DB13DB13/T2051—2014幼羔體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程2014-07-07發(fā)布2014-07-31實施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I12規(guī)范性引用文件4供體選擇要求健康、體況發(fā)育良好、系譜資料完整清楚、出生4～10周齡的5誘導(dǎo)卵泡發(fā)育5.1所使用的生殖激素5.2誘導(dǎo)卵泡發(fā)育方法2間隔12h對供體連續(xù)4次進行等劑量肌肉注射采卵室及檢卵室適宜溫度為20℃~25℃。），），），），含0.9%NaCl的生理鹽水，含有0.96萬IU青霉素/mL和0.2萬IU/mL鏈霉素的生理鹽水，速眠新及蘇醒采卵液配方：9.5g/LTCM199+5mmol/LNaHCO3+10mmol/LHEPES+10mmol/LHEPES-Na+0.665g/L為0.015mL～0.022mL/kg體重；波爾山羊等肉用山羊為0.020mL～0.030mL/kg體重；奶山羊、絨山羊為0.023mL～0.033mL/kg體重；小尾寒羊為3短，再用溫肥皂水浸濕，然后用剃須刀將毛剃凈術(shù)部用5%碘酊棉球涂擦，待其干燥后，用75%酒精棉球脫碘。然后用有孔創(chuàng)巾覆蓋于術(shù)部區(qū)域，用蘇醒靈，劑量為速眠新用量的1～2倍。肌注青在3.5cm（Nunc）培養(yǎng)皿上標記組別、日期等，做100μL的培養(yǎng)滴，覆蓋礦物油。另取一只1.5mLE2+1mmol/LL-谷氨酰胺+20ng/mLEGF+2提前打開恒溫臺調(diào)至38.5℃并用75%酒精消毒，分別取3cm、9cm塑料平皿（國產(chǎn)）各4個、5個，將取經(jīng)過預(yù)平衡的成熟液在培養(yǎng)皿中做液滴4～5個，每個液滴的體積為100μL，依次和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱中，成熟培養(yǎng)24h。8體外受精4在3.5cm（Nunc）培養(yǎng)皿上標記組別、日期等，做30μL的受精滴，覆蓋石蠟油。另取一只1.5mL離心管，吸取1mL的受精液放入離心管中，做好標記，用于洗滌精子，必要時調(diào)整精子密度。取1個4心管，裝2mL的SOF液，用于精子上浮。取1個200μL的離心管裝100μL的0.1%透明質(zhì)酸酶，將平其中SOF液配方：10%StockA（v/v）+5.262mmol/LNaHCO3+2CaCl22O+8%StockE(v/v)+2%發(fā)情羊血清（），8min。棄上清，用受精液調(diào)整精子密度為1.將脫除卵丘顆粒細胞的卵丘卵母細胞復(fù)合體在受精液中洗3～4遍后，放入受精液微滴中，每滴159體外胚胎發(fā)育培養(yǎng)9.1胚胎發(fā)育液預(yù)平衡另取一只1.5mL離心管，吸取1mL的發(fā)育培養(yǎng)I液放入離心管中，做好標記。將平皿和離心管（開蓋）放發(fā)育培養(yǎng)Ⅰ液：SOF液+1%EAA+1%NEAA+10ng/mLEGF+1發(fā)育培養(yǎng)II液：I液+10%FBS（v/發(fā)育培養(yǎng)III液：I液+10%FBS（v/v）+1%9.2脫除精子及卵丘顆粒細胞5的混合氣(5%CO2，5%O2，90%N2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。9.3更換發(fā)育液料袋中，袋內(nèi)置入濕棉球并充入混合氣(5%CO2，5%O2，90%N2)，放入38.5℃、飽和濕度的5%CO26NaClKH2PO4MgSO4-7H2ONaHCO3水水CaCl2-2H2O水HEPES-Na水7水水