ICS65.020.30DB51B41四川省地方標準DB51/T1842—2014山羊支原體山羊肺炎亞種PCR檢測技術規范四川省質量技術監督局發布DB51/T1842—2014目次前言...............................................................................II范圍..............................................................................112規范性引用文件....................................................................13術語和定義........................................................................14設備和試劑........................................................................1567DNA提取...........................................................................2PCR擴增...........................................................................2PCR產物的電泳檢測.................................................................38結果判定..........................................................................3廢棄物無害化處理..................................................................39附錄A（規范性附錄）相關試劑的配制..................................................4IDB51/T1842—2014前言本標準附錄A為規范性附錄。本標準由四川省農業廳提出。本標準由四川省質量技術監督局批準。本標準起草單位：西南民族大學。本標準主要起草人：楊發龍、張煥容、王遠微、岳華、湯承、張斌、任玉鵬。IIDB51/T1842—2014山羊支原體山羊肺炎亞種PCR檢測技術規范1范圍本標準規定了山羊支原體山羊肺炎亞種的PCR檢測方法。本標準適用于山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測與鑒定。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GBT6682分析實驗室用水規格和實驗方法GB16548病害動物和病害動物產品生物安全處理規程《獸醫實驗室生物安全技術管理規范》（2003農業部公告第302號）3術語和定義本標準采用下列術語和定義。山羊支原體山羊肺炎亞種Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae屬于柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬絲狀支原體簇的成員，是引起山羊傳染性胸膜肺炎（contagiouscaprinepleuropneumonia,CCPP）的病原，其典型菌株為F38。1DB51/T1842—20144.2主要試劑4.2.1引物（10μmol/L）P1：5-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3P2：5-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3擴增片段大小為316bp。4.2.2DNA提取試劑：蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉（SDS）、酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇。4.2.3PCR反應試劑：TaqDNA聚合酶（5U/μL）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每種濃度為2.5mmol/L）、10×PCRBuffer(無Mg2+)。4.2.44.2.5STE緩沖液（見附錄A）TAE電泳緩沖液（見附錄A）4.2.66×上樣緩沖液（6×LoadingBuffer）4.2.7瓊脂糖（電泳級）4.2.8核酸染料(Goldview)4.2.9DNA分子量標準4.2.104.2.114.2.12水：所用水應符合GB/T6682中三級水（三蒸水）規格。陽性對照：標準參考菌株作為陽性對照。陰性對照：用GB/T6682中三級水代替PCR擴增模板作為陰性對照。5DNA提取5.1.1組織樣本：肺等組織樣本，按1g加入1mL的STE緩沖液，剪碎并研磨，3000r/min進行離心10min，取上清液，12000r/min進行離心20min，棄上清，沉淀用于DNA提取。5.1.2鼻腔拭子樣本：將鼻腔拭子浸入1mL的STE緩沖液中30min，充分涮洗，貼管壁擠干拭子，12000r/min離心20min，棄去上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.3胸腔滲出液：取500μL胸腔滲出液，加入500μLSTE緩沖液，混勻，12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.4液體培養物：取1mL液體培養物,12000r/min離心20min,棄上清，收集沉淀用于DNA提取。5.1.5對照樣本：陰陽性對照樣本處理與檢測樣本處理方法相同。5.2.2加入10%SDS溶液20μL，20mg/mL蛋白酶K10μL，混勻，在56℃水浴60min。5.2.3加入等體積530μL的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混合液，混勻，12000r/min離心5min。5.2.4定量轉移上清液到另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1）混合液，顛倒混勻，12000r/min離心5min。5.2.5取上清，加入2.5倍體積的預冷無水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，棄去上清液。2DB51/T1842—20146.1PCR反應體系總反應體系25μL，包括以下成份：10×PCRBuffer2.5μL、MgCl2（25mM）2μL、dNTP(2.5mM)2μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.15μL、引物P1（10μmol/L）1μL、引物P2（10μmol/L）1μL、水14.50μL、模板DNA2μL。PCR擴增設置陽性。6.2PCR反應條件94℃預變性3min，然后進行94℃30s,47℃30s,72℃30s的循環，進行35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。7PCR產物的電泳檢測7.1用TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠（見附錄1）。7.2取5μLPCR產物與1μL6×上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔，同時在另一加樣孔中加入DNA分子量標準，以5V/cm恒壓電泳，采用凝膠成像系統判定核酸片段大小。8結果判定8.1陽性對照出現一條316bp大小的條帶，且陰性對照不出現條帶。8.2在滿足8.1的條件下，被檢樣品的PCR產物經電泳后出現一條316bp的條帶判定為陽性（+），即樣本中含有山羊支原體山羊肺炎亞種DNA；被檢樣品的PCR產物經電泳后不出現316bp的條帶判定為陰性（-）。按GB16548病害動物和病害動物產品生物安全處理規程處理。廢棄物實行無害化處理。3DB51/T1842—2014AA附錄A（規范性附錄）相關試劑的配制A.1STE緩沖液0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.HCl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)A.2TAE電泳