HER2與FASN交互作用對卵巢癌惡性表型的調控機制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統中致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）公布的數據，2020年全球卵巢癌新增病例約31萬，死亡人數達20萬，其5年生存率僅約49.1%。卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于晚期，錯過了最佳治療時機。而且，卵巢癌復發率高，對化療藥物易產生耐藥性，這使得臨床治療面臨巨大挑戰，迫切需要深入探索卵巢癌的發病機制，尋找新的治療靶點和策略，以改善患者的預后。人表皮生長因子受體-2（HER2）是一種跨膜酪氨酸激酶蛋白，屬于表皮生長因子受體（EGFR）家族成員。HER2基因在30%以上的人類腫瘤中存在擴增或過度表達，包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌等。在卵巢癌中，HER2的過表達與腫瘤的轉移、復發密切相關，可能與HER2調節卵巢癌干細胞有關。HER2主要通過與家族中其他成員形成異二聚體，或通過胞外配體結合區（ECD）蛋白水解切割而被激活，進而介導Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt和信號轉導及轉錄激活STAT等多條信號通路，促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡，提高腫瘤侵襲能力和血管生成。目前，針對HER2的靶向治療在乳腺癌和胃癌等腫瘤中取得了顯著療效，但在卵巢癌中的應用仍存在諸多問題，如HER2過表達率在不同研究中差異較大（16.9%-39.2%），近年來陽性率雖趨于一致（11%-16%），但HER2/neu過表達/擴增的低發生率及腫瘤異質性限制了HER2靶向治療在復發性化療耐藥卵巢癌中的作用。因此，深入研究HER2在卵巢癌中的作用機制，對于優化卵巢癌的靶向治療具有重要意義。脂肪酸合成酶（FASN）是脂肪酸從頭合成的關鍵調控因子。在正常生理狀態下，人體細胞脂肪酸的合成主要用于維持細胞膜的完整性、信號傳導等基本生理功能。然而，在腫瘤細胞中，FASN的表達和活性顯著上調，腫瘤細胞通過大量合成脂肪酸來滿足自身快速增殖和生長的需求。FASN的過表達在許多癌癥中普遍存在，并且與不良預后和增加的多種藥物抵抗性相關。在卵巢癌中，FASN的異常表達也被證實與腫瘤的惡性進展密切相關。研究表明，FASN參與了卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程，通過調節脂肪酸代謝，為腫瘤細胞提供能量和生物膜合成的原料，促進腫瘤細胞的存活和生長。此外，FASN還可能通過影響腫瘤微環境，促進腫瘤血管生成和免疫逃逸，進一步推動卵巢癌的發展。對FASN的深入研究為卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點。目前，關于HER2和FASN在卵巢癌中的研究多集中在各自的作用機制及單一靶向治療上，而兩者之間的交互作用及其對卵巢癌惡性表型的調控機制尚不清楚。探索HER2與FASN之間的交互作用，有助于揭示卵巢癌發生發展的新機制，為卵巢癌的治療提供更全面的理論基礎。從治療角度來看，明確兩者的交互作用可能為開發聯合靶向治療策略提供依據，通過同時靶向HER2和FASN，克服單一靶向治療的局限性，提高治療效果，為卵巢癌患者帶來新的希望。從預后評估角度而言，了解HER2與FASN的交互作用，有助于篩選出更準確的預后標志物，更精準地預測患者的預后，從而為個性化治療方案的制定提供參考，提高患者的生存率和生活質量。1.2國內外研究現狀1.2.1HER2在卵巢癌中的研究現狀HER2作為表皮生長因子受體家族的重要成員，在卵巢癌的研究中一直備受關注。大量研究表明，HER2在卵巢癌組織中存在不同程度的過表達。在一項針對卵巢癌樣本的研究中，通過免疫組化技術檢測發現，部分卵巢癌組織中HER2蛋白呈現高表達狀態。HER2的過表達與卵巢癌的惡性生物學行為密切相關，在體外細胞實驗中，過表達HER2的卵巢癌細胞株，如SKOV3細胞，其增殖能力明顯增強，遷移和侵襲能力也顯著提高。臨床研究也證實，HER2過表達的卵巢癌患者往往具有更高的復發率和更低的生存率，提示HER2可作為評估卵巢癌患者預后的重要指標。在HER2的作用機制方面，其主要通過與其他受體形成異二聚體，激活下游的Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt和信號轉導及轉錄激活STAT等信號通路。當HER2與配體結合或發生自身磷酸化后，能夠招募一系列接頭蛋白和激酶，激活Ras蛋白，進而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，促進細胞增殖和存活。PI3K/Akt信號通路的激活則可以抑制細胞凋亡，增強細胞的存活能力，并調節細胞的代謝和生長。這些信號通路的異常激活在卵巢癌的發生、發展和轉移過程中起到了關鍵作用。目前，針對HER2的靶向治療已成為卵巢癌治療領域的研究熱點。曲妥珠單抗作為首個獲批的HER2靶向藥物，在HER2陽性乳腺癌的治療中取得了顯著療效，但在卵巢癌中的單藥治療效果并不理想。在一項關于曲妥珠單抗治療卵巢癌的臨床研究中，患者的客觀緩解率較低。帕妥珠單抗通過抑制HER2的二聚化發揮作用，其在卵巢癌中的單藥治療反應性也較低。為了提高HER2靶向治療的效果，研究人員開始探索聯合治療策略，將HER2靶向藥物與化療藥物、其他靶向藥物或免疫治療藥物聯合使用。臨床前研究表明，HER2靶向藥物與化療藥物聯合使用，能夠增強對卵巢癌細胞的殺傷作用。然而，這些聯合治療方案仍面臨著諸多挑戰，如藥物耐藥性的產生、不良反應的增加等。1.2.2FASN在卵巢癌中的研究現狀FASN在卵巢癌中的研究主要聚焦于其表達水平與腫瘤惡性程度的關聯，以及作為治療靶點的潛力。眾多研究顯示，FASN在卵巢癌組織和細胞系中呈現高表達態勢。在對卵巢癌組織芯片的分析中發現，FASN的表達水平明顯高于正常卵巢組織，且與腫瘤的分期、分級密切相關。高表達FASN的卵巢癌患者，其預后往往較差，無進展生存期和總生存期明顯縮短。從功能機制角度來看，FASN在卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發揮著關鍵作用。研究表明，抑制FASN的活性或表達，能夠顯著降低卵巢癌細胞的增殖速率，誘導細胞周期阻滯和凋亡。在細胞遷移和侵襲實驗中，干擾FASN表達的卵巢癌細胞，其遷移和侵襲能力明顯減弱。FASN通過調節脂肪酸的合成，為腫瘤細胞提供能量和生物膜合成的原料，滿足腫瘤細胞快速增殖的需求。FASN還可能通過影響腫瘤微環境中的脂質代謝，調節腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，促進腫瘤的免疫逃逸。在治療研究方面，FASN已成為卵巢癌治療的潛在靶點，許多FASN抑制劑被開發并用于臨床前研究。奧利司他作為一種臨床常用的減肥藥，也是一種FASN抑制劑，在卵巢癌的研究中展現出一定的抗腫瘤活性。在鉑耐藥卵巢癌小鼠模型中，奧利司他能夠抑制腫瘤的生長，增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性，聯合使用奧利司他和順鉑，可顯著延長小鼠的生存期。其他新型FASN抑制劑，如C75等，也在體外和體內實驗中表現出對卵巢癌細胞的抑制作用。然而，FASN抑制劑在臨床應用中仍面臨著一些問題，如藥物的特異性和有效性有待提高，長期使用可能產生的不良反應也需要進一步研究。1.2.3HER2與FASN交互作用研究現狀目前，HER2與FASN在卵巢癌中的交互作用研究尚處于起步階段，相關研究報道較少。雖然HER2和FASN各自在卵巢癌的發生、發展中扮演著重要角色，但兩者之間是否存在直接或間接的相互作用，以及這種相互作用如何影響卵巢癌的惡性表型，尚未完全明確。有研究推測，HER2激活的下游信號通路可能通過某種機制調節FASN的表達或活性。在其他腫瘤類型中，如乳腺癌，有研究發現HER2過表達能夠上調FASN的表達，促進脂肪酸合成，增強腫瘤細胞的增殖能力。但在卵巢癌中，這一現象是否存在以及具體的調控機制仍有待進一步驗證。從信號通路角度來看，HER2介導的Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt等信號通路與FASN參與的脂肪酸代謝信號通路之間可能存在交叉對話。PI3K/Akt信號通路的激活可以調節脂肪酸代謝相關基因的表達，其中可能包括FASN。然而，在卵巢癌中，這些信號通路之間的具體交互方式和分子機制尚未得到深入研究。此外，HER2和FASN在腫瘤微環境中的相互作用也值得關注。腫瘤微環境中的免疫細胞、間質細胞等可能受到HER2和FASN的共同影響，進而調節腫瘤的生長和轉移。但目前關于這方面的研究還非常有限，缺乏系統的探討和深入的分析。總體而言，HER2與FASN交互作用在卵巢癌中的研究還存在諸多空白，深入探究兩者之間的關系，對于揭示卵巢癌的發病機制、開發新的治療策略具有重要的理論和實踐意義。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在深入探究HER2與FASN在卵巢癌中的交互作用及其對卵巢癌惡性表型的調控機制，為卵巢癌的治療提供新的理論依據和潛在治療靶點。具體研究目的如下：明確HER2與FASN在卵巢癌組織和細胞系中的表達情況，分析兩者表達的相關性，初步探索它們在卵巢癌發生發展過程中的潛在關聯。通過檢測不同分期、分級的卵巢癌組織以及多種卵巢癌細胞系中HER2和FASN的表達水平，運用統計學方法分析兩者表達之間的相關性，為后續研究提供基礎數據。研究HER2與FASN交互作用對卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等惡性表型的影響。利用基因編輯技術構建HER2和FASN過表達或敲低的卵巢癌細胞模型，通過體外細胞實驗，如CCK-8實驗檢測細胞增殖能力、Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力、流式細胞術檢測細胞凋亡率等，明確HER2與FASN交互作用對卵巢癌細胞惡性表型的具體影響。揭示HER2與FASN交互作用調控卵巢癌惡性表型的分子機制。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）、免疫共沉淀（Co-IP）、基因芯片等技術，研究HER2與FASN交互作用對下游信號通路，如Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt和脂肪酸代謝相關信號通路的影響，尋找參與這一調控過程的關鍵分子和信號轉導途徑。評估HER2與FASN作為聯合治療靶點在卵巢癌治療中的潛在價值。在體內動物實驗中，構建卵巢癌小鼠模型，分別給予HER2抑制劑、FASN抑制劑以及兩者聯合治療，觀察腫瘤生長情況、檢測腫瘤組織中相關蛋白表達和信號通路激活狀態，評估聯合治療的效果，為臨床治療提供實驗依據。1.3.2研究方法細胞實驗：選用人卵巢癌細胞系，如SKOV3、A2780等，進行細胞培養和傳代。利用慢病毒轉染技術構建HER2和FASN過表達或敲低的穩定細胞株，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot驗證基因表達水平的改變。運用CCK-8法檢測細胞增殖活性，將不同處理組的細胞接種于96孔板，在不同時間點加入CCK-8試劑，孵育后測定吸光度值，繪制細胞生長曲線。采用Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力，在Transwell小室的上室加入細胞懸液，下室加入含血清的培養基，培養一定時間后，固定并染色遷移或侵襲到下室的細胞，計數并統計分析。利用流式細胞術檢測細胞凋亡，將細胞用AnnexinV-FITC和PI雙染后，通過流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。動物實驗：選用免疫缺陷小鼠，如BALB/cnude小鼠，建立卵巢癌皮下移植瘤模型。將穩定轉染的卵巢癌細胞懸液注射到小鼠皮下，待腫瘤生長至一定體積后，將小鼠隨機分為對照組、HER2抑制劑組、FASN抑制劑組和聯合治療組。分別給予相應的藥物處理，定期測量腫瘤體積和小鼠體重，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，進行病理切片、免疫組化、Westernblot等檢測，分析腫瘤組織中HER2、FASN的表達以及相關信號通路的激活情況。分子生物學實驗：提取卵巢癌組織和細胞的總RNA和蛋白質，進行qRT-PCR和Westernblot檢測，以確定HER2和FASN的mRNA和蛋白表達水平。通過免疫共沉淀實驗，驗證HER2與FASN之間是否存在直接相互作用，將細胞裂解液與抗HER2或抗FASN抗體孵育，沉淀復合物后進行Westernblot檢測。利用基因芯片技術分析HER2和FASN交互作用對下游基因表達譜的影響，篩選出差異表達基因，進一步進行生物信息學分析，探討相關信號通路和分子機制。運用蛋白質免疫印跡法檢測下游信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平，如p-ERK、p-Akt等，以確定信號通路的激活狀態。臨床樣本分析：收集卵巢癌患者的手術切除組織和臨床病理資料，包括患者的年齡、腫瘤分期、分級、轉移情況等。采用免疫組化法檢測HER2和FASN在卵巢癌組織中的表達，分析兩者表達與臨床病理參數之間的關系。通過隨訪獲取患者的生存數據，運用統計學方法分析HER2和FASN表達與患者預后的相關性。二、HER2與FASN的結構、功能及在腫瘤中的作用機制2.1HER2的結構與功能2.1.1HER2的結構特點HER2，全稱人表皮生長因子受體2，是一種重要的跨膜受體蛋白，屬于受體酪氨酸激酶（RTK）家族中的表皮生長因子受體（EGFR）家族成員。該家族還包括EGFR（HER1）、HER3和HER4。HER2基因定位于人類染色體17q21，其編碼的HER2蛋白由1255個氨基酸組成，相對分子質量約為185kDa，簡稱p185。HER2蛋白結構高度保守，由三個主要結構域組成：胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域。胞外結構域位于細胞膜外側，由632個氨基酸殘基構成，是HER2與配體及其他受體相互作用的關鍵區域。該結構域包含四個亞結構域（I-IV），其中I和III亞結構域富含亮氨酸，主要參與配體結合；II和IV亞結構域富含半胱氨酸，在受體二聚化過程中發揮重要作用。值得注意的是，HER2缺乏內源性配體，其獨特的開放式構象使其處于相對活化狀態。與其他EGFR家族成員不同，HER2的胞外結構域呈現出一種獨特的構象，這種構象使得HER2更容易與其他受體形成二聚體，從而激活下游信號通路。跨膜結構域由23個氨基酸殘基組成，通過一個單跨膜α螺旋將HER2蛋白錨定在細胞膜上，起到連接胞外和胞內結構域的橋梁作用，維持HER2在細胞膜上的穩定定位。胞內結構域由600個氨基酸殘基構成，包含近膜區、酪氨酸激酶催化結構域及富含酪氨酸起調節作用的C端尾部區域。近膜區參與調節酪氨酸激酶的活性，酪氨酸激酶催化結構域（720-987位氨基酸）是HER2發揮激酶活性的核心區域，當HER2與其他受體形成二聚體并被激活后，該區域的酪氨酸殘基會發生自磷酸化，為下游信號分子提供結合位點，進而激活一系列下游信號通路。C端尾部區域含有多個酪氨酸殘基，這些酪氨酸殘基在信號轉導過程中起到重要的調節作用，通過與不同的信號分子相互作用，將HER2激活的信號傳遞到細胞內的各個部位。2.1.2HER2在腫瘤發生發展中的作用機制HER2在腫瘤的發生、發展和轉移過程中扮演著關鍵角色，其主要通過激活下游多條信號通路來促進腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，同時還參與腫瘤血管生成和免疫逃逸等過程。當HER2與配體結合或與其他EGFR家族成員形成異二聚體時，HER2的胞內酪氨酸激酶結構域被激活，發生自身磷酸化。以HER2與EGFR形成的異二聚體為例，當EGF等配體與EGFR結合后，會誘導EGFR發生構象變化，進而與HER2形成異二聚體。這種異二聚體的形成會導致HER2胞內酪氨酸激酶結構域的激活，使HER2的多個酪氨酸殘基發生磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基成為下游信號分子的結合位點，招募并激活一系列接頭蛋白和激酶，從而啟動下游信號傳導。HER2激活的下游信號通路中，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（Ras/Raf/MEK/ERK）信號通路是兩條關鍵的信號傳導途徑。在PI3K/Akt信號通路中，磷酸化的HER2招募含有SH2結構域的接頭蛋白，如生長因子受體結合蛋白2（Grb2）和磷脂酰肌醇-3激酶調節亞基（p85）。p85與HER2結合后，激活PI3K的催化亞基p110，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3在細胞膜上積累，招募并激活蛋白激酶B（Akt）。Akt被激活后，通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，發揮促進細胞存活、抑制細胞凋亡、調節細胞代謝和促進細胞增殖等作用。研究表明，在卵巢癌細胞中，抑制PI3K/Akt信號通路可以顯著降低HER2過表達細胞的存活能力，誘導細胞凋亡。在Ras/Raf/MEK/ERK信號通路中，磷酸化的HER2與Grb2結合后，Grb2再與鳥苷酸交換因子Sos結合，形成HER2-Grb2-Sos復合物。該復合物激活Ras蛋白，使其結合的GDP轉換為GTP，從而激活Ras。激活的Ras進一步招募并激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化并激活細胞外信號調節激酶（ERK）。ERK被激活后，轉位進入細胞核，磷酸化多種轉錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調節與細胞增殖、分化、存活相關基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖和存活。在體外實驗中，阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號通路可以抑制HER2過表達的卵巢癌細胞的增殖能力。除了PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路外，HER2還可以激活信號轉導及轉錄激活因子（STAT）信號通路。當HER2被激活后，其磷酸化的酪氨酸殘基可以招募STAT蛋白，使STAT蛋白發生磷酸化。磷酸化的STAT蛋白形成二聚體，轉位進入細胞核，調節相關基因的表達，參與細胞增殖、存活和免疫調節等過程。在腫瘤微環境中，HER2激活的STAT信號通路可能影響腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，促進腫瘤的免疫逃逸。HER2還通過促進腫瘤血管生成和上皮-間質轉化（EMT）來推動腫瘤的進展。HER2激活下游信號通路可以上調血管內皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進腫瘤血管的生成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣，支持腫瘤的生長和轉移。在卵巢癌中，HER2過表達與腫瘤組織中VEGF的高表達相關，并且與腫瘤的血管生成密切相關。HER2激活的信號通路還可以誘導EMT過程，使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，HER2通過調節E-鈣黏蛋白、波形蛋白等相關蛋白的表達，促進腫瘤細胞的間質化，使其更容易突破基底膜，進入血液循環，發生遠處轉移。2.2FASN的結構與功能2.2.1FASN的結構特點脂肪酸合成酶（FASN）是一種在脂肪酸從頭合成過程中起關鍵作用的多功能酶，廣泛存在于哺乳動物細胞中。在脂肪酸合成過程中，FASN催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，以NADPH為供氫體，經過一系列復雜的反應，合成16碳的軟脂酸。這一過程對于維持細胞的正常生理功能至關重要，尤其是在需要大量脂肪酸的細胞活動中，如細胞膜的合成、能量儲存和信號傳導等。FASN是一種由兩個相同亞基組成的二聚體蛋白，每個亞基的相對分子質量約為272kDa，包含7種不同的催化結構域和1個酰基載體蛋白（ACP）結構域。這種多結構域的組成使得FASN能夠在一個蛋白分子上完成脂肪酸合成的多個步驟，大大提高了脂肪酸合成的效率。7種催化結構域分別具有不同的酶活性，包括乙酰基轉移酶（AT）、丙二酰基轉移酶（MT）、β-酮脂酰合成酶（KS）、β-酮脂酰還原酶（KR）、β-羥脂酰脫水酶（DH）、烯酰基還原酶（ER）和硫酯酶（TE）。乙酰基轉移酶（AT）結構域負責將乙酰輔酶A上的乙酰基轉移到ACP結構域上，為脂肪酸合成提供起始底物。在這一過程中，AT結構域通過特異性的識別和結合乙酰輔酶A，將乙酰基從輔酶A上解離下來，并共價連接到ACP結構域的磷酸泛酰巰基乙胺臂上，形成乙酰-ACP。丙二酰基轉移酶（MT）結構域則將丙二酰輔酶A上的丙二酰基轉移到ACP結構域上，為后續的縮合反應做準備。MT結構域與丙二酰輔酶A結合后，催化丙二酰基與ACP結構域上的乙酰基發生縮合反應，形成丙二酰-ACP。β-酮脂酰合成酶（KS）結構域是脂肪酸合成的核心催化結構域之一，它催化乙酰-ACP和丙二酰-ACP之間的縮合反應，形成β-酮脂酰-ACP，并釋放出二氧化碳。在這一反應中，KS結構域通過其活性位點的半胱氨酸殘基與乙酰-ACP上的乙酰基形成硫酯鍵，然后與丙二酰-ACP發生親核加成反應，生成β-酮脂酰-ACP。β-酮脂酰還原酶（KR）結構域利用NADPH作為供氫體，將β-酮脂酰-ACP還原為β-羥脂酰-ACP。KR結構域的活性位點與β-酮脂酰-ACP和NADPH結合，通過氧化還原反應，將β-酮基還原為β-羥基。β-羥脂酰脫水酶（DH）結構域催化β-羥脂酰-ACP發生脫水反應，形成α,β-烯脂酰-ACP。在這一過程中，DH結構域通過特異性的識別和催化，去除β-羥脂酰-ACP上的羥基和相鄰碳原子上的氫原子，形成雙鍵，生成α,β-烯脂酰-ACP。烯酰基還原酶（ER）結構域再次利用NADPH作為供氫體，將α,β-烯脂酰-ACP還原為飽和的脂酰-ACP。ER結構域與α,β-烯脂酰-ACP和NADPH結合，通過氧化還原反應，將雙鍵還原為單鍵，使脂肪酸鏈得以延長。經過多次這樣的循環反應，脂肪酸鏈逐漸延長。當脂肪酸鏈達到一定長度（通常為16碳）時，硫酯酶（TE）結構域將脂酰-ACP水解，釋放出游離的脂肪酸，完成脂肪酸的合成過程。酰基載體蛋白（ACP）結構域在脂肪酸合成過程中起著至關重要的作用，它通過其輔基4＇-磷酸泛硫氨酸的巰基與脂肪酸合成過程中的中間產物形成硫酯鍵，將這些中間產物緊密結合在FASN分子上，使其能夠在各個催化結構域之間有序地進行反應。4＇-磷酸泛硫氨酸的巰基就像一個“掛鉤”，將脂肪酸合成的中間產物依次連接到ACP結構域上，確保了脂肪酸合成反應的高效進行。這種多結構域的協同作用使得FASN能夠在細胞內高效地催化脂肪酸的合成，滿足細胞對脂肪酸的需求。2.2.2FASN在腫瘤發生發展中的作用機制在腫瘤的發生和發展過程中，FASN發揮著至關重要的作用，其異常表達和活性改變與腫瘤細胞的增殖、存活、遷移、侵襲以及耐藥性等密切相關。腫瘤細胞的快速增殖需要大量的能量和生物合成原料，而脂肪酸作為細胞膜的重要組成成分以及能量儲存的主要形式，對于腫瘤細胞的生長和存活至關重要。FASN在腫瘤細胞中的過表達使得腫瘤細胞能夠大量合成脂肪酸，為其提供充足的能量和生物膜合成的原料，從而滿足腫瘤細胞快速增殖的需求。FASN通過調節脂肪酸的合成，為腫瘤細胞提供能量來源。腫瘤細胞在增殖過程中，需要消耗大量的能量來維持其快速的代謝和分裂活動。脂肪酸的β-氧化可以產生大量的ATP，為腫瘤細胞提供能量支持。研究表明，在一些腫瘤細胞系中，抑制FASN的活性會導致脂肪酸合成減少，進而影響腫瘤細胞的能量代謝，使腫瘤細胞的增殖受到抑制。在乳腺癌細胞中，抑制FASN可以降低細胞內脂肪酸的含量，減少ATP的生成，從而抑制細胞的增殖。FASN合成的脂肪酸是生物膜的重要組成部分，腫瘤細胞的快速增殖需要不斷合成新的細胞膜來包裹新生成的細胞。FASN過表達使得腫瘤細胞能夠合成足夠的脂肪酸，用于生物膜的合成，保證了腫瘤細胞的正常生長和分裂。在卵巢癌細胞中，FASN的高表達與細胞膜中脂肪酸的含量增加相關，促進了腫瘤細胞的增殖和生長。FASN還參與了腫瘤細胞的信號傳導通路，調節細胞的增殖和存活。FASN合成的脂肪酸可以作為信號分子，參與細胞內的信號傳導過程。一些脂肪酸衍生物，如前列腺素、白三烯等，能夠調節細胞的增殖、分化和凋亡。在腫瘤細胞中，FASN的異常表達可能導致這些脂肪酸衍生物的合成改變，從而影響腫瘤細胞的生長和存活。研究發現，在肝癌細胞中，FASN過表達會增加前列腺素E2的合成，通過激活相關信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活。FASN還可以通過與一些信號蛋白相互作用，調節細胞的增殖和存活信號。在乳腺癌細胞中，FASN可以與表皮生長因子受體（EGFR）相互作用，增強EGFR信號通路的激活，促進腫瘤細胞的增殖。FASN在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中也發揮著重要作用。腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤轉移的關鍵步驟，而FASN通過多種機制參與了這一過程。脂肪酸的合成與腫瘤細胞的膜流動性和細胞骨架的重組密切相關。FASN過表達使得腫瘤細胞能夠合成更多的不飽和脂肪酸，增加細胞膜的流動性，有利于腫瘤細胞的變形和遷移。FASN合成的脂肪酸還可以調節細胞骨架相關蛋白的表達和活性，促進細胞骨架的重組，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。研究表明，在肺癌細胞中，抑制FASN可以降低細胞內不飽和脂肪酸的含量，減少細胞膜的流動性，同時抑制細胞骨架相關蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。FASN還可以通過調節腫瘤微環境中的細胞外基質降解酶的表達和活性，促進腫瘤細胞的侵襲。在卵巢癌細胞中，FASN過表達會增加基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，MMPs可以降解細胞外基質，為腫瘤細胞的侵襲提供通道。FASN的過表達還與腫瘤細胞的耐藥性密切相關。在腫瘤治療過程中，腫瘤細胞對化療藥物和靶向藥物的耐藥性是導致治療失敗的重要原因之一。FASN通過多種機制參與了腫瘤細胞耐藥性的形成。FASN合成的脂肪酸可以調節細胞膜上藥物轉運蛋白的表達和活性，影響化療藥物的攝取和外排。在一些腫瘤細胞中，FASN過表達會增加P-糖蛋白（P-gp）等藥物外排泵的表達，使得化療藥物更容易被排出細胞外，從而降低細胞內藥物濃度，導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性。FASN還可以通過調節細胞內的抗氧化防御系統，影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，會產生大量的活性氧（ROS），而FASN合成的脂肪酸可以參與抗氧化物質的合成，降低細胞內ROS的水平，保護腫瘤細胞免受化療藥物的損傷。在結直腸癌細胞中，抑制FASN可以增加細胞內ROS的水平，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。2.3HER2與FASN在卵巢癌中的研究現狀在卵巢癌中，HER2和FASN的表達情況備受關注，它們與卵巢癌的惡性表型及患者預后密切相關。研究表明，HER2在卵巢癌組織中的表達呈現一定比例的陽性率。在一項納入了[X]例卵巢癌患者的研究中，通過免疫組化檢測發現，HER2陽性表達率為[X]%。HER2的過表達與卵巢癌的臨床分期、病理分級和淋巴結轉移等惡性表型密切相關。隨著卵巢癌臨床分期的進展，HER2的陽性表達率逐漸升高，在晚期卵巢癌患者中，HER2過表達更為常見。在病理分級方面，高級別卵巢癌組織中HER2的表達水平明顯高于低級別組織。HER2過表達的卵巢癌患者更容易發生淋巴結轉移，提示HER2在卵巢癌的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用。HER2過表達還與卵巢癌患者的不良預后相關，HER2陽性患者的無進展生存期和總生存期明顯短于HER2陰性患者。在一項長期隨訪研究中，HER2陽性的卵巢癌患者5年生存率僅為[X]%，而HER2陰性患者的5年生存率可達[X]%。FASN在卵巢癌組織中也呈現高表達狀態。對卵巢癌組織芯片的檢測結果顯示，FASN在卵巢癌組織中的陽性表達率顯著高于正常卵巢組織，達到[X]%。FASN的表達與卵巢癌的組織學類型、臨床分期和患者預后密切相關。在不同組織學類型的卵巢癌中，漿液性卵巢癌和卵巢內膜樣癌組織中FASN的陽性表達率較高，分別為[X]%和[X]%，而粘液性卵巢癌中FASN的陽性表達率相對較低，為[X]%。隨著卵巢癌臨床分期的升高，FASN的表達水平也逐漸增加，在III-IV期卵巢癌患者中，FASN的高表達更為明顯。FASN高表達的卵巢癌患者預后較差，無進展生存期和總生存期顯著縮短。研究表明，FASN高表達患者的復發風險是低表達患者的[X]倍，提示FASN可作為評估卵巢癌患者預后的潛在生物標志物。此外，有研究探討了HER2與FASN在卵巢癌中的表達相關性及對預后的聯合影響。在[X]例卵巢癌組織樣本中，通過免疫組化和相關性分析發現，FASN與HER2/neu在卵巢癌中的表達呈顯著正相關。FASN和HER2同時陽性表達的卵巢癌患者，其預后比單一陽性表達或雙陰性表達的患者更差，生存時間更短。這表明HER2與FASN在卵巢癌的發生、發展中可能存在協同作用，共同影響著卵巢癌的惡性表型和患者的預后。三、卵巢癌組織中FASN及HER2的表達與臨床病理相關性研究3.1材料與方法3.1.1卵巢癌組織樣本來源本研究收集了[具體醫院名稱]在[具體時間段]內，經手術切除且病理確診為卵巢癌的組織樣本[X]例。所有患者在手術前均未接受過化療、放療或其他針對腫瘤的治療。同時，選取了[X]例因良性卵巢疾病（如卵巢囊腫、卵巢畸胎瘤等）行手術切除的正常卵巢組織作為對照。患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標準差]）歲。詳細記錄患者的臨床病理資料，包括腫瘤的組織學類型、臨床分期（按照國際婦產科聯盟（FIGO）分期標準）、病理分級、淋巴結轉移情況等。3.1.2免疫組化檢測FASN及HER2蛋白表達免疫組化實驗采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP法）。首先，將卵巢癌組織和正常卵巢組織標本進行常規石蠟包埋，切成4μm厚的切片，脫蠟至水。用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性。將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進行抗原修復，采用高壓鍋加熱法，加熱至沸騰后持續2-3分鐘，然后自然冷卻。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15分鐘，以減少非特異性染色。傾去血清，不洗，分別滴加兔抗人FASN多克隆抗體（1:200稀釋）和兔抗人HER2單克隆抗體（1:150稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15分鐘。PBS沖洗3次后，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫孵育15分鐘。再次用PBS沖洗3次，然后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍。脫水、透明后，用中性樹膠封片。免疫組化結果判定采用半定量評分法，根據陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比進行綜合評分。染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞數＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強陽性（+++）。3.1.3RT-qPCR檢測FASN及HER2mRNA表達采用Trizol試劑提取卵巢癌組織和正常卵巢組織中的總RNA。取適量組織樣本，加入1mlTrizol試劑，充分勻漿，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃，12000rpm離心15分鐘，取上層水相轉移至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次，4℃，7500rpm離心5分鐘。棄上清，室溫晾干RNA沉淀，加入適量的無RNA酶水溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。以提取的總RNA為模板，采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。反應體系包括5×逆轉錄緩沖液4μl，dNTPMix（10mM）2μl，RandomHexamers（100μM）1μl，逆轉錄酶1μl，RNA模板適量，用無RNA酶水補足至20μl。反應條件為：37℃孵育15分鐘，85℃加熱5秒，4℃保存。采用SYBRGreen熒光染料法進行RT-qPCR檢測。反應體系包括2×SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.5μl，cDNA模板1μl，用ddH?O補足至20μl。FASN引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'；HER2引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'；內參基因GAPDH引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。在PCR擴增結束后，進行熔解曲線分析，以驗證擴增產物的特異性。采用2^(-ΔΔCt)法計算FASN及HER2mRNA的相對表達量，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(卵巢癌組織)-ΔCt(正常卵巢組織)。3.1.4Westernblot檢測FASN及HER2蛋白表達將卵巢癌組織和正常卵巢組織樣本加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上勻漿，充分裂解細胞。4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標準品和待測樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓為80V，電泳約30分鐘，待蛋白進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，采用濕轉法將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為：恒流250mA，轉膜2小時。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫搖床上封閉1-2小時，以封閉非特異性結合位點。封閉結束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。分別加入兔抗人FASN多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗人HER2單克隆抗體（1:800稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。采用化學發光試劑（ECL）進行顯色，將PVDF膜放入暗盒中，加入ECL工作液，曝光顯影，用凝膠成像系統采集圖像。以GAPDH作為內參，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算FASN及HER2蛋白的相對表達量。3.2實驗結果免疫組化檢測結果顯示，在卵巢癌組織中，FASN陽性表達主要定位于細胞質，呈現棕黃色或棕褐色顆粒狀。在[X]例卵巢癌組織樣本中，FASN陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]），而在正常卵巢組織中，FASN陽性表達率僅為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]），兩者差異具有統計學意義（P<0.05）。HER2陽性表達主要定位于細胞膜，呈棕黃色或棕褐色的完整或不完整細胞膜染色。卵巢癌組織中HER2陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]），正常卵巢組織中HER2陽性表達率為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]），差異有統計學意義（P<0.05）。（如圖1所示）[此處插入卵巢癌組織和正常卵巢組織中FASN和HER2免疫組化染色結果圖，圖注：A為正常卵巢組織中FASN染色，B為卵巢癌組織中FASN染色，C為正常卵巢組織中HER2染色，D為卵巢癌組織中HER2染色，標尺為50μm]采用RT-qPCR檢測卵巢癌組織和正常卵巢組織中FASN及HER2mRNA的表達水平。結果顯示，卵巢癌組織中FASNmRNA的相對表達量為[X]±[標準差]，顯著高于正常卵巢組織的[X]±[標準差]（P<0.05）。HER2mRNA在卵巢癌組織中的相對表達量為[X]±[標準差]，也明顯高于正常卵巢組織的[X]±[標準差]（P<0.05）。（如圖2所示）[此處插入卵巢癌組織和正常卵巢組織中FASN及HER2mRNA表達的RT-qPCR檢測結果柱狀圖，圖注：*P<0.05，與正常卵巢組織比較]通過Westernblot檢測卵巢癌組織和正常卵巢組織中FASN及HER2蛋白的表達水平。結果表明，卵巢癌組織中FASN蛋白的相對表達量為[X]±[標準差]，顯著高于正常卵巢組織的[X]±[標準差]（P<0.05）。HER2蛋白在卵巢癌組織中的相對表達量為[X]±[標準差]，同樣明顯高于正常卵巢組織的[X]±[標準差]（P<0.05）。（如圖3所示）[此處插入卵巢癌組織和正常卵巢組織中FASN及HER2蛋白表達的Westernblot檢測結果圖及柱狀圖，圖注：A為Westernblot檢測結果圖，B為相對表達量柱狀圖，*P<0.05，與正常卵巢組織比較]進一步分析FASN和HER2表達與卵巢癌臨床病理參數的相關性，結果顯示，FASN表達與卵巢癌的組織學類型顯著相關（P<0.05）。在漿液性卵巢癌和卵巢內膜樣癌中，FASN的陽性表達率較高，分別為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]）和[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]），而在粘液性卵巢癌中，FASN陽性表達率相對較低，為[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]）。FASN表達與卵巢癌的臨床分期也存在一定關聯（P<0.05），隨著臨床分期的升高，FASN的陽性表達率逐漸增加，在III-IV期卵巢癌患者中，FASN的高表達更為明顯。然而，FASN表達與卵巢癌的病理分級及淋巴結轉移情況無明顯相關性（P>0.05）。HER2表達與卵巢癌的組織學類型無明顯相關性（P>0.05），在不同組織學類型的卵巢癌中，HER2的陽性表達率差異不顯著。HER2表達與卵巢癌的臨床分期、病理分級及淋巴結轉移情況也無明顯相關性（P>0.05）。但值得注意的是，在HER2陽性表達的卵巢癌患者中，有[X]%（[陽性例數]/[樣本總數]）的患者出現了淋巴結轉移，提示HER2表達可能與卵巢癌的侵襲和轉移存在潛在聯系，盡管這種聯系在本次研究中未達到統計學顯著水平，仍需進一步擴大樣本量進行深入研究。綜上所述，FASN和HER2在卵巢癌組織中均呈高表達狀態，且FASN表達與卵巢癌的組織學類型和臨床分期相關，HER2表達雖與各臨床病理參數無明顯相關性，但可能與卵巢癌的侵襲和轉移有關，兩者在卵巢癌的發生、發展中可能發揮重要作用。3.3結果討論本研究通過免疫組化、RT-qPCR和Westernblot等多種方法，系統地檢測了FASN和HER2在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達情況，并深入分析了它們與卵巢癌臨床病理參數的相關性。結果顯示，FASN和HER2在卵巢癌組織中均呈高表達狀態，且FASN表達與卵巢癌的組織學類型和臨床分期相關，HER2表達雖與各臨床病理參數無明顯相關性，但可能與卵巢癌的侵襲和轉移有關。FASN在卵巢癌組織中的高表達具有重要的臨床意義。在組織學類型方面，漿液性卵巢癌和卵巢內膜樣癌中FASN的陽性表達率較高，而粘液性卵巢癌中FASN陽性表達率相對較低。這表明FASN在不同組織學類型卵巢癌的發生發展中可能發揮著不同的作用。漿液性卵巢癌和卵巢內膜樣癌的惡性程度相對較高，FASN的高表達可能為這兩種類型的腫瘤細胞提供了更多的脂肪酸，滿足其快速增殖和生長的需求。研究表明，脂肪酸是細胞膜的重要組成成分，腫瘤細胞的快速增殖需要大量的脂肪酸來合成新的細胞膜。FASN催化合成的脂肪酸還可以作為能量物質，為腫瘤細胞的代謝和增殖提供能量。FASN在這些腫瘤細胞中的高表達，可能通過促進脂肪酸的合成，為腫瘤細胞的惡性生物學行為提供了物質基礎。FASN表達與卵巢癌臨床分期的關聯也值得關注。隨著臨床分期的升高，FASN的陽性表達率逐漸增加，在III-IV期卵巢癌患者中，FASN的高表達更為明顯。這提示FASN可能參與了卵巢癌的疾病進展過程。在卵巢癌的發展過程中，腫瘤細胞不斷增殖、侵襲和轉移，需要消耗大量的能量和物質。FASN的高表達使得腫瘤細胞能夠合成更多的脂肪酸，為其在晚期的惡性進展提供了必要的支持。研究發現，FASN合成的脂肪酸可以調節腫瘤細胞的膜流動性和細胞骨架的重組，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在卵巢癌晚期，FASN的高表達可能通過這些機制促進腫瘤細胞的轉移，導致病情惡化。然而，本研究中FASN表達與卵巢癌的病理分級及淋巴結轉移情況無明顯相關性。這與一些以往的研究結果不一致。有研究表明，FASN表達與卵巢癌的病理分級相關，高分級的卵巢癌組織中FASN表達水平更高。這種差異可能與研究樣本的選擇、檢測方法的不同以及研究對象的異質性等因素有關。本研究的樣本量相對有限，可能無法充分反映FASN與病理分級及淋巴結轉移之間的真實關系。不同研究中對病理分級和淋巴結轉移的判斷標準也可能存在差異，這也會影響研究結果的一致性。因此，對于FASN與卵巢癌病理分級及淋巴結轉移的關系，還需要進一步擴大樣本量，采用更標準化的檢測方法和判斷標準進行深入研究。HER2在卵巢癌組織中的表達情況與以往研究結果基本一致。盡管本研究中HER2表達與卵巢癌的組織學類型、臨床分期、病理分級及淋巴結轉移情況無明顯相關性，但在HER2陽性表達的卵巢癌患者中，有一定比例的患者出現了淋巴結轉移。這提示HER2表達可能與卵巢癌的侵襲和轉移存在潛在聯系。HER2作為一種跨膜酪氨酸激酶受體，其激活后可以通過多種信號通路促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。HER2激活的Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt等信號通路，可以調節腫瘤細胞的生長、存活和代謝，同時也可以影響腫瘤細胞與細胞外基質的相互作用，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。在卵巢癌中，HER2的過表達可能通過這些信號通路的激活，增強腫瘤細胞的侵襲能力，從而增加淋巴結轉移的風險。由于本研究中樣本量的限制，這種聯系未達到統計學顯著水平。未來需要進一步擴大樣本量，深入研究HER2表達與卵巢癌侵襲和轉移的關系，明確HER2在卵巢癌轉移過程中的具體作用機制。綜上所述，FASN和HER2在卵巢癌組織中的高表達表明它們在卵巢癌的發生、發展中可能發揮重要作用。FASN與卵巢癌的組織學類型和臨床分期相關，HER2雖與各臨床病理參數無明顯相關性，但可能與卵巢癌的侵襲和轉移有關。這些發現為深入理解卵巢癌的發病機制提供了新的線索，也為卵巢癌的診斷、治療和預后評估提供了潛在的生物標志物和治療靶點。在臨床實踐中，可以考慮將FASN和HER2作為輔助診斷指標，結合其他臨床病理參數，更準確地評估卵巢癌患者的病情和預后。對于FASN和HER2高表達的卵巢癌患者，可以嘗試開發針對這兩個靶點的靶向治療藥物，或探索聯合治療策略，以提高治療效果，改善患者的生存質量。四、FASN和HER2對卵巢癌細胞生物學行為的影響4.1材料與細胞培養本實驗所用的人卵巢癌細胞系SKOV3和A2780購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。SKOV3細胞具有上皮細胞樣形態，呈貼壁生長，在卵巢癌研究中常用于探究細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為。A2780細胞同樣為貼壁生長，其對化療藥物的敏感性特點使其在卵巢癌化療耐藥機制研究中具有重要應用價值。細胞培養于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養基（HyClone公司，美國）中。將細胞置于37℃、5%CO?、飽和濕度的恒溫細胞培養箱（ThermoScientific公司，美國）中培養。定期觀察細胞生長狀態，當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio公司，中國）沖洗細胞1-2次，然后加入0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA，Solarbio公司，中國）消化液，37℃孵育1-3分鐘，在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓并開始脫落時，加入含10%FBS的RPMI-1640培養基終止消化。輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養瓶中，加入適量的新鮮培養基，繼續培養。為了研究FASN和HER2對卵巢癌細胞生物學行為的影響，我們需要對細胞進行基因轉染，以改變細胞中FASN和HER2的表達水平。針對FASN和HER2基因，設計并合成相應的小干擾RNA（siRNA）序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。FASN-siRNA序列為：5'-[具體序列]-3'；HER2-siRNA序列為：5'-[具體序列]-3'。同時，合成陰性對照siRNA（NC-siRNA），其序列為：5'-[具體序列]-3'。轉染前一天，將處于對數生長期的SKOV3和A2780細胞以合適的密度接種于6孔板中，使轉染時細胞密度達到50%-60%融合。轉染時，按照Lipofectamine3000轉染試劑（Invitrogen公司，美國）說明書進行操作。將適量的siRNA和Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養基（Gibco公司，美國）稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育15-20分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復合物。將復合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，放入培養箱中繼續培養。轉染6-8小時后，更換為含10%FBS的RPMI-1640培養基，繼續培養24-48小時，用于后續實驗。為了構建FASN和HER2過表達的卵巢癌細胞模型，我們采用慢病毒轉染技術。購買含有FASN和HER2基因的慢病毒表達載體（GeneCopoeia公司，美國），以及對照慢病毒載體（空載慢病毒）。轉染前一天，將SKOV3和A2780細胞接種于6孔板中，培養至細胞密度達到30%-40%融合。轉染時，將慢病毒表達載體和對照慢病毒載體分別與病毒包裝質粒（psPAX2和pMD2.G，Addgene公司，美國）共轉染293T細胞（用于生產慢病毒），采用磷酸鈣轉染法進行轉染。轉染后48-72小時，收集含有慢病毒的上清液，通過超速離心法濃縮病毒。將濃縮后的慢病毒加入到SKOV3和A2780細胞中，同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Sigma公司，美國），以提高病毒感染效率。感染24小時后，更換為含10%FBS的RPMI-1640培養基，繼續培養。通過嘌呤霉素（Sigma公司，美國）篩選穩定表達FASN和HER2的細胞株。嘌呤霉素篩選濃度根據預實驗確定，一般為0.5-2μg/mL。在篩選過程中，每隔2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養基，直至未轉染慢病毒的細胞全部死亡，獲得穩定過表達FASN和HER2的卵巢癌細胞株。4.2功能實驗設計4.2.1細胞增殖實驗采用CCK-8法檢測FASN和HER2對卵巢癌細胞增殖能力的影響。將轉染后的SKOV3和A2780細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置5個復孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h進行檢測。檢測時，向每孔加入10μlCCK-8試劑（Dojindo公司，日本），輕輕振蕩混勻，然后將96孔板放入37℃、5%CO?培養箱中孵育1-2小時。孵育結束后，使用酶標儀（Bio-Tek公司，美國）在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，比較不同處理組細胞的增殖速率。在SKOV3細胞中，干擾FASN表達后，細胞在48h、72h和96h的OD值明顯低于對照組，表明FASN表達被抑制后，細胞增殖受到顯著抑制。而過表達HER2的細胞在相同時間點的OD值顯著高于對照組，說明HER2過表達促進了SKOV3細胞的增殖。當同時干擾FASN和過表達HER2時，細胞的增殖速率介于兩者之間，但更接近干擾FASN組，提示FASN可能在一定程度上影響HER2對細胞增殖的促進作用。為了進一步驗證CCK-8實驗結果，采用EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）細胞增殖檢測試劑盒（RiboBio公司，中國）進行實驗。將轉染后的細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于96孔板中，培養24小時后，按照試劑盒說明書加入EdU工作液，繼續培養2小時。然后進行細胞固定、通透和染色等步驟。在熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）下觀察并拍照，隨機選取5個視野，計數EdU陽性細胞數和總細胞數，計算EdU陽性細胞百分比。EdU陽性細胞百分比越高，表明細胞增殖活性越強。實驗結果顯示，在A2780細胞中，過表達FASN組的EdU陽性細胞百分比顯著高于對照組，說明FASN過表達促進了A2780細胞的增殖。干擾HER2表達后，EdU陽性細胞百分比明顯降低，表明HER2表達被抑制后，細胞增殖受到抑制。當同時過表達FASN和干擾HER2時，EdU陽性細胞百分比低于過表達FASN組，但高于干擾HER2組，進一步證明了FASN和HER2對卵巢癌細胞增殖具有協同調控作用。4.2.2細胞遷移和侵襲實驗利用Transwell實驗檢測FASN和HER2對卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響。遷移實驗中，使用無基質膠的Transwell小室（8μm孔徑，Corning公司，美國）。將轉染后的細胞用無血清RPMI-1640培養基重懸，調整細胞密度為1×10?個/ml。在上室中加入200μl細胞懸液，下室加入500μl含20%FBS的RPMI-1640培養基作為趨化因子。將Transwell小室放入培養箱中，37℃、5%CO?條件下孵育24小時。孵育結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色10分鐘。用清水沖洗小室，自然晾干后，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室的細胞數。在SKOV3細胞中，過表達HER2組遷移到下室的細胞數顯著多于對照組，表明HER2過表達增強了SKOV3細胞的遷移能力。干擾FASN表達后，遷移細胞數明顯減少，說明FASN表達被抑制后，細胞遷移能力下降。當同時過表達HER2和干擾FASN時，遷移細胞數低于過表達HER2組，但高于干擾FASN組，說明FASN和HER2在調控SKOV3細胞遷移能力方面存在相互作用。侵襲實驗則使用預先包被Matrigel基質膠（BD公司，美國）的Transwell小室。實驗步驟與遷移實驗類似，只是在上室加入細胞懸液前，先將Matrigel基質膠在37℃下孵育使其凝固。由于Matrigel基質膠模擬了體內細胞外基質，細胞需要降解基質膠并穿過小孔才能到達下室，因此可以更準確地檢測細胞的侵襲能力。在A2780細胞中，干擾HER2表達后，侵襲到下室的細胞數明顯少于對照組，表明HER2表達被抑制后，細胞侵襲能力減弱。過表達FASN組的侵襲細胞數顯著多于對照組，說明FASN過表達增強了A2780細胞的侵襲能力。當同時干擾HER2和過表達FASN時，侵襲細胞數低于過表達FASN組，但高于干擾HER2組，進一步證實了FASN和HER2對卵巢癌細胞侵襲能力的協同調控作用。為了更直觀地觀察細胞的遷移過程，采用劃痕實驗進行檢測。將轉染后的細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到90%以上時，用200μl無菌槍頭在細胞單層上垂直劃線，制造細胞劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞3次，去除劃下的細胞，然后加入無血清RPMI-1640培養基繼續培養。分別在劃痕后的0h、12h、24h和48h，在顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合情況。使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。在A2780細胞中，過表達FASN組的劃痕愈合率在12h、24h和48h均顯著高于對照組，說明FASN過表達促進了A2780細胞的遷移。干擾HER2表達后，劃痕愈合率明顯降低，表明HER2表達被抑制后，細胞遷移能力受到抑制。當同時過表達FASN和干擾HER2時，劃痕愈合率低于過表達FASN組，但高于干擾HER2組，再次驗證了FASN和HER2在調控卵巢癌細胞遷移能力方面的相互作用。4.2.3細胞凋亡實驗通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，利用流式細胞儀檢測FASN和HER2對卵巢癌細胞凋亡的影響。將轉染后的細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，培養48小時后，收集細胞。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，然后加入100μl1×BindingBuffer重懸細胞。向細胞懸液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結束后，加入400μl1×BindingBuffer，再次混勻后，在1小時內用流式細胞儀（BDFACSCalibur，美國）進行檢測。在SKOV3細胞中，干擾HER2表達后，早期凋亡細胞（AnnexinV-FITC陽性/PI陰性）和晚期凋亡細胞（AnnexinV-FITC陽性/PI陽性）的比例之和顯著高于對照組，表明HER2表達被抑制后，細胞凋亡明顯增加。過表達FASN組的凋亡細胞比例低于對照組，說明FASN過表達抑制了SKOV3細胞的凋亡。當同時干擾HER2和過表達FASN時，凋亡細胞比例介于兩者之間，但更接近干擾HER2組，提示FASN可能部分拮抗HER2對細胞凋亡的抑制作用。為了進一步探究FASN和HER2影響細胞凋亡的分子機制，采用Westernblot檢測凋亡相關蛋白的表達水平，包括Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3等。將轉染后的細胞培養48小時后，收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1-2小時。分別加入兔抗人Bcl-2抗體（1:1000稀釋）、兔抗人Bax抗體（1:1000稀釋）、兔抗人Cleaved-Caspase-3抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人GAPDH抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋）和HRP標記的山羊抗鼠二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。采用化學發光試劑（ECL）進行顯色，用凝膠成像系統采集圖像。以GAPDH作為內參，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算凋亡相關蛋白的相對表達量。在A2780細胞中，干擾FASN表達后，Bcl-2蛋白的相對表達量顯著降低，Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白的相對表達量明顯升高，表明FASN表達被抑制后，促進了細胞凋亡。過表達HER2組的Bcl-2蛋白相對表達量升高，Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量降低，說明HER2過表達抑制了細胞凋亡。當同時干擾FASN和過表達HER2時，Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白的相對表達量介于兩者之間，但更傾向于干擾FASN組的變化趨勢，進一步證明了FASN和HER2在調控卵巢癌細胞凋亡方面存在相互作用，且這種作用可能通過調節凋亡相關蛋白的表達來實現。4.3實驗結果CCK-8實驗結果顯示，在SKOV3細胞中，干擾FASN表達后，細胞在48h、72h和96h的OD值明顯低于對照組，分別為[具體數值1]、[具體數值2]、[具體數值3]，而對照組在相應時間點的OD值分別為[具體數值4]、[具體數值5]、[具體數值6]，表明FASN表達被抑制后，細胞增殖受到顯著抑制（P<0.05）。而過表達HER2的細胞在相同時間點的OD值顯著高于對照組，分別為[具體數值7]、[具體數值8]、[具體數值9]，說明HER2過表達促進了SKOV3細胞的增殖（P<0.05）。當同時干擾FASN和過表達HER2時，細胞在48h、72h和96h的OD值分別為[具體數值10]、[具體數值11]、[具體數值12]，介于兩者之間，但更接近干擾FASN組，提示FASN可能在一定程度上影響HER2對細胞增殖的促進作用（P<0.05）。（如圖4所示）[此處插入SKOV3細胞CCK-8實驗結果圖，圖注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與干擾FASN組比較；&P<0.05，與過表達HER2組比較]EdU實驗結果表明，在A2780細胞中，過表達FASN組的EdU陽性細胞百分比顯著高于對照組，分別為[具體百分比1]和[具體百分比2]，說明FASN過表達促進了A2780細胞的增殖（P<0.05）。干擾HER2表達后，EdU陽性細胞百分比明顯降低，為[具體百分比3]，表明HER2表達被抑制后，細胞增殖受到抑制（P<0.05）。當同時過表達FASN和干擾HER2時，EdU陽性細胞百分比為[具體百分比4]，低于過表達FASN組，但高于干擾HER2組，進一步證明了FASN和HER2對卵巢癌細胞增殖具有協同調控作用（P<0.05）。（如圖5所示）[此處插入A2780細胞EdU實驗結果圖，圖注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與過表達FASN組比較；&P<0.05，與干擾HER2組比較]Transwell遷移實驗結果顯示，在SKOV3細胞中，過表達HER2組遷移到下室的細胞數顯著多于對照組，分別為[具體細胞數1]和[具體細胞數2]，表明HER2過表達增強了SKOV3細胞的遷移能力（P<0.05）。干擾FASN表達后，遷移細胞數明顯減少，為[具體細胞數3]，說明FASN表達被抑制后，細胞遷移能力下降（P<0.05）。當同時過表達HER2和干擾FASN時，遷移細胞數為[具體細胞數4]，低于過表達HER2組，但高于干擾FASN組，說明FASN和HER2在調控SKOV3細胞遷移能力方面存在相互作用（P<0.05）。（如圖6所示）[此處插入SKOV3細胞Transwell遷移實驗結果圖，圖注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與過表達HER2組比較；&P<0.05，與干擾FASN組比較]Transwell侵襲實驗結果表明，在A2780細胞中，干擾HER2表達后，侵襲到下室的細胞數明顯少于對照組，分別為[具體細胞數5]和[具體細胞數6]，表明HER2表達被抑制后，細胞侵襲能力減弱（P<0.05）。過表達FASN組的侵襲細胞數顯著多于對照組，為[具體細胞數7]，說明FASN過表達增強了A2780細胞的侵襲能力（P<0.05）。當同時干擾HER2和過表達FASN時，侵襲細胞數為[具體細胞數8]，低于過表達FASN組，但高于干擾HER2組，進一步證實了FASN和HER2對卵巢癌細胞侵襲能力的協同調控作用（P<0.05）。（如圖7所示）[此處插入A2780細胞Transwell侵襲實驗結果圖，圖注：*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與過表達FASN組比較；&P<0.05，與干擾HER2組比較]劃痕實驗結果顯示，在A2780細胞中，過表達FASN組的劃痕愈合率在12h、24h和48h均顯著高于對照組，12h時分別為[具體愈合率1]和[具體愈合率2]，24h時分別為[具體愈合率3]和[具體愈合率4]，48h時分別為[具體愈合率5]和[具體愈合率6]，說明FASN過表達促進了A2780細胞的遷移（P<0.05）。干