犬流感病毒的生物學(xué)特性研究陳堅曹穗蘭指導(dǎo)老師：賀東生華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院摘要：從廣州市各寵物醫(yī)院采集得患病犬只的鼻咽拭子樣本，經(jīng)SPF雞胚培養(yǎng)分離鑒定，分離出3株疑似犬流感病毒，陽性分離株第三代血凝活性均達(dá)128：1以上，而且均不被新城疫陽性血清所凝集，與H3和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)血清血凝抑制價為8：1，與H5型標(biāo)準(zhǔn)血清血凝抑制價為256：1，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集譜測定，其中兩株病毒只能凝集雞的血球和狗的血球；一株除了可以凝集雞、狗的血球以外，還可以凝集貓，牛，兔的血球。關(guān)鍵詞:犬流感病毒;分離鑒定；生物學(xué)特性流感病毒屬分節(jié)段負(fù)股RNA病毒，屬正黏病毒科，分為A、B、C三型，A型流感病毒可以感染禽、豬、馬等多種動物和人，B型流感病毒僅感染人，C型流感病毒感染人和豬，其中C型流感病毒感染極少引起嚴(yán)重疾病，A型禽流感病毒不但感染禽、豬等多種動物和人，還可以感染豬，犬貓等小動物。多種研究證實(shí)：流感病毒中控制N和H的基因可以發(fā)生重組，各種流感病毒之間有著密切的聯(lián)系，可在特定的動物宿主中重組成新的變異毒株，并引發(fā)跨物種傳播，進(jìn)而感染人類，威脅人類的生命安全，而在當(dāng)前，犬作為一種常見的家養(yǎng)寵物，與人類的接觸十分的密切，故而，對犬流感病毒的研究極具意義。目前，國外對犬流感病毒的研究已經(jīng)較為成熟，但國內(nèi)對犬流感病毒的研究卻非常少，病毒分離非常困難，分離率很低，從而極大地影響了對流感病毒進(jìn)一步的科學(xué)研究。針對這種情況，我們在前期創(chuàng)新研究犬流感分離工作的基礎(chǔ)上，繼續(xù)進(jìn)行犬流感病毒的分離鑒定工作，并對其進(jìn)行血清型鑒定、紅細(xì)胞凝集譜等生物學(xué)特性的研究，現(xiàn)報告如下。材料準(zhǔn)備樣品采集疑似流感發(fā)病犬只樣品的采集：2005年4月－2006年3月，從廣州的部分寵物醫(yī)院對疑似犬流感病例進(jìn)行鼻咽拭子的采集，早期的采集對象以出現(xiàn)呼吸道癥狀的犬只為主，后期根據(jù)國外對犬流感的報道研究，針對具有典型流感癥狀的犬只進(jìn)行采樣，主要判斷治標(biāo)為：呼吸道癥狀，低燒，流涕，抗生素治療無效等。先后采集鼻咽拭子一共份，采得的拭子放入含2500單位/ml雙抗保存液中，放4℃病料處理樣品取其上清液，按每毫升1000單位的含量加入青鏈霉素，進(jìn)行無菌處理，放于4℃1.310×PBS液的制備氯化鈉8.5g，磷酸二氫甲0.68g，氫氧化鈉0.15g，溶於100ml水中高壓滅菌，十倍稀釋。1.4阿氏液制備葡萄糖20.5g，氯化鈉4.2g，檸檬酸鈉8.0g，檸檬酸0.55g，加于100水中，115℃，15min高壓滅菌，調(diào)節(jié)PH值至6.8～7.2之間，41.5標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和抗原流感病毒H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和雞新城疫(ND)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病研究室提供。1.6SPF雞胚由廣東永順生物制品廠SPF種禽飼養(yǎng)室提供。1.71%雞紅細(xì)胞、牛紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞、犬紅細(xì)胞、貓紅細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗室提供。所有紅細(xì)胞用PBS洗3遍，前兩次用1500rpm離心兩次，每次5分鐘，最后一次用2000rpm離心10分鐘，將離心得的紅細(xì)胞一毫升加入100ml阿氏液中，配成l%懸液，置4℃方法2.1病毒分離采用雞胚接種絨毛尿囊腔接種分離的方法2.119－11日齡SPF雞胚，由廣東永順生物制品廠提供的SPF種蛋孵化。取上述制備的樣品上清液，經(jīng)絨毛尿囊腔接種，每個樣品接種一個胚，0.2ml/胚，置37℃2.12孵育2－4天，每天照胚2次，收留死胚，細(xì)菌檢查為陰性后轉(zhuǎn)放入4℃2.13采集雞胚的絨毛尿囊液進(jìn)行血球凝集(HA)試驗，若出現(xiàn)血凝活性，則繼續(xù)傳代并測定血凝價。若血凝價為陰性，則轉(zhuǎn)入－20℃2.14將首次收取的HA未有血凝活性的雞胚尿囊液與其它首次接種收胚后不表現(xiàn)血凝活性的樣品收得的尿囊液得進(jìn)行隨機(jī)分組，每5個樣品尿囊液一組，將同一組的尿囊液每個取0.4ml混合，震蕩，再次接種雞胚傳代，方法同上。2.15收取的尿囊液再做HA血球凝集實(shí)驗，結(jié)果仍為陰性者則棄去，如為陽性，則將組內(nèi)的各個樣本分別接種雞胚繼續(xù)傳代，直到分離得陽性毒株，并測定其血凝價。2.16凡病毒分離陽性者均置于－20℃冰箱內(nèi)保2.2病毒鑒定2.21紅細(xì)胞凝集(HA)試驗將上述各傳代雞胚尿囊液按常規(guī)進(jìn)行血凝性和血凝價測定。2.22與新城疫陽性血清進(jìn)行HI試驗，以排除新城疫病毒的可能性。2.23血凝素亞型鑒定分別用H5、H7、H9、ND血清和Hg標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與陽性分離株的尿囊液進(jìn)行HI試驗。2.24紅細(xì)胞凝集譜的測定分別采用雞、牛、兔、犬、貓的1％紅細(xì)胞懸液對上述各傳代雞胚尿囊液進(jìn)行血凝性和血凝價的測定。3結(jié)果3.1病毒的分離及鑒定3.1.1病毒的分離及初步鑒定:本次試驗通過采用將樣品接種于SPF雞胚，收集其尿囊液進(jìn)行血凝活性檢測的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3份樣品的雞胚尿囊液對雞紅血球有血凝活性，經(jīng)雞胚傳代表1－1HA孔號毒株123456789101112014F3####++++++－－－－－028F3######+++++++－－－100F5#######++++++++－－014第3代病毒液HA價達(dá)7孔，滴度為1：128；028第三代病毒液HA值達(dá)9孔，滴度為1：512；100第5代病毒液HA值高達(dá)10孔，滴度為1:1042。表1－2抗NDV陽性血清HI試驗孔號毒株編號123456789101112014－－－－－－－－－－－－028－－－－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－陽性對照######+++－－－－這3株病毒與抗NDV陽性血清的HI試驗為均陰性。故而，初步鑒定這3份樣品分離物為流感病毒。3.1.2病毒亞型的鑒定表2－1H5亞型鑒定結(jié)果孔號毒株編號123456789101112014#####+－－－－－028#####+++++++－－－－100#####+++++－－－－014號毒株與H5的血凝抑制價為64:1；028與100的H5血凝抑制價為256:1；表2－1H7亞型鑒定結(jié)果孔號毒株編號123456789101112014##++－－－－－－－－－028##++－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－014號毒株和028號毒株與H7的血凝抑制價為8:1；100的H7血凝抑制價為；表2－1H9亞型鑒定結(jié)果孔號毒株編號123456789101112014##++－－－－－－－－－028##－－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－014號毒株與H9的血凝抑制價為8:1；028的H9血凝抑制價為4：1；100不能和H9血清的產(chǎn)生凝集抑制。3.13病毒紅細(xì)胞凝集譜測定結(jié)果雞紅細(xì)胞凝集結(jié)果如表1所示表3－1牛紅細(xì)胞凝集測定結(jié)果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋－－－014、028第3代病毒液不能凝集牛的紅細(xì)胞；100第5代病毒液與牛的紅細(xì)胞凝集，HA值達(dá)9孔，滴度為1:512。表3－2狗紅細(xì)胞凝集譜測定結(jié)果孔號毒株123456789101112014F3####＋＋＋＋＋＋－－－－－028F3######＋＋＋＋＋＋－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－3株病毒均能與狗的紅血球凝集，014第3代病毒液HA價達(dá)7孔，滴度為1：128；028第三代病毒液HA值達(dá)9孔，滴度為1：512；100第5代病毒液HA值高達(dá)10孔，滴度為1:1042表3－3貓紅細(xì)胞凝集譜測定結(jié)果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－014、028第3代病毒液不能凝集貓的紅細(xì)胞；100第5代病毒液能與貓的紅細(xì)胞凝集，HA值達(dá)10孔，滴度為1:1024。表3－4兔紅細(xì)胞凝集譜測定結(jié)果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－014、028第3代病毒液不能凝集兔的紅細(xì)胞；100第5代病毒液能與兔的紅細(xì)胞凝集，HA值達(dá)10孔，滴度為1:1024。表3－5凝集時間（min）T＝37毒株編號雞紅細(xì)胞牛紅細(xì)胞狗紅細(xì)胞貓紅細(xì)胞兔紅細(xì)胞01420－50－－02820－50－－10020305050120雞的紅細(xì)胞在20分鐘時即被凝集，牛的紅細(xì)胞需30分鐘，狗和貓的紅細(xì)胞需要50分鐘，兔的紅細(xì)胞需要兩個小時才可觀察到凝集效果。3小結(jié)和討論3.1HA、HI試驗發(fā)現(xiàn)本次創(chuàng)新研究分離出的3株病毒，各種反應(yīng)結(jié)果呈疑似流感病毒的特性，初步斷定為犬流感病毒。3.205年以來，大規(guī)模爆發(fā)的禽流感席卷全球，已經(jīng)引起了世界性的恐慌。據(jù)最近報道：泰國、德國等國家相繼出現(xiàn)貓感染禽流感事件；美國迄今為止雖然沒有發(fā)現(xiàn)禽流感，但已經(jīng)從犬中同樣分離到了流感病毒。經(jīng)研究表明，犬流感病毒是由血清型為H3N8的馬流感病毒變異而來，變異速度十分驚人，并且該病毒在狗與狗之間傳播非常迅速，其傳播形式與人流感及其類似，雖然目前還未見犬流感感染人的報道，但流感病毒及容易發(fā)生基因變異和重組，并可能跨物種傳播，進(jìn)而感染人類，危害人類的生命安全，根據(jù)之前禽流感病毒變異導(dǎo)致亞洲至少60人死亡的先例，本次犬流感病毒應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。而本次分離得的流感毒株在H5血清型上有比較高的血凝抑制價，極具進(jìn)一步研究的價值。3.3目前，在國外，犬流感病毒引起的呼吸道疾病在臨床癥狀上已經(jīng)有了基本的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是在國內(nèi)還沒有引起充分的重視，容易與其它呼吸道疾病混淆，本研究對分離株的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了部分的測定和探索，其毒力和致病性尚需要進(jìn)一步研究。3.4本次試驗采用血清學(xué)、生物特性等方法初步證實(shí)了我國犬流感病毒的存在，為其的下一步研究打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。從發(fā)病犬分離出流感病毒的數(shù)量和比例，也提示在我國寵物犬已開始受到流感病毒的威脅，因此，對于目前寵物熱的日趨高漲和人類自身的安全以及其對公共衛(wèi)生安全的影響來說，今后應(yīng)當(dāng)引起人們的重視。參考文獻(xiàn)：[1]郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗技術(shù)[M].北京:中國三峽出版社，1997:94.[2]傅繼