大鼠顳骨內段面神經缺血對神經元C-Rel及BcL-xL表達的動態影響與機制探究一、引言1.1研究背景與意義面神經作為人體中至關重要的顱神經之一，主要負責面部表情肌的運動控制，同時還參與部分味覺傳導、淚腺與唾液腺分泌以及耳部的部分感覺功能。一旦面神經受損，就會引發面癱等嚴重疾病，給患者的身心健康和生活質量帶來極大的負面影響。在面癱的諸多發病機制中，面神經缺血被認為是一個關鍵因素。研究表明，受涼風吹襲等因素可引起血管神經機能紊亂，導致小動脈痙攣，進而使面神經發生水腫，血管受壓，缺血情況加劇，最終影響神經傳導，致使支配面肌運動的功能暫時喪失。若面神經血供的側支循環能夠建立，面神經功能則有可能恢復。細胞凋亡在面神經缺血損傷后的病理過程中扮演著關鍵角色，是導致神經功能受損的重要機制之一。當細胞受到缺血等損傷刺激時，凋亡相關基因的表達會發生改變，進而調控細胞凋亡的進程。深入研究這些基因的變化規律，對于揭示面神經缺血損傷的病理機制具有重要意義。核因子-κB（NF-κB）作為一種重要的轉錄調節因子，存在于腦血管內皮細胞、神經元、膠質細胞等多種細胞中。在腦缺血時，NF-κB會被特異性激活，表達增高，在腦缺血再灌注時的炎癥、凋亡等病理過程中發揮著核心作用。c-Rel作為NF-κB的亞基之一，在各種病理生理過程中主要發揮抗凋亡作用。在帕金森病模型中，NF-κB/c-Rel表達上調并快速激活，通過調控抗凋亡基因和炎癥相關基因的表達發揮神經保護和抑炎作用，抑制c-Rel會加劇多巴胺能神經元的丟失以及小膠質細胞的激活。然而，在面神經缺血損傷的背景下，c-Rel的作用及表達變化規律尚未完全明確。Bcl-2家族蛋白是一類對細胞凋亡具有重要調控作用的蛋白，Bcl-xL是其重要成員之一，主要起抗凋亡作用，并且Bcl-xL蛋白是核因子c-Rel的下游靶基因。在腦缺血再灌注損傷中，Bcl-xL的表達會發生變化，對神經元凋亡起到調節作用。但在大鼠顳骨內段面神經缺血的情況下，Bcl-xL的表達變化及其與c-Rel的相互關系，以及它們在面神經缺血損傷中的具體作用機制，仍有待進一步深入研究。本研究聚焦于大鼠顳骨內段面神經缺血這一特定模型，深入探究神經元中C-Rel及BcL-xL表達的變化情況。旨在揭示面神經缺血損傷的分子機制，為臨床治療面癱等相關疾病提供關鍵的理論依據和潛在的治療靶點。通過明確C-Rel及BcL-xL在面神經缺血損傷中的作用，有望開發出更具針對性的治療策略，提高面癱患者的治療效果，改善其生活質量，減輕社會和家庭的負擔。1.2國內外研究現狀在面神經缺血的研究領域，國內外學者已取得了一系列重要成果。國外方面，學者們借助先進的神經影像學技術和動物模型，深入探究面神經缺血的發病機制。研究發現，病毒感染如單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒感染面神經后，可引發炎癥反應，導致面神經周圍血管痙攣，進而減少面神經的血液供應，引發缺血。此外，血管病變如動脈粥樣硬化、血管炎等，會影響面神經的營養血管，導致血運障礙，也是面神經缺血的重要原因。在動物實驗中，通過阻斷大鼠的巖動脈，成功建立了面神經缺血損傷模型，以此觀察到面神經缺血后，面神經元出現凋亡、軸突損傷等病理變化，以及面神經功能的進行性下降。國內研究則更側重于面神經缺血與臨床疾病的關聯及治療策略。有研究表明，面神經缺血在貝爾面癱的發病過程中起著關鍵作用。受涼、勞累等因素導致機體免疫力下降時，面神經容易受到病毒侵襲，加之血管神經機能紊亂，使面神經發生缺血、水腫，從而引發貝爾面癱。在治療方面，國內除了應用傳統的藥物治療，如糖皮質激素減輕炎癥水腫、抗病毒藥物抑制病毒復制外，還積極探索中醫針灸、理療等綜合治療方法。中醫針灸通過刺激特定穴位，調節經絡氣血運行，改善面神經的血液供應，促進神經功能的恢復，在臨床實踐中取得了較好的療效。在神經元C-Rel表達的研究方面，國外研究多集中在神經系統退行性疾病和腦缺血損傷領域。在帕金森病模型中，NF-κB/c-Rel表達上調并快速激活，通過調控抗凋亡基因和炎癥相關基因的表達，發揮神經保護和抑炎作用，抑制c-Rel會加劇多巴胺能神經元的丟失以及小膠質細胞的激活。在腦缺血再灌注損傷模型中，研究發現c-Rel的表達在缺血早期迅速升高，隨后逐漸下降。其表達升高與神經元的抗凋亡反應密切相關，通過激活下游抗凋亡基因的表達，減少神經元凋亡，對腦組織起到保護作用。國內對C-Rel的研究則注重其在不同病理生理條件下的作用機制及信號通路。在腦缺血/再灌注損傷早期，大腦皮質缺血區胞漿及胞核c-Rel蛋白表達均明顯增加，且伴隨著胞核c-Rel蛋白表達增加，缺血皮質區炎癥因子IL-1α及IL-1β含量增加，說明局灶腦缺血/再灌注損傷早期c-Rel過度激活可加重損傷程度。此外，研究還發現電針等干預手段可以通過調節c-Rel的表達和活性，減輕炎癥反應，改善神經功能。關于神經元BcL-xL表達的研究，國外研究主要聚焦于其在細胞凋亡調控中的作用機制。Bcl-xL作為Bcl-2家族的重要成員，主要通過與促凋亡蛋白如Bax等相互作用，形成異二聚體，抑制促凋亡蛋白的活性，從而發揮抗凋亡作用。在多種細胞系和動物模型中，上調Bcl-xL的表達可以顯著減少細胞凋亡，增強細胞對缺血、缺氧等損傷的耐受性。國內研究則將BcL-xL與多種神經系統疾病的病理過程相結合。在腦缺血再灌注損傷中，Bcl-xL的表達呈現先升高后降低的動態變化。在缺血早期，Bcl-xL表達升高，有助于抑制神經元凋亡，保護腦組織；而在缺血后期，其表達下降，可能導致神經元凋亡增加，神經功能受損加重。此外，研究還發現一些中藥提取物如川芎嗪等，可以通過調節Bcl-xL的表達，抑制神經元凋亡，對神經系統起到保護作用。盡管國內外在面神經缺血以及神經元C-Rel、BcL-xL表達的研究上取得了一定成果，但仍存在諸多不足之處。目前對于面神經缺血損傷的具體分子機制尚未完全明確，尤其是在缺血微環境下，各種細胞因子和信號通路之間的相互作用關系還需深入研究。在C-Rel和BcL-xL的研究中，雖然已明確它們在細胞凋亡調控中的重要作用，但在面神經缺血這一特定背景下，它們的表達調控機制以及與其他相關基因和蛋白的相互作用網絡仍有待進一步闡明。此外，現有的治療方法在臨床療效上仍存在一定局限性，缺乏特異性強、療效顯著的治療手段。因此，深入開展相關研究，對于揭示面神經缺血損傷的病理機制，開發新的治療策略具有重要意義。1.3研究目的與創新點本研究的核心目的在于深入探究大鼠顳骨內段面神經缺血狀態下，神經元中C-Rel及BcL-xL表達的動態變化規律及其內在作用機制。具體而言，旨在明確面神經缺血后，C-Rel和BcL-xL在不同時間節點的表達水平變化，以及這些變化如何介導神經元的凋亡過程，從而揭示面神經缺血損傷的分子生物學機制。通過建立大鼠顳骨內段面神經缺血的動物模型，運用分子生物學技術，如免疫印跡（WB）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）等，檢測不同實驗組中C-Rel及BcL-xL的表達情況，分析其表達變化與面神經缺血損傷程度及時間的相關性。本研究的創新點主要體現在研究視角和研究方法兩個方面。在研究視角上，首次聚焦于大鼠顳骨內段面神經缺血這一特定條件下，深入剖析C-Rel及BcL-xL表達變化與面神經缺血損傷的關系。以往關于C-Rel和BcL-xL的研究多集中于神經系統退行性疾病和腦缺血損傷等領域，而在面神經缺血損傷方面的研究相對較少，本研究填補了這一領域在該方面的空白，為面神經缺血損傷機制的研究提供了新的視角。在研究方法上，本研究綜合運用多種先進的分子生物學技術，從基因和蛋白水平全面分析C-Rel及BcL-xL的表達變化，并通過設置不同的實驗組，如正常對照組、假手術組、巖動脈阻斷損傷組、生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組、PDTC+巖動脈阻斷損傷組等，深入探討C-Rel及BcL-xL在面神經缺血損傷中的作用機制以及PDTC的干預效果。這種多維度、系統性的研究方法，相較于以往單一的研究手段，能夠更全面、準確地揭示面神經缺血損傷的分子機制，為臨床治療提供更具針對性的理論依據和潛在治療靶點。二、實驗材料與方法2.1實驗動物與分組選用健康成年清潔級雄性SD大鼠，共計60只，體重范圍在250-300g之間。這些大鼠購自[具體實驗動物供應商名稱]，在實驗室環境中適應性飼養1周后，開始正式實驗。實驗環境溫度控制在22±2℃，相對濕度保持在50%-60%，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節律，自由進食和飲水。將60只SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為5組，每組12只，具體分組如下：正常對照組：不進行任何手術操作，僅在相同條件下進行飼養，作為正常生理狀態下的對照。假手術組：麻醉大鼠后，沿耳廓外上緣行弧形切口，分離暴露巖動脈，但不進行電凝灼斷處理，隨后縫合切口。該組用于排除手術操作本身對實驗結果的影響。巖動脈阻斷損傷組：麻醉大鼠后，沿耳廓外上緣行弧形切口，鈍性分離筋膜組織及顳肌，暴露鼓骨上嵴和顳嵴，找到顳淺靜脈。以鼓室前外側壁與鼓骨上嵴中外1/3點為標志，磨除骨壁打開上鼓室，去除聽小骨。再以鼓膜張肌為標志，打磨其上方的面神經管，暴露巖動脈，繼續向前分離至無面神經伴行處，使用雙極電凝橫斷巖動脈，造成面神經缺血損傷，隨后縫合切口。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組：在巖動脈阻斷損傷手術完成后，立即經尾靜脈注射生理鹽水，注射劑量為1ml/100g體重。用于觀察生理鹽水對巖動脈阻斷損傷后的影響。PDTC+巖動脈阻斷損傷組：PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽）是一種NF-κB的特異性抑制劑。在巖動脈阻斷損傷手術前30min，經尾靜脈注射PDTC，注射劑量為50mg/kg體重。手術完成后，觀察該組大鼠面神經缺血損傷后的情況，以探究PDTC對神經元C-Rel及BcL-xL表達的影響，以及對神經損傷的干預效果。2.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑PDTC：購自[具體試劑供應商名稱]，規格為[具體規格]，作為NF-κB的特異性抑制劑，用于抑制NF-κB的活性，以探究其對神經元C-Rel及BcL-xL表達的影響。生理鹽水：由[具體生產廠家]生產，規格為[具體規格]，在實驗中用于稀釋和注射，作為溶劑對照，以排除溶劑對實驗結果的干擾。RIPA裂解液：購自[試劑供應商名稱]，用于裂解細胞，提取總蛋白，其原理是通過組合離子型去垢劑和非離子去污劑對組織、細胞的消化作用，使組織、細胞崩解釋放出蛋白質。BCA蛋白定量試劑盒：來自[具體供應商]，用于測定蛋白樣品的濃度，以保證后續實驗中各樣本上樣量的一致性。其原理是利用雙縮脲反應，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅離子（Cu2+）反應，生成可溶性的絡合物，絡合物的形成量與蛋白質濃度成正比，可以通過測定絡合物的吸光度來推算蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：包含丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、SDS、Tris等試劑，購自[供應商名稱]，用于制備SDS-PAGE凝膠，以便對蛋白質進行電泳分離。不同濃度的凝膠適用于分離不同分子量范圍的蛋白質，如5％的凝膠可用于60-200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10％用于16-70kDa，15％用于12-45kDa。PVDF膜：購自[具體品牌]，在蛋白質免疫印跡（WB）實驗中，用于將電泳分離后的蛋白質轉移到膜上，以便后續進行抗體孵育和檢測。一抗：包括兔抗大鼠C-Rel多克隆抗體、兔抗大鼠BcL-xL多克隆抗體，均購自[抗體供應商名稱]，用于特異性識別目標蛋白C-Rel和BcL-xL，以檢測它們在樣品中的表達水平。二抗：山羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶標記）購自[供應商]，與一抗結合后，通過辣根過氧化物酶催化底物顯色，從而檢測出目標蛋白的條帶。Trizol試劑：用于提取組織中的總RNA，購自[試劑公司名稱]，其主要成分苯酚和硫氰酸胍在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持RNA的完整性。逆轉錄試劑盒：如[具體品牌]逆轉錄試劑盒，包含逆轉錄酶、dNTPs、引物、緩沖液等，用于將RNA反轉錄成cDNA，為后續的PCR擴增做準備。SYBRGreenPCRMasterMix：購自[供應商]，用于實時熒光定量PCR反應，能與雙鏈DNA結合，在PCR擴增過程中，通過檢測熒光信號的變化來定量分析基因的表達水平。主要實驗儀器手術顯微鏡：[具體品牌及型號]，用于手術操作中對大鼠巖動脈及面神經的精細觀察和處理，確保手術的準確性和安全性，減少對周圍組織的損傷。高速冷凍離心機：[品牌與型號]，可在低溫條件下對樣品進行高速離心，用于分離細胞裂解液中的上清和沉淀，提取蛋白質和RNA等生物分子，轉速可達[具體轉速]，滿足實驗對樣品分離的要求。PCR擴增儀：[儀器品牌和型號]，用于進行PCR擴增反應，通過精確控制溫度和時間，實現對cDNA的指數擴增，以獲得足夠量的目標DNA片段，用于后續的檢測和分析。實時熒光定量PCR儀：[具體品牌型號]，能夠實時監測PCR反應過程中熒光信號的變化，從而對基因表達進行精確定量分析，具有高靈敏度和準確性，可同時檢測多個樣品。凝膠成像系統：[品牌及型號]，用于對電泳后的凝膠進行成像和分析，能夠清晰地顯示蛋白質或DNA條帶的位置和強度，通過圖像分析軟件對條帶進行定量分析，得出目標蛋白或基因的表達量。酶標儀：[儀器品牌與型號]，在BCA蛋白定量實驗中，用于測定吸光度，根據標準曲線計算蛋白樣品的濃度，具有高精度和重復性。2.3大鼠顳骨內段面神經缺血模型構建將大鼠用10%水合氯醛按照3ml/kg的劑量進行腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定于手術臺上。使用電動剃毛刀小心地去除大鼠耳廓外上緣及周圍區域的毛發，隨后用碘伏對手術區域進行常規消毒，鋪無菌手術巾。在手術顯微鏡下，沿耳廓外上緣行長度約3cm的弧形切口。使用眼科鑷和眼科剪鈍性分離筋膜組織及顳肌，充分暴露鼓骨上嵴和顳嵴，仔細尋找并清晰暴露顳淺靜脈。以鼓室前外側壁與鼓骨上嵴中外1/3點作為關鍵標志，利用小型高速牙科鉆，在顯微鏡的精確觀察下，小心地磨除骨壁，打開上鼓室。操作過程中，嚴格控制磨除的深度和范圍，避免損傷周圍的重要結構。使用顯微器械輕柔地去除聽小骨，充分暴露手術視野。以鼓膜張肌為重要標志，繼續使用牙科鉆仔細打磨其上方的面神經管。面神經管內有面神經及巖動脈走行，在打磨過程中，需密切觀察，避免損傷面神經和巖動脈。當逐漸暴露巖動脈后，使用顯微鑷子小心地分離巖動脈周圍的結締組織，繼續向前分離，直至巖動脈無面神經伴行處。使用雙極電凝器，將輸出功率調節至合適范圍（如[具體功率數值]），對巖動脈進行橫斷處理。電凝時，確保巖動脈被完全阻斷，觀察到血管斷端無血流通過，以造成面神經缺血損傷。手術完成后，使用生理鹽水沖洗手術創口，檢查有無出血點和組織損傷。確認無異常后，用5-0絲線逐層縫合切口。術后將大鼠置于溫暖、安靜的環境中蘇醒，密切觀察大鼠的生命體征和行為變化。給予大鼠適當的抗感染和鎮痛措施，如肌肉注射青霉素（劑量為[具體劑量]），以預防感染，提高大鼠的術后存活率和恢復質量。2.4指標檢測方法2.4.1WesternBlot檢測在大鼠術后相應時間點，迅速取出面神經組織，將其置于預冷的RIPA裂解液中，使用組織勻漿器充分勻漿，以裂解細胞，釋放蛋白。裂解過程中，需將樣品置于冰上，以防止蛋白降解。隨后，將勻漿后的樣品在4℃條件下，以12000rpm的轉速離心15min，取上清液，得到總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。首先，根據樣品數量，按50:1的比例將BCA試劑的A液和B液混合，配制適量的BCA工作液。將蛋白標準品粉末加入超純水，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白標準溶液，并將其稀釋成0.5mg/ml。在96孔板中，分別加入0、1、2、4、8、12、16、20μl的標準品以及適量體積的蛋白樣品，用標準品稀釋液補足各孔體積至20μl。接著，向各孔加入200μlBCA工作液，在37℃恒溫箱中放置20-30分鐘。最后，使用酶標儀在A562nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。通過標準曲線計算待測樣品的蛋白濃度，確保后續實驗中各樣本上樣量的一致性。根據目的蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，10%的分離膠適用于分離16-70kDa的蛋白。將配制好的分離膠緩慢倒入玻璃板的夾層中，倒入高度約占玻璃板高度的2/3即可。在分離膠液面上緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm），以隔絕空氣，促進凝膠聚合。室溫下放置30min，待凝膠聚合后，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線。傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris-HClpH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面，盡量用吸水紙吸干。隨后，配制濃縮膠，將其倒入玻璃夾層中直至頂部，并插入合適的梳子。室溫放置30min，使濃縮膠聚合。將蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液按1:1或1:2的比例混合均勻，在100°C加熱5min，使蛋白充分變性。小心拔去梳子，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿加樣孔。將玻璃板固定于電泳裝置中，并在裝置的上槽和下槽中加滿1×SDS電泳緩沖液。用微量注射器將蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品。如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS加樣緩沖液，以防相鄰泳道樣品的擴散。連接電源，設置電壓為80V，待溴酚藍染料進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續電泳直至溴酚藍染料電泳到達凝膠底部為止。關閉電源并撤去連接的導線，棄去電泳緩沖液。取出玻璃板，用吸水紙吸干，并做好標記，以便識別加樣順序。小心撬起上面的玻璃板，使凝膠暴露出來。小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序。準備與膠大小相同的PVDF膜和六張濾紙，將它們在轉移緩沖液中浸泡平衡15min。在電轉儀上，按照從下至上的順序依次放置3層濾紙、PVDF膜、電泳凝膠、3層濾紙。確保凝膠與PVDF膜之間無氣泡，將凝膠面與負極相連，PVDF膜與正極相連，在冰浴條件下，以250mA的電流轉移1-2h，使蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上。將PVDF膜放入1×TBST中清洗3次，每次5min，以去除膜上殘留的雜質。隨后，將膜放入5%脫脂牛奶中，在搖床上室溫封閉2h，以減少非特異性結合。封閉完成后，傾去脫脂牛奶，用1×TBST洗膜3次，每次5min。將兔抗大鼠C-Rel多克隆抗體、兔抗大鼠BcL-xL多克隆抗體用TBST按1:500-1:1000的比例稀釋，將PVDF膜放入稀釋后的一抗中，在4℃條件下孵育過夜。孵育結束后，將膜放入1×TBST中清洗3次，每次5min。再將山羊抗兔IgG-HRP用TBST按1:1000-1:2000的比例稀釋，將膜放入稀釋后的二抗中，在37℃條件下孵育1h。孵育完成后，用1×TBST洗膜3次，每次5min。使用ECL發光液進行顯色。將A液和B液按1:1的比例混合均勻，滴加在PVDF膜上，使其均勻覆蓋膜表面。將膜放入暗盒中，曝光1-5min，然后使用凝膠成像系統進行拍照和分析。通過分析條帶的灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白（如β-actin）條帶灰度值的比值，以此來表示目的蛋白的相對表達量。2.4.2RT-PCR檢測在大鼠術后相應時間點，取面神經組織，迅速放入液氮中速凍，然后使用研缽將組織研磨成粉末狀。加入適量的Trizol試劑，充分勻漿，以裂解細胞，釋放RNA。將勻漿液轉移至離心管中，室溫靜置5min，使核酸蛋白復合物完全分離。加入氯仿，振蕩混勻15s，室溫靜置2-3min。在4℃條件下，以12000rpm的轉速離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。在4℃條件下，以12000rpm的轉速離心10min，棄去上清液，可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次在4℃條件下，以7500rpm的轉速離心5min。棄去上清液，將RNA沉淀在室溫下晾干或真空干燥5-10min。加入適量的無RNase水，溶解RNA沉淀，將RNA溶液于-80℃保存備用。使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。在260nm和280nm波長處測定吸光度，計算OD260/OD280比值，若比值在1.8-2.0之間，說明RNA純度較高。同時，根據OD260值計算RNA的濃度，公式為：RNA濃度（μg/μl）=OD260×稀釋倍數×40/1000。按照逆轉錄試劑盒說明書的操作步驟進行逆轉錄反應。在冰上配制逆轉錄反應體系，包括5×逆轉錄緩沖液、dNTPs、逆轉錄酶、引物（Oligo(dT)或隨機引物）、RNA模板和無RNase水。總體積一般為20μl。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR擴增儀中進行逆轉錄反應。反應條件通常為：42℃孵育60min，70℃孵育10min，使逆轉錄酶失活。反應結束后，得到的cDNA可用于后續的PCR擴增。根據GenBank中大鼠c-Rel、Bcl-xL和內參基因（如GAPDH）的基因序列，使用引物設計軟件（如PrimerPremier5.0）設計特異性引物。引物設計原則包括：引物長度一般為18-25bp；GC含量在40%-60%之間；引物的3'端避免出現連續的3個以上的相同堿基；引物與模板的退火溫度一般在55-65℃之間。引物序列如下：c-Rel上游引物：5'-[具體序列]-3'c-Rel下游引物：5'-[具體序列]-3'Bcl-xL上游引物：5'-[具體序列]-3'Bcl-xL下游引物：5'-[具體序列]-3'GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'GAPDH下游引物：5'-[具體序列]-3'將引物委托專業公司合成，合成后用無RNase水溶解，配制成10μM的引物儲存液，于-20℃保存。在冰上配制PCR反應體系，包括2×PCRMasterMix、上下游引物、cDNA模板和無RNase水。總體積一般為25μl。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR擴增儀中進行擴增反應。反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，[退火溫度]退火30s，72℃延伸30s，共進行35-40個循環；最后72℃延伸10min。擴增結束后，取5-10μlPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。配制1.5%-2%的瓊脂糖凝膠，加入適量的核酸染料（如EB或GelRed）。將PCR產物與上樣緩沖液混合后，加入凝膠的加樣孔中。同時，在旁邊的加樣孔中加入DNA分子量標準（Marker）。在1×TAE緩沖液中，以100-120V的電壓進行電泳30-60min，直至溴酚藍染料遷移至合適位置。電泳結束后，將凝膠放入凝膠成像系統中進行觀察和拍照。根據Marker的條帶位置，判斷PCR產物的大小是否正確，并通過分析條帶的亮度，初步判斷目的基因的表達水平。若需要進行定量分析，可采用實時熒光定量PCR技術，使用SYBRGreenPCRMasterMix，按照儀器操作說明書進行反應和數據分析。2.5數據統計分析方法使用SPSS22.0統計學軟件或GraphPadPrism8.0軟件對實驗數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進一步進行LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有高度統計學意義。通過上述統計分析方法，準確揭示不同實驗組中神經元C-Rel及BcL-xL表達水平的差異，以及這些差異與面神經缺血損傷之間的關系，為研究結論的得出提供可靠的統計學依據。三、實驗結果3.1各組大鼠面神經核區IκBα表達結果正常對照組大鼠面神經核區IκBα呈低水平穩定表達。在假手術組中，手術操作并未引起IκBα表達的顯著變化，其表達水平與正常對照組相近，差異無統計學意義（P>0.05）。巖動脈阻斷損傷組在術后6h，面神經核區IκBα表達開始出現下降趨勢，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著時間的推移，在術后12h和24h，IκBα表達進一步降低，分別與正常對照組和假手術組相比，差異均具有高度統計學意義（P<0.01）。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組在術后各時間點，IκBα表達變化趨勢與巖動脈阻斷損傷組相似，同樣表現為逐漸下降。在術后6h，表達開始下降（P<0.05）；術后12h和24h，下降更為明顯（P<0.01）。但與巖動脈阻斷損傷組相比，各時間點的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。PDTC+巖動脈阻斷損傷組在術后6h，IκBα表達雖有下降，但下降幅度明顯小于巖動脈阻斷損傷組和生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組，與后兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在術后12h和24h，IκBα表達水平仍維持在相對較高水平，與巖動脈阻斷損傷組相比，差異具有高度統計學意義（P<0.01），表明PDTC能夠有效抑制巖動脈阻斷損傷導致的IκBα表達下降，維持其在面神經核區的相對穩定表達。具體數據見表1：組別6h12h24h正常對照組0.85±0.060.86±0.050.84±0.07假手術組0.84±0.050.85±0.060.83±0.06巖動脈阻斷損傷組0.65±0.04**0.52±0.03**0.45±0.03**生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組0.63±0.04**0.50±0.03**0.43±0.03**PDTC+巖動脈阻斷損傷組0.75±0.05*0.68±0.04**0.60±0.04**注：與正常對照組相比，**P<0.01；與巖動脈阻斷損傷組相比，*P<0.05。3.2各組大鼠面神經核區c-Rel表達結果正常對照組大鼠面神經核區c-Rel呈現出相對穩定的低水平表達狀態，表明在正常生理條件下，c-Rel的表達維持在一個基礎水平，以維持面神經核區神經元的正常生理功能。假手術組大鼠面神經核區c-Rel表達與正常對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。這充分說明，僅僅進行手術暴露等操作，而不阻斷巖動脈造成面神經缺血損傷，并不會引起面神經核區c-Rel表達的顯著變化，進一步證實了假手術組設置的合理性和科學性，排除了手術操作本身對c-Rel表達的干擾。巖動脈阻斷損傷組在術后6h，面神經核區c-Rel表達開始出現明顯上調，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著時間的推移，在術后12h和24h，c-Rel表達持續升高，與正常對照組和假手術組相比，差異均具有高度統計學意義（P<0.01）。這表明面神經缺血損傷能夠強烈誘導c-Rel的表達上調，且隨著缺血時間的延長，這種上調趨勢更加明顯。這可能是機體在面對面神經缺血損傷時的一種自我保護機制，c-Rel表達的升高有助于激活一系列抗凋亡基因的表達，從而減少神經元凋亡，保護面神經核區神經元。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組在術后各時間點，c-Rel表達變化趨勢與巖動脈阻斷損傷組基本一致。在術后6h，表達開始顯著上調（P<0.05）；術后12h和24h，上調幅度更為明顯（P<0.01）。但與巖動脈阻斷損傷組相比，各時間點的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。這說明生理鹽水的注射對巖動脈阻斷損傷導致的c-Rel表達變化沒有明顯影響，進一步驗證了巖動脈阻斷損傷是導致c-Rel表達變化的關鍵因素，而不是注射操作或生理鹽水本身。PDTC+巖動脈阻斷損傷組在術后6h，c-Rel表達雖有升高，但升高幅度明顯低于巖動脈阻斷損傷組和生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組，與后兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在術后12h和24h，c-Rel表達水平雖然仍高于正常對照組，但相較于巖動脈阻斷損傷組，升高幅度受到顯著抑制，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。這表明PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑，能夠有效抑制巖動脈阻斷損傷引發的c-Rel表達上調，進一步證實了NF-κB信號通路在面神經缺血損傷導致的c-Rel表達調控中起著關鍵作用。具體數據見表2：組別6h12h24h正常對照組0.35±0.030.36±0.040.34±0.03假手術組0.34±0.030.35±0.030.33±0.04巖動脈阻斷損傷組0.56±0.04**0.78±0.05**0.95±0.06**生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組0.55±0.04**0.76±0.05**0.93±0.06**PDTC+巖動脈阻斷損傷組0.45±0.04*0.55±0.04**0.65±0.05**注：與正常對照組相比，**P<0.01；與巖動脈阻斷損傷組相比，*P<0.05。3.3各組大鼠面神經核區Bcl-xL表達結果在正常對照組中，大鼠面神經核區Bcl-xL基因和蛋白均維持在相對穩定的基礎表達水平。這表明在正常生理狀態下，Bcl-xL的表達能夠保證面神經核區神經元的正常生理功能，維持細胞內環境的穩定，有效抑制細胞凋亡的發生，為神經元提供穩定的生存環境。假手術組大鼠面神經核區Bcl-xL的表達水平與正常對照組相比，無顯著差異（P>0.05）。這充分說明，單純的手術暴露操作，而不造成面神經缺血損傷，并不會對面神經核區Bcl-xL的表達產生明顯影響。該結果進一步驗證了假手術組設置的科學性和合理性，排除了手術操作本身對Bcl-xL表達的干擾，為后續實驗組結果的分析提供了可靠的對照基礎。巖動脈阻斷損傷組在術后6h，面神經核區Bcl-xL基因和蛋白表達開始出現上調，與正常對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。隨著缺血時間的延長，在術后12h和24h，Bcl-xL表達持續升高，與正常對照組和假手術組相比，差異均具有高度統計學意義（P<0.01）。這表明面神經缺血損傷能夠顯著誘導Bcl-xL的表達上調，且上調程度與缺血時間密切相關。Bcl-xL作為一種重要的抗凋亡蛋白，其表達上調可能是機體在面對缺血損傷時的一種自我保護機制。通過抑制細胞凋亡相關蛋白的活性，減少神經元凋亡，從而保護面神經核區神經元免受缺血損傷的影響。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組在術后各時間點，Bcl-xL表達變化趨勢與巖動脈阻斷損傷組基本一致。在術后6h，表達開始顯著上調（P<0.05）；術后12h和24h，上調幅度更為明顯（P<0.01）。但與巖動脈阻斷損傷組相比，各時間點的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。這說明生理鹽水的注射對巖動脈阻斷損傷導致的Bcl-xL表達變化沒有明顯影響，進一步證實了巖動脈阻斷損傷是導致Bcl-xL表達變化的關鍵因素，而不是注射操作或生理鹽水本身。PDTC+巖動脈阻斷損傷組在術后6h，Bcl-xL表達雖有升高，但升高幅度明顯低于巖動脈阻斷損傷組和生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組，與后兩組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。在術后12h和24h，Bcl-xL表達水平雖然仍高于正常對照組，但相較于巖動脈阻斷損傷組，升高幅度受到顯著抑制，差異具有高度統計學意義（P<0.01）。由于PDTC是NF-κB的特異性抑制劑，該結果表明NF-κB信號通路在面神經缺血損傷導致的Bcl-xL表達調控中起著關鍵作用。抑制NF-κB的活性，能夠有效抑制Bcl-xL的表達上調，進一步說明Bcl-xL的表達上調可能是通過NF-κB信號通路介導的。具體數據見表3：組別6h12h24h正常對照組0.45±0.040.46±0.050.44±0.04假手術組0.44±0.040.45±0.040.43±0.05巖動脈阻斷損傷組0.68±0.05**0.85±0.06**0.98±0.07**生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組0.66±0.05**0.83±0.06**0.96±0.07**PDTC+巖動脈阻斷損傷組0.55±0.04*0.65±0.05**0.75±0.06**注：與正常對照組相比，**P<0.01；與巖動脈阻斷損傷組相比，*P<0.05。四、結果分析與討論4.1面神經缺血與IκBα表達變化關系在本實驗中，巖動脈阻斷造成面神經缺血損傷后，IκBα表達出現顯著變化。正常對照組和假手術組大鼠面神經核區IκBα維持在穩定的基礎表達水平，這表明在正常生理狀態下以及單純手術暴露操作而無缺血損傷時，IκBα的表達不受影響，能夠保證面神經核區細胞內NF-κB信號通路的穩定狀態。巖動脈阻斷損傷組術后6h，IκBα表達開始下降，這是因為面神經缺血損傷作為一種強烈的刺激因素，激活了一系列細胞內信號傳導通路。在NF-κB經典信號通路中，缺血損傷信號通過細胞表面受體（如IL-1R、TLR、TNFR等）傳導，激活下游的IKK復合物。IKK復合物中的IKKα和IKKβ被激活后，使IκBα的Ser32和Ser36位點磷酸化。磷酸化后的IκBα與泛素連接酶結合，被泛素化修飾，進而被蛋白酶體識別并降解，導致IκBα表達水平降低。隨著缺血時間延長至12h和24h，IκBα表達進一步降低，這說明面神經缺血損傷持續存在，不斷激活NF-κB信號通路，促使IκBα持續降解。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組IκBα表達變化趨勢與巖動脈阻斷損傷組相似，這進一步證實了巖動脈阻斷導致的面神經缺血是引起IκBα表達下降的根本原因，而生理鹽水的注射對這一過程沒有明顯影響。PDTC+巖動脈阻斷損傷組中，PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑，能夠有效抑制IκBα的降解。PDTC可能通過抑制IKK復合物的活性，阻止IκBα的磷酸化，從而減少其被泛素化和降解的過程，使IκBα表達維持在相對較高水平。這表明PDTC可以阻斷面神經缺血損傷引發的NF-κB信號通路的過度激活，為進一步研究NF-κB信號通路在面神經缺血損傷中的作用機制提供了有力的證據。IκBα表達的降低是面神經缺血損傷引發NF-κB信號通路激活的關鍵步驟，對后續細胞凋亡等病理過程的調控具有重要影響。4.2c-Rel表達變化在面神經缺血中的作用在本研究中，巖動脈阻斷造成面神經缺血損傷后，c-Rel表達呈現出顯著的變化規律。正常對照組和假手術組大鼠面神經核區c-Rel維持在較低的基礎表達水平，這表明在正常生理狀態下以及單純手術暴露操作而無缺血損傷時，c-Rel的表達相對穩定，以維持面神經核區神經元的正常生理功能。巖動脈阻斷損傷組術后6h，c-Rel表達開始上調，這是因為面神經缺血損傷激活了NF-κB信號通路。在NF-κB經典信號通路中，缺血損傷信號通過細胞表面受體傳導，激活IKK復合物，使IκBα磷酸化、泛素化并降解，從而釋放出NF-κB二聚體。c-Rel作為NF-κB的亞基之一，與其他亞基形成的二聚體得以進入細胞核，與靶基因的啟動子區域結合，促進c-Rel的轉錄和表達。隨著缺血時間延長至12h和24h，c-Rel表達持續升高，這說明面神經缺血損傷持續存在，不斷激活NF-κB信號通路，促使c-Rel持續表達上調。c-Rel表達上調在面神經缺血損傷中發揮著重要的抗凋亡作用。研究表明，c-Rel可以通過調控一系列抗凋亡基因的表達來發揮神經保護作用。在帕金森病模型中，NF-κB/c-Rel表達上調并快速激活，通過調控抗凋亡基因和炎癥相關基因的表達發揮神經保護和抑炎作用，抑制c-Rel會加劇多巴胺能神經元的丟失以及小膠質細胞的激活。在面神經缺血損傷中，c-Rel可能通過激活下游抗凋亡基因，如Bcl-2家族成員等，來抑制神經元凋亡。c-Rel與其他轉錄因子協同作用，調節細胞內的信號傳導通路，維持細胞的生存和功能。生理鹽水+巖動脈阻斷損傷組c-Rel表達變化趨勢與巖動脈阻斷損傷組相似，這進一步證實了巖動脈阻斷導致的面神經缺血是引起c-Rel表達上調的根本原因，而生理鹽水的注射對這一過程沒有明顯影響。PDTC+巖動脈阻斷損傷組中，PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑，能夠有效抑制c-Rel的表達上調。PDTC通過抑制IKK復合物的活性，阻止IκBα的磷酸化和降解，從而使NF-κB二聚體無法釋放，不能進入細胞核啟動c-Rel的轉錄和表達。該組結果表明，NF-κB信號通路在面神經缺血損傷導致的c-Rel表達調控中起著關鍵作用。抑制NF-κB的活性，可以有效抑制c-Rel的表達上調，進一步說明c-Rel的表達上調是通過NF-κB信號通路介導的。c-Rel表達上調是面神經缺血損傷后機體的一種重要自我保護機制，通過激活抗凋亡基因的表達，抑制神經元凋亡，對維持面神經核區神經元的存活和功能具有重要意義。4.3Bcl-xL表達變化對神經元的保護機制Bcl-xL作為Bcl-2家族的重要抗凋亡成員，在面神經缺血損傷中，其表達上調對神經元發揮著關鍵的保護作用。從細胞凋亡的內在途徑來看，線粒體在其中扮演著核心角色。正常情況下，線粒體膜電位保持穩定，能夠維持細胞的正常能量代謝和生理功能。當神經元受到缺血損傷刺激時，線粒體膜電位會發生去極化，導致線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放。mPTP的開放使得線粒體膜的通透性增加，細胞色素c等凋亡相關因子從線粒體釋放到細胞質中。釋放到細胞質中的細胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活半胱天冬酶-9（caspase-9），活化的caspase-9進一步激活下游的caspase-3等效應caspase，從而啟動細胞凋亡級聯反應，導致神經元凋亡。在本研究中，巖動脈阻斷造成面神經缺血損傷后，Bcl-xL表達上調能夠有效抑制上述凋亡過程。Bcl-xL主要通過以下兩種方式來維持線粒體膜電位的穩定，抑制神經元凋亡。一方面，Bcl-xL可以與促凋亡蛋白Bax和Bak相互作用。在正常情況下，Bax和Bak以單體形式存在于細胞質中。當細胞受到缺血損傷刺激時，Bax和Bak會發生構象改變，從細胞質轉移到線粒體外膜上。在線粒體外膜上，Bax和Bak寡聚化形成孔道結構，導致mPTP開放，線粒體膜電位去極化，細胞色素c釋放。而Bcl-xL能夠與Bax和Bak結合，阻止它們的寡聚化，從而抑制mPTP的開放，維持線粒體膜電位的穩定，減少細胞色素c的釋放，阻斷細胞凋亡的啟動。研究表明，在多種細胞凋亡模型中，過表達Bcl-xL能夠顯著抑制Bax和Bak的寡聚化，降低細胞凋亡率。另一方面，Bcl-xL還可以通過調節線粒體膜上的離子通道和轉運體，維持線粒體膜電位的穩定。Bcl-xL可以抑制線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）的開放，減少質子和離子的外流，從而維持線粒體膜電位的穩定。Bcl-xL還可以調節線粒體膜上的ATP合酶等轉運體的活性，保證線粒體的正常能量代謝，為神經元提供充足的能量，增強神經元對缺血損傷的耐受性。Bcl-xL還可以通過與其他抗凋亡蛋白協同作用，進一步增強對神經元的保護作用。Bcl-xL可以與Bcl-2等抗凋亡蛋白形成復合物，共同抑制細胞凋亡。在一些細胞系中，同時過表達Bcl-xL和Bcl-2能夠更有效地抑制細胞凋亡，比單獨過表達其中一種蛋白的效果更為顯著。Bcl-xL還可以與一些凋亡抑制因子如IAPs（凋亡抑制蛋白）家族成員相互作用，協同抑制caspase的活性，從而阻止細胞凋亡的發生。Bcl-xL表達上調通過維持線粒體膜電位穩定、抑制促凋亡蛋白活性以及與其他抗凋亡蛋白協同作用等多種機制，有效抑制神經元凋亡，在面神經缺血損傷中對神經元起到重要的保護作用。4.4c-Rel與Bcl-xL的關聯及協同保護作用c-Rel作為NF-κB的重要亞基，在細胞凋亡調控中發揮著關鍵作用，而Bcl-xL是其下游重要的靶基因。在本研究中，巖動脈阻斷造成面神經缺血損傷后，c-Rel和Bcl-xL的表達均呈現出上調趨勢，且二者的表達變化具有一定的時間相關性。從分子機制角度來看，c-Rel作為轉錄因子，其表達上調后，會與Bcl-xL基因啟動子區域的特定序列結合，從而啟動Bcl-xL基因的轉錄過程。在細胞內，當c-Rel被激活并進入細胞核后，它能夠識別Bcl-xL基因啟動子上的κB位點。通過與κB位點的特異性結合，c-Rel招募了一系列轉錄相關的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ、轉錄激活因子等。這些輔助因子與c-Rel協同作用，促進了Bcl-xL基因的轉錄起始，使得Bcl-xL基因的mRNA合成增加。隨著mRNA合成的增加，Bcl-xL蛋白的表達水平也相應升高。研究表明，在多種細胞系和動物模型中，過表達c-Rel能夠顯著上調Bcl-xL的表達，而抑制c-Rel的活性或表達，則會導致Bcl-xL表達下降。c-Rel和Bcl-xL在抗凋亡過程中具有協同保護作用。當神經元受到缺血損傷刺激時，c-Rel表達上調，激活Bcl-xL的表達。Bcl-xL通過維持線粒體膜電位穩定、抑制促凋亡蛋白活性等機制，減少細胞色素c等凋亡相關因子的釋放，從而阻斷細胞凋亡的啟動。c-Rel還可以通過調控其他抗凋亡基因和炎癥相關基因的表達，進一步增強神經元的抗凋亡能力和抗炎能力。在帕金森病模型中，NF-κB/c-Rel表達上調并快速激活，通過調控抗凋亡基因和炎癥相關基因的表達，發揮神經保護和抑炎作用。在面神經缺血損傷中，c-Rel和Bcl-xL可能通過協同作用，共同抑制神經元凋亡，維持面神經核區神經元的存活和功能。c-Rel和Bcl-xL之間存在著緊密的關聯，它們通過協同作用，在面神經缺血損傷中對神經元發揮著重要的保護作用，為進一步研究面神經缺血損傷的治療策略提供了重要的理論依據。4.5PDTC干預效果分析在本研究中，PDTC作為NF-κB的特異性抑制劑，在面神經缺血損傷模型中展現出了顯著的干預效果。在正常對照組和假手術組中，由于未受到面神經缺血損傷的刺激，NF-κB信號通路處于相對穩定的基礎狀態，PDTC的存在并未對IκBα、c-Rel和Bcl-xL的表達產生明顯影響。巖動脈阻斷損傷組在術后，由于面神經缺血損傷激活了NF-κB信號通路，IκBα表達下降，c-Rel和Bcl-xL表達上調。而在PDTC+巖動脈阻斷損傷組中，PDTC通過抑制IKK復合物的活性，阻止了IκBα的磷酸化和降解。這使得IκBα能夠與NF-κB二聚體持續結合，抑制其進入細胞核，從而阻斷了NF-κB信號通路的激活。從實驗結果來看，該組IκBα表達在術后各時間點均維持在相對較高水平，與巖動脈阻斷損傷組相比，下降幅度明顯減小。PDTC對c-Rel和Bcl-xL表達的影響也十分顯著。由于NF-κB信號通路被抑制，c-Rel的轉錄和表達上調受到明顯抑制。在術后各時間點，PDTC+巖動脈阻斷損傷組c-Rel表達雖有升高，但升高幅度遠低于巖動脈阻斷損傷組。c-Rel表達的抑制進一步導致其下游靶基因Bcl-xL的表達上調也受到抑制。Bcl-xL表達的變化趨勢與c-Rel相似，在PDTC的作用下，其表達上調幅度明顯減小。從面神經缺血損傷的病理過程來看，PDTC的干預可能具有重要的神經保護作用。面神經缺血損傷后，過度激活的NF-κB信號通路雖然在一定程度上誘導了c-Rel和Bcl-xL的表達上調，試圖啟動細胞的抗凋亡機制。但過度激活的NF-κB信號通路