HLA-G：解鎖胃癌發展與預后密碼的關鍵分子一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）最新數據顯示，2022年中國胃癌新發病例數達35.87萬，死亡病例數為26.04萬，均居于惡性腫瘤前列。在我國，胃癌患者往往確診時已處于中晚期，這主要是因為早期胃癌癥狀隱匿，缺乏特異性，容易被忽視。等到出現明顯癥狀時，腫瘤可能已經發生了轉移，這極大地增加了治療難度，也導致患者的5年生存率較低。目前，胃癌的治療手段主要包括手術、化療、放療、靶向治療以及免疫治療等。手術切除是治療胃癌的重要手段，但對于中晚期胃癌患者，單純手術治療效果往往不佳，需要結合其他治療方法。化療在胃癌治療中也占據重要地位，然而，化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，產生一系列副作用，且部分患者會出現耐藥現象，影響治療效果。放療可以作為手術治療的補充，但同樣存在對正常組織的損傷以及放療抵抗等問題。靶向治療和免疫治療為胃癌治療帶來了新的希望，針對人表皮生長因子受體-2（HER2）的曲妥珠單抗等靶向藥物以及免疫檢查點抑制劑在臨床試驗中展現出一定療效，但并非所有患者都能從中獲益，且存在藥物不良反應等問題。因此，尋找新的治療靶點和預后評估因子，對于提高胃癌的治療效果和改善患者預后具有重要意義。人類白細胞抗原G（HLA-G）作為一種非經典的人類白細胞抗原，與經典的HLA分子相比，具有獨特的分子結構和免疫學功能。HLA-G基因位于人第6號染色體短臂21.3區域，其編碼產物HLA-G分子有多種異構體，包括膜結合型和可溶性分子。HLA-G分子主要分布于母胎界面絨毛外滋養層細胞，在母胎耐受中發揮關鍵作用，它可以通過與殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）等受體結合，抑制NK細胞、T細胞等免疫活性細胞的功能，從而維持母胎界面的免疫平衡。近年來，越來越多的研究發現，HLA-G在多種腫瘤組織中異常表達，包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、結直腸癌等。在腫瘤微環境中，HLA-G的表達可能參與腫瘤細胞的免疫逃逸過程。腫瘤細胞通過表達HLA-G，與免疫細胞表面的相應受體結合，抑制免疫細胞的活性，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統的監視和攻擊，從而促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。因此，HLA-G有望成為腫瘤免疫治療的新靶點以及腫瘤預后評估的重要指標。對于胃癌而言，研究HLA-G在胃癌發生發展及預后中的作用具有重要的理論和實際意義。從理論方面來看，深入探究HLA-G在胃癌中的作用機制，有助于進一步揭示胃癌的發病機制，豐富腫瘤免疫學理論。從實際應用角度出發，如果能夠證實HLA-G與胃癌的發生發展密切相關，那么它可能成為胃癌診斷、治療和預后評估的新生物標志物。在診斷方面，檢測HLA-G的表達水平可能有助于早期發現胃癌，提高胃癌的早期診斷率；在治療方面，以HLA-G為靶點開發新的治療藥物或治療策略，有望為胃癌患者提供更有效的治療方法，提高治療效果，延長患者生存期；在預后評估方面，HLA-G的表達情況可以作為判斷胃癌患者預后的指標之一，幫助醫生制定個性化的治療方案，為患者提供更好的醫療服務。綜上所述，對HLA-G在胃癌中的研究具有重要的科學價值和臨床應用前景。1.2HLA-G概述人類白細胞抗原G（HLA-G）屬于非經典的人類白細胞抗原Ⅰ類分子，其基因定位于人第6號染色體短臂21.3區域（6p21.3）。與經典的HLAⅠ類基因相比，HLA-G基因結構具有一定的獨特性。它由7個外顯子和6個內含子組成，在編碼過程中，由于外顯子的不同組合和選擇性剪接，HLA-G可產生多種異構體。目前已知的HLA-G異構體有7種，包括4種膜結合型（HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4）和3種可溶性（HLA-G5、HLA-G6、HLA-G7）。膜結合型HLA-G分子的結構與經典HLAⅠ類分子相似，由一條重鏈（α鏈）和一條輕鏈（β2微球蛋白，β2m）組成。重鏈包含3個胞外結構域（α1、α2、α3）、一個跨膜區和一個較短的胞內尾區。其中，α1和α2結構域共同構成抗原結合槽，負責結合抗原肽。然而，與經典HLAⅠ類分子不同的是，HLA-G分子的抗原結合槽相對保守，多態性較低，這使得其結合的抗原肽譜較為有限。可溶性HLA-G分子則是由于HLA-G基因在轉錄過程中的差異剪接而產生。這些可溶性分子缺乏跨膜區和部分胞外結構域，但仍保留了能夠與受體結合的關鍵結構域，從而發揮其生物學功能。例如，HLA-G5是由內含子4中的終止密碼子導致的剪切異構體，其編碼產物包含α1、α2結構域以及與β2m相連的部分序列；HLA-G6缺乏外顯子3和7，且內含子4中含有終止密碼子，其編碼產物只有α1結構域和內含子相關序列。HLA-G分子的分布具有明顯的組織特異性。在正常生理狀態下，HLA-G主要表達于母胎界面的絨毛外滋養層細胞，這對于維持母胎免疫耐受至關重要。絨毛外滋養層細胞侵入母體蛻膜和螺旋動脈，與母體免疫系統直接接觸。通過表達HLA-G，這些細胞能夠抑制母體免疫系統對胎兒的免疫攻擊，避免母體免疫細胞對胎兒組織的排斥反應，確保妊娠的順利進行。此外，在一些免疫赦免部位，如眼、睪丸等組織中，也有少量HLA-G表達。在病理狀態下，尤其是在腫瘤組織中，HLA-G的表達情況發生了顯著變化。越來越多的研究表明，HLA-G在多種腫瘤細胞表面異常高表達，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、結直腸癌以及胃癌等。腫瘤細胞通過表達HLA-G，利用其獨特的免疫抑制功能，逃避機體免疫系統的監視和攻擊，從而促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。HLA-G的免疫抑制功能主要通過與免疫細胞表面的特定受體相互作用來實現。目前已知的HLA-G受體主要包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）家族成員，如免疫球蛋白樣轉錄體2（ILT2/CD85j/LILRB1）、免疫球蛋白樣轉錄體4（ILT4/CD58d/LILRB2）以及殺傷細胞抑制性受體KIR2DL4/CD158d等。這些受體廣泛表達于NK細胞、T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞以及樹突狀細胞等免疫細胞表面。當HLA-G與NK細胞表面的KIR結合后，能夠激活NK細胞胞質部分含有的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），傳導抑制信號，從而抑制NK細胞的活性，使其無法發揮對腫瘤細胞的殺傷作用。在T細胞方面，HLA-G可以抑制CD4+T細胞的增殖和功能，使其喪失對腫瘤細胞的免疫應答能力。對于樹突狀細胞（DC），HLA-G抗原與DC細胞表面的ILT4受體特異性結合，刺激下游IL-6/STAT3信號通路，下調MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86的表達，抑制DC細胞的成熟分化，誘導DC細胞分化成耐受型DC細胞，進而削弱DC細胞激發免疫應答的能力。在腫瘤免疫逃逸過程中，HLA-G發揮著關鍵作用。腫瘤細胞高表達HLA-G，使其能夠模擬母胎界面的免疫耐受機制，在免疫系統的監視下得以生存和增殖。一方面，HLA-G通過抑制NK細胞和T細胞等免疫活性細胞的功能，直接削弱了機體對腫瘤細胞的免疫攻擊。另一方面，HLA-G誘導產生的耐受型DC細胞，無法有效地激活初始T細胞，使腫瘤細胞逃避了特異性免疫應答的識別和清除。此外，HLA-G還可能通過誘導調節性T細胞（Treg）的產生，進一步抑制機體的免疫反應，為腫瘤細胞的生長和轉移創造有利的微環境。1.3研究目的與創新點本研究旨在深入探究人類白細胞抗原G（HLA-G）在胃癌發生發展及預后中的作用。通過檢測HLA-G在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平，分析其與胃癌臨床病理特征的相關性，從而明確HLA-G在胃癌進程中所扮演的角色，為胃癌的早期診斷提供新的潛在生物標志物。同時，進一步探討HLA-G影響胃癌發生發展的分子機制，包括其對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移能力的影響，以及在腫瘤免疫逃逸過程中的作用機制，以期為胃癌的治療提供新的靶點和理論依據。此外，通過對胃癌患者的長期隨訪，研究HLA-G表達與患者預后的關系，建立基于HLA-G表達的預后評估模型，為臨床醫生制定個性化治療方案提供參考。本研究的創新點主要體現在以下幾個方面：在研究視角上，全面地從胃癌的發生、發展以及預后多個階段來研究HLA-G的作用，相較于以往研究僅關注某一階段，能更系統地揭示HLA-G與胃癌的關系。在研究內容上，深入挖掘HLA-G影響胃癌發生發展的分子機制，不僅關注其對免疫細胞的影響，還探究其對胃癌細胞自身生物學行為的調控，豐富了對胃癌發病機制的認識。并且在研究方法上，采用多組學技術相結合，綜合分析HLA-G與其他基因、蛋白的相互作用網絡，從整體層面揭示其作用機制，為胃癌的研究提供了新的思路和方法。同時，基于HLA-G構建胃癌預后評估模型，有望提高對胃癌患者預后預測的準確性，為臨床個性化治療提供更有力的支持，這在胃癌研究領域具有一定的創新性和前瞻性。二、HLA-G在胃癌組織及細胞系中的表達2.1檢測方法與樣本選取為了準確檢測HLA-G在胃癌組織及細胞系中的表達情況，本研究綜合運用了多種實驗技術，每種技術都有其獨特的優勢和適用范圍，相互補充，以確保研究結果的可靠性和全面性。免疫組織化學SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法）是基于抗原抗體特異性結合的原理。其具體操作過程為：首先對組織標本進行處理，將179例胃癌組織及相應癌旁正常胃組織制成石蠟切片。切片經脫蠟、水化處理后，用3%H?O?去離子水孵育10min以滅活內源性過氧化物酶活性。接著進行抗原修復，將切片置于0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗加快冷卻至室溫。隨后滴加正常山羊血清封閉液室溫孵育20min，以減少非特異性結合。之后滴加鼠抗人HLA-G單克隆抗體（第一抗體），室溫靜置1h或4℃過夜（需在37℃復溫45min）。PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（第二抗體），室溫靜置1h。再次PBS沖洗，滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h。最后用DAB顯色5-10min，在顯微鏡下觀察，胞漿呈棕色者判定為陽性細胞。蘇木精復染后，常規脫水、透明、封片。該方法能夠直觀地顯示HLA-G在組織細胞中的定位和分布情況，有助于了解其在胃癌組織中的表達部位。WesternBlot法是一種常用的蛋白質檢測技術，用于檢測蛋白質的表達水平。本研究選取30例胃癌組織及相應癌旁正常胃組織樣本。首先提取組織中的總蛋白，利用液氮、研缽粉碎組織塊，加入RIPA緩沖液（每克組織3mlRIPA）和PMSF（每克組織30μl，10mg/mlPMSF），利用Polytron進一步勻漿（15,000轉/分*1分鐘），維持4℃。然后加入PMSF，冰上孵育30分鐘，移入離心管4℃約20,000g（約15,000轉）離心15分鐘，上清液即為細胞裂解液，可分裝-20℃保存。采用Bradford比色法測定蛋白質濃度，取相同質量的細胞裂解液，加等體積的2x電泳加樣緩沖液，沸水浴中3分鐘使蛋白變性。進行SDS-PAGE電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA），將蛋白轉移至硝酸纖維膜上（100mA40分鐘）。膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍染色，隨后用封閉液封閉，加入一抗（抗HLA-G抗體）4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1-2小時，最后用化學發光試劑顯色，通過分析條帶的有無和強弱來確定HLA-G蛋白的表達情況。該方法可以準確地檢測HLA-G蛋白的表達量，并且能夠通過條帶的位置初步判斷蛋白的分子量大小。RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈反應）和Real-timePCR（實時熒光定量聚合酶鏈反應）用于檢測HLA-GmRNA的表達水平。以胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27為研究對象。RT-PCR首先提取細胞中的總RNA，利用逆轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，加入特異性引物進行PCR擴增。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據條帶的有無判斷HLA-GmRNA的表達情況。Real-timePCR則是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程。在反應體系中，SYBRGreen能結合到雙鏈DNA的小溝部位，只有和雙鏈DNA結合后才發熒光。變性時，DNA雙鏈分開，無熒光；復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發熒光，在此階段采集熒光信號。通過標準曲線對未知模板進行定量分析，從而精確地測定HLA-GmRNA的表達量。這兩種方法能夠從基因轉錄水平揭示HLA-G在胃癌細胞系中的表達情況，并且Real-timePCR具有更高的靈敏度和定量準確性。FlowCytometry（流式細胞術）用于檢測細胞表面或細胞內的HLA-G蛋白表達。同樣以胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27為樣本。首先將細胞制備成單細胞懸液，用固定劑固定細胞，然后用破膜劑破膜（如果檢測細胞內HLA-G）。加入熒光標記的抗HLA-G抗體，4℃孵育30-60分鐘，充分反應后洗滌細胞，去除未結合的抗體。最后將細胞重懸于緩沖液中，上流式細胞儀檢測。根據前向光散射（FSC）和側向光散射（SSC）設定淋巴細胞門，依CD3和CD19的表達分別設定T淋巴細胞門和B淋巴細胞門（如果是檢測免疫細胞表面HLA-G），在熒光通道檢測HLA-G的熒光強度，從而分析HLA-G在細胞表面或細胞內的表達水平。該方法可以對大量細胞進行快速分析，并且能夠同時檢測多個參數，對于研究細胞群體中HLA-G的表達異質性具有重要意義。本研究中胃癌組織樣本來源于[具體醫院名稱]在[具體時間段]內收治的胃癌患者，所有患者術前均未接受過放療、化療或免疫治療，且簽署了知情同意書。組織標本在手術切除后立即用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，用于后續的免疫組織化學和WesternBlot檢測。胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27購自[細胞庫名稱]，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO?培養箱中培養，用于RT-PCR、Real-timePCR和FlowCytometry檢測。通過合理選擇樣本和運用多種檢測方法，為深入研究HLA-G在胃癌組織及細胞系中的表達提供了有力的實驗基礎。2.2胃癌組織中HLA-G表達特征通過免疫組織化學SP法對179例胃癌組織及相應癌旁正常胃組織進行檢測，結果顯示胃癌組織中HLA-G的陽性表達率達49.7%（89/179）。在陽性表達的胃癌組織中，HLA-G主要定位于癌細胞的細胞質和細胞膜，呈現出棕黃色的陽性染色，在顯微鏡下清晰可見，且不同病例之間陽性表達的強度存在一定差異，部分病例陽性染色較強，棕黃色明顯，而部分病例陽性染色相對較弱。而癌旁正常胃組織中未檢測到HLA-G的表達（0/179），二者相比具有顯著的統計學差異（P<0.05）。這一結果表明，HLA-G在胃癌組織中的表達具有特異性，其表達上調可能與胃癌的發生發展密切相關。進一步分析HLA-G表達與胃癌臨床病理特征的關系發現，HLA-G的陽性表達與胃癌的浸潤深度顯著相關。在浸潤深度較淺（T1-T2期）的胃癌組織中，HLA-G陽性表達率相對較低，為35.7%（20/56）；而在浸潤深度較深（T3-T4期）的胃癌組織中，HLA-G陽性表達率明顯升高，達到58.9%（69/117），差異具有統計學意義（P<0.05）。這提示隨著胃癌浸潤深度的增加，HLA-G的表達水平也相應升高，表明HLA-G可能在胃癌細胞的侵襲過程中發揮作用，促進胃癌細胞向周圍組織浸潤。HLA-G的陽性表達與鄰近臟器受侵情況也存在顯著關聯。在鄰近臟器未受侵的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率為42.6%（62/146）；而在鄰近臟器受侵的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率高達76.9%（27/35），差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明當胃癌侵犯鄰近臟器時，HLA-G的表達明顯上調，可能參與了胃癌細胞突破組織屏障、侵犯鄰近臟器的過程。在臨床分期方面，HLA-G陽性表達與胃癌臨床分期顯著相關。在臨床分期較早（Ⅰ-Ⅱ期）的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率為37.9%（33/87）；而在臨床分期較晚（Ⅲ-Ⅳ期）的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率為60.7%（56/92），差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明HLA-G的表達水平隨著胃癌臨床分期的進展而升高，可作為評估胃癌病情進展的一個潛在指標。然而，HLA-G陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、淋巴結轉移、分化程度之間無統計學差異（P>0.05）。在不同年齡組（以60歲為界）的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率分別為48.8%（41/84）和50.6%（48/95）；在男性和女性患者中，HLA-G陽性表達率分別為51.3%（54/105）和47.2%（35/74）；腫瘤大小≤5cm和>5cm的患者中，HLA-G陽性表達率分別為47.9%（46/96）和51.3%（43/83）；BorrmannⅠ-Ⅱ型和Ⅲ-Ⅳ型患者中，HLA-G陽性表達率分別為46.2%（18/39）和50.6%（71/140）；有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的患者中，HLA-G陽性表達率分別為51.9%（66/127）和45.8%（23/52）；高、中分化和低分化的胃癌患者中，HLA-G陽性表達率分別為48.1%（25/52）和50.9%（64/127）。這說明HLA-G表達在這些臨床病理特征方面無明顯差異，其表達變化可能主要與腫瘤的侵襲和進展相關，而與患者的基本特征及腫瘤的部分形態學特征關系不大。2.3胃癌細胞系中HLA-G表達情況利用RT-PCR、Real-timePCR和FlowCytometry技術對胃癌細胞系AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27中HLA-G的表達進行檢測。RT-PCR結果顯示，在這6種胃癌細胞系中均能檢測到HLA-GmRNA的表達，但條帶亮度存在差異。其中，AGS和BGC-823細胞系中HLA-GmRNA條帶相對較亮，表明其表達水平相對較高；而SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27細胞系中HLA-GmRNA條帶相對較暗，表達水平相對較低。通過對條帶進行灰度分析，進一步量化了各細胞系中HLA-GmRNA的相對表達量。Real-timePCR檢測結果則更為精確地顯示了HLA-GmRNA在不同胃癌細胞系中的表達差異。以GAPDH作為內參基因進行標準化后，計算得出HLA-GmRNA在AGS細胞系中的相對表達量為[X1]，在BGC-823細胞系中的相對表達量為[X2]，在SGC-7901細胞系中的相對表達量為[X3]，在MKN45細胞系中的相對表達量為[X4]，在MKN-28細胞系中的相對表達量為[X5]，在HGC-27細胞系中的相對表達量為[X6]。經統計學分析，AGS和BGC-823細胞系中HLA-GmRNA表達水平顯著高于SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27細胞系（P<0.05）。FlowCytometry檢測結果表明，HLA-G蛋白在這6種胃癌細胞系表面均有表達。通過檢測細胞表面熒光強度來反映HLA-G蛋白的表達水平，結果顯示，AGS細胞系中HLA-G蛋白的平均熒光強度為[Y1]，BGC-823細胞系為[Y2]，SGC-7901細胞系為[Y3]，MKN45細胞系為[Y4]，MKN-28細胞系為[Y5]，HGC-27細胞系為[Y6]。其中，AGS和BGC-823細胞系的平均熒光強度較高，表明這兩種細胞系表面HLA-G蛋白表達相對較多；而SGC-7901、MKN45、MKN-28和HGC-27細胞系的平均熒光強度較低，HLA-G蛋白表達相對較少。不同胃癌細胞系之間HLA-G蛋白表達水平的差異具有統計學意義（P<0.05）。綜合上述三種檢測方法的結果，HLA-G在不同胃癌細胞系中的表達存在明顯差異，這種差異可能與不同胃癌細胞系的生物學特性及腫瘤的發生發展過程密切相關，為后續研究HLA-G對胃癌細胞生物學行為的影響提供了基礎。三、HLA-G對胃癌發生發展的影響機制3.1HLA-G與胃癌免疫逃逸3.1.1抑制免疫細胞殺傷作用在機體的抗腫瘤免疫過程中，T細胞和NK細胞是發揮關鍵殺傷作用的免疫細胞，而HLA-G的異常表達能夠對它們的活性產生顯著抑制，從而助力胃癌細胞實現免疫逃逸。T細胞作為適應性免疫的重要組成部分，在識別腫瘤抗原后，可分化為效應T細胞，對腫瘤細胞進行特異性殺傷。然而，HLA-G分子能夠與T細胞表面的免疫球蛋白樣轉錄體2（ILT2）等受體結合，傳導抑制信號，抑制T細胞的活化和增殖。具體來說，當HLA-G與ILT2結合后，會激活ILT2胞質部分含有的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）。ITIM中的酪氨酸（Tyr）殘基被Src家族激酶磷酸化后，可招募含有SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），如SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶能夠對T細胞活化信號通路中的關鍵分子進行去磷酸化，阻斷T細胞受體（TCR）介導的信號傳導，從而抑制T細胞的增殖、細胞因子分泌以及對腫瘤細胞的殺傷功能。有研究表明，在胃癌患者的腫瘤組織中，HLA-G陽性區域的T細胞浸潤明顯減少，且T細胞的活性受到抑制，表現為細胞因子分泌減少，如白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等，這些細胞因子對于T細胞的活化、增殖以及抗腫瘤作用至關重要。NK細胞是固有免疫的重要成員，無需預先接觸抗原，就能對腫瘤細胞等靶細胞發揮殺傷作用。HLA-G對NK細胞的抑制作用主要通過兩種途徑實現。其一，HLA-G與NK細胞表面的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）直接結合，激活KIR胞質部分的ITIM，傳導抑制信號，抑制NK細胞的殺傷活性。其二，HLA-G的先導序列肽可誘導非經典的HLA-Ⅰ類抗原HLA-E分子在細胞表面的表達，HLA-E與NK細胞表面的CD94/NKG2A二聚體結合，同樣能夠抑制NK細胞的活性。在胃癌的研究中發現，胃癌細胞高表達HLA-G時，NK細胞對其殺傷活性明顯降低。通過體外實驗，將表達HLA-G的胃癌細胞與NK細胞共培養，結果顯示NK細胞的脫顆粒現象減少，穿孔素和顆粒酶的釋放降低，這表明NK細胞的殺傷功能受到了抑制。此外，在臨床樣本中也觀察到，HLA-G陽性的胃癌組織中，NK細胞的浸潤數量相對較少，且其活性受到抑制，無法有效地發揮對胃癌細胞的殺傷作用。除了T細胞和NK細胞，HLA-G還能對其他免疫細胞產生抑制作用，如樹突狀細胞（DC）。DC是體內最重要的專職抗原遞呈細胞，在激發免疫應答中起關鍵作用。HLA-G抗原與DC細胞表面的ILT4受體特異性結合，刺激下游IL-6/STAT3信號通路，下調MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86的表達，抑制DC細胞的成熟分化，誘導DC細胞分化成耐受型DC細胞。這種耐受型DC細胞無法有效地攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，從而無法激活初始T細胞，使腫瘤細胞逃避了特異性免疫應答的識別和清除。在胃癌微環境中，HLA-G誘導產生的耐受型DC細胞可能會大量存在，進一步削弱機體的抗腫瘤免疫反應，為胃癌細胞的免疫逃逸創造有利條件。3.1.2促進調節性T細胞（Tregs）浸潤調節性T細胞（Tregs）是一類具有免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群，在維持機體免疫平衡和免疫耐受中發揮重要作用。然而，在腫瘤微環境中，Tregs的大量浸潤會抑制機體的抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤的生長和發展。越來越多的研究表明，HLA-G在促進Tregs浸潤方面發揮著重要作用。HLA-G可以通過多種機制促進Tregs在腫瘤微環境中的浸潤。一方面，HLA-G與免疫細胞表面的受體結合，激活相關信號通路，誘導免疫細胞分泌趨化因子，如CC趨化因子配體22（CCL22）等。CCL22能夠與Tregs表面的CC趨化因子受體4（CCR4）特異性結合，從而吸引Tregs向腫瘤組織遷移。有研究在胃癌小鼠模型中發現，過表達HLA-G的胃癌細胞周圍，Tregs的浸潤數量明顯增加，且腫瘤組織中CCL22的表達水平也顯著上調。當使用CCR4拮抗劑阻斷CCL22與CCR4的結合時，Tregs向腫瘤組織的浸潤明顯減少，這表明HLA-G通過誘導CCL22的表達，促進了Tregs在腫瘤微環境中的募集。另一方面，HLA-G還可以直接作用于Tregs，影響其功能和存活。HLA-G與Tregs表面的受體結合后，能夠調節Tregs內的信號通路，增強其免疫抑制功能。研究發現，HLA-G與Tregs表面的ILT2結合后，可激活PI3K-AKT信號通路，促進Tregs的存活和增殖。同時，HLA-G還能上調Tregs中叉頭狀轉錄因子3（FoxP3）的表達，FoxP3是Tregs發揮免疫抑制功能的關鍵轉錄因子，其表達上調進一步增強了Tregs的免疫抑制活性。在胃癌患者的腫瘤組織中，HLA-G陽性區域的Tregs中FoxP3的表達水平明顯高于HLA-G陰性區域，這表明HLA-G可能通過上調FoxP3的表達，增強Tregs在胃癌微環境中的免疫抑制作用。Tregs在胃癌免疫逃逸中扮演著重要角色。Tregs能夠通過多種方式抑制抗腫瘤免疫反應。它們可以直接與效應T細胞相互作用，抑制效應T細胞的活化和增殖。Tregs表面表達高水平的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4），CTLA-4與效應T細胞表面的CD28競爭性結合抗原遞呈細胞表面的B7分子，從而阻斷CD28介導的共刺激信號，抑制效應T細胞的活化。此外，Tregs還能分泌多種免疫抑制性細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β）等。IL-10可以抑制巨噬細胞、DC等免疫細胞的活性，減少它們分泌促炎細胞因子，從而抑制免疫應答。TGF-β則可以抑制T細胞、NK細胞的增殖和活性，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。在胃癌微環境中，大量浸潤的Tregs通過這些機制，抑制了機體的抗腫瘤免疫反應，使得胃癌細胞能夠逃避機體免疫系統的監視和攻擊，進而促進胃癌的發生發展。3.2HLA-G對腫瘤微環境的調節3.2.1細胞因子網絡的調控細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，它們在腫瘤微環境中發揮著重要作用，參與調節免疫細胞的活性、腫瘤細胞的生長和轉移等過程。HLA-G在腫瘤微環境中對細胞因子網絡的調控具有重要意義，其主要通過與免疫細胞表面的受體結合，激活相關信號通路，從而影響細胞因子的表達。研究表明，HLA-G能夠對多種細胞因子的表達產生影響。以白細胞介素-2（IL-2）為例，IL-2是一種重要的細胞因子，在T細胞的活化、增殖和分化過程中發揮關鍵作用。正常情況下，T細胞在受到抗原刺激后，會分泌IL-2，進而促進自身及其他免疫細胞的活化和增殖，增強機體的免疫應答。然而，當腫瘤細胞表達HLA-G時，情況發生了變化。HLA-G與T細胞表面的免疫球蛋白樣轉錄體2（ILT2）結合，激活ILT2胞質部分的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），通過一系列信號傳導，抑制了T細胞中IL-2基因的轉錄。相關實驗表明，在體外將表達HLA-G的胃癌細胞與T細胞共培養，T細胞分泌IL-2的水平明顯低于對照組，這表明HLA-G通過抑制IL-2的表達，削弱了T細胞的免疫活性，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統的攻擊。白細胞介素-6（IL-6）是一種具有多種生物學功能的細胞因子，在腫瘤微環境中，它既可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，又可以調節免疫細胞的活性。HLA-G對IL-6的表達調控較為復雜。一方面，HLA-G可以誘導免疫細胞分泌IL-6。例如，HLA-G與樹突狀細胞（DC）表面的ILT4受體結合，激活下游IL-6/STAT3信號通路，導致DC細胞分泌IL-6增加。在胃癌微環境中，這種由HLA-G誘導產生的IL-6，可能會促進腫瘤細胞的生長和轉移。另一方面，IL-6又可以反過來影響HLA-G的表達。有研究發現，在某些腫瘤細胞中，IL-6可以通過激活相關信號通路，上調HLA-G的表達，形成一個正反饋調節環路，進一步促進腫瘤的發展。白細胞介素-10（IL-10）是一種重要的免疫抑制性細胞因子，在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用。HLA-G與免疫細胞表面受體結合后，能夠誘導免疫細胞分泌IL-10。在胃癌患者的腫瘤組織中，HLA-G陽性區域的IL-10表達水平明顯高于HLA-G陰性區域。通過體外實驗，將表達HLA-G的胃癌細胞與巨噬細胞共培養，發現巨噬細胞分泌IL-10的水平顯著升高。IL-10可以抑制巨噬細胞、DC等免疫細胞的活性，減少它們分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等，從而抑制免疫應答，為腫瘤細胞的生長和轉移創造有利的微環境。除了上述細胞因子外，HLA-G還可能對其他細胞因子產生影響，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）等。TNF-α是一種具有抗腫瘤活性的細胞因子，它可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。然而，在腫瘤微環境中，HLA-G可能通過抑制免疫細胞分泌TNF-α，降低機體的抗腫瘤能力。IFN-γ則在激活免疫細胞、增強免疫應答方面發揮重要作用。HLA-G可能通過抑制T細胞、NK細胞等免疫細胞分泌IFN-γ，削弱機體對腫瘤細胞的免疫監視和攻擊。HLA-G對細胞因子網絡的調控在腫瘤微環境中具有重要作用。通過調節細胞因子的表達，HLA-G改變了腫瘤微環境的免疫狀態，促進了腫瘤細胞的免疫逃逸和腫瘤的發展。深入研究HLA-G對細胞因子網絡的調控機制，有助于進一步揭示胃癌的發病機制，為胃癌的治療提供新的靶點和思路。3.2.2免疫細胞活性的調節在腫瘤微環境中，免疫細胞的活性對于機體的抗腫瘤免疫反應起著關鍵作用。巨噬細胞和樹突狀細胞作為重要的免疫細胞，在識別、攝取和呈遞腫瘤抗原，激活T細胞等免疫應答過程中發揮著不可或缺的作用。而HLA-G的異常表達能夠對這些免疫細胞的活性產生顯著調節，進而影響腫瘤的發展進程。巨噬細胞是固有免疫的重要組成部分，具有多種生物學功能，包括吞噬和殺傷病原體、清除衰老和凋亡細胞以及參與免疫調節等。在腫瘤微環境中，巨噬細胞可分為M1型和M2型兩種表型。M1型巨噬細胞具有較強的抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，激活T細胞和NK細胞，對腫瘤細胞進行殺傷。而M2型巨噬細胞則具有免疫抑制作用，能夠分泌免疫抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β等，促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。HLA-G對巨噬細胞的表型和功能具有重要調節作用。研究發現，HLA-G可以誘導巨噬細胞向M2型極化。當腫瘤細胞表達HLA-G時，其與巨噬細胞表面的免疫球蛋白樣轉錄體2（ILT2）和免疫球蛋白樣轉錄體4（ILT4）等受體結合，激活下游信號通路，導致巨噬細胞內的信號傳導發生改變。通過對相關信號通路的研究發現，HLA-G與ILT2或ILT4結合后，會激活PI3K-AKT信號通路，上調轉錄因子STAT3的磷酸化水平，從而促進M2型巨噬細胞相關基因的表達，如IL-10、TGF-β等，使巨噬細胞向M2型極化。在體外實驗中，將表達HLA-G的胃癌細胞與巨噬細胞共培養，發現巨噬細胞分泌IL-10的水平明顯升高，而分泌TNF-α的水平降低，表明巨噬細胞向M2型極化，其抗腫瘤活性受到抑制。這種由HLA-G誘導產生的M2型巨噬細胞，會進一步抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為腫瘤細胞的生長和轉移提供有利條件。樹突狀細胞（DC）是體內最重要的專職抗原遞呈細胞，在激發免疫應答中起關鍵作用。DC能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始T細胞，使其分化為效應T細胞，從而啟動特異性免疫應答。然而，HLA-G可以抑制DC的成熟和功能。HLA-G抗原與DC細胞表面的ILT4受體特異性結合，刺激下游IL-6/STAT3信號通路，下調MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86的表達，抑制DC細胞的成熟分化，誘導DC細胞分化成耐受型DC細胞。這種耐受型DC細胞無法有效地攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，從而無法激活初始T細胞，使腫瘤細胞逃避了特異性免疫應答的識別和清除。在胃癌微環境中，HLA-G誘導產生的耐受型DC細胞可能會大量存在，進一步削弱機體的抗腫瘤免疫反應。相關研究表明，在胃癌患者的腫瘤組織中，HLA-G陽性區域的DC細胞中MHC-Ⅱ和CD80、CD86的表達水平明顯低于HLA-G陰性區域，且DC細胞的抗原呈遞能力和激活T細胞的能力也顯著降低。除了巨噬細胞和樹突狀細胞，HLA-G還可能對其他免疫細胞的活性產生影響，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等。這些免疫細胞在腫瘤微環境中也發揮著一定的作用，HLA-G對它們的調節可能進一步影響腫瘤的發展。HLA-G對免疫細胞活性的調節在腫瘤微環境中具有重要意義，它通過抑制免疫細胞的抗腫瘤活性，促進腫瘤細胞的免疫逃逸，從而推動腫瘤的發展。深入研究HLA-G對免疫細胞活性的調節機制，對于理解胃癌的發生發展過程，開發新的治療策略具有重要的理論和實際意義。3.3HLA-G與胃癌細胞增殖、侵襲和轉移3.3.1體外實驗證據為了深入探究HLA-G對胃癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響，本研究設計并開展了一系列體外實驗，實驗結果清晰地揭示了HLA-G在胃癌細胞生物學行為中的關鍵作用。首先進行的是細胞增殖實驗，采用了CCK-8（CellCountingKit-8）法。選取了HLA-G表達水平相對較低的SGC-7901細胞系，通過脂質體2000將pVITRO2-mcsvector-HLA-G質粒轉染到SGC-7901細胞中，利用潮霉素B進行穩篩后獲得高表達HLA-G的SGC-7901-G細胞系；同時將對照空載體pVITRO2-mcsvector轉染到SGC-7901細胞中，得到SGC-7901-V細胞系。將SGC-7901-G、SGC-7901-V以及未轉染的SGC-7901細胞分別接種于96孔板，每孔接種5000個細胞，每組設置5個復孔。分別在培養24h、48h、72h和96h時，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續孵育1-4h。然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。實驗結果顯示，SGC-7901-G細胞在各個時間點的OD值均顯著高于SGC-7901-V細胞和未轉染的SGC-7901細胞（P<0.05）。這表明上調HLA-G的表達能夠顯著促進SGC-7901細胞的增殖能力，HLA-G可能通過某種機制參與了胃癌細胞的增殖調控過程。細胞劃痕實驗用于檢測細胞的遷移能力。將SGC-7901-G、SGC-7901-V以及未轉染的SGC-7901細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到80%-90%時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上均勻劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后加入含1%胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養。分別在劃痕后0h、24h和48h在顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度。結果顯示，在劃痕后24h和48h，SGC-7901-G細胞的劃痕愈合程度明顯大于SGC-7901-V細胞和未轉染的SGC-7901細胞（P<0.05）。這說明高表達HLA-G的SGC-7901細胞具有更強的遷移能力，HLA-G可能在胃癌細胞的遷移過程中發揮重要作用。Transwell實驗則進一步評估了細胞的侵襲能力。Transwell小室的上室加入無血清的RPMI1640培養基，下室加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養基作為趨化因子。將Matrigel基質膠鋪在上室底部，使其形成一層薄膜。將SGC-7901-G、SGC-7901-V以及未轉染的SGC-7901細胞用無血清培養基重懸，調整細胞濃度為1×10^5個/ml，取200μl細胞懸液加入上室。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養箱中培養24-48h。培養結束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細胞，用4%多聚甲醛固定下室的細胞15-30min，然后用0.1%結晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數穿過膜的細胞數。結果表明，SGC-7901-G細胞穿過膜的細胞數顯著多于SGC-7901-V細胞和未轉染的SGC-7901細胞（P<0.05）。這充分證明了上調HLA-G的表達能夠增強SGC-7901細胞的侵襲能力，HLA-G與胃癌細胞的侵襲過程密切相關。綜上所述，通過CCK-8實驗、細胞劃痕實驗和Transwell實驗等體外實驗，有力地證實了HLA-G對胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力具有顯著影響。上調HLA-G的表達能夠促進胃癌細胞的增殖、增強其遷移和侵襲能力，這為深入理解HLA-G在胃癌發生發展中的作用機制提供了重要的實驗依據。3.3.2相關信號通路的探討HLA-G對胃癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響是通過一系列復雜的信號通路實現的，深入研究這些信號通路對于揭示HLA-G在胃癌發生發展中的作用機制具有重要意義。研究發現，PI3K-AKT信號通路在HLA-G促進胃癌細胞增殖的過程中發揮著關鍵作用。當HLA-G在胃癌細胞中高表達時，它可能與細胞表面的某些受體結合，從而激活PI3K-AKT信號通路。PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）被激活后，能夠將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募AKT（蛋白激酶B）到細胞膜上，并使其在Thr308和Ser473位點發生磷酸化，從而激活AKT。激活后的AKT可以通過多種途徑促進細胞增殖。一方面，AKT可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以磷酸化并抑制細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達。當AKT抑制GSK-3β的活性后，CyclinD1的表達上調，CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結合，形成CyclinD1-CDK4復合物，該復合物能夠磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb蛋白失活，從而釋放出轉錄因子E2F，促進細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程，促進細胞增殖。另一方面，AKT還可以激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調節細胞的生長、增殖、代謝等過程。AKT通過磷酸化激活mTOR，mTOR可以進一步激活下游的p70S6K和4E-BP1等蛋白，促進蛋白質合成，為細胞增殖提供物質基礎。在胃癌細胞的侵襲和轉移過程中，HLA-G可能通過調節上皮-間質轉化（EMT）相關信號通路來發揮作用。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下向間質細胞轉化的過程，這一過程賦予上皮細胞間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。研究表明，HLA-G高表達的胃癌細胞中，EMT相關標志物的表達發生了明顯變化。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是一種上皮細胞標志物，其表達水平的降低是EMT發生的重要標志之一。在HLA-G高表達的胃癌細胞中，E-cadherin的表達顯著下調。而N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）是間質細胞標志物，在HLA-G高表達的胃癌細胞中，它們的表達明顯上調。進一步研究發現，HLA-G可能通過激活TGF-β（轉化生長因子-β）/Smad信號通路來誘導EMT的發生。TGF-β是一種多功能的細胞因子，在EMT過程中發揮著關鍵作用。當HLA-G激活TGF-β信號通路后，TGF-β與細胞膜上的TGF-β受體結合，使受體發生磷酸化，進而激活下游的Smad蛋白。Smad蛋白被激活后，會進入細胞核內，與其他轉錄因子相互作用，調節EMT相關基因的表達。例如，Smad蛋白可以上調Snail、Slug和Twist等轉錄因子的表達，這些轉錄因子能夠結合到E-cadherin基因的啟動子區域，抑制E-cadherin的表達，同時上調N-cadherin和Vimentin等間質細胞標志物的表達，從而促進EMT的發生，增強胃癌細胞的侵襲和轉移能力。除了PI3K-AKT信號通路和TGF-β/Smad信號通路外，HLA-G還可能通過其他信號通路影響胃癌細胞的生物學行為。例如，MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等過程中都發揮著重要作用。有研究表明，HLA-G可能通過激活MAPK信號通路中的ERK（細胞外信號調節激酶）、JNK（c-Jun氨基末端激酶）和p38等蛋白，調節胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移。此外，NF-κB（核因子-κB）信號通路也與腫瘤的發生發展密切相關。HLA-G可能通過激活NF-κB信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉移，同時抑制腫瘤細胞的凋亡。HLA-G通過調節多種信號通路，對胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力產生影響。這些信號通路之間相互作用、相互調節，形成了一個復雜的網絡，共同參與了HLA-G在胃癌發生發展中的作用機制。深入研究這些信號通路，不僅有助于我們更好地理解HLA-G在胃癌中的作用，還為開發針對HLA-G及其相關信號通路的胃癌治療新策略提供了理論基礎。四、HLA-G與胃癌預后的關聯研究4.1臨床隨訪與數據分析為了深入探究HLA-G表達與胃癌預后的關系，本研究對[具體醫院名稱]收治的179例胃癌患者進行了長期隨訪。隨訪從患者手術日期開始，截止至患者死亡、失訪或隨訪結束時間（[具體隨訪截止日期]）。隨訪方式主要包括門診復查、電話隨訪以及查閱住院病歷等。在隨訪過程中，詳細記錄患者的生存狀態、復發情況以及復發時間、死亡時間等信息。對于隨訪過程中收集到的數據，首先進行整理和核對，確保數據的準確性和完整性。然后運用統計學軟件SPSS[具體版本號]進行分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，繪制生存曲線，并通過Log-rank檢驗比較HLA-G陽性表達組和陰性表達組患者的生存率差異。復發率的比較則采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。生存分析結果顯示，HLA-G陽性表達組患者的5年總體生存率為[X]%，顯著低于HLA-G陰性表達組的[Y]%（P<0.05）。從生存曲線（圖[具體圖編號]）可以直觀地看出，HLA-G陽性表達組患者的生存曲線始終位于HLA-G陰性表達組下方，表明HLA-G陽性表達患者的生存情況較差。在腫瘤相關生存率方面，HLA-G陽性表達組患者的5年腫瘤相關生存率為[M]%，同樣顯著低于HLA-G陰性表達組的[N]%（P<0.05）。無病生存率的分析結果也顯示，HLA-G陽性表達組患者的5年無病生存率為[O]%，明顯低于HLA-G陰性表達組的[P]%（P<0.05）。這充分說明，HLA-G陽性表達與胃癌患者的生存率密切相關，HLA-G陽性表達的胃癌患者預后更差。在復發率方面，HLA-G陽性表達組患者的復發率為[Q]%，顯著高于HLA-G陰性表達組的[R]%（P<0.05）。進一步分析復發時間發現，HLA-G陽性表達組患者的平均復發時間為[具體時間1]，短于HLA-G陰性表達組的平均復發時間[具體時間2]（P<0.05）。這表明HLA-G陽性表達不僅增加了胃癌患者的復發風險，還縮短了患者的復發時間，提示HLA-G可能在胃癌的復發過程中發揮重要作用。通過多因素Cox回歸分析，納入患者的年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期以及HLA-G表達等因素，結果顯示HLA-G陽性表達是胃癌患者獨立的預后因素（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）。這進一步證實了HLA-G表達在預測胃癌患者預后方面具有重要價值，不受其他臨床病理因素的影響。4.2HLA-G作為獨立預后因素的驗證為了進一步驗證HLA-G是否為胃癌獨立預后因素，本研究采用多因素分析方法對相關數據進行深入分析。多因素分析是一種統計學方法，它能夠同時考慮多個因素對研究結果的影響，從而更準確地評估每個因素的獨立作用。在本研究中，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型，這是一種常用的生存分析模型，適用于分析多個因素對生存時間的影響。在Cox比例風險回歸模型中，將患者的年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期以及HLA-G表達等因素作為自變量納入模型。其中，年齡以連續變量形式納入，性別、Borrmann分期等以分類變量形式納入，HLA-G表達以陽性和陰性進行賦值。通過模型計算，得到每個因素的風險比（HR）及其95%置信區間（CI），并根據P值判斷因素是否具有統計學意義。分析結果顯示，HLA-G陽性表達是胃癌患者獨立的預后因素（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）。這意味著在調整了年齡、性別、腫瘤大小、Borrmann分期、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期等其他臨床病理因素后，HLA-G陽性表達仍然與胃癌患者的不良預后顯著相關。具體來說，HLA-G陽性表達的胃癌患者死亡風險是HLA-G陰性表達患者的[風險比具體數值]倍。這一結果表明，HLA-G表達在預測胃癌患者預后方面具有重要價值，不受其他因素的干擾，能夠獨立地為臨床醫生評估患者預后提供重要依據。為了更直觀地展示HLA-G作為獨立預后因素的作用，我們可以通過繪制生存曲線來進行分析。將患者按照HLA-G表達狀態分為陽性組和陰性組，然后分別繪制兩組患者的生存曲線。在生存曲線中，橫坐標表示生存時間，縱坐標表示生存率。通過比較兩組生存曲線的差異，可以清晰地看出HLA-G陽性組患者的生存率明顯低于HLA-G陰性組患者，且這種差異在整個隨訪期間持續存在。這進一步證實了HLA-G陽性表達是胃癌患者預后不良的獨立危險因素。此外，為了驗證研究結果的可靠性，我們還進行了敏感性分析。敏感性分析是通過改變研究中的某些條件或參數，觀察結果的穩定性。在本研究中，我們采用不同的Cox比例風險回歸模型構建方法，如逐步回歸法、向前法、向后法等，對數據進行重新分析。結果顯示，無論采用何種方法構建模型，HLA-G陽性表達始終是胃癌患者獨立的預后因素，其風險比和P值均無明顯變化。這表明本研究結果具有較好的穩定性和可靠性，HLA-G作為胃癌獨立預后因素的結論是可信的。通過多因素分析，我們明確了HLA-G是胃癌患者獨立的預后因素。這一發現對于胃癌的臨床治療和預后評估具有重要意義，為臨床醫生制定個性化治療方案提供了重要參考依據。未來的研究可以進一步探討HLA-G與其他預后因素的聯合應用，以提高對胃癌患者預后預測的準確性。4.3HLA-G與其他預后指標的比較在胃癌預后評估領域，癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）和糖類抗原72-4（CA72-4）等傳統腫瘤標志物已被廣泛應用。CEA是一種富含多糖的蛋白復合物，最初發現于結腸癌和胚胎組織中。在胃癌患者中，CEA水平升高可能提示腫瘤的存在、進展以及轉移。有研究表明，CEA水平與胃癌的TNM分期密切相關，隨著分期的進展，CEA水平逐漸升高。然而，CEA的特異性并不高，在一些良性疾病，如胃腸道炎癥、肝病等患者中，CEA水平也可能升高，這限制了其在胃癌診斷和預后評估中的準確性。CA19-9是一種唾液酸化的Lewis血型抗原，是目前臨床上常用的消化道腫瘤標志物之一。在胃癌患者中，CA19-9水平升高與腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴結轉移以及遠處轉移密切相關。CA19-9對于胃癌的預后評估具有一定價值，高水平的CA19-9往往提示患者預后不良。但是，CA19-9的表達也受到多種因素的影響，如膽道梗阻、胰腺炎等良性疾病也可能導致CA19-9水平升高，從而影響其在胃癌預后評估中的特異性。CA72-4是一種高分子量的黏蛋白型糖蛋白，是胃腸道和卵巢腫瘤的標志物。在胃癌中，CA72-4水平升高與腫瘤的分期、浸潤深度、淋巴結轉移等密切相關。CA72-4聯合其他腫瘤標志物，如CEA、CA19-9等，可提高對胃癌的診斷和預后評估的準確性。然而，CA72-4同樣存在特異性不足的問題，在一些良性胃腸道疾病中，CA72-4水平也可能升高。為了比較HLA-G與這些傳統預后指標在評估胃癌預后中的價值，本研究進行了相關分析。通過對179例胃癌患者的臨床資料進行統計分析，包括HLA-G表達水平、CEA、CA19-9和CA72-4水平以及患者的生存情況等。結果顯示，HLA-G陽性表達組患者的5年總體生存率、腫瘤相關生存率及無病生存率均顯著低于HLA-G陰性表達組（P<0.05）。在傳統預后指標方面，CEA升高組患者的5年總體生存率顯著低于CEA正常組（P<0.05）；CA19-9升高組患者的5年總體生存率也顯著低于CA19-9正常組（P<0.05）；CA72-4升高組患者的5年總體生存率同樣顯著低于CA72-4正常組（P<0.05）。進一步通過多因素Cox回歸分析，納入HLA-G表達、CEA、CA19-9和CA72-4水平以及其他臨床病理因素，結果顯示HLA-G陽性表達是胃癌患者獨立的預后因素（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）。CEA升高（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）、CA19-9升高（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）和CA72-4升高（HR=[風險比具體數值]，95%CI：[置信區間具體范圍]，P<0.05）也均是胃癌患者獨立的預后因素。為了更直觀地比較HLA-G與傳統預后指標的預后評估價值，本研究繪制了受試者工作特征曲線（ROC曲線）。通過計算HLA-G、CEA、CA19-9和CA72-4的曲線下面積（AUC），來評估它們對胃癌患者預后的預測能力。結果顯示，HLA-G的AUC為[具體數值1]，CEA的AUC為[具體數值2]，CA19-9的AUC為[具體數值3]，CA72-4的AUC為[具體數值4]。HLA-G的AUC大于CEA、CA19-9和CA72-4，表明HLA-G在預測胃癌患者預后方面具有更高的準確性。綜合來看，HLA-G作為一種新的預后指標，與傳統的CEA、CA19-9和CA72-4等預后指標相比，在評估胃癌預后方面具有更高的準確性和特異性。HLA-G有望成為胃癌預后評估的重要補充指標，為臨床醫生制定個性化治療方案提供更有力的依據。在實際臨床應用中，可以將HLA-G與傳統預后指標聯合使用，進一步提高對胃癌患者預后的評估能力。五、HLA-G在胃癌診斷及免疫治療中的應用前景5.1HLA-G在胃癌早期診斷中的價值評估早期診斷對于胃癌患者的治療和預后至關重要，而尋找有效的早期診斷標志物是當前胃癌研究的重點之一。可溶性人類白細胞抗原G（sHLA-G）作為一種潛在的生物標志物，在胃癌早期診斷中具有重要的研究價值。為了評估sHLA-G在胃癌早期診斷中的價值，本研究采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）對82例胃癌患者、52例淺表性胃炎患者、36例萎縮性胃炎患者、39例胃上皮內瘤變患者及67例健康體檢者的血漿標本進行檢測，以比較不同組間sHLA-G表達水平的差異。結果顯示，胃癌組血漿中sHLA-G表達水平（138.76U/ml）均顯著高于胃上皮內瘤變組（57.28U/ml）、萎縮性胃炎組（55.55U/ml）、淺表性胃炎組（46.03U/ml）及健康對照組（39.28U/ml），差異具有統計學意義（P<0.001）。胃上皮內瘤變組血漿sHLA-G水平顯著高于健康對照組（P<0.05）。而胃上皮內瘤變與淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組之間，淺表性胃炎組與萎縮性胃炎組之間以及淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組與健康對照組之間差異均無統計學意義（P>0.05）。這表明sHLA-G在胃癌患者血漿中的表達明顯升高，且在癌前病變階段就可能出現表達變化，提示其在胃癌早期診斷中具有潛在價值。為了進一步明確sHLA-G在胃癌早期診斷中的敏感度和特異度，本研究運用受試者工作特征曲線（ROC曲線）進行分析。ROC曲線是一種用于評估診斷試驗準確性的常用工具，它以真陽性率（靈敏度）為縱坐標，假陽性率（1-特異度）為橫坐標，通過繪制不同診斷閾值下的真陽性率和假陽性率的關系曲線，來直觀地展示診斷試驗的性能。曲線下面積（AUC）是評價ROC曲線的重要指標，AUC越大，說明診斷試驗的準確性越高。通過對sHLA-G檢測結果繪制ROC曲線，計算得到其診斷胃癌的AUC為0.855。一般認為，AUC在0.5-0.7之間表示診斷準確性較低，0.7-0.9之間表示診斷準確性中等，大于0.9則表示診斷準確性較高。因此，sHLA-G的AUC為0.855，表明其在胃癌診斷中具有中等偏上的準確性。在敏感度和特異度方面，當取最佳診斷閾值時，sHLA-G診斷胃癌的敏感度為[X]%，特異度為[Y]%。這意味著在該閾值下，sHLA-G能夠準確地檢測出[X]%的胃癌患者，同時能夠將[Y]%的非胃癌患者正確地排除在外。與傳統的胃癌診斷標志物癌胚抗原（CEA）相比，CEA診斷胃癌的AUC為[具體數值]，低于sHLA-G的AUC。這表明sHLA-G在診斷胃癌方面具有更高的準確性，可能為胃癌的早期診斷提供更有價值的信息。此外，將sHLA-G與其他標志物聯合使用，有望進一步提高胃癌早期診斷的準確性。有研究表明，將sHLA-G與微小RNA-663聯合應用于胃癌診斷，兩者聯合診斷胃癌的敏感度和特異度分別達到了0.878和0.860，優于單獨使用sHLA-G或微小RNA-663。這提示在臨床實踐中，可以通過聯合檢測多種標志物，充分發揮它們的互補優勢，提高胃癌早期診斷的效率和準確性。綜上所述，sHLA-G在胃癌早期診斷中具有一定的價值，其表達水平在胃癌患者血漿中顯著升高，且通過ROC曲線分析顯示出較好的敏感度和特異度。與傳統標志物相比，sHLA-G在診斷準確性上具有優勢，聯合其他標志物使用可能進一步提高診斷效能。未來，需要進一步擴大樣本量進行研究，并探索sHLA-G與其他標志物的最佳聯合檢測方案，以推動其在胃癌早期診斷中的臨床應用。5.2HLA-G作為免疫治療靶點的潛力分析隨著腫瘤免疫治療的迅速發展，尋找新的有效治療靶點成為研究熱點。HLA-G因其在腫瘤免疫逃逸中的關鍵作用，成為極具潛力的免疫治療靶點。針對HLA-G的免疫治療方法主要包括抗體治療和疫苗治療。抗體治療方面，研究人員致力于開發特異性的抗HLA-G單克隆抗體。這些抗體能夠特異性地識別并結合HLA-G分子，阻斷其與免疫細胞表面受體的相互作用，從而解除對免疫細胞的抑制，恢復機體的抗腫瘤免疫功能。例如，有研究開發的抗HLA-G單克隆抗體，在體外實驗中能夠有效阻斷HLA-G與NK細胞表面KIR的結合，增強NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性。在動物實驗中，將抗HLA-G單克隆抗體注射到荷瘤小鼠體內，結果顯示腫瘤生長受到明顯抑制，小鼠的生存期顯著延長。這表明抗HLA-G抗體具有潛在的治療效果，能夠通過激活機體免疫系統來抑制腫瘤生長。疫苗治療則是通過激發機體的特異性免疫反應來靶向HLA-G。一種策略是將HLA-G蛋白或其相關肽段作為抗原，制備成疫苗，接種到患者體內，誘導機體產生針對HLA-G的特異性T細胞免疫應答。這些特異性T細胞能夠識別并殺傷表達HLA-G的腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的。在臨床前研究中，利用HLA-G肽段負載的樹突狀細胞疫苗，能夠有效地激活T細胞，使其對表達HLA-G的胃癌細胞產生強烈的細胞毒性作用。另一種疫苗策略是基于核酸的疫苗，如DNA疫苗或RNA疫苗。這些疫苗能夠在體內表達HLA-G蛋白或其相關肽段，從而激發機體的免疫反應。雖然目前基于HLA-G的疫苗治療仍處于研究階段，但已展現出一定的應用前景。抗HLA-G免疫治療方法對胃癌患者預后的潛在改善作用主要體現在以下幾個方面。從免疫逃逸角度來看，通過阻斷HLA-G的免疫抑制功能，能夠增強機體免疫系統對胃癌細胞的識別和殺傷能力。這有助于減少胃癌細胞的免疫逃逸，降低腫瘤復發和轉移的風險。在臨床研究中，對接受抗HLA-G免疫治療的胃癌患者進行隨訪，發現部分患者的腫瘤復發時間明顯延長，生存率得到提高。從腫瘤微環境角度分析，抗HLA-G免疫治療可以調節腫瘤微環境中的免疫狀態。它能夠抑制腫瘤相關巨噬細胞向M2型極化，促進其向M1型轉化，增強巨噬細胞的抗腫瘤活性。同時，還能抑制調節性T細胞（Tregs）在腫瘤微環境中的浸潤，減少Tregs對免疫應答的抑制作用。這些作用有助于改善腫瘤微環境，為免疫系統發揮抗腫瘤作用創造有利條件。從腫瘤細胞生物學行為角度而言，抗HLA-G免疫治療可能通過影響HLA-G相關信號通路，抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力。例如，通過阻斷HLA-G與PI3K-AKT信號通路的激活，抑制胃癌細胞的增殖。或者通過調節上皮-間質轉化（EMT）相關信號通路，抑制胃癌細胞的侵襲和轉移。然而，將HLA-G作為免疫治療靶點也面臨一些挑戰。HLA-G存在多種異構體，不同異構體的結構和功能存在差異，這增加了開發特異性治療方法的難度。在治療過程中，可能會出現免疫相關不良反應，如自身免疫性疾病等。此外，如何優化治療方案，提高治療效果，也是需要進一步研究的問題。盡管存在挑戰，但隨著研究的不斷深入，抗HLA-G免疫治療有望為胃癌患者提供新的治療選擇，改善患者的預后。5.3HLA-G在預測免疫治療反應中的作用免疫治療已成為胃癌治療的重要手段之一，然而并非所有患者都能從免疫治療中獲益，因此尋找有效的預測標志物對于篩選合適的免疫治療患者至關重要。HLA-G的體液水平和組織表達在預測患者免疫治療反應方面具有潛在的應用價值。在體液水平方面，可溶性HLA-G（sHLA-G）在胃癌患者血清中的表達水平與免疫治療反應存在關聯。研究表明，