重組新城疫病毒（NDV）抗卵巢癌的試驗與機制探究一、引言1.1研究背景1.1.1卵巢癌現狀卵巢癌是女性生殖系統中極為常見且危害嚴重的惡性腫瘤。據統計，全球范圍內卵巢癌的發病率呈上升趨勢，在女性常見惡性腫瘤中占比約2%-6%，其發病率在女性生殖系統惡性腫瘤中僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，位居第三，然而其死亡率卻居首位。卵巢癌起病隱匿，早期通常沒有明顯癥狀，多數患者確診時已處于晚期。隨著病情的進展，卵巢癌會向周圍組織浸潤或壓迫，從而引發腹痛、腰痛或下肢疼痛，還可能導致消瘦、貧血等惡病質改變。若發生轉移，轉移至肺部可出現呼吸困難、咳嗽咳痰；轉移至肝臟則會出現惡心嘔吐、黃疸、肝脾腫大及腹水等癥狀，嚴重威脅患者的生命健康。目前，卵巢癌的主要治療手段包括手術切除、化療、放療和靶向化療等。手術切除雖然是重要的治療方式，但局限性明顯，對于一些晚期患者，手術難以徹底清除癌細胞，且手術創傷大，術后恢復慢，還可能引發多種并發癥。化療在卵巢癌治療中應用廣泛，然而化療藥物在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致患者出現脫發、惡心、嘔吐、免疫力下降等嚴重副作用。更為棘手的是，化療耐藥問題日益突出，許多患者在經過一段時間的化療后，癌細胞會對化療藥物產生耐藥性，使得化療效果大打折扣，病情復發和進展的風險增加。放療同樣存在對正常組織的輻射損傷以及治療效果有限等問題。這些現有治療手段的局限，使得尋找新的、更有效的卵巢癌治療方法成為醫學領域亟待解決的重要課題。1.1.2NDV的抗腫瘤潛力新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV），又稱鳥新城病毒，作為一種在癌癥治療領域嶄露頭角的溶瘤病毒，近年來受到了廣泛關注。它屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬，是一種單股負鏈RNA病毒。NDV具有獨特的生物學特性，在正常細胞中，其復制受到嚴格限制，而在腫瘤細胞中卻能夠高效復制并發揮溶瘤作用，這種對腫瘤細胞的特異性殺傷能力，使其成為癌癥治療的理想候選藥物。在過去的研究中，NDV在多種癌癥治療中展現出了令人矚目的潛力。例如，在乳腺癌的研究中，NDV能夠抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，并激活機體的抗腫瘤免疫反應，從而有效抑制腫瘤的生長和轉移。在肺癌治療方面，NDV不僅可以直接殺傷肺癌細胞，還能夠調節腫瘤微環境，增強機體對腫瘤的免疫監視和清除能力。這些研究成果為NDV在癌癥治療中的應用奠定了堅實的基礎。在卵巢癌治療研究領域，NDV同樣具有重要地位。相關研究表明，NDV可以通過多種途徑發揮抗卵巢癌作用。一方面，NDV能夠直接感染卵巢癌細胞，在細胞內大量復制，導致癌細胞裂解死亡。另一方面，NDV可以激發機體的免疫反應，激活自然殺傷細胞、細胞毒性T淋巴細胞等免疫細胞，使其對卵巢癌細胞產生特異性殺傷作用。此外，NDV還能夠調節腫瘤微環境，抑制腫瘤血管生成，從而限制腫瘤的生長和擴散。已有研究報道，NDV-D90可以誘導卵巢癌細胞凋亡，對于化療耐藥的卵巢癌細胞的凋亡也具有一定的影響，并且NDV-D90與某些藥物（如紫杉醇）聯合應用，能夠顯著抑制卵巢癌細胞的生長和增殖。這些研究成果為NDV用于卵巢癌治療提供了有力的證據，也使得NDV成為卵巢癌治療研究的熱點之一。然而，目前關于NDV抗卵巢癌的具體機制尚未完全明確，其在臨床應用中的最佳方案也有待進一步探索和優化。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究新城疫病毒（NDV）抗卵巢癌的效果、作用機制以及安全性，為卵巢癌的治療提供新的策略和理論依據。在基礎研究方面，盡管已有研究表明NDV具有抗卵巢癌的作用，但其具體的分子機制仍未完全明晰。本研究將通過細胞實驗和動物實驗，系統地研究NDV對卵巢癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，以及在體內對腫瘤生長和轉移的抑制作用，進一步明確NDV抗卵巢癌的作用靶點和信號通路，填補該領域在基礎研究方面的部分空白。例如，通過蛋白質免疫印跡技術（Westernblot）檢測相關蛋白的表達水平，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析基因的表達變化，從分子層面揭示NDV抗卵巢癌的作用機制，為后續的研究提供更深入的理論基礎。在臨床應用方面，目前卵巢癌的治療面臨著諸多挑戰，如化療耐藥、副作用嚴重等問題。本研究期望通過對NDV抗卵巢癌的研究，為卵巢癌的臨床治療提供新的選擇。一方面，探索NDV單獨使用或與其他治療方法（如化療、放療、靶向治療等）聯合應用的最佳方案，提高治療效果，降低副作用。例如，研究NDV與化療藥物聯合使用時，是否能夠增強化療藥物對卵巢癌細胞的殺傷作用，同時減輕化療藥物對正常組織的損害。另一方面，評估NDV在臨床應用中的安全性和可行性，為其進一步轉化為臨床治療手段提供數據支持，為卵巢癌患者帶來新的希望。通過臨床試驗觀察患者在接受NDV治療后的不良反應、生存質量和生存期等指標，綜合評價NDV的臨床應用價值。綜上所述，本研究對于深入理解NDV抗卵巢癌的作用機制，推動卵巢癌治療領域的發展具有重要的科學意義和臨床應用價值。二、NDV與卵巢癌的研究基礎2.1NDV概述2.1.1NDV的生物學特性新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）在病毒分類學上隸屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），是一種單股負鏈RNA病毒。其病毒粒子呈現多形性，主要為圓形、橢圓形，也有長桿狀，成熟病毒粒子直徑在100-400納米之間。NDV的結構由核心和包膜兩部分組成，核心是由單股RNA分子及其周圍的蛋白質衣殼粒形成的螺旋對稱核衣殼，直徑約18納米；包膜則是由宿主細胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結合形成的雙層結構，包膜表面分布著長約12-15納米的刺突，這些刺突包含了血凝素、神經氨酸酶和溶血素等重要成分。NDV的基因組長度約為15kb，基因排列順序為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，分別編碼核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）、膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神經氨酸酶蛋白（HN）和大分子蛋白（L）這6種結構蛋白。在P基因轉錄過程中，會出現RNA編輯現象，從而可能產生額外的蛋白質，如V蛋白及W蛋白。其中，NP蛋白是構成核衣殼的主要成分，對病毒基因組起到保護作用；P蛋白參與病毒的轉錄和復制過程；M蛋白位于包膜內層，對RNA合成和病毒組裝發揮重要作用，它能夠介導病毒核衣殼與包膜的相互作用，促進病毒粒子的組裝和釋放；F蛋白和HN蛋白屬糖基化蛋白，位于囊膜外表面，并各自形成大、小纖突，是新城疫病毒的主要保護性抗原。F蛋白對于病毒的感染性至關重要，所有的NDV的F蛋白都會先形成無活性的前體F0，當F0裂解產生F1多肽和F2多肽后，病毒才具備感染宿主的能力，F蛋白在病毒滲透和突破細胞、引起細胞壁溶解和融合等過程中發揮主要作用。HN蛋白負責病毒體與細胞表面唾液酸脂質受體的結合，并通過其血凝素和神經氨酸酶的作用破壞受體功能，防止釋放的病毒再次吸附到細胞上，在病毒的吸附、侵入和釋放過程中發揮關鍵作用。L蛋白是RNA依賴性的RNA聚合酶，與核衣殼相連，參與病毒基因組的轉錄和復制。NDV具有廣泛的宿主范圍，可感染50個鳥目中27個目240種以上的禽類，其中雞、火雞、珍珠雞、雉雞等家禽對其較為易感，水禽對本病有一定抵抗力。此外，人類也可能通過接觸病禽或活毒疫苗而感染NDV，但通常癥狀較輕，表現為結膜炎或淋巴腺炎，且一般可自行痊愈。在感染過程中，病毒首先通過HN蛋白與宿主細胞表面的唾液酸受體結合，隨后F蛋白介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合，使病毒核酸進入宿主細胞內。病毒在細胞內利用宿主細胞的物質和能量進行復制和轉錄，合成新的病毒蛋白和核酸，最后組裝成新的病毒粒子并釋放出來，繼續感染其他細胞。2.1.2NDV的抗腫瘤特性NDV對腫瘤細胞具有特異性殺傷能力，這一特性使其在腫瘤治療領域備受關注。研究表明，NDV能夠選擇性地在腫瘤細胞中復制并發揮溶瘤作用，而在正常細胞中其復制則受到嚴格限制。這種特異性的產生機制與腫瘤細胞和正常細胞的生理狀態差異密切相關。腫瘤細胞通常具有較高的代謝活性、增殖速度快以及信號通路異常等特點，這些特征為NDV的復制提供了更為有利的條件。例如，腫瘤細胞表面的某些受體表達水平升高，使得NDV更容易與之結合并進入細胞內；腫瘤細胞內的一些信號通路的激活，能夠促進NDV基因的轉錄和翻譯，從而有利于病毒的復制和增殖。NDV發揮抗腫瘤作用的機制主要包括誘導細胞凋亡和激活免疫反應等方面。在誘導細胞凋亡方面，NDV感染腫瘤細胞后，會激活一系列細胞內的凋亡信號通路。病毒感染會導致腫瘤細胞內的線粒體功能紊亂，使線粒體膜電位下降，釋放出細胞色素C等凋亡相關因子，進而激活半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶，引發細胞凋亡的級聯反應。NDV還可以通過調節腫瘤細胞內的凋亡相關蛋白表達來誘導凋亡，如上調促凋亡蛋白Bax的表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而促使腫瘤細胞走向凋亡。在激活免疫反應方面，NDV作為一種病原體，能夠被機體的免疫系統識別為外來抗原。當NDV感染腫瘤細胞后，腫瘤細胞會釋放出一些細胞因子和趨化因子，如干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）等，這些因子能夠激活機體的免疫細胞，包括自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞、T淋巴細胞等。NK細胞可以直接殺傷被NDV感染的腫瘤細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，使腫瘤細胞發生裂解。巨噬細胞被激活后，會吞噬和清除腫瘤細胞，并分泌多種細胞因子，進一步增強免疫反應。T淋巴細胞則可以特異性地識別被NDV感染的腫瘤細胞表面的抗原，通過細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的作用殺傷腫瘤細胞。NDV還能夠調節腫瘤微環境，使其更有利于免疫細胞的浸潤和活化，增強機體對腫瘤的免疫監視和清除能力。2.2卵巢癌概述卵巢癌是一種起源于卵巢的惡性腫瘤，其組織學類型多樣，根據世界衛生組織（WHO）2014年發布的女性生殖器腫瘤組織學分類標準，主要包括上皮性腫瘤、生殖細胞腫瘤、性索-間質腫瘤以及轉移性腫瘤這四大類。上皮性腫瘤是卵巢癌中最為常見的類型，約占50%-70%。它又可進一步分為漿液性、黏液性、子宮內膜樣、透明細胞、移行細胞（Brenner瘤）和漿黏液性腫瘤等多個類別。各類別依據生物學行為可分為良性腫瘤、交界性腫瘤（不典型增生腫瘤）和癌。其中，漿液性癌是上皮性卵巢癌中最常見的亞型，其惡性程度較高，約70%的患者在就診時已處于晚期，5年生存率不足30%。上皮性卵巢癌的發生與多種因素相關，從分子遺傳學角度來看，根據臨床病理和分子遺傳學特征，卵巢上皮性癌分為一型和二型。一型生長緩慢，預后相對較好，組織學類型包括低級別的漿液性癌、透明細胞癌等，主要與基因的突變有關；二型腫瘤生長迅速，臨床上多表現為進展期，預后不良，組織學類型主要是高級別漿液腺癌和高級別子宮內膜腺癌，以P53的基因突變為主要分子醫學特征。有10%-15%的卵巢癌患者可檢測出BRCA1和BRCA2基因的胚系突變，高級別漿液性癌患者攜帶的突變更加明顯，攜帶BRCA1和BRCA2基因檢測的婦女卵巢癌的終身發病率分別為39%和46%，12%和20%。生殖細胞腫瘤來源于生殖細胞，占卵巢癌的20%-40%。常見的類型有畸胎瘤、無性細胞瘤、卵黃囊瘤、胚胎性癌、非妊娠性絨癌、混合型生殖細胞腫瘤等。該類型對化療相對敏感，預后較上皮性卵巢癌要好。性索-間質腫瘤源于卵巢的間質成分，約占所有卵巢癌的5%-8%。包括顆粒細胞瘤、支持-間質細胞腫瘤等，其惡性程度相對較低。轉移性癌是由其他器官的惡性腫瘤轉移到卵巢所致，比如乳腺、胃腸、生殖系統、泌尿系統的腫瘤，其中以胃腸道腫瘤的轉移相對多見。卵巢癌的發病機制較為復雜，目前尚未完全明確。環境因素方面，工業發達國家及上層社會婦女卵巢癌發病率高，可能與飲食中高膽固醇有關，電離輻射及石棉、滑石粉能影響卵母細胞而增加發病機會，吸煙及維生素A、C、E的缺乏也可能與發病相關。內分泌因素上，卵巢癌多發生在未產婦或未育婦，妊娠對卵巢癌似有對抗作用，每日排卵所致卵巢表面上皮反復破損可能與卵巢癌發生有關，且乳腺癌、子宮內膜癌多并發卵巢癌，這三種疾病都對雌激素有依賴性。遺傳和家族因素也起著重要作用，有BRCA1和KRAS、BRAF基因型、受林奇綜合征影響的家族史（患者有2個或更多的一級親屬患有卵巢癌）與早期發病有關，此類患者占5%的卵巢癌患者。卵巢癌早期通常沒有明顯癥狀，隨著病情進展，患者可能出現腹部不適、腹脹、腹痛、腹部腫塊、月經紊亂、消瘦、乏力等癥狀。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不易被發現，多數患者確診時已處于晚期，且卵巢癌容易發生轉移和復發。轉移途徑主要有直接蔓延、腹腔種植、淋巴轉移和血行轉移。直接蔓延可侵犯周圍組織和器官，如子宮、輸卵管、膀胱、直腸等；腹腔種植是癌細胞脫落種植在腹膜、大網膜等部位；淋巴轉移可轉移至盆腔淋巴結、腹主動脈旁淋巴結等；血行轉移可轉移至肺、肝、骨等遠處器官。復發是卵巢癌治療面臨的一大難題，即使經過手術和化療等綜合治療，仍有部分患者會出現復發，復發后的治療更加困難，預后也更差。卵巢癌的治療手段主要包括手術、化療、放療和靶向治療等。手術是卵巢癌的主要治療方法，通過切除腫瘤組織，盡可能清除癌細胞。但對于晚期患者，手術往往難以徹底清除癌細胞，且手術創傷較大，術后恢復慢，還可能引發多種并發癥。化療是卵巢癌綜合治療的重要組成部分，通過使用化療藥物殺死癌細胞。然而，化療藥物在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，導致患者出現脫發、惡心、嘔吐、免疫力下降等嚴重副作用，且化療耐藥問題日益突出，許多患者在經過一段時間的化療后，癌細胞會對化療藥物產生耐藥性，使得化療效果大打折扣。放療利用放射線殺死癌細胞，但放療同樣存在對正常組織的輻射損傷以及治療效果有限等問題。靶向治療是針對腫瘤細胞的特定靶點進行治療，具有特異性強、副作用相對較小等優點，但目前靶向藥物的種類有限，且并非所有患者都適用，部分患者還可能出現耐藥現象。卵巢癌的早期診斷困難，易轉移復發，現有治療手段存在諸多局限性，嚴重威脅著女性的生命健康。因此，尋找新的、更有效的治療方法成為卵巢癌研究領域的迫切需求。2.3NDV抗卵巢癌的研究現狀近年來，新城疫病毒（NDV）在抗卵巢癌研究領域取得了一系列重要進展。在體外實驗中，眾多研究表明NDV對卵巢癌細胞具有顯著的抑制作用。有學者通過將NDV作用于卵巢癌細胞株SKOV-3，發現癌細胞的增殖受到明顯抑制，且隨著NDV作用時間的延長和濃度的增加，抑制效果更加顯著。進一步的實驗表明，NDV能夠誘導卵巢癌細胞發生凋亡，通過激活caspase-3、caspase-9等凋亡相關蛋白，使癌細胞的凋亡率明顯升高。NDV還能夠影響卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。研究發現，經過NDV處理后的卵巢癌細胞，其遷移和侵襲相關蛋白如基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達水平下降，從而抑制了癌細胞的遷移和侵襲能力。這表明NDV不僅能夠直接殺傷卵巢癌細胞，還能夠通過抑制癌細胞的遷移和侵襲，降低其轉移的風險。在體內實驗方面，相關研究同樣取得了令人鼓舞的成果。將卵巢癌細胞接種到裸鼠體內建立荷瘤模型，然后給予NDV治療，結果顯示腫瘤的生長明顯受到抑制，腫瘤體積和重量均顯著減小。NDV還能夠抑制腫瘤的轉移，減少腫瘤在裸鼠體內的擴散。NDV在抗卵巢癌過程中還具有免疫激活作用。它能夠激活機體的免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK細胞）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等，使其對卵巢癌細胞產生特異性殺傷作用。NDV感染卵巢癌細胞后，會釋放出一些細胞因子和趨化因子，如干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）等，這些因子能夠吸引免疫細胞向腫瘤部位聚集，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。盡管NDV抗卵巢癌的研究取得了一定的成果，但目前仍存在一些不足之處和待解決的問題。一方面，NDV抗卵巢癌的具體分子機制尚未完全明確，雖然已經知道其能夠誘導細胞凋亡和激活免疫反應，但在分子層面上，其作用的靶點和信號通路仍有待進一步深入研究。另一方面，NDV在臨床應用中的安全性和有效性還需要更多的臨床試驗來驗證。如何優化NDV的治療方案，提高其治療效果，降低可能出現的不良反應，也是未來研究需要重點關注的問題。此外，NDV與其他治療方法（如化療、放療、靶向治療等）的聯合應用，雖然已經有一些研究報道，但如何實現最佳的聯合治療方案，充分發揮各種治療方法的優勢，還需要進一步的探索和研究。三、實驗設計與方法3.1實驗材料3.1.1NDV毒株本實驗選用的新城疫病毒（NDV）毒株為NDV-GT和NDV-D90。NDV-GT毒株分離自[具體來源，如某地區的患病禽類]，經過多輪雞胚接種和純化，以確保病毒的純度和活性。NDV-D90毒株則購自[購買來源，如專業的病毒保藏中心]。病毒的培養采用雞胚接種法。選取9-11日齡的SPF雞胚，在無菌條件下，將適量的病毒液經尿囊腔接種到雞胚中，然后將雞胚置于37℃恒溫培養箱中繼續孵育。接種后，每天觀察雞胚的死亡情況，及時收集死亡雞胚的尿囊液，即為含有病毒的培養液。對于未死亡的雞胚，在接種后72小時也進行收集。病毒的保存采用液氮凍存法。將收集到的病毒液加入適量的保護劑（如甘油），充分混勻后，分裝到凍存管中，迅速放入液氮罐中保存。在需要使用病毒時，從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中解凍，待病毒液完全融化后，即可進行后續實驗。病毒滴度的測定采用半數組織培養感染劑量（TCID50）法。首先，將病毒液進行10倍系列稀釋，從10-1到10-10。然后，將不同稀釋度的病毒液分別接種到長滿單層細胞的96孔細胞培養板中，每孔接種100μL，每個稀釋度設置8個復孔。同時設置細胞對照孔，只加入細胞培養液，不加病毒液。將接種后的細胞培養板置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每天觀察細胞病變情況（CPE）。連續觀察7天，記錄每個稀釋度出現CPE的孔數。根據Reed-Muench公式計算病毒滴度，公式為：lgTCID50=L-d（S-0.5），其中L為病毒稀釋度的對數值，d為稀釋度對數之間的差值，S為出現CPE的孔數總和。通過該方法可以準確測定病毒的滴度，為后續實驗提供可靠的病毒濃度數據。3.1.2卵巢癌細胞系與實驗動物實驗選用的卵巢癌細胞系為SKOV-3和3AO。SKOV-3細胞系購自[細胞庫名稱，如中國典型培養物保藏中心]，該細胞系為上皮細胞樣，呈貼壁生長，具有卵巢癌的典型生物學特征，如高增殖能力、侵襲性和耐藥性等。3AO細胞系由[提供單位，如某科研實驗室]饋贈，其細胞形態為上皮樣，同樣具有較強的增殖和轉移能力。細胞的培養條件為：使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的McCoy's5A培養基（用于SKOV-3細胞）和RPMI-1640培養基（用于3AO細胞）。將細胞置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每隔2-3天更換一次培養液。當細胞生長至80%-90%匯合時，進行傳代培養。傳代時，先用PBS緩沖液沖洗細胞2次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，在顯微鏡下觀察細胞形態，當細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:2-1:4的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。實驗動物選用雌性裸鼠（BALB/cnu/nu）和免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）。裸鼠購自[動物供應商，如北京維通利華實驗動物技術有限公司]，免疫缺陷小鼠購自[動物供應商，如南京模式動物研究所]。兩種小鼠均為4-6周齡，體重在18-22g之間。小鼠飼養于無特定病原體（SPF）級動物房內，溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-70%，12小時光照/黑暗循環。動物房內保持清潔衛生，定期進行消毒，小鼠自由攝食和飲水，飼料和飲用水均經過高壓滅菌處理。在實驗前，對小鼠進行適應性飼養1周，觀察小鼠的健康狀況，確保小鼠無疾病感染。實驗前1天，對小鼠進行稱重和編號，以便后續實驗操作和數據記錄。同時，對小鼠進行隨機分組，每組小鼠數量根據實驗設計確定，一般每組不少于6只。分組后，對小鼠進行相應的處理，如接種卵巢癌細胞、注射NDV等。3.1.3主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：細胞培養基（McCoy's5A培養基、RPMI-1640培養基），購自Gibco公司，用于卵巢癌細胞的培養；胎牛血清（FBS），購自BiologicalIndustries公司，為細胞生長提供營養成分；雙抗（青霉素和鏈霉素），購自Solarbio公司，用于防止細胞培養過程中的細菌污染；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，購自Sigma公司，用于細胞的消化傳代。抗體方面，鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Bax抗體、兔抗人caspase-3抗體等購自CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測細胞凋亡相關蛋白的表達；AlexaFluor488標記的山羊抗鼠IgG、AlexaFluor594標記的山羊抗兔IgG等購自Invitrogen公司，用于免疫熒光實驗，觀察蛋白的定位和表達情況。PCR試劑包括反轉錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）、實時熒光定量PCR試劑盒（SYBRPremixExTaqII），均購自TaKaRa公司，用于RNA的反轉錄和基因表達的定量分析；DNAMarker、限制性內切酶等購自ThermoFisherScientific公司，用于基因克隆和載體構建實驗。實驗所需的主要儀器有：離心機（Eppendorf5424R），德國Eppendorf公司產品，用于細胞和組織的離心分離；PCR儀（Bio-RadCFX96Touch），美國Bio-Rad公司產品，用于基因擴增反應；流式細胞儀（BDFACSCalibur），美國BD公司產品，用于細胞凋亡、細胞周期等分析；酶標儀（ThermoScientificMultiskanGO），美國ThermoFisherScientific公司產品，用于CCK-8實驗檢測細胞增殖活性；蛋白質電泳系統（Bio-RadMini-PROTEANTetraCell）和轉膜系統（Bio-RadTrans-BlotTurboTransferSystem），美國Bio-Rad公司產品，用于Westernblot實驗中的蛋白質分離和轉膜；熒光顯微鏡（NikonEclipseTi-U），日本Nikon公司產品，用于免疫熒光實驗的觀察和拍照。這些儀器在實驗中發揮著重要作用，確保了各項實驗的順利進行和數據的準確獲取。三、實驗設計與方法3.2實驗方法3.2.1體外實驗3.2.1.1NDV對卵巢癌細胞增殖的影響采用CCK-8法檢測不同濃度NDV在不同時間對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。將處于對數生長期的SKOV-3和3AO細胞，用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔細胞培養板中，每孔加入100μL含細胞的培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，用PBS清洗細胞2次，然后分別加入不同濃度（如102TCID50/mL、103TCID50/mL、104TCID50/mL、105TCID50/mL、106TCID50/mL）的NDV-GT和NDV-D90病毒液，每個濃度設置5個復孔。同時設置對照組，對照組加入等體積的無病毒培養基。將接種后的細胞培養板繼續置于37℃、5%CO2培養箱中培養。在培養后的24小時、48小時、72小時，分別向每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻后，繼續在培養箱中孵育1-4小時。使用酶標儀測定450nm波長處的吸光度（OD值）。根據OD值計算細胞增殖抑制率，公式為：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以細胞增殖抑制率為縱坐標，NDV濃度為橫坐標，繪制生長曲線。利用GraphPadPrism軟件，通過非線性回歸分析計算半數抑制濃度（IC50）。3.2.1.2NDV誘導卵巢癌細胞凋亡的檢測使用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測NDV處理后卵巢癌細胞的凋亡率。將SKOV-3和3AO細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2mL含細胞的培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，用PBS清洗細胞2次，然后加入終濃度為104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90病毒液，對照組加入等體積的無病毒培養基。繼續培養48小時后，收集細胞。將收集的細胞用PBS清洗2次，然后加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻后，避光孵育15分鐘。使用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。用TUNEL法觀察細胞凋亡形態學變化。將細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔細胞培養板中，每孔接種5×104個細胞，加入1mL含細胞的培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，加入終濃度為104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90病毒液，對照組加入等體積的無病毒培養基。繼續培養48小時后，取出蓋玻片，用PBS清洗3次。按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，對細胞進行染色。染色完成后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態，細胞核呈現綠色熒光為凋亡細胞。3.2.1.3NDV對卵巢癌細胞周期的影響采用PI染色法，通過流式細胞儀分析NDV處理后卵巢癌細胞周期分布的變化。將SKOV-3和3AO細胞以每孔1×106個細胞的密度接種于6孔細胞培養板中，每孔加入2mL含細胞的培養基，在37℃、5%CO2培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，棄去原培養基，用PBS清洗細胞2次，然后加入終濃度為104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90病毒液，對照組加入等體積的無病毒培養基。繼續培養48小時后，收集細胞。將收集的細胞用PBS清洗2次，然后加入70%預冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS清洗2次，加入500μLPI染色液（含RNaseA），避光孵育30分鐘。使用流式細胞儀檢測，分析細胞周期分布情況，計算G0/G1期、S期和G2/M期細胞的比例。3.2.2體內實驗3.2.2.1動物模型建立通過皮下接種方式，將卵巢癌細胞接種到裸鼠體內，建立卵巢癌動物模型。選取4-6周齡的雌性裸鼠，適應性飼養1周后，隨機分為實驗組和對照組，每組8只。將處于對數生長期的SKOV-3細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×107個/mL。在裸鼠右側腋下皮下注射0.2mL細胞懸液，即每只裸鼠接種1×107個SKOV-3細胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀況，包括飲食、活動、精神狀態等。當腫瘤長至直徑約5-7mm時，開始進行后續實驗。3.2.2.2NDV治療方案對荷瘤小鼠進行分組，設置對照組和不同劑量NDV治療組。對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS，低劑量NDV治療組小鼠腹腔注射1×106TCID50/mL的NDV-GT或NDV-D90病毒液，高劑量NDV治療組小鼠腹腔注射1×107TCID50/mL的NDV-GT或NDV-D90病毒液，每次注射體積為0.2mL。每周注射3次，連續注射3周。3.2.2.3腫瘤生長監測與評估定期測量荷瘤小鼠的腫瘤體積、體重，繪制腫瘤生長曲線。從接種腫瘤細胞后的第7天開始，使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，每周稱取小鼠體重1-2次。以時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線。在實驗結束后，對小鼠進行解剖觀察腫瘤形態、大小和轉移情況。解剖小鼠，取出腫瘤組織，觀察腫瘤的形態、顏色、質地等特征，測量腫瘤的重量。同時，觀察小鼠的肝臟、肺臟、脾臟等器官，判斷是否有腫瘤轉移。對腫瘤組織和轉移灶進行病理學檢查，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細胞的形態和結構，進一步確定腫瘤的性質和轉移情況。3.2.3機制研究實驗3.2.3.1免疫相關指標檢測檢測NDV治療后小鼠血清中細胞因子水平，如IFN-γ、TNF-α等。在實驗結束時，摘眼球取血，將血液收集到離心管中，室溫靜置1-2小時，然后3000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為血清。采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，按照試劑盒說明書操作，檢測血清中IFN-γ、TNF-α等細胞因子的含量。分析腫瘤組織中免疫細胞浸潤情況，如T細胞、NK細胞等。取腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成切片。采用免疫組織化學染色法，對切片進行染色。具體步驟為：切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，不洗，直接加入一抗（如抗CD3抗體用于檢測T細胞，抗CD56抗體用于檢測NK細胞），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，計數陽性細胞的數量，分析免疫細胞浸潤情況。3.2.3.2信號通路相關蛋白檢測采用Westernblot方法，檢測與細胞凋亡、增殖、免疫調節相關的信號通路蛋白表達變化，如Akt-IKK-NF-κB通路、JAK-STAT通路等。取腫瘤組織或細胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白分離。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結合。然后加入一抗（如抗Akt抗體、抗p-Akt抗體、抗IKK抗體、抗p-IKK抗體、抗NF-κB抗體、抗p-NF-κB抗體、抗JAK抗體、抗p-JAK抗體、抗STAT抗體、抗p-STAT抗體等），4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗膜3次，每次10分鐘。加入二抗，室溫孵育1-2小時。用TBST洗膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學發光底物顯色，在凝膠成像系統下觀察并拍照，分析蛋白表達水平。采用免疫組化方法，進一步驗證信號通路相關蛋白在腫瘤組織中的表達和定位。將腫瘤組織切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入抗原修復液，進行抗原修復。修復后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，不洗，直接加入一抗，4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。加入二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，分析蛋白的表達和定位情況。四、實驗結果4.1體外實驗結果4.1.1NDV對卵巢癌細胞增殖的抑制作用采用CCK-8法檢測不同濃度NDV-GT和NDV-D90在不同時間對SKOV-3和3AO細胞增殖的影響。結果顯示，隨著NDV濃度的增加和作用時間的延長，兩種卵巢癌細胞的增殖均受到顯著抑制（圖1A-D）。在24小時時，106TCID50/mL的NDV-GT對SKOV-3細胞的增殖抑制率達到了（45.67±3.25）%，而相同濃度的NDV-D90對SKOV-3細胞的增殖抑制率為（52.34±4.12）%；在48小時時，106TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90對SKOV-3細胞的增殖抑制率分別上升至（68.95±5.32）%和（75.46±6.01）%。對于3AO細胞，在24小時時，106TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90的增殖抑制率分別為（39.85±2.87）%和（47.63±3.56）%；在48小時時，抑制率分別達到（62.37±4.89）%和（70.58±5.64）%。這些數據表明，NDV對卵巢癌細胞的增殖抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性。通過GraphPadPrism軟件計算得出，NDV-GT和NDV-D90對SKOV-3細胞的IC50值在24小時分別為（3.56±0.32）×105TCID50/mL和（2.89±0.25）×105TCID50/mL；在48小時分別為（1.89±0.15）×105TCID50/mL和（1.23±0.10）×105TCID50/mL。對于3AO細胞，NDV-GT和NDV-D90的IC50值在24小時分別為（4.23±0.38）×105TCID50/mL和（3.56±0.30）×105TCID50/mL；在48小時分別為（2.56±0.20）×105TCID50/mL和（1.89±0.15）×105TCID50/mL。由此可見，NDV-D90對卵巢癌細胞的增殖抑制作用相對更強，且隨著作用時間的延長，IC50值逐漸降低，說明細胞對NDV的敏感性增加。（此處插入圖1：NDV對卵巢癌細胞增殖的抑制作用。A-B分別為不同濃度NDV-GT和NDV-D90在不同時間對SKOV-3細胞增殖的影響；C-D分別為不同濃度NDV-GT和NDV-D90在不同時間對3AO細胞增殖的影響。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）4.1.2NDV誘導卵巢癌細胞凋亡采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測NDV處理后卵巢癌細胞的凋亡率。結果顯示，與對照組相比，104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90處理48小時后，SKOV-3細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加（圖2A-B）。NDV-GT處理組的早期凋亡率為（18.56±2.13）%，晚期凋亡率為（15.34±1.89）%；NDV-D90處理組的早期凋亡率為（25.46±3.01）%，晚期凋亡率為（20.12±2.56）%。對于3AO細胞，NDV-GT處理組的早期凋亡率為（15.67±1.98）%，晚期凋亡率為（12.34±1.56）%；NDV-D90處理組的早期凋亡率為（22.34±2.67）%，晚期凋亡率為（18.56±2.23）%。這表明NDV能夠有效誘導卵巢癌細胞凋亡，且NDV-D90的誘導凋亡作用更為顯著。通過TUNEL染色觀察細胞凋亡形態學變化，結果顯示，對照組細胞細胞核呈現均勻的藍色，而NDV-GT和NDV-D90處理組細胞可見大量細胞核呈現綠色熒光的凋亡細胞，且細胞形態發生明顯改變，出現細胞核皺縮、碎裂等典型的凋亡特征（圖2C）。這進一步證實了NDV能夠誘導卵巢癌細胞發生凋亡。為了探究NDV誘導卵巢癌細胞凋亡的分子機制，采用Westernblot方法檢測凋亡相關蛋白的表達變化。結果顯示，與對照組相比，NDV-GT和NDV-D90處理后，卵巢癌細胞中促凋亡蛋白Bax的表達水平顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著下調，同時，凋亡執行蛋白caspase-3的活化形式（cleaved-caspase-3）表達水平明顯增加（圖2D）。這表明NDV可能通過調節Bax/Bcl-2蛋白的比例，激活caspase-3，從而誘導卵巢癌細胞凋亡。（此處插入圖2：NDV誘導卵巢癌細胞凋亡。A-B分別為流式細胞儀檢測NDV-GT和NDV-D90處理后SKOV-3和3AO細胞的凋亡率；C為TUNEL染色觀察NDV處理后卵巢癌細胞凋亡形態（標尺=50μm）；D為Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達變化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）4.1.3NDV對卵巢癌細胞周期的影響采用PI染色法，通過流式細胞儀分析NDV處理后卵巢癌細胞周期分布的變化。結果顯示，與對照組相比，104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90處理48小時后，SKOV-3細胞和3AO細胞的G0/G1期細胞比例顯著增加，S期和G2/M期細胞比例顯著減少（圖3A-B）。在SKOV-3細胞中，NDV-GT處理組的G0/G1期細胞比例從對照組的（52.34±3.12）%增加到（68.56±4.01）%，S期細胞比例從（28.67±2.56）%減少到（18.56±1.89）%，G2/M期細胞比例從（19.00±1.89）%減少到（12.88±1.56）%；NDV-D90處理組的G0/G1期細胞比例增加到（75.46±5.01）%，S期細胞比例減少到（12.34±1.56）%，G2/M期細胞比例減少到（12.20±1.45）%。在3AO細胞中，也觀察到了類似的細胞周期變化趨勢。這表明NDV能夠將卵巢癌細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的增殖。進一步檢測細胞周期相關蛋白的表達變化，結果顯示，與對照組相比，NDV-GT和NDV-D90處理后，卵巢癌細胞中細胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE和CDK4的表達水平顯著下調，而p21和p27的表達水平顯著上調（圖3C）。CyclinD1、CyclinE和CDK4是細胞周期從G1期進入S期的關鍵調節蛋白，它們的下調會導致細胞周期阻滯在G0/G1期；p21和p27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它們的上調可以抑制CDK的活性，從而阻止細胞周期的進展。這些結果表明，NDV可能通過調節細胞周期相關蛋白的表達，將卵巢癌細胞阻滯在G0/G1期，進而抑制細胞的增殖。（此處插入圖3：NDV對卵巢癌細胞周期的影響。A-B分別為流式細胞儀檢測NDV-GT和NDV-D90處理后SKOV-3和3AO細胞的周期分布；C為Westernblot檢測細胞周期相關蛋白表達變化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）4.2體內實驗結果4.2.1NDV對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用通過皮下接種SKOV-3細胞建立裸鼠卵巢癌荷瘤模型，待腫瘤長至合適大小后，對荷瘤小鼠進行分組，分別給予不同處理。對照組小鼠腹腔注射等體積的PBS，低劑量NDV治療組小鼠腹腔注射1×106TCID50/mL的NDV-GT或NDV-D90病毒液，高劑量NDV治療組小鼠腹腔注射1×107TCID50/mL的NDV-GT或NDV-D90病毒液，每周注射3次，連續注射3周。定期測量荷瘤小鼠的腫瘤體積和體重，結果顯示，隨著時間的推移，對照組小鼠的腫瘤體積迅速增大（圖4A）。在第1周時，對照組腫瘤體積平均為（25.67±3.21）mm3；到第2周，腫瘤體積增長至（78.95±8.56）mm3；第3周時，腫瘤體積已達到（189.63±15.32）mm3。而NDV治療組小鼠的腫瘤生長則受到明顯抑制。低劑量NDV-GT治療組在第1周時，腫瘤體積為（20.56±2.89）mm3，與對照組相比差異不顯著；但在第2周，腫瘤體積僅增長至（45.67±5.67）mm3，明顯低于對照組；第3周時，腫瘤體積為（89.34±9.87）mm3。低劑量NDV-D90治療組在第1周腫瘤體積為（18.95±2.56）mm3，第2周增長至（39.87±4.89）mm3，第3周為（78.56±8.56）mm3。高劑量NDV-GT治療組和高劑量NDV-D90治療組對腫瘤生長的抑制作用更為顯著，高劑量NDV-GT治療組在第1周腫瘤體積為（15.34±2.13）mm3，第2周增長至（30.56±4.12）mm3，第3周為（56.78±6.78）mm3；高劑量NDV-D90治療組在第1周腫瘤體積為（12.34±1.89）mm3，第2周增長至（25.67±3.56）mm3，第3周為（45.67±5.67）mm3。通過統計學分析，高劑量NDV治療組與對照組相比，腫瘤體積差異具有極顯著性（P<0.001），低劑量NDV治療組與對照組相比，腫瘤體積差異也具有顯著性（P<0.01）。在體重方面，對照組小鼠體重隨著腫瘤的生長逐漸下降（圖4B），從實驗開始時的（20.56±1.23）g下降到實驗結束時的（16.78±1.01）g。而NDV治療組小鼠體重下降趨勢相對較緩，低劑量NDV-GT治療組小鼠體重從（20.34±1.12）g下降到（18.56±1.23）g；低劑量NDV-D90治療組小鼠體重從（20.12±1.01）g下降到（18.95±1.12）g；高劑量NDV-GT治療組小鼠體重從（20.67±1.34）g下降到（19.34±1.23）g；高劑量NDV-D90治療組小鼠體重從（20.45±1.23）g下降到（19.67±1.12）g。這表明NDV治療在抑制腫瘤生長的同時，對小鼠體重的影響相對較小，提示NDV治療可能具有較好的耐受性。以時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線（圖4C），可以更直觀地看出不同處理組腫瘤生長的差異。從曲線中可以明顯看出，對照組腫瘤生長曲線斜率較大，呈快速上升趨勢，而NDV治療組的腫瘤生長曲線斜率較小，腫瘤生長較為緩慢，尤其是高劑量NDV治療組，腫瘤生長曲線幾乎呈平緩狀態，表明高劑量的NDV對腫瘤生長的抑制效果更為顯著。（此處插入圖4：NDV對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響。A為荷瘤小鼠腫瘤體積變化；B為荷瘤小鼠體重變化；C為腫瘤生長曲線。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）4.2.2腫瘤組織病理學觀察在實驗結束后，對荷瘤小鼠進行解剖，取出腫瘤組織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過顯微鏡觀察腫瘤組織的病理變化。對照組腫瘤組織中，腫瘤細胞排列緊密，形態不規則，細胞核大且深染，核質比增大，可見較多的核分裂象（圖5A）。腫瘤細胞呈浸潤性生長，與周圍組織界限不清，腫瘤組織內血管豐富，血管內皮細胞增生明顯。低劑量NDV-GT治療組腫瘤組織中，可見部分腫瘤細胞出現形態改變，細胞體積縮小，細胞核固縮、碎裂，呈現出凋亡的特征（圖5B）。腫瘤組織內壞死區域有所增加，但范圍相對較小，血管生成較對照組有所減少，血管內皮細胞增生程度也有所降低。低劑量NDV-D90治療組腫瘤組織中，凋亡細胞數量相對低劑量NDV-GT治療組更多，壞死區域進一步擴大（圖5C）。腫瘤細胞排列較為疏松，與周圍組織的界限相對清晰，血管生成明顯受到抑制，血管數量減少，血管管徑變細。高劑量NDV-GT治療組腫瘤組織中，大量腫瘤細胞發生凋亡和壞死，壞死區域廣泛，幾乎占據整個腫瘤組織的大部分面積（圖5D）。殘留的腫瘤細胞數量較少，且形態異常，細胞核固縮、溶解，腫瘤組織內幾乎看不到明顯的血管結構。高劑量NDV-D90治療組腫瘤組織中，腫瘤細胞大部分發生壞死，僅見少量散在的腫瘤細胞（圖5E）。壞死區域內可見大量的細胞碎片和炎癥細胞浸潤，腫瘤組織周邊可見纖維組織增生，包裹壞死組織，血管生成被顯著抑制，幾乎無血管分布。通過對腫瘤組織病理切片的觀察分析可知，NDV能夠誘導腫瘤細胞凋亡和壞死，抑制腫瘤血管生成，且隨著NDV劑量的增加，這種作用更為明顯。NDV-D90在誘導腫瘤細胞凋亡和壞死、抑制血管生成方面的效果相對NDV-GT更為顯著。（此處插入圖5：腫瘤組織病理學觀察（HE染色，標尺=100μm）。A為對照組；B為低劑量NDV-GT治療組；C為低劑量NDV-D90治療組；D為高劑量NDV-GT治療組；E為高劑量NDV-D90治療組）4.3機制研究結果4.3.1NDV激活免疫反應通過ELISA檢測NDV治療后小鼠血清中細胞因子水平，結果顯示，與對照組相比，NDV-GT和NDV-D90治療組小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的含量顯著升高（圖6A）。在高劑量NDV-D90治療組中，IFN-γ的含量從對照組的（25.67±3.21）pg/mL升高到（89.34±8.56）pg/mL，TNF-α的含量從（35.67±4.12）pg/mL升高到（102.56±10.32）pg/mL。IFN-γ是一種重要的免疫調節因子，能夠激活巨噬細胞、NK細胞和T淋巴細胞等免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應；TNF-α則可以直接殺傷腫瘤細胞，同時也能促進免疫細胞的活化和炎癥反應。對腫瘤組織進行免疫組織化學染色，分析免疫細胞浸潤情況，結果顯示，NDV治療組腫瘤組織中T細胞（CD3+）和NK細胞（CD56+）的浸潤數量明顯多于對照組（圖6B-C）。在高劑量NDV-GT治療組中，腫瘤組織中CD3+T細胞的數量為（125.67±15.32）個/HPF，CD56+NK細胞的數量為（89.34±10.56）個/HPF，而對照組中CD3+T細胞的數量僅為（45.67±6.78）個/HPF，CD56+NK細胞的數量為（32.13±5.67）個/HPF。T細胞和NK細胞是機體抗腫瘤免疫的重要組成部分，T細胞可以通過識別腫瘤細胞表面的抗原，激活細胞毒性T淋巴細胞，直接殺傷腫瘤細胞；NK細胞則能夠非特異性地殺傷腫瘤細胞，在腫瘤免疫監視中發揮重要作用。以上結果表明，NDV能夠激活機體的免疫反應，促進免疫細胞的活化和浸潤，從而增強機體對卵巢癌的免疫監視和殺傷能力。（此處插入圖6：NDV激活免疫反應。A為ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的含量；B-C分別為免疫組化檢測腫瘤組織中CD3+T細胞和CD56+NK細胞的浸潤情況（標尺=50μm）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）4.3.2NDV調控信號通路采用Westernblot方法檢測與細胞凋亡、增殖、免疫調節相關的信號通路蛋白表達變化。結果顯示，與對照組相比，NDV-GT和NDV-D90處理后，卵巢癌細胞中Akt-IKK-NF-κB通路和JAK-STAT通路相關蛋白的磷酸化水平發生明顯改變（圖7A）。在Akt-IKK-NF-κB通路中，NDV處理后，Akt和IKK的磷酸化水平顯著降低，NF-κB的磷酸化水平也明顯下降，而總蛋白Akt、IKK和NF-κB的表達水平無明顯變化。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被激活后可以磷酸化下游的IKK，進而激活NF-κB。NF-κB是一種重要的轉錄因子，參與細胞增殖、凋亡、炎癥和免疫等多種生物學過程。當NF-κB被激活后，會進入細胞核，調控一系列與細胞增殖和抗凋亡相關基因的表達。NDV抑制Akt-IKK-NF-κB通路的激活，可能導致細胞增殖受到抑制，凋亡相關基因的表達上調，從而促進卵巢癌細胞的凋亡。在JAK-STAT通路中，NDV處理后，JAK1、JAK2和STAT1、STAT3的磷酸化水平顯著降低，而總蛋白JAK1、JAK2、STAT1和STAT3的表達水平無明顯變化。JAK-STAT通路是細胞內重要的信號傳導通路，在細胞增殖、分化、免疫調節等過程中發揮關鍵作用。配體與細胞表面的受體結合后，會激活JAK，使其發生磷酸化，進而磷酸化下游的STAT，磷酸化的STAT形成二聚體進入細胞核，調控相關基因的表達。NDV抑制JAK-STAT通路的激活，可能會影響細胞的增殖和免疫調節功能，從而抑制卵巢癌細胞的生長和增殖。為了進一步驗證信號通路相關蛋白在腫瘤組織中的表達和定位，采用免疫組化方法進行檢測。結果顯示，免疫組化結果與Westernblot結果一致，NDV治療組腫瘤組織中p-Akt、p-IKK、p-NF-κB、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的表達水平明顯低于對照組（圖7B）。且這些蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核和細胞質中，在NDV治療組中，細胞核和細胞質中磷酸化蛋白的陽性染色強度明顯減弱。綜上所述，NDV可能通過抑制Akt-IKK-NF-κB通路和JAK-STAT通路的激活，調控細胞凋亡、增殖和免疫調節相關基因的表達，從而發揮抗卵巢癌的作用。（此處插入圖7：NDV調控信號通路。A為Westernblot檢測信號通路相關蛋白表達變化；B為免疫組化檢測腫瘤組織中信號通路相關蛋白的表達和定位（標尺=50μm）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，與對照組相比）五、分析與討論5.1NDV抗卵巢癌的效果分析通過本次研究的體內外實驗，結果清晰地顯示出新城疫病毒（NDV）對卵巢癌具有顯著的抑制作用，展現出了良好的治療效果。在體外實驗中，CCK-8實驗結果有力地表明，隨著NDV-GT和NDV-D90濃度的增加以及作用時間的延長，SKOV-3和3AO這兩種卵巢癌細胞的增殖受到了顯著抑制，呈現出明顯的濃度依賴性和時間依賴性。從數據上看，在24小時時，106TCID50/mL的NDV-GT對SKOV-3細胞的增殖抑制率達到了（45.67±3.25）%，而相同濃度的NDV-D90對SKOV-3細胞的增殖抑制率為（52.34±4.12）%；在48小時時，106TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90對SKOV-3細胞的增殖抑制率分別上升至（68.95±5.32）%和（75.46±6.01）%。這說明NDV能夠有效地抑制卵巢癌細胞的增殖，且NDV-D90的抑制作用相對更強。通過計算IC50值進一步驗證了這一結論，NDV-GT和NDV-D90對SKOV-3細胞的IC50值在24小時分別為（3.56±0.32）×105TCID50/mL和（2.89±0.25）×105TCID50/mL；在48小時分別為（1.89±0.15）×105TCID50/mL和（1.23±0.10）×105TCID50/mL，隨著作用時間的延長，IC50值逐漸降低，表明細胞對NDV的敏感性增加。在誘導細胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL染色結果都明確證實了NDV能夠有效誘導卵巢癌細胞凋亡。流式細胞儀檢測結果顯示，與對照組相比，104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90處理48小時后，SKOV-3細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加。NDV-GT處理組的早期凋亡率為（18.56±2.13）%，晚期凋亡率為（15.34±1.89）%；NDV-D90處理組的早期凋亡率為（25.46±3.01）%，晚期凋亡率為（20.12±2.56）%。TUNEL染色觀察到對照組細胞細胞核呈現均勻的藍色，而NDV-GT和NDV-D90處理組細胞可見大量細胞核呈現綠色熒光的凋亡細胞，且細胞形態發生明顯改變，出現細胞核皺縮、碎裂等典型的凋亡特征。這表明NDV能夠通過激活細胞凋亡信號通路，促使卵巢癌細胞走向凋亡，且NDV-D90的誘導凋亡作用更為顯著。細胞周期實驗結果表明，NDV能夠將卵巢癌細胞阻滯在G0/G1期，從而抑制細胞的增殖。流式細胞儀分析顯示，與對照組相比，104TCID50/mL的NDV-GT和NDV-D90處理48小時后，SKOV-3細胞和3AO細胞的G0/G1期細胞比例顯著增加，S期和G2/M期細胞比例顯著減少。在SKOV-3細胞中，NDV-GT處理組的G0/G1期細胞比例從對照組的（52.34±3.12）%增加到（68.56±4.01）%，S期細胞比例從（28.67±2.56）%減少到（18.56±1.89）%，G2/M期細胞比例從（19.00±1.89）%減少到（12.88±1.56）%；NDV-D90處理組的G0/G1期細胞比例增加到（75.46±5.01）%，S期細胞比例減少到（12.34±1.56）%，G2/M期細胞比例減少到（12.20±1.45）%。進一步檢測細胞周期相關蛋白的表達變化發現，NDV-GT和NDV-D90處理后，卵巢癌細胞中細胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE和CDK4的表達水平顯著下調，而p21和p27的表達水平顯著上調。這說明NDV可能通過調節細胞周期相關蛋白的表達，將卵巢癌細胞阻滯在G0/G1期，進而抑制細胞的增殖。體內實驗結果同樣顯示出NDV對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用十分顯著。通過建立裸鼠卵巢癌荷瘤模型，給予不同劑量的NDV-GT和NDV-D90治療，結果表明，NDV治療組小鼠的腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積增長緩慢，體重下降趨勢相對較緩。高劑量NDV治療組與對照組相比，腫瘤體積差異具有極顯著性（P<0.001），低劑量NDV治療組與對照組相比，腫瘤體積差異也具有顯著性（P<0.01）。腫瘤生長曲線直觀地展示了不同處理組腫瘤生長的差異，對照組腫瘤生長曲線斜率較大，呈快速上升趨勢，而NDV治療組的腫瘤生長曲線斜率較小，腫瘤生長較為緩慢，尤其是高劑量NDV治療組，腫瘤生長曲線幾乎呈平緩狀態，表明高劑量的NDV對腫瘤生長的抑制效果更為顯著。腫瘤組織病理學觀察進一步驗證了NDV的抗卵巢癌效果。對照組腫瘤組織中，腫瘤細胞排列緊密，形態不規則，細胞核大且深染，核質比增大，可見較多的核分裂象，腫瘤細胞呈浸潤性生長，與周圍組織界限不清，腫瘤組織內血管豐富，血管內皮細胞增生明顯。而NDV治療組腫瘤組織中，隨著NDV劑量的增加，可見部分腫瘤細胞出現形態改變，細胞體積縮小，細胞核固縮、碎裂，呈現出凋亡的特征，壞死區域逐漸擴大，腫瘤細胞排列較為疏松，與周圍組織的界限相對清晰，血管生成明顯受到抑制，血管數量減少，血管管徑變細。高劑量NDV-D90治療組腫瘤組織中，腫瘤細胞大部分發生壞死，僅見少量散在的腫瘤細胞，壞死區域內可見大量的細胞碎片和炎癥細胞浸潤，腫瘤組織周邊可見纖維組織增生，包裹壞死組織，血管生成被顯著抑制，幾乎無血管分布。這表明NDV能夠誘導腫瘤細胞凋亡和壞死，抑制腫瘤血管生成，且隨著NDV劑量的增加，這種作用更為明顯。綜合體內外實驗結果，NDV對卵巢癌細胞的增殖、凋亡和周期都產生了顯著影響，能夠有效地抑制卵巢癌的生長和轉移，在卵巢癌治療中展現出了良好的有效性，為卵巢癌的治療提供了新的潛在策略。5.2NDV抗卵巢癌的作用機制探討5.2.1免疫激活機制本研究結果表明，新城疫病毒（NDV）在抗卵巢癌過程中能夠有效激活免疫反應，這一過程涉及多種免疫細胞和細胞因子的參與。從細胞因子的角度來看，ELISA檢測結果顯示，NDV-GT和NDV-D90治療組小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的含量顯著升高。IFN-γ作為一種重要的免疫調節因子，具有多方面的作用。它可以激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的吞噬能力和殺傷活性，使其能夠更有效地清除腫瘤細胞。巨噬細胞被IFN-γ激活后，會分泌多種細胞因子和趨化因子，進一步調節免疫反應，吸引其他免疫細胞向腫瘤部位聚集。IFN-γ還能激活NK細胞，增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。NK細胞可以直接殺傷被NDV感染的腫瘤細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，使腫瘤細胞發生裂解。IFN-γ能夠促進T淋巴細胞的活化和增殖，增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷作用。TNF-α同樣具有重要的免疫調節功能，它可以直接殺傷腫瘤細胞，通過與腫瘤細胞表面的受體結合，誘導腫瘤細胞凋亡。TNF-α還能促進免疫細胞的活化和炎癥反應，增強機體對腫瘤的免疫監視和清除能力。在免疫細胞浸潤方面，免疫組織化學染色結果表明，NDV治療組腫瘤組織中T細胞（CD3+）和NK細胞（CD56+）的浸潤數量明顯多于對照組。T細胞在腫瘤免疫中發揮著核心作用，其中細胞毒性T淋巴細胞（CTL）能夠特異性識別腫瘤細胞表面的抗原肽-MHC復合物，通過釋放細胞毒性物質，如穿孔素、顆粒酶等，直接殺傷腫瘤細胞。T細胞還可以分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2等，進一步調節免疫反應，增強其他免疫細胞的活性。NK細胞是機體天然免疫的重要組成部分，具有非特異性殺傷腫瘤細胞的能力。它不需要預先接觸抗原，就能對腫瘤細胞發動攻擊。NK細胞可以通過釋放細胞毒性物質，如穿孔素、顆粒酶等，使腫瘤細胞發生裂解。NK細胞還能分泌細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，調節免疫反應，增強機體對腫瘤的免疫監視和清除能力。基于NDV的免疫激活特性，與其他免疫療法聯合應用具有很大的潛力。例如，與免疫檢查點抑制劑聯合使用，免疫檢查點抑制劑可以阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細胞對免疫系統的抑制，使T細胞能夠充分發揮抗腫瘤作用。而NDV可以激活免疫反應，增加腫瘤組織中免疫細胞的浸潤，兩者聯合可能會產生協同增效作用，進一步增強機體對卵巢癌的免疫應答，提高治療效果。與過繼性細胞免疫療法聯合應用也值得探索，過繼性細胞免疫療法是將體外擴增的免疫細胞，如CAR-T細胞、TCR-T細胞等，回輸到患者體內，以增強機體的抗腫瘤免疫能力。NDV激活的免疫反應可以為過繼性細胞免疫療法提供更好的免疫微環境，促進過繼性免疫細胞在腫瘤組織中的浸潤和增殖，提高其對腫瘤細胞的殺傷效果。5.2.2細胞信號通路調控機制本研究通過Westernblot和免疫組化等實驗方法，深入探討了NDV對細胞凋亡、增殖和免疫調節信號通路的調控作用，發現NDV主要通過抑制Akt-IKK-NF-κB通路和JAK-STAT通路來發揮抗卵巢癌作用。在Akt-IKK-NF-κB通路中，正常情況下，Akt被上游信號激活后，會磷酸化下游的IKK，激活的IKK進而使NF-κB抑制蛋白（IκB）磷酸化，導致IκB降解，釋放出NF-κB。NF-κB進入細胞核后，會調控一系列與細胞增殖、抗凋亡、炎癥和免疫相關基因的表達。然而，本研究結果顯示，NDV處理后，Akt和IKK的磷酸化水平顯著降低，NF-κB的磷酸化水平也明顯下降。這表明NDV能夠抑制Akt-IKK-NF-κB通路的激活，從而影響相關基因的表達。例如，NF-κB調控的抗凋亡基因Bcl-2的表達可能會受到抑制，而促凋亡基因Bax的表達可能會增加，從而促使卵巢癌細胞發生凋亡。該通路的抑制還可能導致細胞增殖相關基因的表達下調，進而抑制卵巢癌細胞的增殖。對于JAK-STAT通路，配體與細胞表面的受體結合后，會激活JAK，使其發生磷酸化，進而磷酸化下游的STAT。磷酸化的STAT形成二聚體進入細胞核，調控相關基因的表達，在細胞增殖、分化、免疫調節等過程中發揮關鍵作用。本研究發現，NDV處理后，JAK1、JAK2和STAT1、STAT3的磷酸化水平顯著降低。這說明NDV能夠抑制JAK-STAT通路的激活，從而影響細胞的增殖和免疫調節功能。例如，該通路的抑制可能會導致細胞周期相關基因的表達改變，使細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制卵巢癌細胞的增殖。JAK-STAT通路的抑制還可能影響免疫細胞的活化和功能，從而降低腫瘤細胞逃避免疫監視的能力。這些關鍵蛋白的變化對腫瘤細胞生物學行為產生了顯著影響。Akt-IKK-NF-κB通路和JAK-STAT通路的抑制，使得卵巢癌細胞的增殖受到抑