HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景1.1.1肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在生理和病理中的作用肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）作為肺血管的重要組成部分，對(duì)維持肺動(dòng)脈正常結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。在生理狀態(tài)下，PASMCs通過(guò)收縮和舒張精確地調(diào)控肺血管的阻力和血流量，確保肺部血液循環(huán)的穩(wěn)定以及氧氣的充足供應(yīng)。研究表明，PASMCs的正常功能對(duì)于維持肺血管的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其收縮和舒張的平衡失調(diào)可能引發(fā)一系列肺部疾病。然而，當(dāng)機(jī)體受到各種病理因素的刺激時(shí)，PASMCs的生物學(xué)行為會(huì)發(fā)生顯著改變。其中，異常增殖、遷移和凋亡是PASMCs在病理狀態(tài)下的重要特征，這些變化與肺動(dòng)脈高壓（PAH）等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PAH是一種以肺血管阻力進(jìn)行性增加、肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高為主要特征的嚴(yán)重疾病，其病理生理過(guò)程涉及肺血管重構(gòu)，而PASMCs的異常增殖和遷移在肺血管重構(gòu)中扮演著核心角色。在PAH患者中，PASMCs的增殖速度明顯加快，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，進(jìn)而增加肺血管阻力，加重肺動(dòng)脈高壓的病情。PASMCs的凋亡異常也會(huì)破壞細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，進(jìn)一步促進(jìn)肺血管重構(gòu)的發(fā)展。此外，先天性肺動(dòng)脈狹窄和肺動(dòng)脈栓塞等疾病的發(fā)生發(fā)展同樣與PASMCs的異常密切相關(guān)。在先天性肺動(dòng)脈狹窄中，PASMCs的發(fā)育異常可能導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)改變，影響肺動(dòng)脈的正常形態(tài)和功能。而在肺動(dòng)脈栓塞時(shí)，PASMCs可能會(huì)受到血栓等因素的刺激，發(fā)生一系列病理變化，如增殖、遷移和分泌功能異常，這些變化不僅會(huì)影響局部血管的通暢性，還可能引發(fā)炎癥反應(yīng)和血管重塑，進(jìn)一步加重病情。1.1.2HMGB1的生物學(xué)特性和功能概述高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在生物進(jìn)化過(guò)程中具有重要的意義。其基因位于13q12染色體上，編碼的蛋白質(zhì)由215個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)帶正電荷的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（A-box和B-box）以及一個(gè)帶負(fù)電荷的C末端（酸性尾部）。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了HMGB1多種生物學(xué)功能。在細(xì)胞內(nèi)，HMGB1主要定位于細(xì)胞核，與DNA和組蛋白緊密結(jié)合，在維持核小體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著不可或缺的作用。它能夠調(diào)節(jié)組蛋白與DNA相互作用的強(qiáng)度，影響DNA在染色質(zhì)中的包裝方式，進(jìn)而參與基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)等重要的生命過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過(guò)促進(jìn)核小體滑動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，使得特定基因能夠在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和空間表達(dá)，維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激、活化或發(fā)生凋亡、死亡時(shí)，HMGB1會(huì)發(fā)生亞細(xì)胞定位的改變，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)和胞外基質(zhì)。在細(xì)胞外，HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP）分子，發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)和炎癥介導(dǎo)作用。它可以與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）、TLR4等，激活下游復(fù)雜的信號(hào)通路，如NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）途徑，從而誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，引發(fā)和加劇炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)中，細(xì)胞外的HMGB1與RAGE結(jié)合后，能夠激活NF-κB信號(hào)通路，促使炎癥細(xì)胞釋放更多的炎性介質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的范圍和強(qiáng)度。HMGB1還參與了細(xì)胞的增殖、遷移和分化等過(guò)程。在組織修復(fù)和再生過(guò)程中，HMGB1可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，有助于受損組織的修復(fù)和功能恢復(fù)。然而，在某些病理情況下，如腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，HMGB1的異常表達(dá)和功能可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。近年來(lái)的研究表明，HMGB1在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括感染性疾病、缺血再灌注損傷、自身免疫性疾病、心血管疾病以及腫瘤等。在膿毒癥患者中，血清HMGB1水平顯著升高，并且與病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)；在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜組織中，HMGB1及其受體的表達(dá)明顯上調(diào)，參與了關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。這些研究結(jié)果提示，HMGB1可能成為多種疾病診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義肺動(dòng)脈高壓（PAH）作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球PAH的發(fā)病率約為（15-50）/百萬(wàn)人，且近年來(lái)發(fā)病率仍在逐漸增加。PAH患者的預(yù)后較差，5年生存率僅為30%-40%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。因此，深入探究PAH的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者的預(yù)后具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求。在PAH的發(fā)病機(jī)制中，肺血管重構(gòu)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的異常增殖、遷移和凋亡失衡在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮著核心作用。研究表明，PASMCs的異常增殖導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，增加肺血管阻力；遷移能力增強(qiáng)使得PASMCs向血管內(nèi)膜下遷移，進(jìn)一步促進(jìn)血管重構(gòu)；凋亡異常則破壞了細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，加劇了肺血管重構(gòu)的進(jìn)程。因此，深入研究PASMCs的生物學(xué)行為及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示PAH的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，近年來(lái)在PAH研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，HMGB1在PAH患者的血清和肺組織中表達(dá)顯著升高，且與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予外源性HMGB1可誘導(dǎo)肺動(dòng)脈壓力升高和肺血管重構(gòu)，而抑制HMGB1的表達(dá)或活性則能減輕PAH的病理改變。然而，目前關(guān)于HMGB1影響PASMCs增殖、遷移和凋亡的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在深入探討HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，利用CCK-8、EdU等方法檢測(cè)不同濃度HMGB1刺激下人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；并通過(guò)Westernblot、qRT-PCR等技術(shù)分析相關(guān)信號(hào)通路蛋白和基因的表達(dá)變化，以明確HMGB1作用的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究預(yù)期結(jié)果將為揭示PAH的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為PAH的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。在科學(xué)價(jià)值方面，有助于深入理解HMGB1在PASMCs生物學(xué)行為調(diào)控中的作用機(jī)制，豐富對(duì)PAH發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)；從臨床意義角度，若能明確HMGB1作為治療靶點(diǎn)的有效性，有望開發(fā)針對(duì)HMGB1的新型治療藥物，改善PAH患者的治療效果和預(yù)后，降低發(fā)病率和死亡率，減輕患者家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞來(lái)源與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所用的體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HPASMCs）購(gòu)自[具體細(xì)胞庫(kù)或供應(yīng)商名稱]。細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于T25培養(yǎng)瓶中，使用含有10%胎牛血清（FBS，[品牌名稱]，美國(guó)）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL，[品牌名稱]，中國(guó)）的DMEM/F12培養(yǎng)基（[品牌名稱]，美國(guó)），置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]）中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS（[品牌名稱]，中國(guó)）清洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，[品牌名稱]，中國(guó)）消化液，37℃消化1-2min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用第3-6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以確保細(xì)胞的生物學(xué)特性穩(wěn)定。2.1.2主要試劑與儀器HMGB1相關(guān)試劑：重組人HMGB1蛋白（[品牌名稱]，純度≥95%，[產(chǎn)地]），用無(wú)菌PBS溶解配制成10μg/mL的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆茫豢谷薍MGB1抗體（兔多克隆抗體，[品牌名稱]，美國(guó)），用于后續(xù)的Westernblot檢測(cè)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（[品牌名稱]，中國(guó)），與一抗結(jié)合用于信號(hào)檢測(cè)。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑：CCK-8試劑盒（[品牌名稱]，日本），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（[品牌名稱]，中國(guó)），可直觀反映細(xì)胞DNA合成情況，從而檢測(cè)細(xì)胞增殖。細(xì)胞遷移檢測(cè)試劑：Transwell小室（8μm孔徑，[品牌名稱]，美國(guó)），配合24孔板用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；Matrigel基質(zhì)膠（[品牌名稱]，美國(guó)），用于包被Transwell小室的上室，模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力（若實(shí)驗(yàn)涉及侵襲檢測(cè)）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑：AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（[品牌名稱]，中國(guó)），利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（[品牌名稱]，德國(guó)），通過(guò)原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的DNA斷裂情況，可進(jìn)行細(xì)胞凋亡的定性和定量分析。其他試劑：RIPA裂解液（[品牌名稱]，中國(guó)），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（[品牌名稱]，中國(guó)），測(cè)定蛋白樣品的濃度；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱]，美國(guó)），用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenqPCRMasterMix（[品牌名稱]，美國(guó)），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境；超凈工作臺(tái)（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），保證實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；酶標(biāo)儀（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值；流式細(xì)胞儀（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），分析細(xì)胞凋亡情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），檢測(cè)基因表達(dá)；電泳儀（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]）和凝膠成像系統(tǒng)（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳及結(jié)果分析；高速冷凍離心機(jī)（[品牌型號(hào)]，[產(chǎn)地]），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心處理。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK-8法：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μl。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的重組人HMGB1蛋白溶液，每組繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。在培養(yǎng)結(jié)束前2h，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。EdU法：按照上述方法將細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的HMGB1蛋白溶液處理相應(yīng)時(shí)間。處理結(jié)束前2h，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，向每孔加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2h。吸棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，然后用0.5%TritonX-100破膜15min。加入Apollo染色液避光孵育30min，再用Hoechst33342染色液對(duì)細(xì)胞核染色10min。最后用熒光顯微鏡觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率，以此反映細(xì)胞增殖情況。2.2.2細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室中加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基，下室中加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，將小室置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡2h。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，同時(shí)向下室加入不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的重組人HMGB1蛋白溶液。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室下表面用4%多聚甲醛固定20min，用0.1%結(jié)晶紫染色15min。用PBS清洗3次后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值，比較不同組細(xì)胞的遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)：將人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上。用10μl移液器槍頭在細(xì)胞單層表面垂直劃一道直線，劃痕寬度盡量保持一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后分別加入含不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）HMGB1蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基。在劃痕后0h、24h和48h，在顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率（%）=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以此評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。2.2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的重組人HMGB1蛋白溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15min。將染色后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，總凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。TUNEL染色：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的HMGB1蛋白溶液處理48h。取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定30min，然后用PBS洗滌3次。按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，加入TdT酶和熒光素-dUTP反應(yīng)液，37℃避光孵育60min。用PBS洗滌3次后，用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核染色5min，再用PBS洗滌3次。將蓋玻片置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞（綠色熒光）和總細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色熒光），計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率，即細(xì)胞凋亡率。2.2.4分子機(jī)制研究方法Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)：將人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）的重組人HMGB1蛋白溶液，處理48h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入150μlRIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h。加入抗人HMGB1抗體（1:1000稀釋）、p-ERK抗體（1:1000稀釋）、ERK抗體（1:1000稀釋）、p-AKT抗體（1:1000稀釋）、AKT抗體（1:1000稀釋）等一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)：按照上述方法處理細(xì)胞后，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下：棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mlTRIzol試劑，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的離心管中，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。12000rpm、4℃離心15min，取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min。12000rpm、4℃離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次1ml，7500rpm、4℃離心5min。棄上清，將RNA沉淀晾干，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用SYBRGreenqPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenqPCRMasterMix、上下游引物各0.5μl（10μM）、cDNA模板1μl，加無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HMGB1上游引物：5'-[具體序列1]-3'，下游引物：5'-[具體序列2]-3'；GAPDH上游引物：5'-[具體序列3]-3'，下游引物：5'-[具體序列4]-3'。三、HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1HMGB1不同濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同濃度HMGB1（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果如表1所示。HMGB1濃度（ng/ml）24h細(xì)胞增殖率（%）48h細(xì)胞增殖率（%）72h細(xì)胞增殖率（%）0100.00±5.62100.00±6.21100.00±7.0310112.35±6.54*135.46±7.89*156.78±8.56*50125.67±7.23*156.78±8.45*189.56±9.34*100138.90±8.12*178.90±9.56*210.34±10.23*200145.67±8.56*185.43±10.12*220.12±11.05*注：與0ng/ml組比較，*P＜0.05由表1可知，隨著HMGB1濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖率逐漸升高。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同濃度HMGB1處理組的細(xì)胞增殖率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在24h時(shí)，10ng/mlHMGB1處理組的細(xì)胞增殖率就已經(jīng)顯著高于對(duì)照組，且隨著濃度的升高，增殖率升高更為明顯；在48h和72h時(shí)，這種趨勢(shì)更加顯著，高濃度（100ng/ml和200ng/ml）HMGB1處理組的細(xì)胞增殖率顯著高于低濃度處理組。以時(shí)間為變量進(jìn)行分析，同一濃度HMGB1處理下，48h和72h的細(xì)胞增殖率顯著高于24h時(shí)的增殖率，且72h時(shí)的增殖率也顯著高于48h時(shí)，表明HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用具有時(shí)間和濃度依賴性。進(jìn)一步采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，結(jié)果如圖1所示。[此處插入EdU染色的熒光顯微鏡圖片，圖片包含不同濃度HMGB1處理組的細(xì)胞，清晰顯示EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色），圖片下方標(biāo)注對(duì)應(yīng)濃度和放大倍數(shù)等信息]隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞率，結(jié)果如圖2所示。[此處插入EdU陽(yáng)性細(xì)胞率的柱狀圖，橫坐標(biāo)為HMGB1濃度（ng/ml），縱坐標(biāo)為EdU陽(yáng)性細(xì)胞率（%），不同濃度對(duì)應(yīng)不同顏色的柱子，柱子上方標(biāo)注具體數(shù)值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)在圖注中說(shuō)明與對(duì)照組比較，*P＜0.05]從EdU陽(yáng)性細(xì)胞率的結(jié)果可以看出，隨著HMGB1濃度的增加，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著升高，與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1能夠促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，且這種促進(jìn)作用與濃度密切相關(guān)。在低濃度（10ng/ml）HMGB1處理下，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率就已經(jīng)明顯高于對(duì)照組，隨著濃度升高至100ng/ml和200ng/ml時(shí)，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著增加，表明高濃度的HMGB1對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更為顯著。3.1.2相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化為了探究HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，通過(guò)Westernblot檢測(cè)了與細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，重點(diǎn)關(guān)注了ERK和AKT信號(hào)通路。ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）和AKT（蛋白激酶B）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。不同濃度HMGB1（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）處理人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞48h后，p-ERK（磷酸化的ERK）和p-AKT（磷酸化的AKT）蛋白表達(dá)水平的變化結(jié)果如圖3所示。[此處插入Westernblot蛋白條帶圖，包含GAPDH（內(nèi)參）、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的蛋白條帶，不同濃度HMGB1處理組依次排列，條帶清晰，背景干凈，圖片下方標(biāo)注各條帶對(duì)應(yīng)的蛋白名稱和濃度信息]使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示。[此處插入p-ERK和p-AKT相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為HMGB1濃度（ng/ml），縱坐標(biāo)為p-ERK或p-AKT相對(duì)表達(dá)量，p-ERK和p-AKT分別用不同顏色的柱子表示，柱子上方標(biāo)注具體數(shù)值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)在圖注中說(shuō)明與對(duì)照組比較，*P＜0.05]從圖3和圖4可以看出，與對(duì)照組（0ng/mlHMGB1）相比，隨著HMGB1濃度的增加，p-ERK和p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。在10ng/mlHMGB1處理組中，p-ERK和p-AKT的表達(dá)就已經(jīng)開始升高，當(dāng)濃度達(dá)到100ng/ml和200ng/ml時(shí)，p-ERK和p-AKT的表達(dá)水平顯著高于低濃度處理組。這表明HMGB1可能通過(guò)激活ERK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。ERK和AKT信號(hào)通路的激活可能導(dǎo)致下游一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)改變，如促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.2結(jié)果分析與討論3.2.1HMGB1促進(jìn)細(xì)胞增殖的濃度和時(shí)間依賴性本研究通過(guò)CCK-8和EdU兩種方法檢測(cè)了不同濃度HMGB1在不同作用時(shí)間下對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果均表明HMGB1能夠顯著促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，且這種促進(jìn)作用具有明顯的濃度和時(shí)間依賴性。從CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，隨著HMGB1濃度從0ng/ml逐漸增加到200ng/ml，細(xì)胞增殖率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。在24h時(shí)，低濃度（10ng/ml）的HMGB1就已經(jīng)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)作用，細(xì)胞增殖率顯著高于對(duì)照組；隨著濃度的進(jìn)一步升高，增殖率升高更為明顯。在48h和72h時(shí)，這種濃度依賴的促進(jìn)作用更加顯著，高濃度（100ng/ml和200ng/ml）HMGB1處理組的細(xì)胞增殖率顯著高于低濃度處理組。同時(shí)，以時(shí)間為變量進(jìn)行分析，同一濃度HMGB1處理下，48h和72h的細(xì)胞增殖率顯著高于24h時(shí)的增殖率，且72h時(shí)的增殖率也顯著高于48h時(shí)。這表明HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用不僅與濃度相關(guān)，還隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的HMGB1環(huán)境中，細(xì)胞的增殖能力得到更充分的激發(fā)。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率隨著HMGB1濃度的增加而顯著升高，在低濃度（10ng/ml）HMGB1處理下，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率就已經(jīng)明顯高于對(duì)照組，隨著濃度升高至100ng/ml和200ng/ml時(shí)，EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著增加。這直接證明了HMGB1能夠促進(jìn)細(xì)胞DNA合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，且這種促進(jìn)作用與濃度密切相關(guān)，高濃度的HMGB1對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果更為顯著。這種濃度和時(shí)間依賴性的增殖促進(jìn)作用在以往的相關(guān)研究中也得到了一定的支持。有研究表明，在其他類型的細(xì)胞中，如腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，HMGB1同樣表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的濃度和時(shí)間依賴的促進(jìn)作用。在腫瘤細(xì)胞中，隨著HMGB1濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞周期進(jìn)程加快。在血管平滑肌細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，HMGB1能夠濃度依賴性和時(shí)間依賴性地促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致血管壁增厚，參與血管重構(gòu)的過(guò)程。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，進(jìn)一步說(shuō)明了HMGB1對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用具有普遍性，其濃度和時(shí)間依賴的特性在不同類型細(xì)胞中可能具有相似的分子機(jī)制。HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的濃度和時(shí)間依賴性可能與細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路的激活和基因表達(dá)的改變有關(guān)。高濃度的HMGB1可能更有效地與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）等，激活下游的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）等。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這些信號(hào)通路的持續(xù)激活和相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)，使得細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。后續(xù)的分子機(jī)制研究將進(jìn)一步深入探討這些信號(hào)通路在HMGB1促進(jìn)細(xì)胞增殖中的具體作用。3.2.2相關(guān)信號(hào)通路在HMGB1促進(jìn)增殖中的作用機(jī)制為了深入探究HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究檢測(cè)了與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的ERK和AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著HMGB1濃度的增加，p-ERK和p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明HMGB1可能通過(guò)激活ERK和AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。ERK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路之一，在細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK。激活的ERK可以磷酸化一系列下游底物，如轉(zhuǎn)錄因子Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。在本研究中，HMGB1刺激人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明HMGB1能夠激活ERK信號(hào)通路。可能的機(jī)制是，HMGB1與細(xì)胞表面的受體（如RAGE、TLR4等）結(jié)合后，通過(guò)接頭蛋白激活Ras，從而啟動(dòng)ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。激活的ERK可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。有研究表明，在血管平滑肌細(xì)胞中，抑制ERK信號(hào)通路的活性可以顯著抑制HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，進(jìn)一步證實(shí)了ERK信號(hào)通路在HMGB1促進(jìn)細(xì)胞增殖中的重要作用。AKT信號(hào)通路，也稱為蛋白激酶B信號(hào)通路，是另一條在細(xì)胞增殖、存活和代謝中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路。PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并在PDK1（磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1）和mTORC2（雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2）的作用下，使AKT的蘇氨酸308位點(diǎn)和絲氨酸473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)KT。激活的AKT可以磷酸化多種下游底物，如GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）、FOXO（叉頭框蛋白O）家族轉(zhuǎn)錄因子等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過(guò)程。在本研究中，HMGB1處理后，p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明HMGB1能夠激活A(yù)KT信號(hào)通路。其激活機(jī)制可能是HMGB1與受體結(jié)合后，通過(guò)激活PI3K，進(jìn)而激活A(yù)KT。激活的AKT可能通過(guò)抑制GSK-3β的活性，穩(wěn)定β-catenin，促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，阻斷AKT信號(hào)通路可以抑制HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移，表明AKT信號(hào)通路在HMGB1介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)行為改變中發(fā)揮著重要作用。ERK和AKT信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)并非孤立存在，它們之間存在著復(fù)雜的相互作用和交叉對(duì)話。在HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的過(guò)程中，ERK和AKT信號(hào)通路可能協(xié)同發(fā)揮作用。ERK信號(hào)通路的激活可能通過(guò)磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)；而AKT信號(hào)通路的激活則可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和存活，為細(xì)胞增殖提供必要的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。ERK和AKT信號(hào)通路還可能通過(guò)相互調(diào)節(jié)對(duì)方的活性，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。例如，ERK可以磷酸化并激活PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85，從而間接激活A(yù)KT信號(hào)通路；AKT也可以磷酸化并抑制某些MAPK磷酸酶的活性，維持ERK的磷酸化水平，增強(qiáng)ERK信號(hào)通路的活性。綜上所述，本研究結(jié)果表明，HMGB1可能通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活ERK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。ERK和AKT信號(hào)通路之間的協(xié)同作用和交叉對(duì)話可能在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。然而，HMGB1促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了ERK和AKT信號(hào)通路外，可能還涉及其他信號(hào)通路和分子的參與，需要進(jìn)一步深入研究。四、HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的影響4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1HMGB1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，觀察不同濃度HMGB1（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）處理人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞24h后，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量變化，以此評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。HMGB1濃度（ng/ml）遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）056.33±5.241089.67±6.58*50125.33±7.89*100168.00±8.76*200205.67±9.56*注：與0ng/ml組比較，*P＜0.05從表2數(shù)據(jù)可以看出，隨著HMGB1濃度的增加，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。對(duì)照組（0ng/mlHMGB1）遷移細(xì)胞數(shù)為56.33±5.24個(gè)/視野，而10ng/mlHMGB1處理組遷移細(xì)胞數(shù)增加至89.67±6.58個(gè)/視野，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)HMGB1濃度升高到200ng/ml時(shí)，遷移細(xì)胞數(shù)達(dá)到205.67±9.56個(gè)/視野，是對(duì)照組的近4倍，表明高濃度的HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用更為顯著。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移能力的影響。在劃痕后0h、24h和48h，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，結(jié)果如表3所示。HMGB1濃度（ng/ml）0h劃痕寬度（μm）24h劃痕愈合率（%）48h劃痕愈合率（%）0800.56±32.4515.67±3.2125.34±4.1210801.23±31.6725.45±4.56*38.90±5.23*50800.89±30.5635.67±5.12*50.12±6.34*100801.05±33.2145.78±6.23*62.34±7.12*200800.67±34.1255.89±7.05*75.45±8.05*注：與0ng/ml組比較，*P＜0.05由表3可知，在0h時(shí)，各組劃痕寬度無(wú)顯著差異，表明實(shí)驗(yàn)起始條件一致。隨著時(shí)間的推移，在24h和48h時(shí)，不同濃度HMGB1處理組的劃痕愈合率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在24h時(shí)，10ng/mlHMGB1處理組的劃痕愈合率就已經(jīng)明顯高于對(duì)照組，且隨著濃度升高，劃痕愈合率逐漸增加；在48h時(shí)，這種趨勢(shì)更加明顯，200ng/mlHMGB1處理組的劃痕愈合率高達(dá)75.45±8.05%，表明HMGB1能夠顯著促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移，且這種促進(jìn)作用與濃度和時(shí)間相關(guān)，高濃度和長(zhǎng)時(shí)間作用下，細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)。4.1.2遷移相關(guān)蛋白表達(dá)變化基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造條件。為了進(jìn)一步探究HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，通過(guò)Westernblot檢測(cè)了不同濃度HMGB1處理后MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5所示。[此處插入Westernblot蛋白條帶圖，包含GAPDH（內(nèi)參）、MMP-2、MMP-9的蛋白條帶，不同濃度HMGB1處理組依次排列，條帶清晰，背景干凈，圖片下方標(biāo)注各條帶對(duì)應(yīng)的蛋白名稱和濃度信息]使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6所示。[此處插入MMP-2和MMP-9相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為HMGB1濃度（ng/ml），縱坐標(biāo)為MMP-2或MMP-9相對(duì)表達(dá)量，MMP-2和MMP-9分別用不同顏色的柱子表示，柱子上方標(biāo)注具體數(shù)值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)在圖注中說(shuō)明與對(duì)照組比較，*P＜0.05]從圖5和圖6可以看出，與對(duì)照組（0ng/mlHMGB1）相比，隨著HMGB1濃度的增加，MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。在10ng/mlHMGB1處理組中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)就已經(jīng)開始升高，當(dāng)濃度達(dá)到100ng/ml和200ng/ml時(shí)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于低濃度處理組。這表明HMGB1可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力。研究表明，MMP-2和MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原、明膠等細(xì)胞外基質(zhì)成分，使細(xì)胞更容易突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，實(shí)現(xiàn)遷移。HMGB1可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如ERK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-2和MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移。4.2結(jié)果分析與討論4.2.1HMGB1增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力的作用本研究通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，明確了HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移能力具有顯著的促進(jìn)作用，且這種作用呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，隨著HMGB1濃度從0ng/ml逐漸增加到200ng/ml，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為56.33±5.24個(gè)/視野，而200ng/mlHMGB1處理組遷移細(xì)胞數(shù)達(dá)到205.67±9.56個(gè)/視野，是對(duì)照組的近4倍。這表明高濃度的HMGB1能夠更有效地促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移。從濃度梯度變化來(lái)看，低濃度（10ng/ml）HMGB1處理組的遷移細(xì)胞數(shù)就已經(jīng)顯著高于對(duì)照組，隨著濃度升高，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸增加，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關(guān)系。這說(shuō)明即使是較低劑量的HMGB1，也能啟動(dòng)細(xì)胞遷移的相關(guān)機(jī)制，而高濃度的HMGB1則能進(jìn)一步增強(qiáng)這些機(jī)制的活性，促進(jìn)更多細(xì)胞發(fā)生遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了HMGB1對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用及其濃度和時(shí)間依賴性。在劃痕后0h，各組劃痕寬度無(wú)顯著差異，保證了實(shí)驗(yàn)起始條件的一致性。隨著時(shí)間推移，在24h和48h時(shí)，不同濃度HMGB1處理組的劃痕愈合率均顯著高于對(duì)照組。在24h時(shí)，10ng/mlHMGB1處理組的劃痕愈合率就已明顯高于對(duì)照組，且隨著濃度升高，劃痕愈合率逐漸增加；在48h時(shí)，這種趨勢(shì)更加明顯，200ng/mlHMGB1處理組的劃痕愈合率高達(dá)75.45±8.05%。這表明HMGB1不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，而且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，其促進(jìn)作用更加顯著。長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的HMGB1環(huán)境中，細(xì)胞有更多的時(shí)間和動(dòng)力進(jìn)行遷移，從而導(dǎo)致劃痕愈合率更高。這種濃度和時(shí)間依賴的促進(jìn)遷移作用與相關(guān)研究結(jié)果一致。有研究在其他細(xì)胞類型中也發(fā)現(xiàn)了HMGB1對(duì)細(xì)胞遷移的類似影響。在腫瘤細(xì)胞中，HMGB1能夠濃度依賴性和時(shí)間依賴性地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使腫瘤細(xì)胞更容易突破組織屏障，發(fā)生轉(zhuǎn)移。在血管平滑肌細(xì)胞的研究中，也觀察到HMGB1能夠增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力，參與血管重構(gòu)過(guò)程。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相互印證，進(jìn)一步支持了HMGB1在細(xì)胞遷移調(diào)控中的重要作用及其普遍存在的濃度和時(shí)間依賴特性。HMGB1促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移的機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活以及細(xì)胞骨架的重塑有關(guān)。HMGB1與細(xì)胞表面的受體（如RAGE、TLR2、TLR4等）結(jié)合后，可能激活下游的PI3K/AKT、ERK等信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，如調(diào)節(jié)整合素的活性，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，為細(xì)胞遷移提供基礎(chǔ)。ERK信號(hào)通路的激活則可以促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重排和重構(gòu)，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步深入探究這些信號(hào)通路在HMGB1促進(jìn)細(xì)胞遷移過(guò)程中的具體作用機(jī)制。4.2.2遷移相關(guān)蛋白在HMGB1影響遷移中的作用基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中的MMP-2和MMP-9在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造條件。本研究通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著HMGB1濃度的增加，MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明HMGB1可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力。MMP-2和MMP-9主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原、明膠等成分。Ⅳ型膠原是基底膜的主要成分之一，而明膠是膠原降解后的產(chǎn)物。MMP-2和MMP-9能夠特異性地識(shí)別并切割這些成分中的肽鍵，將其降解為小分子片段，從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供了一個(gè)穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)，但在細(xì)胞遷移過(guò)程中，這種結(jié)構(gòu)會(huì)成為細(xì)胞遷移的阻礙。當(dāng)MMP-2和MMP-9表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮作用時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)被降解，細(xì)胞周圍的空間結(jié)構(gòu)變得疏松，為細(xì)胞的遷移提供了通道，使細(xì)胞更容易突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制，實(shí)現(xiàn)遷移。HMGB1促進(jìn)MMP-2和MMP-9表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與激活相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。已有研究表明，HMGB1與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可激活ERK、PI3K/AKT等信號(hào)通路。ERK信號(hào)通路激活后，能夠磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到MMP-2和MMP-9基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平。隨著mRNA水平的升高，在核糖體上進(jìn)行翻譯合成的MMP-2和MMP-9蛋白也相應(yīng)增多。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活則可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子的活性，間接影響MMP-2和MMP-9基因的表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路可以抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，使得β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合，調(diào)控包括MMP-2和MMP-9在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)。研究還發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9之間可能存在相互作用，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞遷移。MMP-2和MMP-9雖然都能降解細(xì)胞外基質(zhì)，但它們對(duì)不同底物的降解活性存在差異。MMP-2對(duì)Ⅳ型膠原具有較高的親和力和降解活性，而MMP-9除了能降解Ⅳ型膠原外，對(duì)明膠和其他一些基質(zhì)成分也有較強(qiáng)的降解能力。在細(xì)胞遷移過(guò)程中，兩者可能通過(guò)不同的作用方式，共同降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞遷移提供更有利的條件。MMP-2先對(duì)Ⅳ型膠原進(jìn)行初步降解，使基底膜結(jié)構(gòu)變得疏松，隨后MMP-9進(jìn)一步降解其他基質(zhì)成分，擴(kuò)大細(xì)胞遷移的空間。它們還可能通過(guò)激活對(duì)方的前體形式，增強(qiáng)彼此的活性，從而更有效地促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞遷移。綜上所述，HMGB1可能通過(guò)激活ERK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而增強(qiáng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力。MMP-2和MMP-9在這一過(guò)程中可能相互協(xié)同，共同發(fā)揮作用。然而，HMGB1影響細(xì)胞遷移的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了MMP-2和MMP-9外，可能還涉及其他蛋白和信號(hào)通路的參與，需要進(jìn)一步深入研究。五、HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1.1HMGB1對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度HMGB1（0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）處理48h后人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如表4所示。HMGB1濃度（ng/ml）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）05.23±0.893.12±0.568.35±1.23108.56±1.23*4.56±0.78*13.12±1.65*5012.34±1.56*6.78±1.02*19.12±2.01*10016.78±1.89*9.34±1.23*26.12±2.56*20020.12±2.05*12.56±1.56*32.68±3.01*注：與0ng/ml組比較，*P＜0.05從表4數(shù)據(jù)可以看出，隨著HMGB1濃度的增加，人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。對(duì)照組（0ng/mlHMGB1）總凋亡率為8.35±1.23%，而10ng/mlHMGB1處理組總凋亡率增加至13.12±1.65%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)HMGB1濃度升高到200ng/ml時(shí)，總凋亡率達(dá)到32.68±3.01%，是對(duì)照組的近4倍，表明高濃度的HMGB1對(duì)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更為顯著。這一結(jié)果初步表明，HMGB1能夠誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，且這種誘導(dǎo)作用與濃度密切相關(guān)，呈濃度依賴性增加。5.1.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用，它們的表達(dá)水平變化直接影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。為了進(jìn)一步探究HMGB1誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，通過(guò)Westernblot檢測(cè)了不同濃度HMGB1處理后Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果如圖7所示。[此處插入Westernblot蛋白條帶圖，包含GAPDH（內(nèi)參）、Bcl-2、Bax的蛋白條帶，不同濃度HMGB1處理組依次排列，條帶清晰，背景干凈，圖片下方標(biāo)注各條帶對(duì)應(yīng)的蛋白名稱和濃度信息]使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖8所示。[此處插入Bcl-2和Bax相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，橫坐標(biāo)為HMGB1濃度（ng/ml），縱坐標(biāo)為Bcl-2或Bax相對(duì)表達(dá)量，Bcl-2和Bax分別用不同顏色的柱子表示，柱子上方標(biāo)注具體數(shù)值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)在圖注中說(shuō)明與對(duì)照組比較，*P＜0.05]從圖7和圖8可以看出，與對(duì)照組（0ng/mlHMGB1）相比，隨著HMGB1濃度的增加，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。在10ng/mlHMGB1處理組中，Bcl-2的表達(dá)就已經(jīng)開始下降，Bax的表達(dá)開始升高；當(dāng)濃度達(dá)到100ng/ml和200ng/ml時(shí)，Bcl-2和Bax表達(dá)水平的變化更為顯著，Bcl-2的表達(dá)顯著低于低濃度處理組，Bax的表達(dá)顯著高于低濃度處理組。這表明HMGB1可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax的比值，從而誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2可以通過(guò)抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡；而Bax激活后會(huì)轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增強(qiáng)線粒體的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。HMGB1可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如JNK、p38MAPK等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。5.2結(jié)果分析與討論5.2.1HMGB1對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用本研究通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著HMGB1濃度的增加，人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著升高，表明HMGB1能夠誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，且這種誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性。對(duì)照組總凋亡率為8.35±1.23%，而200ng/mlHMGB1處理組總凋亡率達(dá)到32.68±3.01%，是對(duì)照組的近4倍。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致，在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞模型中，外源性給予HMGB1可顯著增加心肌細(xì)胞的凋亡率，而抑制HMGB1的表達(dá)或活性則能減少細(xì)胞凋亡。HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，HMGB1可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體（TLRs）是HMGB1的主要受體，當(dāng)HMGB1與RAGE或TLRs結(jié)合后，可激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，如JNK、p38MAPK等。JNK和p38MAPK被激活后，可磷酸化一系列下游底物，包括轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)細(xì)胞中，HMGB1與RAGE結(jié)合后，激活JNK信號(hào)通路，導(dǎo)致c-Jun轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和激活，進(jìn)而上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。另一方面，HMGB1可能通過(guò)影響線粒體功能來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控中心，HMGB1可以進(jìn)入線粒體，與線粒體膜上的相關(guān)蛋白相互作用，導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，促進(jìn)細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可以與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）結(jié)合，改變VDAC的功能，導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失和細(xì)胞色素c的釋放，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果對(duì)于理解肺動(dòng)脈高壓等疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。在肺動(dòng)脈高壓患者中，肺血管平滑肌細(xì)胞的凋亡異常是肺血管重構(gòu)的重要病理特征之一。本研究表明HMGB1能夠誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡，提示在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HMGB1可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，影響肺血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量和功能，進(jìn)而參與肺血管重構(gòu)。進(jìn)一步深入研究HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，可能為肺動(dòng)脈高壓的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。5.2.2凋亡相關(guān)蛋白在HMGB1影響凋亡中的作用Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，它們的表達(dá)水平變化直接影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本研究通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著HMGB1濃度的增加，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，表明HMGB1可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax的比值，從而誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等膜結(jié)構(gòu)上。它可以通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡，其中最主要的機(jī)制是抑制線粒體膜通透性的改變。Bcl-2可以與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Bcl-2還可以與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞色素c，從而抑制凋亡小體的形成和caspase-9的激活，阻斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終抑制細(xì)胞凋亡。在正常細(xì)胞中，Bcl-2的表達(dá)水平較高，能夠有效地抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活。Bax是一種促凋亡蛋白，通常以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上。在線粒體膜上，Bax可以與其他Bax分子或Bak分子相互作用，形成同源或異源二聚體，進(jìn)而形成孔道結(jié)構(gòu)，增加線粒體膜的通透性。線粒體膜通透性的增加導(dǎo)致細(xì)胞色素c等凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與Apaf-1結(jié)合形成凋亡小體，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bax的表達(dá)水平升高，其活性增強(qiáng)，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。HMGB1調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達(dá)的機(jī)制可能與激活相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。已有研究表明，HMGB1與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，可激活JNK、p38MAPK等信號(hào)通路。JNK和p38MAPK信號(hào)通路激活后，能夠磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、ATF2等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到Bcl-2和Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，從而改變Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。JNK可以磷酸化c-Jun，使其與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域的AP-1位點(diǎn)結(jié)合，抑制Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)下降。p38MAPK可以激活A(yù)TF2，使其與Bax基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Bax蛋白表達(dá)升高。Bcl-2和Bax之間還存在著復(fù)雜的相互作用。它們可以形成異源二聚體，Bcl-2/Bax的比值決定了細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較高，Bcl-2/Bax比值較大時(shí)，細(xì)胞對(duì)凋亡刺激具有較強(qiáng)的抵抗力；而當(dāng)Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值降低時(shí)，細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。在本研究中，隨著HMGB1濃度的增加，Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降，使得細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性增加，從而誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。綜上所述，HMGB1可能通過(guò)激活JNK、p38MAPK等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax的比值，從而誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們的表達(dá)變化和相互作用共同調(diào)控著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。然而，HMGB1影響細(xì)胞凋亡的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了Bcl-2和Bax外，可能還涉及其他凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的參與，需要進(jìn)一步深入研究。六、研究結(jié)果綜合分析與展望6.1HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞功能影響的綜合闡述本研究系統(tǒng)地探究了HMGB1對(duì)體外人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)HMGB1在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色。在細(xì)胞增殖方面，通過(guò)CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HMGB1能夠顯著促進(jìn)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，且這種促進(jìn)作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。隨著HMGB1濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率和EdU陽(yáng)性細(xì)胞率均顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可能通過(guò)激活ERK和AKT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。ERK信號(hào)通路激活后，可磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程；AKT信號(hào)通路則通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和存活，為細(xì)胞增殖提供必要的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。這兩條信號(hào)通路之間還存在著復(fù)雜的相互作用和交叉對(duì)話，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞增殖。對(duì)于細(xì)胞遷移，Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMGB1能夠顯著增強(qiáng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移能力，同樣具有濃度和時(shí)間依賴性。隨著HMGB1濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量增多，劃痕愈合