳離子親和層析柱進行純化。經不同濃度咪唑洗脫后，收集洗脫液進行SDS-PAGE分析。結果顯示，用含20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫時，可去除大部分雜蛋白；用含50mM咪唑的PBS緩沖液進一步洗脫，雜蛋白含量進一步降低；用含250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫，得到了純度較高的重組蛋白。對純化后的重組蛋白進行BCA蛋白定量，測得Hsp90α全長重組蛋白的濃度為1.5mg/mL，Hsp90α-N端片段重組蛋白的濃度為1.2mg/mL。對于部分以包涵體形式表達的Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白，先將包涵體用8M尿素溶解，再進行鎳離子親和層析柱純化。純化后采用梯度透析法進行復性，復性后的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示，復性后的重組蛋白條帶單一，雜帶較少，表明復性效果良好。經BCA蛋白定量，測得Hsp90α-中間片段重組蛋白的濃度為0.8mg/mL，Hsp90α-C端片段重組蛋白的濃度為0.7mg/mL。采用Westernblot技術對純化后的重組蛋白進行鑒定。結果顯示，在NC膜上均出現了與預期分子量大小一致的特異性條帶。以Hsp90α全長重組蛋白為例，在約105kDa處出現了明顯的條帶，與SDS-PAGE分析結果相符。這表明純化后的蛋白為目的重組蛋白，且具有良好的免疫活性，能夠與鼠抗His-tag單克隆抗體特異性結合。其他截短片段的重組蛋白也在相應的分子量位置出現了特異性條帶，進一步驗證了重組蛋白的正確性。通過Far-Westernblot方法鑒定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區。結果顯示，Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白與IBDV能夠特異性結合，在NC膜上出現了明顯的特異性條帶。而Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白與IBDV未出現特異性結合條帶。這表明Hsp90α蛋白的N端區域可能是與IBDV結合的關鍵區域。為了進一步驗證結合區的準確性，采用ELISA方法進行驗證。結果顯示，Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白包被的酶標板在450nm處的吸光度值顯著高于其他片段及陰性對照。這進一步證明了Hsp90α蛋白的N端區域與IBDV存在特異性結合，初步確定Hsp90α蛋白的N端（1-250aa）為IBDV結合區。3.4討論本研究通過一系列嚴謹的實驗步驟，成功地對Hsp90α蛋白IBDV結合區進行了初步確定，這一研究成果具有重要的意義和價值。在實驗過程中，從雞法氏囊細胞中提取總RNA，通過RT-PCR技術成功擴增出Hsp90α全長及不同截短片段的cDNA。這一過程中，引物設計的合理性和PCR反應條件的優化至關重要，確保了目的基因片段的特異性擴增。將擴增得到的基因片段克隆至原核表達載體pET-32a(+)上，構建重組表達載體。通過對重組載體的酶切鑒定和測序分析，證實了載體構建的準確性，為后續重組蛋白的表達奠定了堅實的基礎。在重組蛋白誘導表達階段，通過對IPTG濃度、誘導時間和誘導溫度等條件的優化，確定了各重組蛋白的最佳誘導表達條件。這一優化過程充分考慮了不同條件對蛋白表達量和表達形式的影響，為獲得高表達量的重組蛋白提供了保障。對誘導表達后的重組蛋白進行表達分析，發現Hsp90α全長重組蛋白和Hsp90α-N端片段重組蛋白主要以可溶性形式表達，而Hsp90α-中間片段和C端片段重組蛋白部分以包涵體形式表達。根據蛋白的表達形式，采用鎳離子親和層析柱對可溶性蛋白進行純化，對包涵體蛋白進行溶解、純化和復性處理。通過SDS-PAGE和Westernblot對純化后的重組蛋白進行鑒定，結果表明獲得了純度較高的目的重組蛋白，且蛋白具有良好的免疫活性。采用Far-Westernblot和ELISA方法對Hsp90α蛋白IBDV結合區進行鑒定，結果顯示Hsp90α蛋白的N端區域（1-250aa）與IBDV存在特異性結合，初步確定該區域為IBDV結合區。這一結果具有重要的生物學意義。從病毒感染機制的角度來看，確定Hsp90α蛋白與IBDV的結合區，有助于深入了解IBDV感染雞法氏囊細胞的分子機制。Hsp90α作為細胞內的分子伴侶，其N端區域與IBDV的結合可能在病毒的吸附、侵入或復制過程中發揮關鍵作用。進一步研究二者的相互作用機制，有望揭示IBDV感染的新途徑和新機制，為理解病毒與宿主細胞的相互關系提供新的視角。在抗病毒藥物研發方面，Hsp90α蛋白IBDV結合區的確定為開發新型抗IBDV藥物提供了潛在的靶點。通過設計能夠干擾Hsp90α與IBDV結合的小分子化合物或抗體，有望阻斷病毒的感染過程，從而達到治療IBD的目的。這種基于病毒與宿主蛋白相互作用靶點的藥物研發策略，具有較高的特異性和針對性，相較于傳統的抗病毒藥物，可能具有更好的療效和更低的副作用。同時，這也為其他病毒感染性疾病的藥物研發提供了借鑒和參考，推動了抗病毒藥物研發領域的發展。然而，本研究也存在一定的局限性。雖然初步確定了Hsp90α蛋白的N端區域為IBDV結合區，但對于二者相互作用的具體分子機制，如結合的氨基酸殘基、結合后的構象變化等，還需要進一步深入研究。此外，本研究僅在體外細胞水平進行了實驗，未來還需要在動物體內進行驗證，以確定Hsp90α與IBDV的相互作用在體內的生物學意義和功能。在后續的研究中，可以利用定點突變技術對Hsp90αN端區域的關鍵氨基酸殘基進行突變，研究突變對其與IBDV結合能力的影響，從而進一步明確二者相互作用的關鍵位點。同時，開展動物實驗，觀察Hsp90α在IBDV感染過程中的作用，為IBD的防控提供更有力的理論依據和實踐指導。四、Hsp90α參與IBDV感染法氏囊細胞的初步研究4.1材料4.1.1細胞和實驗動物雞法氏囊細胞系（DF-1細胞），購自中國典型培養物保藏中心，該細胞系具有良好的生長特性和對IBDV的易感性，可用于病毒感染實驗。1日齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司，用于法氏囊細胞的制備。4.1.2主要試劑TRIzol試劑，購自Invitrogen公司，用于從細胞中提取總RNA，具有高效、便捷的特點，能夠有效分離出高質量的RNA。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）逆轉錄試劑盒，購自TaKaRa公司，可將RNA逆轉錄為cDNA，操作簡便，逆轉錄效率高。SYBRPremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司，用于熒光定量PCR反應，能夠準確地定量檢測基因的表達水平。鼠抗Hsp90α單克隆抗體，購自Abcam公司，具有高特異性和親和力，能夠特異性地識別Hsp90α蛋白。FITC標記的羊抗鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，用于間接免疫熒光試驗中，與鼠抗Hsp90α單克隆抗體結合，發出熒光信號，便于觀察。重組Hsp90α蛋白，由本實驗室前期制備并保存，其純度和活性經過嚴格檢測，可用于后續的病毒感染阻斷試驗。抗Hsp90α抗體，購自Sigma公司，能夠特異性地結合Hsp90α蛋白，用于阻斷Hsp90α與IBDV的相互作用。其他常規試劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產分析純，用于配制各種緩沖液和培養基。4.1.3培養基DF-1細胞培養基：RPMI1640培養基（含10%胎牛血清