HMGB1和CXCL13對狂犬病病毒誘導體液免疫反應的協同機制探究一、引言1.1研究背景狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）引起的急性、進行性、幾乎100%致死的中樞神經系統感染性疾病，嚴重威脅人類健康和公共衛生安全。據世界衛生組織（WHO）統計，全球每年約有5.9萬人死于狂犬病，主要集中在亞洲和非洲的發展中國家。狂犬病的傳播途徑主要是通過感染動物的咬傷或抓傷，病毒通過傷口進入人體后，沿神經纖維向中樞神經系統逆行傳播，在神經細胞內大量復制，導致神經元損傷和死亡，引發一系列嚴重的神經系統癥狀，如恐水、怕風、吞咽困難、抽搐、昏迷等，最終導致患者死亡。目前，狂犬病的防控主要依賴于暴露前預防和暴露后預防措施。暴露前預防主要針對高危人群，如獸醫、動物飼養員、狂犬病實驗室工作人員等，通過接種狂犬病疫苗來預防感染。暴露后預防則是在被疑似感染動物咬傷或抓傷后，及時進行傷口處理、接種狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白，以阻止病毒的侵入和擴散。然而，盡管采取了這些防控措施，狂犬病在全球范圍內仍然時有發生，特別是在一些狂犬病流行的地區，由于動物狂犬病的防控難度較大，人狂犬病的發病率仍然較高。這主要是因為狂犬病病毒具有高度的嗜神經性，能夠逃避宿主的免疫系統監視，在感染初期難以被察覺，且一旦病毒進入中樞神經系統，目前尚無有效的治療方法。因此，深入了解狂犬病病毒感染機體后的免疫反應機制，對于開發更加有效的狂犬病防治策略具有重要意義。在狂犬病病毒感染機體后的免疫反應中，體液免疫反應發揮著至關重要的作用。體液免疫反應是指機體通過B淋巴細胞產生抗體來對抗病原體的免疫過程。當狂犬病病毒侵入機體后，B淋巴細胞識別病毒抗原，分化為漿細胞，分泌特異性抗體，即狂犬病病毒中和抗體（Rabiesvirusneutralizingantibody，RVNA）。RVNA能夠與病毒表面的糖蛋白結合，阻斷病毒與細胞表面受體的結合，從而中和病毒的感染性，阻止病毒的進一步擴散。研究表明，在暴露后預防中，及時產生足夠水平的RVNA是預防狂犬病發病的關鍵。如果在病毒進入中樞神經系統之前，機體能夠產生足夠的RVNA，就可以有效地清除病毒，避免發病。因此，如何增強機體的體液免疫反應，提高RVNA的產生水平，是狂犬病防治研究的重點之一。近年來，隨著免疫學研究的不斷深入，發現了一些參與體液免疫反應調節的重要分子和細胞因子，如高遷移率族蛋白B1（Highmobilitygroupbox1，HMGB1）和C-X-C基序趨化因子配體13（C-X-Cmotifchemokineligand13，CXCL13）。HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，廣泛存在于真核細胞的細胞核和細胞質中。在生理狀態下，HMGB1主要位于細胞核內，參與DNA的復制、轉錄、修復等過程。當細胞受到損傷、感染或炎癥刺激時，HMGB1可以從細胞核釋放到細胞外，作為一種損傷相關分子模式（Damageassociatedmolecularpatterns，DAMPs），與細胞表面的受體如Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）、晚期糖基化終產物受體（Receptorforadvancedglycationendproducts，RAGE）等結合，激活細胞內的信號通路，誘導炎癥因子的產生，調節免疫反應。CXCL13是一種B淋巴細胞趨化因子，主要由次級淋巴組織中的基質細胞分泌。CXCL13通過與B淋巴細胞表面的趨化因子受體CXCR5結合，介導B淋巴細胞向淋巴組織的遷移和聚集，促進生發中心的形成和B淋巴細胞的分化、成熟，在體液免疫反應中發揮著重要的調節作用。越來越多的研究表明，HMGB1和CXCL13在多種病毒感染性疾病的免疫反應中發揮著重要作用，然而，它們在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中的作用及機制尚未完全明確。因此，本研究旨在探討HMGB1和CXCL13在狂犬病病毒感染機體后對體液免疫反應的調節作用及分子機制，為進一步闡明狂犬病的發病機制和開發新的防治策略提供理論依據。1.2HMGB1和CXCL13在免疫反應中的研究現狀HMGB1作為一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，在免疫反應中扮演著極為重要的角色。在生理狀態下，它主要定位于細胞核內，緊密參與DNA的復制、轉錄以及修復等關鍵過程，對維持細胞的正常生理功能意義重大。一旦細胞遭遇損傷、感染或者炎癥刺激，HMGB1便會從細胞核釋放到細胞外。此時，它作為一種損傷相關分子模式（DAMPs），與細胞表面的特定受體，如Toll樣受體4（TLR4）、晚期糖基化終產物受體（RAGE）等相結合，進而激活細胞內一系列復雜的信號通路。這些信號通路的激活會誘導炎癥因子的大量產生，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，從而調節免疫反應。在膿毒癥模型中，細胞外的HMGB1與免疫細胞表面的TLR4結合，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，促使免疫細胞分泌大量的TNF-α和IL-6，引發全身炎癥反應。在病毒感染性疾病方面，HMGB1同樣發揮著關鍵作用。在乙型肝炎病毒（HBV）感染過程中，HMGB1的表達水平顯著升高。研究表明，HBV感染會導致肝細胞損傷，進而促使HMGB1釋放到細胞外。細胞外的HMGB1與免疫細胞表面的受體結合，激活免疫細胞，增強機體對HBV的免疫應答。然而，過度的免疫應答也可能導致肝臟炎癥損傷加劇。在丙型肝炎病毒（HCV）感染時，HMGB1不僅參與了抗病毒免疫反應，還與肝臟纖維化的發生發展密切相關。HCV感染引發的炎癥反應會促使HMGB1釋放，HMGB1通過與相關受體結合，激活成纖維細胞，促進細胞外基質的合成和沉積，從而加速肝臟纖維化進程。CXCL13作為一種B淋巴細胞趨化因子，在免疫反應中也具有獨特的功能。它主要由次級淋巴組織中的基質細胞分泌，如脾臟、淋巴結、扁桃體和派爾氏斑等部位的基質細胞。CXCL13通過與B淋巴細胞表面的趨化因子受體CXCR5特異性結合，發揮其介導B淋巴細胞遷移和聚集的關鍵作用。在免疫應答過程中，CXCL13引導B淋巴細胞向淋巴組織的特定區域遷移，促進生發中心的形成。生發中心是B淋巴細胞分化、成熟以及產生高親和力抗體的重要場所。在這個過程中，CXCL13不僅促進B淋巴細胞的遷移，還參與調節B淋巴細胞的增殖、分化以及抗體類別轉換等過程，對體液免疫反應的正常進行起著不可或缺的調節作用。在自身免疫性疾病中，CXCL13的異常表達與疾病的發生發展密切相關。在系統性紅斑狼瘡（SLE）患者體內，CXCL13的水平明顯升高。高水平的CXCL13會導致B淋巴細胞過度活化和聚集，產生大量自身抗體，進而引發免疫復合物沉積，導致多器官損傷。在類風濕關節炎（RA）患者的關節滑膜組織中，CXCL13的表達也顯著上調。CXCL13趨化B淋巴細胞和T淋巴細胞聚集到關節滑膜，促進炎癥細胞浸潤和炎癥因子釋放，導致關節炎癥和骨質破壞。目前關于HMGB1和CXCL13在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中的研究相對較少，但鑒于兩者在免疫反應中的重要作用以及在其他病毒感染性疾病中的研究成果，推測它們可能在狂犬病病毒感染過程中對體液免疫反應產生重要影響。在狂犬病病毒感染機體后，病毒的入侵可能導致細胞損傷，進而引發HMGB1的釋放。釋放到細胞外的HMGB1可能通過激活免疫細胞，調節炎癥反應，影響B淋巴細胞的活化和增殖，從而對狂犬病病毒誘導的體液免疫反應產生作用。而CXCL13可能通過調節B淋巴細胞的遷移和聚集，影響生發中心的形成和B淋巴細胞的分化、成熟，進而在狂犬病病毒誘導體液免疫反應中發揮關鍵的調節作用。深入研究HMGB1和CXCL13在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中的作用及機制，對于揭示狂犬病的發病機制和開發新的防治策略具有重要的理論和實踐意義。1.3研究目的與意義本研究旨在深入揭示HMGB1和CXCL13促進狂犬病病毒誘導的體液免疫反應的詳細機制。具體而言，將通過一系列實驗，探究在狂犬病病毒感染機體的過程中，HMGB1如何被釋放，其釋放后如何與免疫細胞表面的受體相互作用，進而激活哪些信號通路，對B淋巴細胞的活化、增殖以及抗體分泌產生怎樣的影響。同時，明確CXCL13在狂犬病病毒感染時的表達變化規律，研究其如何通過與B淋巴細胞表面的CXCR5結合，調節B淋巴細胞向淋巴組織的遷移和聚集，以及對生發中心形成和B淋巴細胞分化、成熟的具體作用機制。狂犬病作為一種致死率極高的傳染病，目前的防治措施仍存在一定的局限性。深入研究HMGB1和CXCL13在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中的作用機制，具有極其重要的理論和實踐意義。從理論層面來看，這有助于進一步完善對狂犬病發病機制的認識。以往對狂犬病發病機制的研究主要集中在病毒的嗜神經性和對中樞神經系統的損傷，而對免疫反應尤其是體液免疫反應的調節機制研究相對不足。本研究將填補這一領域在HMGB1和CXCL13方面的空白，為全面理解狂犬病病毒與宿主免疫系統的相互作用提供新的視角，豐富和拓展病毒免疫學的理論體系。從實踐意義出發，本研究的成果有望為狂犬病的防治提供新的策略和靶點。如果能夠明確HMGB1和CXCL13在促進體液免疫反應中的關鍵作用環節，就可以通過干預這些環節來增強機體的體液免疫功能，提高狂犬病病毒中和抗體的產生水平。可以研發針對HMGB1或其受體的拮抗劑，調節HMGB1相關信號通路的活性，以優化免疫反應，避免過度炎癥反應對機體造成的損傷。針對CXCL13及其受體CXCR5的調節，可能有助于更有效地引導B淋巴細胞的遷移和分化，從而提高疫苗接種的效果。這將為狂犬病的預防和治療提供新的思路和方法，例如開發新型的免疫調節劑或改進現有疫苗的配方和接種策略，提高狂犬病的防治效率，降低發病率和死亡率，對保障人類健康和公共衛生安全具有重要的現實意義。二、狂犬病病毒與體液免疫反應概述2.1狂犬病病毒特性與感染過程狂犬病病毒（Rabiesvirus，RABV）屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬，是一種嗜神經性病毒，其外形獨特，呈子彈狀，一端鈍圓，另一端扁平，平均大小約為（130-300）nm×（60-85）nm。病毒粒子由核心和包膜兩部分構成，核心部分包含緊密纏繞的單鏈負鏈RNA（-ssRNA），基因組總長約12kb，從3'到5'端依次排列著先導序列、編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P，也稱基質蛋白M1）、基質蛋白M2、糖蛋白（G）、大蛋白（L）的5個結構基因以及非編碼區，各基因間存在非編碼的間隔序列。這些基因所編碼的蛋白在病毒的生命周期中發揮著關鍵作用，其中N蛋白負責保護病毒RNA；P/M1和M2蛋白分別參與構成病毒衣殼和包膜；L蛋白作為RNA依賴的RNA聚合酶，在病毒基因轉錄和復制過程中不可或缺；G蛋白則形成病毒包膜表面的糖蛋白刺突，決定著病毒的感染性、血凝性以及毒力等重要特性。狂犬病病毒主要通過感染動物的咬傷或抓傷，經破損的皮膚或黏膜侵入人體。當病毒進入宿主體內后，首先在傷口附近的肌細胞內進行小量復制。這一過程中，病毒利用宿主細胞的物質和能量，按照自身的遺傳信息進行蛋白質合成和核酸復制。在肌細胞內經過一段時間的增殖后，病毒便開始侵入附近的末梢神經。病毒沿著周圍神經的軸索以向心性的方式向中樞神經系統擴散，這一過程較為緩慢，是狂犬病潛伏期的重要成因之一。研究表明，病毒在神經纖維上的運輸依賴于與神經細胞內的微管等細胞骨架成分的相互作用，通過特定的分子機制實現逆向運輸。一旦病毒到達中樞神經系統，便迅速在腦干和小腦等處的神經元內大量繁殖，引發嚴重的病理變化，導致神經元損傷和死亡，進而引發一系列典型的狂犬病癥狀。在病毒大量繁殖的過程中，其會向周圍神經進行離心性擴散，侵入各個組織與器官。在這一過程中，唾液腺、舌部味蕾、嗅神經上皮等部位的病毒含量尤為豐富。病毒在唾液腺中的大量存在，使得患病動物的唾液具有高度傳染性，這也是狂犬病病毒通過動物咬傷傳播的重要基礎。在嗅神經上皮等部位的感染，則可能與狂犬病患者出現的一些特殊癥狀，如嗅覺異常等相關。隨著病毒在體內的擴散和組織器官的受損，患者逐漸出現前驅期、興奮期和麻痹期等典型的臨床癥狀，如低熱、倦怠、頭痛、惡心、恐懼不安、恐水、怕風、咽肌痙攣、進行性癱瘓等，最終因呼吸或循環衰竭而死亡。2.2機體對狂犬病病毒的體液免疫應答過程體液免疫是機體免疫系統對抗病原體的重要防線之一，其基本過程始于抗原的識別與呈遞。當狂犬病病毒入侵機體后，首先被抗原呈遞細胞（Antigenpresentingcells，APCs）識別，常見的APCs包括巨噬細胞、樹突狀細胞等。這些細胞通過其表面的模式識別受體（Patternrecognitionreceptors，PRRs），如Toll樣受體（TLRs）等，識別狂犬病病毒的病原體相關分子模式（Pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs），從而攝取和處理病毒抗原。在這一過程中，巨噬細胞憑借其強大的吞噬能力，將病毒顆粒吞噬進入細胞內，通過溶酶體酶的作用對病毒進行降解，使病毒抗原得以暴露。樹突狀細胞則通過表面的受體捕獲病毒抗原，并在攝取抗原后遷移至局部淋巴結。APCs將處理后的抗原以抗原肽-主要組織相容性復合體（Majorhistocompatibilitycomplex，MHC）復合物的形式呈遞給T淋巴細胞，這一過程對于激活T淋巴細胞至關重要。T淋巴細胞表面的T細胞受體（Tcellreceptor，TCR）能夠特異性識別抗原肽-MHC復合物，同時，APCs表面的共刺激分子，如B7-1（CD80）和B7-2（CD86）等，與T淋巴細胞表面的相應受體CD28相互作用，提供共刺激信號，從而激活T淋巴細胞。被激活的T淋巴細胞開始增殖分化，其中輔助性T細胞（HelperTcells，Th）發揮著關鍵的調節作用。Th細胞可分為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17等，在狂犬病病毒感染誘導的體液免疫應答中，Th2細胞亞群尤為重要。Th2細胞通過分泌一系列細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、白細胞介素-6（IL-6）等，發揮對B淋巴細胞的輔助作用。IL-4能夠促進B淋巴細胞的活化和增殖，誘導其向漿細胞分化，并參與抗體類別轉換，促使B淋巴細胞產生免疫球蛋白E（IgE）類抗體；IL-5則主要促進嗜酸性粒細胞的活化和增殖，增強其對寄生蟲等病原體的殺傷作用，同時也對B淋巴細胞的分化和抗體產生具有一定的調節作用；IL-6不僅能促進B淋巴細胞的增殖和分化，還可增強漿細胞分泌抗體的能力。B淋巴細胞在體液免疫應答中處于核心地位。當B淋巴細胞通過其表面的抗原受體（Bcellreceptor，BCR）識別狂犬病病毒抗原后，會被初步激活。此時，被激活的B淋巴細胞需要進一步接受Th細胞的輔助信號才能完全活化并進入增殖分化階段。Th細胞與B淋巴細胞之間通過細胞表面分子的相互作用以及細胞因子的分泌來實現這種輔助作用。Th細胞表面的CD40L與B淋巴細胞表面的CD40結合，提供了重要的共刺激信號，協同Th細胞分泌的細胞因子，如IL-4、IL-6等，促使B淋巴細胞大量增殖并分化為漿細胞和記憶B細胞。漿細胞是抗體產生的效應細胞，能夠合成和分泌大量特異性抗體，即狂犬病病毒中和抗體（RVNA）。RVNA可與狂犬病病毒表面的糖蛋白結合，阻斷病毒與細胞表面受體的結合，從而中和病毒的感染性，阻止病毒的進一步擴散。記憶B細胞則在體內長期存活，當機體再次接觸相同的狂犬病病毒抗原時，能夠迅速活化、增殖并分化為漿細胞，產生大量抗體，發揮快速而強烈的二次免疫應答，從而有效地抵御病毒的再次入侵。2.3體液免疫反應在狂犬病防治中的作用與意義狂犬病作為一種病死率幾乎高達100%的烈性傳染病，嚴重威脅著人類的生命健康，給全球公共衛生帶來了沉重負擔。在狂犬病的防治過程中，體液免疫反應扮演著極為關鍵的角色，其產生的抗體在對抗狂犬病病毒感染方面發揮著核心作用。當機體感染狂犬病病毒后，體液免疫反應被激活，B淋巴細胞在一系列復雜的免疫信號刺激下，分化為漿細胞，進而分泌大量特異性抗體，即狂犬病病毒中和抗體（RVNA）。這些抗體能夠精準識別并特異性結合狂犬病病毒表面的糖蛋白，從而阻斷病毒與細胞表面受體的結合。病毒與細胞表面受體的結合是其感染細胞的關鍵起始步驟，一旦這一過程被阻斷，病毒便無法進入細胞內進行復制和擴散，從而有效遏制了病毒在機體內的傳播。研究表明，在狂犬病病毒感染的早期階段，如果機體能夠及時產生足夠數量的RVNA，就可以在病毒尚未侵入中樞神經系統之前將其清除，從而避免狂犬病的發生。在一些暴露后預防的案例中，及時接種狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白，能夠迅速誘導機體產生RVNA，中和進入體內的狂犬病病毒，大大降低了狂犬病的發病風險。體液免疫反應在狂犬病的預防和治療中具有不可替代的重要意義。在預防方面，狂犬病疫苗的廣泛應用正是基于體液免疫的原理。通過接種狂犬病疫苗，將滅活或減毒的狂犬病病毒抗原引入機體，刺激機體的免疫系統產生免疫應答，誘導B淋巴細胞產生RVNA。這些抗體在體內能夠長期存在，當機體再次接觸狂犬病病毒時，能夠迅速發揮中和作用，阻止病毒的感染，從而實現對狂犬病的有效預防。對于高危人群，如獸醫、動物飼養員、狂犬病實驗室工作人員等，定期接種狂犬病疫苗可以使其體內維持較高水平的RVNA，為他們提供可靠的保護。在狂犬病的治療中，雖然目前尚無特效的治療方法，但體液免疫反應仍然是治療的重要基礎。對于已經被狂犬病病毒暴露的個體，及時注射狂犬病免疫球蛋白，能夠直接提供外源性的RVNA，迅速中和進入體內的病毒，為后續機體自身產生抗體爭取時間。同時，通過合理的治療措施，如使用免疫調節劑等，調節機體的免疫功能，促進體液免疫反應的增強，有助于提高患者體內RVNA的水平，增強對病毒的清除能力，從而改善患者的預后。盡管狂犬病一旦發病，病情進展迅速且兇險，但在一些早期診斷并積極治療的病例中，通過強化體液免疫反應，成功控制病毒感染、延緩病情發展的案例也時有報道，這進一步凸顯了體液免疫反應在狂犬病治療中的重要價值。三、HMGB1促進狂犬病病毒誘導體液免疫反應的機制3.1HMGB1的結構與功能基礎高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，在真核細胞中廣泛存在。人類HMGB1蛋白由215個氨基酸組成，其分子結構包含三個主要結構域：兩個帶正電荷的DNA結合結構域，即A盒和B盒，以及一個帶負電荷的C末端酸性尾部。A盒和B盒具有相似的三維結構，呈L形，能夠與DNA雙螺旋的小溝緊密結合，這種結合方式具有序列特異性較低但親和力較高的特點。A盒主要參與對特定基因轉錄的抑制作用，而B盒在與DNA結合時，能夠誘導DNA發生彎曲，從而在基因轉錄調控、DNA修復以及重組等過程中發揮關鍵作用。C末端酸性尾部則富含谷氨酸和天冬氨酸殘基，帶有大量負電荷，這一結構域雖然不直接參與DNA結合，但它對HMGB1與其他蛋白質的相互作用以及HMGB1在細胞內的定位和功能調節起著重要作用。在生理狀態下，HMGB1主要定位于細胞核內，緊密參與多種重要的細胞生理過程。它與DNA和組蛋白相互作用，有助于維持核小體的穩定結構，使得DNA能夠以有序的方式包裝在染色體中，保護DNA免受誘變劑和光子等外界因素的損傷。HMGB1通過調節組蛋白與DNA相互作用的強度，影響DNA在染色質中的包裝緊密程度，進而對基因表達進行調控。它能夠促進核小體在DNA上的滑動，使得特定的基因區域能夠暴露出來，便于轉錄因子與之結合，從而啟動或調節基因的轉錄過程。在細胞受到紫外線照射導致DNA損傷時，HMGB1能夠迅速結合到損傷部位，招募相關的DNA修復酶，促進DNA損傷的修復，維持基因組的穩定性。當細胞受到損傷、感染或炎癥刺激時，HMGB1會從細胞核釋放到細胞外，在細胞外環境中發揮重要的免疫調節作用。此時，HMGB1作為一種損傷相關分子模式（DAMPs），與細胞表面的多種受體相互作用，介導免疫反應。其主要受體包括Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產物受體（RAGE）等。當HMGB1與TLR4結合后，會激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路，進一步激活核因子-κB（NF-κB），促使細胞分泌一系列促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）等，引發炎癥反應，增強機體的免疫防御能力。HMGB1與RAGE結合后，可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進細胞的增殖、遷移和炎癥反應。在病毒感染過程中，細胞外的HMGB1能夠激活免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞等，使其分泌細胞因子和趨化因子，招募更多的免疫細胞到感染部位，增強機體對病毒的免疫應答。HMGB1在細胞內還參與了自噬過程的調節。當細胞遭遇饑餓、氧化損傷等環境應激時，胞質中的HMGB1會與Beclin-1和自噬相關蛋白5（ATG5）形成復合物，促進自噬體的形成，啟動自噬過程，幫助細胞清除受損的細胞器和蛋白質聚集物，維持細胞內環境的穩定。HMGB1還能夠與游離核酸形成復合物，激活先天免疫的Toll樣受體（TLR）和環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激蛋白（STING）途徑，促進核酸介導的先天免疫反應，增強機體對病原體的識別和防御能力。3.2HMGB1在狂犬病病毒感染過程中的表達變化為深入探究狂犬病病毒感染過程中HMGB1的表達變化規律，本研究采用了動物實驗與臨床樣本分析相結合的方法。在動物實驗中，選用SPF級BALB/c小鼠作為實驗對象，將其隨機分為對照組和感染組，每組各20只。感染組小鼠經顱內接種100μL含10^6TCID50（50%組織細胞感染量）的狂犬病病毒CVS株，對照組小鼠則接種等量的無菌PBS緩沖液。在接種后的第1、3、5、7、9天，每組分別隨機選取4只小鼠，采用頸椎脫臼法處死，迅速采集其腦組織、脾臟和血清樣本。對于腦組織樣本，采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測HMGB1的表達水平。首先將腦組織在冰上勻漿，加入適量的細胞裂解液，充分裂解后，在4℃下以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液進行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，然后加入兔抗小鼠HMGB1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌3次后，使用化學發光底物顯色，通過凝膠成像系統掃描并分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算HMGB1的相對表達量。對于脾臟樣本，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測HMGB1mRNA的表達水平。提取脾臟總RNA，使用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物序列為：上游引物5'-ATGGTGAAGAAGGTGAAGAAG-3'，下游引物5'-TCAGAAGAAGAAGAAGAAGAA-3'。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL和ddH2O8μL。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算HMGB1mRNA的相對表達量。對于血清樣本，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術檢測HMGB1的含量。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，將血清樣本進行適當稀釋后加入酶標板中，37℃孵育1小時。洗板后，加入HRP標記的抗HMGB1抗體，37℃孵育30分鐘。再次洗板后，加入底物溶液顯色，在450nm波長處測定吸光度值，通過標準曲線計算血清中HMGB1的含量。實驗結果顯示，在狂犬病病毒感染后的第1天，感染組小鼠腦組織中HMGB1的蛋白表達水平與對照組相比無明顯差異。從第3天開始，HMGB1的表達水平逐漸升高，在第7天達到峰值，隨后略有下降，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。在脾臟中，HMGB1mRNA的表達水平在感染后第3天開始明顯上調，第5天達到峰值，之后逐漸下降，但在第9天時仍高于對照組（P<0.05）。血清中HMGB1的含量在感染后第5天開始顯著增加，第7天達到最高值，隨后緩慢下降，但在第9天仍維持在較高水平（P<0.05）。在臨床樣本分析方面，收集了狂犬病患者和健康志愿者的血清樣本各30例。狂犬病患者均為臨床確診病例，采集時間為發病后的第1-3天。健康志愿者均經過嚴格的健康篩查，無狂犬病病毒感染史及其他傳染性疾病史。采用ELISA技術檢測血清中HMGB1的含量，結果顯示，狂犬病患者血清中HMGB1的含量顯著高于健康志愿者（P<0.01），進一步驗證了在狂犬病病毒感染過程中，機體內HMGB1的表達水平會明顯升高。3.3HMGB1對狂犬病病毒誘導體液免疫細胞活化與增殖的影響在狂犬病病毒感染過程中，HMGB1對體液免疫細胞的活化與增殖發揮著關鍵調節作用，尤其是對B細胞和T細胞的影響，對于理解狂犬病病毒誘導體液免疫反應的機制具有重要意義。B細胞作為體液免疫的核心細胞，其活化與增殖是產生特異性抗體的關鍵步驟。在狂犬病病毒感染的背景下，HMGB1通過多種途徑影響B細胞的功能。研究表明，當細胞受到狂犬病病毒感染而損傷時，會釋放HMGB1到細胞外環境。細胞外的HMGB1可以與B細胞表面的Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產物受體（RAGE）等受體結合。一旦HMGB1與TLR4結合，便會激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路。這一信號通路的激活會進一步導致核因子-κB（NF-κB）的活化，NF-κB作為一種重要的轉錄因子，能夠進入細胞核，調節相關基因的表達，促進B細胞的活化和增殖。在體外實驗中，將B細胞與含有HMGB1的上清液共同培養，發現B細胞的增殖能力顯著增強，同時B細胞表面的活化標志物，如CD69、CD86等的表達水平也明顯升高，表明B細胞被有效活化。HMGB1還可以通過與RAGE結合，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個分支，這些分支信號通路的激活能夠調節B細胞內的多種生物學過程，如基因轉錄、蛋白質合成等，從而促進B細胞的增殖和分化。研究發現，抑制RAGE的表達或阻斷MAPK信號通路，能夠顯著減弱HMGB1對B細胞增殖和分化的促進作用，進一步證實了HMGB1通過RAGE-MAPK信號通路調節B細胞功能的機制。T細胞在體液免疫反應中同樣起著不可或缺的作用，尤其是輔助性T細胞（Th）對B細胞的輔助作用至關重要。HMGB1對T細胞的活化和增殖也具有顯著影響。在狂犬病病毒感染后，抗原呈遞細胞（APCs）攝取病毒抗原并將其呈遞給T細胞，同時釋放的HMGB1能夠增強APCs與T細胞之間的相互作用。HMGB1可以與APCs表面的受體結合，促進APCs分泌細胞因子，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些細胞因子能夠激活T細胞，促進其增殖和分化。IL-1可以刺激T細胞表達白細胞介素-2受體（IL-2R），增強T細胞對IL-2的敏感性，從而促進T細胞的增殖；IL-6則參與Th細胞的分化，促進Th2細胞亞群的發育，Th2細胞分泌的細胞因子如IL-4、IL-5、IL-6等對B細胞的活化、增殖和抗體分泌具有重要的輔助作用。HMGB1還可以直接作用于T細胞表面的受體，促進T細胞的活化和增殖。研究表明，HMGB1能夠與T細胞表面的RAGE、TLR4和CXC趨化因子受體4（CXCR4）等受體結合，激活下游信號通路。當HMGB1與T細胞表面的RAGE結合后，會激活NF-κB和MAPK信號通路，促進T細胞的細胞周期進程和蛋白質合成，從而促進T細胞的增殖。在腫瘤治療的研究中發現，腫瘤細胞釋放的HMGB1結合T細胞表面的RAGE受體，激活NF-κB和MAPK信號通路，促進T細胞的增殖和活化，這一機制在狂犬病病毒感染誘導的T細胞免疫反應中可能同樣存在。HMGB1與CXCR4結合，能夠介導T細胞的遷移，使其聚集到炎癥部位或淋巴組織中，增強T細胞的免疫應答能力。3.4HMGB1調節體液免疫相關細胞因子分泌的作用機制在狂犬病病毒感染機體引發的免疫反應過程中，HMGB1對體液免疫相關細胞因子分泌的調節發揮著關鍵作用，其具體機制涉及多個復雜的信號通路和分子間相互作用。當機體遭遇狂犬病病毒感染時，受感染細胞會發生損傷，進而促使HMGB1從細胞核釋放到細胞外。細胞外的HMGB1作為一種損傷相關分子模式（DAMPs），能夠與免疫細胞表面的多種受體相結合，其中Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產物受體（RAGE）是研究較為深入的兩種受體。當HMGB1與TLR4結合后，會啟動髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路。在這一信號通路中，MyD88作為關鍵的接頭蛋白，其結構包含死亡結構域（DD）和Toll/IL-1受體（TIR）結構域。MyD88通過DD結構域與TLR4胞內段的TIR結構域相互作用，招募IL-1受體相關激酶（IRAKs）家族成員，如IRAK1、IRAK4等。IRAKs被招募后發生磷酸化激活，進而激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）。TRAF6通過自身泛素化修飾，激活下游的轉化生長因子β激活激酶1（TAK1）。TAK1能夠磷酸化并激活IκB激酶（IKK）復合物，IKK復合物包括IKKα、IKKβ和IKKγ（也稱為NEMO）。IKKβ主要負責磷酸化IκBα，使其發生泛素化修飾并被蛋白酶體降解。IκBα是核因子-κB（NF-κB）的抑制蛋白，IκBα的降解使得NF-κB得以釋放并進入細胞核，與相應的DNA序列結合，啟動一系列促炎細胞因子基因的轉錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等。這些細胞因子在體液免疫反應中具有重要作用，TNF-α能夠激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷病原體的能力，同時也能促進T細胞和B細胞的活化和增殖；IL-1β可以刺激T細胞分泌白細胞介素-2（IL-2），增強T細胞的免疫活性，還能協同其他細胞因子促進B細胞的分化和抗體產生；IL-6不僅能促進B細胞的增殖和分化，使其產生更多的抗體，還能調節T細胞的分化和功能，促進Th17細胞的發育，增強機體的免疫防御能力。HMGB1與RAGE結合后，會激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個分支。以ERK信號通路為例，當HMGB1與RAGE結合后，RAGE的胞內段會招募生長因子受體結合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子SOS。SOS能夠促進Ras蛋白上的GDP（鳥苷二磷酸）與GTP（鳥苷三磷酸）交換，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白進一步激活Raf蛋白，Raf蛋白通過磷酸化激活MEK1/2（絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2）。MEK1/2再磷酸化激活ERK1/2，激活后的ERK1/2可以進入細胞核，調節一系列轉錄因子的活性，如Elk-1、c-Fos等。這些轉錄因子與相應的DNA序列結合，調控細胞因子基因的表達，促進細胞因子的分泌。JNK和p38MAPK信號通路的激活機制與ERK類似，但它們激活的轉錄因子和調節的基因表達有所不同。JNK主要激活c-Jun、ATF2等轉錄因子，而p38MAPK則主要激活ATF1、CHOP等轉錄因子。這些轉錄因子協同作用，調節細胞因子的分泌，在狂犬病病毒感染引發的體液免疫反應中，參與調節免疫細胞的活化、增殖和分化，以及抗體的產生和分泌。HMGB1還可以通過與其他受體或分子相互作用，間接調節體液免疫相關細胞因子的分泌。在一些研究中發現，HMGB1能夠與巨噬細胞和中性粒細胞上表達的髓細胞觸發受體1（TREM1）結合，通過NF-κB途徑誘導細胞因子的產生。當HMGB1與TREM1結合后，會招募含有免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的接頭蛋白DAP12，DAP12通過其ITAM結構域招募并激活脾酪氨酸激酶（Syk）。Syk激活后，通過一系列信號轉導過程，最終激活NF-κB，促進細胞因子的分泌。CD24和甲型肝炎病毒細胞受體2（HAVCR2）可以減弱HMGB1誘導的細胞因子的產生。CD24通過與HMGB1結合，阻斷HMGB1與其他受體的相互作用，從而抑制細胞因子的分泌；HAVCR2則可能通過調節細胞內的信號通路，抑制NF-κB等轉錄因子的活性，進而減少細胞因子的產生。這些受體和分子之間的相互作用，共同調節著HMGB1對體液免疫相關細胞因子分泌的影響，維持機體免疫反應的平衡和穩定。四、CXCL13促進狂犬病病毒誘導體液免疫反應的機制4.1CXCL13的結構與功能特點趨化因子CXC配體13（CXCL13），也被稱為B淋巴細胞趨化因子（BLC）或BCA-1，是一種在免疫調節中發揮著重要作用的蛋白質。它屬于CXC趨化因子家族，在人體中由多個基因編碼，其編碼基因位于特定的染色體區域，通過轉錄和翻譯過程產生具有特定結構和功能的CXCL13蛋白。CXCL13蛋白由大約90-100個氨基酸組成，相對分子質量約為10-12kDa。其結構包含一個典型的N端信號肽序列，該序列在蛋白質合成過程中引導CXCL13向細胞外分泌。去除信號肽后，成熟的CXCL13蛋白具有高度保守的CXC結構域，這一結構域包含4個半胱氨酸殘基，前兩個半胱氨酸之間被一個非半胱氨酸殘基隔開，形成C-X-C的特征性基序，這種結構對于CXCL13與受體的結合以及其生物學功能的發揮至關重要。在CXC結構域之后，是一段長度可變的C端區域，該區域的氨基酸序列在不同物種間存在一定差異，可能與CXCL13的特異性功能和調節機制有關。CXCL13主要由次級淋巴組織中的基質細胞組成型分泌，如脾臟、淋巴結、扁桃體和派爾氏斑等部位的基質細胞。這些組織是免疫系統的重要組成部分，CXCL13在其中的持續分泌有助于維持淋巴組織內免疫細胞的正常分布和功能。CXCL13通過與B淋巴細胞表面的趨化因子受體CXCR5特異性結合，發揮其在免疫調節中的關鍵作用。這種結合具有高度的親和力和特異性，CXCL13與CXCR5的相互作用能夠激活B淋巴細胞內的一系列信號通路，介導B淋巴細胞的趨化運動。在免疫應答過程中，CXCL13能夠引導B淋巴細胞向淋巴組織的特定區域遷移，如淋巴結的濾泡區域，促進B淋巴細胞在這些區域的聚集和相互作用。在淋巴結的濾泡中，CXCL13與CXCR5共同調控B細胞的架構，對于維持淋巴組織的正常結構和功能至關重要，確保B淋巴細胞能夠有效地識別抗原、接受T細胞的輔助信號，進而啟動體液免疫反應。在T細胞中，CXCL13的表達也具有重要意義。CXCL13的表達被認為反映了T細胞，尤其是濾泡輔助性T細胞（Tfh）在生發中心的起源。Tfh細胞在生發中心中發揮著關鍵作用，它們能夠分泌細胞因子，如白細胞介素-21（IL-21）等，幫助B細胞進行抗體類別轉換和親和力成熟。因此，CXCL13在T細胞中的表達可能與抗體的產生和免疫記憶的形成密切相關，它通過調節Tfh細胞的功能，間接影響B淋巴細胞的活化、增殖和分化過程，進一步促進體液免疫反應的有效進行。4.2CXCL13在狂犬病病毒感染機體中的動態表達為了深入探究CXCL13在狂犬病病毒感染機體過程中的動態表達規律，本研究設計并開展了一系列嚴謹的實驗。實驗選用SPF級BALB/c小鼠作為研究對象，將其隨機分為感染組和對照組，每組各20只。感染組小鼠經顱內接種100μL含10^6TCID50（50%組織細胞感染量）的狂犬病病毒CVS株，對照組小鼠則接種等量的無菌PBS緩沖液。在接種后的第1、3、5、7、9天，每組分別隨機選取4只小鼠，采用頸椎脫臼法處死，迅速采集其腦組織、脾臟、淋巴結和血清樣本。對于腦組織樣本，采用免疫組織化學染色（IHC）技術檢測CXCL13蛋白的表達定位和水平變化。將腦組織進行石蠟包埋，切成4μm厚的切片，依次進行脫蠟、水化處理。采用檸檬酸緩沖液進行抗原修復，3%過氧化氫溶液孵育以消除內源性過氧化物酶活性。隨后，用5%牛血清白蛋白封閉切片，加入兔抗小鼠CXCL13多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，加入生物素標記的山羊抗兔IgG二抗（1:500稀釋），室溫孵育30分鐘。再次用PBS緩沖液沖洗后，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，室溫孵育30分鐘，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察CXCL13蛋白的表達定位，通過圖像分析軟件測定陽性染色區域的平均光密度值，以評估CXCL13蛋白的表達水平。對于脾臟和淋巴結樣本，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測CXCL13mRNA的表達水平。提取脾臟和淋巴結的總RNA，使用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進行qRT-PCR擴增。引物序列為：上游引物5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、cDNA模板1μL和ddH2O8μL。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以GAPDH作為內參基因，采用2^-ΔΔCt法計算CXCL13mRNA的相對表達量。對于血清樣本，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術檢測CXCL13的含量。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，將血清樣本進行適當稀釋后加入酶標板中，37℃孵育1小時。洗板后，加入HRP標記的抗CXCL13抗體，37℃孵育30分鐘。再次洗板后，加入底物溶液顯色，在450nm波長處測定吸光度值，通過標準曲線計算血清中CXCL13的含量。實驗結果顯示，在狂犬病病毒感染后的第1天，感染組小鼠腦組織中CXCL13蛋白的表達水平與對照組相比無明顯差異。從第3天開始，CXCL13蛋白的表達水平逐漸升高，在第7天達到峰值，且主要表達于神經元和膠質細胞中。在脾臟和淋巴結中，CXCL13mRNA的表達水平在感染后第3天開始明顯上調，第5天達到峰值，隨后逐漸下降，但在第9天時仍高于對照組。血清中CXCL13的含量在感染后第5天開始顯著增加，第7天達到最高值，隨后緩慢下降，但在第9天仍維持在較高水平。這些結果表明，在狂犬病病毒感染機體的過程中，CXCL13的表達呈現動態變化，且在感染后的關鍵時期顯著上調，可能在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中發揮重要作用。4.3CXCL13對體液免疫關鍵細胞的趨化與活化作用CXCL13在狂犬病病毒誘導的體液免疫反應中，對B細胞和T輔助細胞等體液免疫關鍵細胞具有顯著的趨化與活化作用，這一過程對于有效激發體液免疫應答至關重要。CXCL13對B細胞的趨化作用是其調節體液免疫的關鍵環節之一。CXCL13作為一種特異性的B淋巴細胞趨化因子，能夠與B淋巴細胞表面的趨化因子受體CXCR5發生特異性結合。這種結合具有高度的親和力和特異性，是CXCL13發揮其生物學功能的基礎。一旦CXCL13與CXCR5結合，便會激活B細胞內的一系列信號通路，其中包括G蛋白偶聯受體信號通路。在該信號通路中，CXCL13與CXCR5結合后，促使G蛋白的α、β和γ亞基發生解離，進而激活下游的磷脂酶C（PLC）。PLC催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3能夠促使內質網釋放鈣離子，使細胞內鈣離子濃度升高，激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（CaMK）等下游分子；DAG則激活蛋白激酶C（PKC），進一步引發細胞內的級聯反應。這些信號轉導過程最終導致B細胞的細胞骨架發生重排，促使B細胞向CXCL13濃度較高的區域遷移。在狂犬病病毒感染機體后，淋巴組織中的基質細胞會分泌大量的CXCL13，形成濃度梯度，引導B細胞向淋巴組織，如淋巴結、脾臟的特定區域遷移和聚集。這種遷移和聚集使得B細胞能夠更有效地接觸到抗原和T輔助細胞，為后續的活化和分化過程創造有利條件。在淋巴結的濾泡區域，高濃度的CXCL13吸引B細胞聚集，促進B細胞之間以及B細胞與濾泡樹突狀細胞（FDC）之間的相互作用，有助于B細胞捕獲抗原，啟動體液免疫應答。CXCL13還在B細胞的活化和分化過程中發揮著重要作用。當B細胞遷移到富含CXCL13的區域后，與抗原和T輔助細胞的充分接觸為其活化提供了必要條件。T輔助細胞表面的CD40L與B細胞表面的CD40結合，提供共刺激信號，同時T輔助細胞分泌的細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-6（IL-6）等，協同CXCL13促進B細胞的活化和增殖。研究表明，CXCL13可以上調B細胞表面的共刺激分子，如CD80、CD86的表達，增強B細胞與T輔助細胞之間的相互作用，促進B細胞的活化。在B細胞分化過程中，CXCL13與T輔助細胞分泌的細胞因子共同作用，促使B細胞向漿細胞和記憶B細胞分化。CXCL13通過調節相關基因的表達，促進B細胞的抗體類別轉換，使其產生不同類型的抗體，如IgG、IgA等，增強機體對狂犬病病毒的免疫防御能力。在T輔助細胞方面，CXCL13同樣具有重要的調節作用。濾泡輔助性T細胞（Tfh）是T輔助細胞的一個重要亞群，在生發中心中發揮著關鍵作用，幫助B細胞進行抗體類別轉換和親和力成熟。CXCL13在Tfh細胞中的表達被認為反映了Tfh細胞在生發中心的起源，并且對Tfh細胞的功能具有重要影響。CXCL13可以趨化Tfh細胞向生發中心遷移，使其與B細胞緊密接觸，為B細胞提供有效的輔助信號。在狂犬病病毒感染后，Tfh細胞在CXCL13的趨化作用下，遷移到生發中心，通過分泌細胞因子，如IL-21等，促進B細胞的活化、增殖和分化。IL-21能夠增強B細胞的增殖能力，促進其向漿細胞分化，并參與抗體類別轉換過程，提高抗體的親和力和特異性。CXCL13還可以調節Tfh細胞與其他免疫細胞之間的相互作用，維持生發中心內的免疫微環境穩定，有利于體液免疫反應的有效進行。4.4CXCL13對生發中心形成及抗體類別轉換的影響生發中心作為體液免疫反應中的關鍵結構，在B淋巴細胞的分化、成熟以及高親和力抗體的產生過程中發揮著至關重要的作用。在狂犬病病毒感染機體后，CXCL13在生發中心的形成過程中扮演著不可或缺的角色，其對B細胞抗體類別轉換和親和力成熟產生著深遠影響。CXCL13對生發中心形成的促進作用是多方面的。在免疫應答的起始階段，當機體遭遇狂犬病病毒感染時，淋巴組織中的基質細胞會大量分泌CXCL13。CXCL13作為一種特異性的趨化因子，能夠與B淋巴細胞表面的趨化因子受體CXCR5發生特異性結合，這一結合作用激活了B細胞內的一系列信號通路，如G蛋白偶聯受體信號通路。通過該信號通路，B細胞內的細胞骨架發生重排，使得B細胞能夠沿著CXCL13的濃度梯度向淋巴組織中的特定區域遷移和聚集，這些區域正是生發中心形成的關鍵部位。在遷移過程中，B細胞不斷與抗原呈遞細胞（APCs）、濾泡輔助性T細胞（Tfh）等免疫細胞相互作用。APCs能夠攝取和處理狂犬病病毒抗原，并將其呈遞給B細胞，而Tfh細胞則通過分泌細胞因子，如白細胞介素-21（IL-21）等，為B細胞的活化和增殖提供重要的輔助信號。在CXCL13的趨化作用下，B細胞、APCs和Tfh細胞在特定區域的聚集，為生發中心的形成奠定了細胞基礎。隨著這些細胞的聚集，生發中心開始逐步形成并發育成熟。在生發中心內，B細胞經歷了一系列復雜的生物學過程，包括增殖、分化、抗體類別轉換和親和力成熟等。CXCL13不僅在生發中心的起始形成階段發揮作用，還在其維持和功能發揮過程中持續發揮關鍵影響。它能夠調節生發中心內的細胞間相互作用，維持生發中心的穩定結構和功能。CXCL13可以促進濾泡樹突狀細胞（FDC）與B細胞之間的相互作用，FDC能夠捕獲和呈遞抗原，為B細胞提供持續的抗原刺激，促進B細胞的活化和增殖。CXCL13還可以調節生發中心內的細胞因子微環境，促進Tfh細胞與B細胞之間的協作，確保B細胞能夠在生發中心內順利完成分化和成熟過程。在抗體類別轉換方面，CXCL13同樣發揮著重要的調節作用。抗體類別轉換是指B細胞在免疫應答過程中，從最初產生的免疫球蛋白M（IgM）類別轉換為其他類別，如免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）等的過程。這一過程對于增強機體對病原體的免疫防御能力具有重要意義，不同類別的抗體具有不同的生物學功能，能夠在不同的組織和生理環境中發揮作用。在狂犬病病毒感染誘導的體液免疫反應中，CXCL13通過與Tfh細胞分泌的細胞因子協同作用，促進B細胞的抗體類別轉換。Tfh細胞分泌的IL-21是調節抗體類別轉換的關鍵細胞因子之一，它能夠激活B細胞內的一系列信號通路，誘導激活誘導胞嘧啶脫氨酶（AID）的表達。AID是抗體類別轉換過程中的關鍵酶，它能夠對DNA進行修飾，使得B細胞能夠從IgM類別轉換為其他類別。CXCL13可以增強B細胞對IL-21的敏感性，促進IL-21信號通路的激活，從而上調AID的表達，加速抗體類別轉換過程。研究表明，在缺乏CXCL13的情況下，B細胞的抗體類別轉換受到明顯抑制，IgG、IgA等類別的抗體產生量顯著減少，這進一步證實了CXCL13在抗體類別轉換過程中的重要作用。CXCL13還參與了B細胞親和力成熟的調節過程。親和力成熟是指在免疫應答過程中，B細胞通過體細胞高頻突變和抗原選擇，產生高親和力抗體的過程。在生發中心內，B細胞的抗原受體（BCR）基因會發生高頻突變，這些突變會導致BCR對抗原的親和力發生改變。只有那些表達高親和力BCR的B細胞能夠更好地捕獲抗原，并在Tfh細胞的輔助下存活和增殖，最終分化為產生高親和力抗體的漿細胞和記憶B細胞。CXCL13通過調節生發中心內的細胞微環境，促進B細胞與抗原和Tfh細胞的相互作用，從而影響B細胞的親和力成熟。CXCL13可以促使B細胞更有效地接觸到抗原，增加抗原刺激的強度和頻率，促進BCR基因的體細胞高頻突變。CXCL13還可以調節Tfh細胞與B細胞之間的信號傳遞，為B細胞的存活和增殖提供必要的支持，確保高親和力B細胞克隆能夠在競爭中勝出，實現親和力成熟。五、HMGB1和CXCL13的協同作用對狂犬病病毒誘導體液免疫反應的影響5.1HMGB1和CXCL13在免疫微環境中的相互作用關系在狂犬病病毒感染機體所營造的復雜免疫微環境中，HMGB1與CXCL13之間存在著緊密且微妙的相互作用關系，這種關系對于調節機體的體液免疫反應至關重要。當機體遭受狂犬病病毒侵襲后，受感染細胞會因病毒的增殖和破壞而發生損傷，進而導致HMGB1從細胞核釋放至細胞外。細胞外的HMGB1作為一種損傷相關分子模式（DAMPs），迅速與免疫細胞表面的受體，如Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產物受體（RAGE）等相結合，從而激活一系列免疫信號通路。這些信號通路的激活，促使免疫細胞分泌多種細胞因子和趨化因子，其中就包括CXCL13。研究表明，在體外培養的巨噬細胞中，加入外源性的HMGB1刺激后，巨噬細胞分泌CXCL13的水平顯著升高。這一過程涉及到核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，HMGB1與TLR4結合后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號途徑，激活NF-κB，使其進入細胞核，啟動CXCL13基因的轉錄，從而促進CXCL13的合成與分泌。CXCL13在被分泌到免疫微環境中后，又會對HMGB1的功能產生影響。CXCL13主要通過趨化免疫細胞，改變免疫細胞在感染部位的分布和聚集情況，間接影響HMGB1與免疫細胞的相互作用。CXCL13能夠引導B淋巴細胞和濾泡輔助性T細胞（Tfh）向富含HMGB1的炎癥區域遷移，使得這些免疫細胞能夠更有效地接觸到HMGB1，增強HMGB1對免疫細胞的激活作用。在狂犬病病毒感染的淋巴結中，CXCL13濃度較高的區域，B淋巴細胞和Tfh細胞的聚集更為明顯，同時這些區域的HMGB1與免疫細胞的結合也更為緊密，免疫細胞的活化程度更高。CXCL13還可能通過調節免疫細胞表面HMGB1受體的表達，影響HMGB1的信號傳導。研究發現，CXCL13刺激B淋巴細胞后，B淋巴細胞表面TLR4和RAGE的表達水平會發生變化，這種變化可能增強B淋巴細胞對HMGB1的敏感性，使其在接受HMGB1刺激時能夠更有效地激活下游信號通路，促進B淋巴細胞的活化和增殖。HMGB1和CXCL13在免疫微環境中還可能通過與其他免疫分子相互作用，間接調節彼此的功能。HMGB1與核酸結合形成的復合物，不僅可以激活免疫細胞，還可能影響CXCL13的趨化作用。這些復合物可能改變免疫細胞表面CXCL13受體的親和力，或者調節CXCL13的穩定性，從而影響CXCL13對免疫細胞的趨化能力。反之，CXCL13引導免疫細胞的遷移和聚集，可能改變免疫細胞所處微環境中其他細胞因子和趨化因子的濃度分布，進而影響HMGB1的釋放和活性。5.2兩者協同調節體液免疫細胞功能與細胞因子網絡的機制在狂犬病病毒感染引發的體液免疫反應中，HMGB1和CXCL13通過協同作用，對體液免疫細胞功能進行精細調節，進而維持細胞因子網絡的平衡，共同促進體液免疫反應的有效進行。在體液免疫細胞功能調節方面，HMGB1和CXCL13對B細胞的協同作用十分關鍵。如前文所述，HMGB1通過與B細胞表面的TLR4和RAGE等受體結合，激活NF-κB和MAPK等信號通路，促進B細胞的活化和增殖。而CXCL13則通過與B細胞表面的CXCR5結合，趨化B細胞向淋巴組織的特定區域遷移和聚集，為B細胞的活化和分化提供了適宜的微環境。研究表明，在二者協同作用下，B細胞的活化和增殖效率顯著提高。當HMGB1和CXCL13共同作用于B細胞時，B細胞表面的活化標志物CD69和CD86的表達水平相較于單獨作用時明顯升高，且B細胞的增殖能力也顯著增強，這表明二者協同能夠更有效地激活B細胞，促進其進入細胞周期進行增殖。在T輔助細胞中，HMGB1可以通過激活抗原呈遞細胞，促進其分泌細胞因子，如IL-1、IL-6等，從而激活T輔助細胞，促進其增殖和分化。CXCL13則趨化濾泡輔助性T細胞（Tfh）向生發中心遷移，使其與B細胞緊密接觸，為B細胞提供有效的輔助信號。在狂犬病病毒感染的小鼠模型中，敲低CXCL13或阻斷其信號通路后，Tfh細胞向生發中心的遷移受阻，B細胞的活化和抗體產生受到明顯抑制，即使存在HMGB1的刺激，體液免疫反應也顯著減弱，這充分說明了二者在調節T輔助細胞功能方面的協同作用對于體液免疫反應的重要性。HMGB1和CXCL13還共同參與調節細胞因子網絡的平衡。HMGB1激活免疫細胞后，促使其分泌一系列促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，這些細胞因子在免疫反應初期能夠迅速啟動免疫應答，增強機體對狂犬病病毒的防御能力。CXCL13則通過調節免疫細胞的遷移和聚集，間接影響細胞因子的分泌和作用。CXCL13引導B細胞和Tfh細胞聚集，使得這些細胞在局部區域內相互作用，促進Tfh細胞分泌IL-21等細胞因子。IL-21不僅能夠促進B細胞的活化、增殖和抗體類別轉換，還能調節其他細胞因子的分泌，如抑制Th1細胞分泌干擾素-γ（IFN-γ），從而維持Th1/Th2細胞因子的平衡，確保體液免疫反應朝著有利于抗體產生的方向發展。在細胞因子網絡中，HMGB1和CXCL13還通過與其他細胞因子的相互作用來維持平衡。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，它可以抑制HMGB1誘導的炎癥細胞因子的分泌，從而避免過度炎癥反應對機體造成損傷。CXCL13可以調節IL-10的產生，在CXCL13的作用下，免疫細胞分泌IL-10的水平發生變化，進而影響細胞因子網絡的平衡。在狂犬病病毒感染過程中，如果HMGB1和CXCL13的協同作用失調，細胞因子網絡就會失衡，可能導致免疫反應過度或不足，影響機體對狂犬病病毒的清除和防御能力。當HMGB1過度激活免疫細胞，導致促炎細胞因子大量分泌，而CXCL13的調節作用不足時，可能引發過度炎癥反應，導致組織損傷和免疫病理損害；反之，如果CXCL13不能有效趨化免疫細胞，使得免疫細胞無法在感染部位聚集并發揮作用，即使HMGB1能夠激活免疫細胞，也難以形成有效的免疫應答，導致病毒無法被及時清除。5.3基于兩者協同作用的體液免疫增強策略探討鑒于HMGB1和CXCL13在狂犬病病毒誘導體液免疫反應中展現出的協同作用，探索基于兩者協同作用的體液免疫增強策略具有重要的應用前景。在疫苗設計方面，可考慮將HMGB1和CXCL13作為免疫佐劑納入狂犬病疫苗的研發中。傳統的狂犬病疫苗主要通過病毒抗原刺激機體產生免疫反應，但部分疫苗的免疫效果可能存在一定局限性。通過添加HMGB1和CXCL13作為佐劑，有望增強疫苗的免疫原性。HMGB1能夠激活免疫細胞，促進細胞因子的分泌，增強免疫細胞的活性，從而提高機體對疫苗抗原的免疫應答。CXCL13則可以引導B細胞和Tfh細胞向疫苗接種部位遷移和聚集，增加免疫細胞與抗原的接觸機會，促進生發中心的形成和B細胞的分化、成熟，提高抗體的產生水平和親和力。在動物實驗中，將含有HMGB1和CXCL13的疫苗與傳統疫苗進行對比，發現前者能夠顯著提高小鼠體內狂犬病病毒中和抗體的滴度，增強小鼠對狂犬病病毒的抵抗力。還可以開發針對HMGB1和CXCL13信號通路的調節劑，以優化體液免疫反應。針對HMGB1與TLR4、RAGE等受體的結合，研發特異性的拮抗劑或激動劑。在狂犬病病毒感染初期，適量使用HMGB1的激動劑，可增強免疫細胞的活化和細胞因子的分泌，啟動有效的免疫應答；而在免疫反應后期，當炎癥反應過度時，使用拮抗劑可抑制HMGB1的過度激活，避免過度炎癥反應對機體造成損傷。對于CXCL13信號通路，可以研發調節CXCL13與CXCR5結合的小分子化合物，或者調節CXCL13表達的基因療法。通過調節CXCL13的活性，精準調控B細胞和Tfh細胞的遷移、活化和分化過程，提高體液免疫反應的效率和質量。在免疫治療方面，基于HMGB1和CXCL13協同作用的策略也具有潛在應用價值。對于狂犬病病毒暴露后尚未發病的個體，可以考慮采用免疫調節治療。通過注射外源性的HMGB1和CXCL13，或者使用能夠促進機體自身分泌HMGB1和CXCL13的藥物，增強機體的體液免疫反應，提高中和抗體的產生速度和水平，從而更有效地清除體內的狂犬病病毒。在一些免疫功能低下的個體中，這種免疫調節治療可能尤為重要，能夠彌補其免疫功能的不足，降低狂犬病的發病風險。利用HMGB1和CXCL13協同作用增強狂犬病病毒誘導體液免疫反應的策略具有廣闊的應用前景，有望為狂犬病的預防和治療提供新的思路和方法，提高狂犬病的防控效果，減少狂犬病的發病和死亡。六、結論與展望6.1研究成果總結本研究深入探究了HMGB1和CXCL13促進狂犬病病毒誘導的體液免疫反應的機制，取得了一系列具有重要理論和實踐意義的成果。在HMGB1方面，明確了其在狂犬病病毒感染過程中的表達變化規律。動物實驗和臨床樣本分析均表明，在狂犬病病毒感染后，機體內HMGB1的表達水平顯著升高。在感染后的關鍵時期，如小鼠感染后的第3-7天，腦組織、脾臟等組織中HMGB1的蛋白和mRNA表達水平明顯上調，血清中HMGB1的含量也顯著增加。揭示了HMGB1對狂犬病病毒誘導體液免疫細胞活化與增殖的影響機制。HMGB1通過與B細胞和T細胞表面的受體TLR4、RAGE等結合，激活NF-κB和MAPK等信號通路，促進B細胞和T細胞的活化和增殖。在體外實驗中，添加HMGB1能夠顯著增強B細胞的增殖能力，上調B細胞表面活化標志物的表達；在體內實驗中，敲低HMGB1的表達或阻斷其信號通路，會導致B細胞和T細胞的活化和增殖受到抑制，體液免疫反應減弱。還闡明了HMGB1調節體液免疫相關細胞因子分泌的作用機制。HMGB1與免疫細胞表面受體結合后，通過激活MyD88依賴的信號通路和MAPK信號通路，促進NF-κB等轉錄因子的活化，從而上調TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細胞因子的分泌，這些細胞因子在體液免疫反應中發揮著重要的調節作用，促進免疫細胞的活化、增殖和抗體的產生。在CXCL13方面，系統研究了其在狂犬病病毒感染機體中的動態表達。動物實驗結果顯示，在狂犬病病毒感染后的第3-7天，CXCL13在腦組織、脾臟和淋巴結等組織中的表達顯著上調，血清中CXCL13的含量也明顯增加。明確了CXCL13對體液免疫關鍵細胞的趨化與活化作用機制。CXCL13通過與B細胞表面的CXCR5特異性結合，激活G蛋白偶聯受體信號通路，促使B細胞向淋巴組織的特定區域遷移和聚集，為B細胞的活化和分化提供了有利條件。CXCL13還能上調B細胞表面共刺激分子的表達，增強B細胞與T輔助細胞之間的相互作用，促進B細胞的活化和增殖。在T輔助細胞中，CXCL13趨化濾泡輔助性T細胞（Tfh）向生發中心遷移，使其與B細胞緊密接觸，為B細胞提供有效的輔助信號，促進B細胞的抗體類別轉換和親和力成熟。揭示了CXCL13對生發中心形成及抗體類別轉換的影響機制。CXCL13促進B細胞、抗原呈遞細胞和Tfh細胞在淋巴組織特定區域的聚集，為生發中心的形成奠定了細胞基礎。在生發中心內，CXCL13調節細胞間相互作用和細胞因子微環境，促進B細胞的抗體類別轉換和親和力成熟，通過與Tfh細胞分泌的IL-21等細胞因子協同作用，上調激活誘導胞嘧啶脫氨酶（AID）的表達，加速抗體類別轉換過程。在HMGB1和CXCL13的協同作用方面，發現了兩者在免疫微環境中的相互作用關系。HMGB1能夠促進免疫細胞分泌CXCL13，而CXCL13則通過趨化免疫細胞，改變免疫細胞在感染部位的分布和聚集情況，間接影響HMGB1與免疫細胞的相互作用。CXCL13還可能通過調節免疫細胞表面HMGB1受體的表達，影響HMGB1的信號傳導。闡明了兩者協同調節體液免疫細胞功能與細胞因子網絡的機制。在體液免疫細胞功能調節方面，HMGB1和CXCL13協同促進B細胞和T