HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義探究一、引言1.1研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居各類惡性腫瘤前列。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌的發(fā)病率在男性中居首位，在女性中位列第二，死亡率更是在惡性腫瘤中排名第一，占癌癥死亡患者的18%。2020年，中國新增肺癌病例數(shù)多達(dá)82萬例，肺癌已然成為我國乃至全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的重大問題。在肺癌的眾多病理類型中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）最為常見，約占肺癌病例總數(shù)的80%-85%。非小細(xì)胞肺癌主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等亞型，各亞型在發(fā)病機(jī)制、臨床特征和治療反應(yīng)上存在一定差異。近年來，盡管醫(yī)療技術(shù)取得了顯著進(jìn)步，肺癌的綜合治療手段不斷豐富，涵蓋了手術(shù)、化療、放療、靶向治療及免疫治療等，但肺癌患者的總體療效在近數(shù)十年來卻無明顯提升，五年生存率僅維持在10-15%的較低水平。究其原因，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌治療失敗和患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。腫瘤細(xì)胞一旦發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，就會(huì)擴(kuò)散至身體其他部位，不僅增加了治療的難度，還極大地降低了患者的生存幾率。因此，深入探究非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肺癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）、核轉(zhuǎn)錄因子κBp65（NuclearFactor-κBp65，NF-κBp65）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MatrixMetalloproteinase-9，MMP-9）作為與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)它們的研究有望為非小細(xì)胞肺癌的診療提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，并分析它們與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而揭示這三種分子在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中所扮演的角色及潛在作用機(jī)制。肺癌的高發(fā)病率和高死亡率給全球公共衛(wèi)生帶來了沉重負(fù)擔(dān)，非小細(xì)胞肺癌作為肺癌的主要類型，其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究仍存在諸多未被揭示的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HMGB1作為一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，近年來被發(fā)現(xiàn)參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。研究表明，HMGB1能夠通過激活NF-κBp65蛋白，促使其與MMP-9基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)MMP-9基因的蛋白表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。然而，目前對(duì)于這三種分子在非小細(xì)胞肺癌中的具體表達(dá)特征、相互作用關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同影響非小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)行為，仍缺乏全面且深入的認(rèn)識(shí)。通過本研究，有望在以下幾個(gè)方面取得重要突破：其一，明確HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平，為非小細(xì)胞肺癌的早期診斷提供潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。早期診斷對(duì)于提高非小細(xì)胞肺癌患者的生存率至關(guān)重要，目前臨床上缺乏特異性高、敏感性強(qiáng)的診斷指標(biāo)，若能確定這三種分子的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的早期發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，將為臨床醫(yī)生提供新的診斷思路和方法。其二，深入分析這三種分子的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，有助于進(jìn)一步了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展規(guī)律。例如，通過研究它們與腫瘤的組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)的關(guān)系，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供科學(xué)依據(jù)。其三，揭示HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和治療策略奠定理論基礎(chǔ)。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌治療失敗的主要原因，若能明確這三種分子在其中的作用機(jī)制，就有可能針對(duì)這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)研發(fā)出更有效的靶向治療藥物，從而提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。綜上所述，本研究對(duì)于深入理解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制、提高早期診斷水平和優(yōu)化治療策略具有重要的理論和實(shí)踐意義，有望為非小細(xì)胞肺癌的臨床診療帶來新的突破和發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌概述非小細(xì)胞肺癌是指發(fā)生于支氣管黏膜和腺體的上皮惡性腫瘤，是相對(duì)于小細(xì)胞肺癌而言的一個(gè)肺癌分類，也是較為常見的一種病理類型，約占肺癌病例總數(shù)的80%-85%。從組織學(xué)類型來看，非小細(xì)胞肺癌主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌等。腺癌多起源于支氣管黏膜上皮的黏液腺，在女性和不吸煙人群中更為常見；鱗癌則常發(fā)生于較大的支氣管，與吸煙關(guān)系密切；大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞體積大，形態(tài)多樣，惡性程度較高。在流行病學(xué)方面，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均處于較高水平，且呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。其發(fā)病與多種因素相關(guān)，吸煙是最為主要的危險(xiǎn)因素，長期大量吸煙會(huì)顯著增加患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，環(huán)境污染、職業(yè)暴露（如石棉、氡氣、砷等）、遺傳因素以及肺部慢性疾病（如慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等）也與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。不同地區(qū)和人群的非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率存在一定差異，一般來說，發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率高于發(fā)展中國家，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)。臨床上，非小細(xì)胞肺癌的治療手段較為多樣，主要包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)治療是早期非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法，通過切除腫瘤組織，有望實(shí)現(xiàn)根治。對(duì)于可切除的非小細(xì)胞肺癌患者，肺葉切除術(shù)加系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃是標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)方式。化療則是利用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞，適用于中晚期患者，可分為輔助化療、新輔助化療和姑息化療等不同類型，常用的化療藥物有順鉑、卡鉑、紫杉醇、吉西他濱等。放療是使用高能射線照射腫瘤部位，以殺死癌細(xì)胞，可用于局部晚期患者的根治性治療，也可作為手術(shù)后的輔助治療或晚期患者的姑息治療手段。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，靶向治療和免疫治療為非小細(xì)胞肺癌患者帶來了新的希望。靶向治療針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，如表皮生長因子受體（EGFR）突變、間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因等，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，具有療效高、副作用小的特點(diǎn)。免疫治療則通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤細(xì)胞，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑（如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等），可顯著延長部分患者的生存期。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，醫(yī)生會(huì)根據(jù)患者的具體情況，如腫瘤的分期、病理類型、基因檢測(cè)結(jié)果以及患者的身體狀況等，制定個(gè)性化的綜合治療方案，以提高治療效果和患者的生存質(zhì)量。2.2HMGB1、NF-κBp65和MMP-9的生物學(xué)特性2.2.1HMGB1的結(jié)構(gòu)、功能與腫瘤相關(guān)性高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。其相對(duì)分子質(zhì)量約為30kD，由215個(gè)氨基酸殘基組成，包含兩個(gè)串聯(lián)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（A盒和B盒）以及一個(gè)酸性C末端尾巴。A盒和B盒結(jié)構(gòu)相似，均由3個(gè)α螺旋組成，通過形成一個(gè)帶正電荷的溝槽來與DNA相互作用，從而參與DNA的復(fù)制、修復(fù)、重組和基因轉(zhuǎn)錄等過程。C末端尾巴富含酸性氨基酸，主要起到調(diào)節(jié)HMGB1與DNA結(jié)合親和力以及蛋白質(zhì)間相互作用的作用。在正常生理狀態(tài)下，HMGB1在細(xì)胞內(nèi)主要發(fā)揮維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用。它能夠與核小體緊密結(jié)合，促進(jìn)核小體的組裝和穩(wěn)定，進(jìn)而維持染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，HMGB1可以與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如p53、糖皮質(zhì)激素受體等，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，HMGB1還參與DNA損傷修復(fù)過程，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，HMGB1能夠迅速結(jié)合到損傷部位，招募修復(fù)蛋白，促進(jìn)DNA的修復(fù)。然而，在細(xì)胞受到損傷、炎癥或應(yīng)激刺激時(shí)，HMGB1會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP）發(fā)揮重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。細(xì)胞外的HMGB1可以與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等。當(dāng)HMGB1與這些受體結(jié)合后，會(huì)激活下游的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，HMGB1的異常表達(dá)和釋放與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。一方面，腫瘤細(xì)胞自身可以高表達(dá)并分泌HMGB1，通過激活RAGE和TLR4等受體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。另一方面，腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞也會(huì)釋放HMGB1，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，HMGB1可以通過激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)基因的表達(dá)，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供有利條件。此外，HMGB1還可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.2.2NF-κBp65的信號(hào)通路及在腫瘤中的作用核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）家族是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及免疫和炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。NF-κB家族成員包括p50（由NFKB1基因編碼）、p52（由NFKB2基因編碼）、p65（RELA）、c-Rel和RelB等。這些成員均含有一個(gè)高度保守的N端Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合以及成員之間的二聚化。在細(xì)胞中，NF-κB通常以二聚體的形式存在，其中p50/p65二聚體最為常見。NF-κBp65信號(hào)通路的激活過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)分子和蛋白激酶的參與。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種胞內(nèi)外刺激，如促炎癥細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α，TNF-α；白細(xì)胞介素-1，IL-1）、細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA以及物理和化學(xué)壓力等時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。首先，上游信號(hào)分子通過激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，使IKKα和IKKβ發(fā)生磷酸化。活化的IKK復(fù)合物進(jìn)而磷酸化IκB蛋白，使其發(fā)生泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解。IκB蛋白的降解導(dǎo)致NF-κB二聚體得以釋放，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κBp65信號(hào)通路的異常激活發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。一方面，NF-κBp65可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。它能夠上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、CyclinE等）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。另一方面，NF-κBp65具有抗凋亡作用。它可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白（如Bax、Bid等）的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞得以存活和增殖。此外，NF-κBp65還在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。它可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞與周圍組織的連接，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。同時(shí)，NF-κBp65還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子（如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白等）的表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞的粘附特性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，NF-κBp65信號(hào)通路的激活還與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)。它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)，抑制機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷作用，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。2.2.3MMP-9的生物學(xué)功能及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9），又稱明膠酶B，是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中的重要成員之一。MMP-9基因位于人類染色體20q11.2-q13.1，其編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為92kD。MMP-9具有典型的MMPs結(jié)構(gòu)特征，包括一個(gè)信號(hào)肽序列、一個(gè)前肽區(qū)、一個(gè)催化活性區(qū)、一個(gè)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和一個(gè)羧基末端區(qū)。信號(hào)肽序列負(fù)責(zé)引導(dǎo)MMP-9在細(xì)胞內(nèi)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)；前肽區(qū)含有半胱氨酸開關(guān)結(jié)構(gòu)，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定，當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后，MMP-9酶原被激活；催化活性區(qū)含有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要；富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)連接催化活性區(qū)和羧基末端區(qū)，具有一定的柔韌性；羧基末端區(qū)與酶的底物特異性有關(guān)。MMP-9的主要生物學(xué)功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的多種成分，在維持組織的正常結(jié)構(gòu)和生理功能以及組織修復(fù)和重塑過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的粘附、遷移、增殖和分化等過程。MMP-9能夠特異性地降解IV型、V型、VII型、X型和XI型膠原、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。在生理狀態(tài)下，MMP-9的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，MMP-9的表達(dá)和活性常常出現(xiàn)異常升高。腫瘤細(xì)胞自身可以分泌MMP-9，同時(shí)腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也會(huì)產(chǎn)生大量的MMP-9。高表達(dá)的MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞腫瘤細(xì)胞周圍的組織屏障，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，向周圍組織浸潤。此外，MMP-9還可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生長因子和細(xì)胞因子的結(jié)合蛋白，釋放出活性生長因子和細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，MMP-9的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在多種腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等，MMP-9的高表達(dá)往往預(yù)示著腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，患者的預(yù)后較差。因此，MMP-9被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)關(guān)鍵分子，也是腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1樣本來源本研究的樣本取自[具體醫(yī)院名稱]。在20[開始年份]年1月至20[結(jié)束年份]年12月期間，收集了95例非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，術(shù)后病理檢查確診為非小細(xì)胞肺癌。其中男性患者55例，女性患者40例；年齡范圍在35-75歲之間，平均年齡為（55.6±8.5）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I期患者25例，II期患者30例，III期患者28例，IV期患者12例；組織學(xué)類型方面，腺癌50例，鱗癌35例，大細(xì)胞癌10例。同時(shí)，選取了27例距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照，這些標(biāo)本經(jīng)病理檢查證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤。患者的基本信息整理如表1所示：患者基本信息例數(shù)性別男：55女：40年齡（歲）[35-75]，平均（55.6±8.5）TNM分期I期：25II期：30III期：28IV期：12組織學(xué)類型腺癌：50鱗癌：35大細(xì)胞癌：103.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本研究使用的主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：免疫組化試劑盒（購自[公司名稱1]，包含二抗、三抗及DAB顯色劑等），鼠抗人HMGB1單克隆抗體（[公司名稱2]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)1]），兔抗人NF-κBp65多克隆抗體（[公司名稱3]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)2]），兔抗人MMP-9多克隆抗體（[公司名稱4]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)3]），蘇木精染液（[公司名稱5]），伊紅染液（[公司名稱6]），0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0，用于抗原修復(fù)），PBS緩沖液（pH7.4，用于沖洗切片）等。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：德國LeicaRM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，用于制作組織切片；日本OlympusBX53顯微鏡，配備成像系統(tǒng)，用于觀察切片并采集圖像；德國Eppendorf5810R離心機(jī)，用于樣本離心；微波爐，用于抗原修復(fù)；恒溫烤箱，用于烤片；電子天平，用于試劑稱量等。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法免疫組織化學(xué)檢測(cè)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究。本研究利用免疫組化檢測(cè)HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白表達(dá)，具體步驟如下：切片準(zhǔn)備：將收集的非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織標(biāo)本的石蠟切片，厚度為4μm，依次置于60℃恒溫烤箱中烤片2h，以增強(qiáng)組織與載玻片的粘附力。隨后，將切片放入二甲苯中進(jìn)行脫蠟處理，每次15分鐘，共進(jìn)行3次，以徹底去除石蠟。接著，將切片依次放入不同濃度的乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）中進(jìn)行水化，每個(gè)濃度浸泡5分鐘，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。抗原修復(fù)：采用高溫高壓抗原修復(fù)法，將水化后的切片置于盛有0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后保持2-3分鐘，然后自然冷卻。抗原修復(fù)的目的是暴露被掩蓋的抗原決定簇，增強(qiáng)抗原抗體的結(jié)合能力，提高檢測(cè)的敏感性。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將修復(fù)后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以去除殘留的緩沖液。然后，將切片浸泡在3%過氧化氫溶液中，室溫孵育15分鐘，以阻斷組織中的內(nèi)源性過氧化物酶，防止其產(chǎn)生非特異性染色。孵育結(jié)束后，再次用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。血清封閉：用濾紙吸干切片周圍的水分，在切片上滴加適量的正常山羊血清，室溫孵育30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。一抗孵育：傾去血清，不沖洗，在切片上滴加稀釋好的鼠抗人HMGB1單克隆抗體、兔抗人NF-κBp65多克隆抗體和兔抗人MMP-9多克隆抗體（抗體稀釋度根據(jù)說明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。一抗孵育是免疫組化檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，一抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，為后續(xù)的檢測(cè)提供基礎(chǔ)。二抗孵育：取出切片，室溫復(fù)溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。然后，在切片上滴加生物素標(biāo)記的二抗（與一抗來源種屬匹配），室溫孵育30分鐘。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，通過生物素-親和素系統(tǒng)放大信號(hào)，增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。三抗孵育：二抗孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。接著，在切片上滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（三抗），室溫孵育30分鐘。三抗與二抗結(jié)合，進(jìn)一步放大信號(hào)，使目標(biāo)蛋白的檢測(cè)更加準(zhǔn)確。DAB顯色：用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘后，在切片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽性信號(hào)時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。DAB顯色是利用辣根過氧化物酶催化DAB底物產(chǎn)生棕色沉淀，從而使目標(biāo)蛋白在顯微鏡下可見。蘇木精復(fù)染：將顯色后的切片放入蘇木精染液中復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間為3-5分鐘，然后用自來水沖洗，再用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，最后用自來水沖洗返藍(lán)。蘇木精復(fù)染可以使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，與陽性信號(hào)形成對(duì)比，便于觀察和分析。脫水、透明與封片：將復(fù)染后的切片依次放入不同濃度的乙醇溶液（70%、80%、95%、100%）中脫水，每個(gè)濃度浸泡5分鐘，然后放入二甲苯中透明，每次15分鐘，共進(jìn)行2次。最后，用中性樹膠封片，待封片膠干燥后，即可進(jìn)行顯微鏡觀察。3.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)本研究采用半定量積分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師在雙盲條件下進(jìn)行閱片，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性表達(dá)判斷：HMGB1、NF-κBp65和MMP-9陽性產(chǎn)物均為棕黃色顆粒。其中，HMGB1蛋白在腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)炎細(xì)胞的胞質(zhì)和（或）胞核中表達(dá)；NF-κBp65蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，間質(zhì)細(xì)胞基本無表達(dá)；MMP-9蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)。根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的比例，將陽性表達(dá)分為陰性（-）和陽性（+），陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性。染色強(qiáng)度評(píng)分：根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：每張切片在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，取平均值。陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。綜合評(píng)分：將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘，得到綜合評(píng)分。0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。通過這種綜合評(píng)分的方式，可以更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，兩組之間的比較采用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí)，采用Fisher確切概率法；多組之間的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。對(duì)于HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r值，r值的絕對(duì)值越接近1，表示相關(guān)性越強(qiáng)，r＞0為正相關(guān)，r＜0為負(fù)相關(guān)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)分析均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況通過免疫組織化學(xué)染色，對(duì)95例非小細(xì)胞肺癌組織和27例癌旁正常肺組織中HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HMGB1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)炎細(xì)胞的胞質(zhì)和（或）胞核，呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色顆粒。在癌旁正常肺組織中，HMGB1蛋白的陽性表達(dá)較弱，主要位于少數(shù)間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，HMGB1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為61.05%（58/95），顯著高于癌旁正常肺組織的22.22%（6/27），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.56，P＜0.01），如表2所示。NF-κBp65蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核，間質(zhì)細(xì)胞基本無表達(dá)，陽性產(chǎn)物呈淡黃至棕黃色。在癌旁正常肺組織中，NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)極少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，NF-κBp65蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為44.21%（42/95），明顯高于癌旁正常肺組織的22.22%（6/27），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.26，P＜0.05），如表2所示。MMP-9蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。在癌旁正常肺組織中，MMP-9蛋白的陽性表達(dá)水平較低。經(jīng)計(jì)算，MMP-9蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為40.00%（38/95），顯著高于癌旁正常肺組織的14.81%（4/27），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.67，P＜0.05），如表2所示。蛋白非小細(xì)胞肺癌組織（n=95）癌旁正常肺組織（n=27）χ2值P值HMGB158（61.05%）6（22.22%）12.56＜0.01NF-κBp6542（44.21%）6（22.22%）4.26＜0.05MMP-938（40.00%）4（14.81%）5.67＜0.05綜上所述，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁正常肺組織，提示這三種蛋白可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.2HMGB1、NF-κBp65和MMP-9表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步分析HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果如表3所示。在年齡方面，以60歲為界，將患者分為≤60歲組（50例）和＞60歲組（45例），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白在不同年齡組中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。性別上，男性患者55例，女性患者40例，三組蛋白在不同性別患者中的表達(dá)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤大小以3cm為界，≤3cm組42例，＞3cm組53例，三組蛋白表達(dá)與腫瘤大小之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。在組織學(xué)分型中，腺癌50例，鱗癌35例，大細(xì)胞癌10例，HMGB1蛋白在不同組織學(xué)分型中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.68，P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，腺癌中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于鱗癌（P＜0.05）。NF-κBp65蛋白在不同組織學(xué)分型中的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.35，P＜0.05），其中腺癌中NF-κBp65的陽性表達(dá)率明顯高于大細(xì)胞癌（P＜0.05）。MMP-9蛋白在不同組織學(xué)分型中的表達(dá)差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.21，P＜0.01），腺癌中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于鱗癌和大細(xì)胞癌（P＜0.05）。根據(jù)腫瘤的分化程度，高分化組18例，中分化組45例，低分化組32例，HMGB1蛋白在不同分化程度中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.12，P＜0.05），低分化組中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于高分化組（P＜0.05）。NF-κBp65蛋白在不同分化程度中的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.03，P＜0.05），低分化組中NF-κBp65的陽性表達(dá)率明顯高于高分化組和中分化組（P＜0.05）。MMP-9蛋白在不同分化程度中的表達(dá)差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.56，P＜0.01），隨著分化程度降低，MMP-9的陽性表達(dá)率逐漸升高，低分化組顯著高于高分化組和中分化組（P＜0.05）。按照TNM分期，I期25例，II期30例，III期28例，IV期12例，HMGB1蛋白在不同TNM分期中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.45，P＜0.05），III-IV期患者中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于I-II期患者（P＜0.05）。NF-κBp65蛋白在不同TNM分期中的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.23，P＜0.01），III-IV期患者中NF-κBp65的陽性表達(dá)率明顯高于I-II期患者（P＜0.05）。MMP-9蛋白在不同TNM分期中的表達(dá)差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.25，P＜0.01），III-IV期患者中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于I-II期患者（P＜0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組55例，HMGB1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=7.65，P＜0.01）。NF-κBp65蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=8.23，P＜0.01）。MMP-9蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率同樣顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=9.12，P＜0.01）。臨床病理特征例數(shù)HMGB1陽性表達(dá)（例，%）χ2值P值NF-κBp65陽性表達(dá)（例，%）χ2值P值MMP-9陽性表達(dá)（例，%）χ2值P值年齡（歲）≤605032（64.00）0.78＞0.0523（46.00）0.36＞0.0521（42.00）0.56＞604526（57.78）19（42.22）17（37.78）性別男5534（61.82）0.03＞0.0524（43.64）0.04＞0.0522（40.00）0.00女4024（60.00）18（45.00）16（40.00）腫瘤大小（cm）≤34226（61.90）0.02＞0.0519（45.24）0.09＞0.0517（40.48）0.01＞35332（60.38）23（43.40）21（39.62）組織學(xué)分型腺癌5034（68.00）5.68＜0.0525（50.00）6.35＜0.0524（48.00）7.21鱗癌3518（51.43）13（37.14）10（28.57）大細(xì)胞癌106（60.00）4（40.00）4（40.00）分化程度高分化188（44.44）6.12＜0.056（33.33）7.03＜0.055（27.78）8.56中分化4526（57.78）18（40.00）15（33.33）低分化3224（75.00）18（56.25）18（56.25）TNM分期I-II期5528（50.91）8.45＜0.0518（32.73）9.23＜0.0114（25.45）10.25III-IV期4030（75.00）24（60.00）24（60.00）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有4030（75.00）7.65＜0.0124（60.00）8.23＜0.0122（55.00）9.12無5528（50.91）18（32.73）16（29.09）綜上所述，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示這三種蛋白可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，有望作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者病情和預(yù)后的潛在指標(biāo)。4.3HMGB1、NF-κBp65和MMP-9之間的表達(dá)相關(guān)性分析運(yùn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析對(duì)HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性展開研究，結(jié)果清晰地顯示出這三種蛋白之間存在緊密的關(guān)聯(lián)。在95例非小細(xì)胞肺癌組織中，HMGB1與NF-κBp65的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.456（P＜0.01），這意味著隨著HMGB1表達(dá)水平的升高，NF-κBp65的表達(dá)水平也會(huì)相應(yīng)上升。研究表明，細(xì)胞在受到損傷、炎癥或應(yīng)激刺激時(shí)，HMGB1會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等結(jié)合，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，其中就包括NF-κB信號(hào)通路。在這一過程中，HMGB1與受體結(jié)合后，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使IκB激酶（IKK）復(fù)合物活化，使得IκB蛋白磷酸化、泛素化并最終被蛋白酶體降解，從而釋放出NF-κB二聚體，使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這就解釋了為何HMGB1的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)NF-κBp65的表達(dá)。NF-κBp65與MMP-9的表達(dá)同樣呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.387（P＜0.01）。當(dāng)NF-κBp65被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位后，它能夠與MMP-9基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。眾多研究已經(jīng)證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中，NF-κBp65的激活可以上調(diào)MMP-9的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在非小細(xì)胞肺癌中，這種正相關(guān)關(guān)系同樣存在，說明NF-κBp65可能通過調(diào)控MMP-9的表達(dá)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。此外，HMGB1與MMP-9的表達(dá)也呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.421（P＜0.01）。由于HMGB1可以激活NF-κBp65信號(hào)通路，而NF-κBp65又能促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，所以HMGB1通過間接的方式，即通過激活NF-κBp65信號(hào)通路，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)MMP-9表達(dá)的促進(jìn)作用。這一信號(hào)傳導(dǎo)途徑在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到關(guān)鍵作用，進(jìn)一步表明了HMGB1、NF-κBp65和MMP-9這三種蛋白在非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的協(xié)同作用機(jī)制。綜上所述，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)密切相關(guān)，它們之間的相互作用可能共同參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。五、結(jié)果討論5.1HMGB1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義討論本研究通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HMGB1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為61.05%，顯著高于癌旁正常肺組織的22.22%，這一結(jié)果與眾多既往研究報(bào)道一致，充分表明HMGB1在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。從HMGB1的生物學(xué)特性來看，它作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在正常細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核，參與維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要生理過程。然而，在腫瘤細(xì)胞中，HMGB1的表達(dá)和分布發(fā)生了顯著改變，不僅表達(dá)水平明顯升高，還會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，發(fā)揮多種促腫瘤作用。細(xì)胞外的HMGB1可作為一種損傷相關(guān)分子模式（DAMP），與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等結(jié)合，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。在本研究中，HMGB1在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，可能正是通過上述機(jī)制，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。進(jìn)一步分析HMGB1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，HMGB1蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在組織學(xué)分型方面，腺癌中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于鱗癌，這可能與不同組織學(xué)類型腫瘤的生物學(xué)特性差異有關(guān)。腺癌往往具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而HMGB1的高表達(dá)可能在其中起到了促進(jìn)作用。在分化程度上，低分化組中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于高分化組，表明隨著腫瘤分化程度的降低，HMGB1的表達(dá)水平升高。腫瘤分化程度越低，其惡性程度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，這進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1與腫瘤惡性程度之間的正相關(guān)關(guān)系。在TNM分期中，III-IV期患者中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于I-II期患者，提示隨著腫瘤分期的進(jìn)展，HMGB1的表達(dá)逐漸增加，這也與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨分期升高而增強(qiáng)的特點(diǎn)相符合。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中HMGB1的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明HMGB1的高表達(dá)可能促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過分泌HMGB1，激活周圍微環(huán)境中的相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使其更容易突破基底膜，進(jìn)入淋巴管，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1與NF-κBp65和MMP-9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。HMGB1可以通過激活NF-κB信號(hào)通路，促使NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而與MMP-9基因的啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)MMP-9的表達(dá)。MMP-9作為一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。因此，HMGB1可能通過這種間接的方式，即通過激活NF-κBp65信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。綜上所述，HMGB1在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)也為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。5.2NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義討論本研究結(jié)果顯示，NF-κBp65蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為44.21%，顯著高于癌旁正常肺組織的22.22%，這與國內(nèi)外眾多研究結(jié)果一致，表明NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。NF-κBp65作為核轉(zhuǎn)錄因子κB家族的重要成員，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中占據(jù)關(guān)鍵地位。在正常生理狀態(tài)下，NF-κBp65通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB緊密結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如炎癥因子、生長因子、致癌物質(zhì)等，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路被激活，IκB激酶（IKK）被活化，進(jìn)而使IκB蛋白磷酸化、泛素化并最終被蛋白酶體降解。IκB的降解導(dǎo)致NF-κBp65得以釋放，并迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄過程，這些基因涉及細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過程。在非小細(xì)胞肺癌中，由于多種因素導(dǎo)致NF-κBp65信號(hào)通路異常激活，使得NF-κBp65持續(xù)高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活以及對(duì)化療和放療的抵抗，同時(shí)抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利條件。進(jìn)一步分析NF-κBp65表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NF-κBp65蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在組織學(xué)分型方面，腺癌中NF-κBp65的陽性表達(dá)率明顯高于大細(xì)胞癌，這可能與不同組織學(xué)類型腫瘤的細(xì)胞生物學(xué)特性和信號(hào)通路激活情況不同有關(guān)。腺癌具有獨(dú)特的分子生物學(xué)特征，其細(xì)胞表面可能存在更多能夠激活NF-κBp65信號(hào)通路的受體或配體，從而導(dǎo)致NF-κBp65的表達(dá)水平升高。在分化程度上，低分化組中NF-κBp65的陽性表達(dá)率顯著高于高分化組和中分化組，說明腫瘤細(xì)胞的分化程度越低，NF-κBp65的表達(dá)越活躍。腫瘤細(xì)胞的低分化狀態(tài)通常伴隨著更高的惡性程度和更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而NF-κBp65的高表達(dá)可能在其中起到了促進(jìn)作用。研究表明，NF-κBp65可以通過上調(diào)一系列與細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞粘附分子等，來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在TNM分期中，III-IV期患者中NF-κBp65的陽性表達(dá)率明顯高于I-II期患者，提示隨著腫瘤分期的進(jìn)展，NF-κBp65的表達(dá)逐漸增加。這與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨分期升高而增強(qiáng)的特點(diǎn)相符合，表明NF-κBp65可能在腫瘤的晚期階段發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中NF-κBp65的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明NF-κBp65的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞通過激活NF-κBp65信號(hào)通路，上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)自身的侵襲能力，從而更容易突破基底膜，進(jìn)入淋巴管，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NF-κBp65與HMGB1和MMP-9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。HMGB1可以通過激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位和活性，從而上調(diào)其下游靶基因的表達(dá)。而NF-κBp65又能夠與MMP-9基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。這種相互作用關(guān)系表明，NF-κBp65在HMGB1和MMP-9之間起到了關(guān)鍵的橋梁作用，它們共同構(gòu)成了一條促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)通路。綜上所述，NF-κBp65在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者病情和預(yù)后的重要指標(biāo)，同時(shí)也為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。5.3MMP-9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義討論本研究通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率為40.00%，顯著高于癌旁正常肺組織的14.81%，這一結(jié)果與眾多國內(nèi)外研究結(jié)果一致，表明MMP-9在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，其主要生物學(xué)功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，在維持組織的正常結(jié)構(gòu)和生理功能以及組織修復(fù)和重塑過程中起著關(guān)鍵作用。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，MMP-9的表達(dá)和活性常常出現(xiàn)異常升高。腫瘤細(xì)胞自身可以分泌MMP-9，同時(shí)腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等也會(huì)產(chǎn)生大量的MMP-9。在非小細(xì)胞肺癌中，高表達(dá)的MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等成分，破壞腫瘤細(xì)胞周圍的組織屏障，使腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，向周圍組織浸潤。此外，MMP-9還可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生長因子和細(xì)胞因子的結(jié)合蛋白，釋放出活性生長因子和細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析MMP-9表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，MMP-9蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在組織學(xué)分型方面，腺癌中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于鱗癌和大細(xì)胞癌，這可能與不同組織學(xué)類型腫瘤的生物學(xué)特性和侵襲轉(zhuǎn)移能力差異有關(guān)。腺癌具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移傾向，而MMP-9的高表達(dá)可能在其中起到了促進(jìn)作用。在分化程度上，隨著分化程度降低，MMP-9的陽性表達(dá)率逐漸升高，低分化組顯著高于高分化組和中分化組。腫瘤分化程度越低，其惡性程度越高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，MMP-9的高表達(dá)與腫瘤的低分化狀態(tài)密切相關(guān)，表明MMP-9可能在腫瘤的惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。在TNM分期中，III-IV期患者中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于I-II期患者，提示隨著腫瘤分期的進(jìn)展，MMP-9的表達(dá)逐漸增加，這與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨分期升高而增強(qiáng)的特點(diǎn)相符合，表明MMP-9可能在腫瘤的晚期侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MMP-9的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明MMP-9的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞通過分泌MMP-9，降解周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管創(chuàng)造條件，從而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MMP-9與HMGB1和NF-κBp65的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。HMGB1可以通過激活NF-κB信號(hào)通路，促使NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而與MMP-9基因的啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)MMP-9的表達(dá)。這種相互作用關(guān)系表明，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9共同構(gòu)成了一條促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中協(xié)同發(fā)揮作用。綜上所述，MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。同時(shí)，由于MMP-9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用，其可能成為非小細(xì)胞肺癌靶向治療的重要靶點(diǎn)。未來的研究可以進(jìn)一步探討MMP-9的作用機(jī)制，以及開發(fā)針對(duì)MMP-9的特異性抑制劑，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的策略和方法。5.4HMGB1、NF-κBp65和MMP-9聯(lián)合表達(dá)的綜合分析本研究結(jié)果顯示，HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)兩兩之間均呈顯著正相關(guān)，這表明這三種蛋白在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，共同參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制。從三者的作用機(jī)制來看，HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式，在腫瘤細(xì)胞受到刺激時(shí)，會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的RAGE、TLR2和TLR4等受體結(jié)合，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，促使NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合。而MMP-9基因正是NF-κBp65的下游靶基因之一，被激活的NF-κBp65能夠與MMP-9基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。MMP-9作為一種重要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。這種相互關(guān)聯(lián)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，使得HMGB1、NF-κBp65和MMP-9在非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中形成了一個(gè)緊密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在臨床應(yīng)用方面，三者聯(lián)合表達(dá)的檢測(cè)可能具有重要的潛在價(jià)值。一方面，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的診斷，聯(lián)合檢測(cè)這三種蛋白的表達(dá)水平，可能比單獨(dú)檢測(cè)某一種蛋白具有更高的敏感性和特異性。因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同作用，使得它們的聯(lián)合表達(dá)更能反映腫瘤的生物學(xué)特性，有助于提高早期診斷的準(zhǔn)確性。另一方面，在治療策略的選擇上，針對(duì)這一信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)取得更好的治療效果。例如，開發(fā)能夠抑制HMGB1釋放或阻斷其與受體結(jié)