藥用植物細胞培養技術規程

編制說明

提出單位：珍稀瀕危藥用植物國家地方聯合工程研究中心

歸口單位：中華中醫藥學會

起草單位：珍稀瀕危藥用植物國家地方聯合工程研究中心，

中國中醫科學院中藥資源中心，大連普瑞康生物技術有限公

司，廣西藥用植物園，安徽中醫藥大學，大連源盛泰醫療投

資股份有限公司、北京同仁堂健康藥業有限公司、浙江中醫

藥大學

主要起草人：黃璐琦、劉漢石、袁媛

起草人：黃璐琦、劉漢石、袁媛、劉雅萍、秦雙雙、劉禹、

李曉琳、謝冬梅、陳梓、金銀兵、趙玉洋、張顯林、周駿輝、

吳俊罡、趙喬、黃利、張宏、朱愛松

二〇二一年十二月

目次

一、工作簡況……………………1

二、主要技術內容……………2

三、主要編制過程……………2

四、與國內外同類標準的對比和最新標準采用情況…………14

五、與現行強制性國家標準或政策法規的關系…14

六、代表性分歧意見的處理經過和依據……………14

七、宣傳、貫徹標準和后效評價標準的要求和措施…………14

八、廢止現行有關標準的建議…………16

九、相關附錄……………………16

一、工作簡況

1.任務背景

藥用植物細胞工程已越來越多應用到中藥資源開發中。利用

藥用植物細胞培養來生產藥用活性成分或補充藥物資源已成為

稀瀕危藥用植物可持續發展的重要途徑。2019年“天山雪蓮、

人參等藥用植物細胞和不定根培養及產業化關鍵技術”獲得國家

科技進步二等獎。迄今通過植物細胞工程培養的藥用植物細胞已

有400多種，其中有60多種代謝物含量高于或等于原植物。人

參、紫草、報春花、洋地黃、天山雪蓮等藥用植物細胞已實現了

工業化生產，以藥用植物細胞為原料開發出的保健品、化妝品產

值已超過30億。因此，我國藥用植物細胞培養具有很大的開發

潛力。

藥用植物細胞培養是用來生產藥用活性成分或進行藥用植

物無性系快速繁殖的生物技術。完全采用植物細胞培養技術得到

的細胞可能會缺乏生成產物的能力或生產能力不穩定，有時需要

選擇性誘導環節，以增加活性成分的產量。

目前國內動物細胞體外培養技術成熟，已建立相關的國家標

準，如GB/T24863-2010禽畜動物細胞體外培養和保存技術規程。

植物組培技術也已制定了相關行業和地方標準，如LY/T

1882-2010林木組織培養育苗技術規程、NY/T2306-2013花卉種

苗組培快繁技術規程、DB/T752-2009植物種苗快繁技術規程等。

但藥用植物細胞培養相關的技術規程或標準尚處于空白，缺乏規

范的培養技術規程，會導致培養過程出現污染、褐變、玻璃化、

細胞缺乏生成產物的能力或生產能力不穩定、生產中質控混亂等

問題，最終造成人力、物力、財力和時間上的巨大浪費。例如清

洗與滅菌、培養基配制等操作不規范易造成污染。培養基組成和

配制的差異會造成玻璃化、缺乏生成產物能力等。因此亟需制定

一個統一的的藥用植物細胞培養的標準總則。

本標準的建立和實施，可指導和規范藥用植物細胞培養的科

學研究和生產，提高藥用植物細胞培養物的品質，與國際接軌，

1

有助于促進國際貿易，具有廣闊的應用前景。

2.任務來源

任務來源于國家863計劃《藥食同源重要功能因子提取、分

離及規模化生物合成關鍵技術研究》（2014AA022201）。

3.標準起草單位

珍稀瀕危藥用植物國家地方聯合工程研究中心，中國中醫科

學院中藥資源中心，大連普瑞康生物技術有限公司，廣西藥用植

物園，安徽中醫藥大學，大連源盛泰醫療投資股份有限公司、北

京同仁堂健康藥業有限公司、浙江中醫藥大學。

二、主要技術內容

主要技術內容為藥用植物細胞培養過程中的條件和技術方

法，包括工作區條件、清洗與滅菌、試劑與培養基、藥用植物細

胞的培養與保存等。其中，工作區條件包括洗滌間、消毒間、培

養基制備間、接種間、培養間、細胞保存間；試劑與培養基包括

水、消毒滅菌劑、培養基、培養基配制；藥用植物細胞的培養與

保存包括外植體的選擇及處理、接種、藥用植物細胞的初代培養、

繼代培養和保存，適用于苔蘚植物、蕨類植物、種子植物中的藥

用植物細胞的培養。詳見《藥用植物細胞培養技術規程》文本部

分。

三、主要編制過程

遵循“沒有記錄，就沒有發生”的原則。列出標準制定過程

中全部工作步驟及工作內容，召開會議要提供會議紀要。以“成

立起草組”為例，如下：

（一）文獻和現有標準、應用情況梳理

2021年1月~2月，標準起草的負責人團隊在中國知網學術文

獻總庫（CNKI）、萬方數據知識服務平臺（Wanfang）、Pubmed

等數據庫對植物細胞工程、植物組織培養及植物細胞培養的概念、

植物細胞工程的應用、植物細胞培養技術的發展和應用、藥用植

2

物細胞培養技術與植物細胞培養技術的差異、存在問題進行了系

統的檢索和文獻梳理，共查找中英文文獻相關文獻112篇。同時

在全國標準信息公共服務平臺、標準網等對相關的現有標準進行

了檢索。最終形成了文獻/標準調研報告（附件1《藥用植物細胞

培養技術規程》文獻/標準調研報告）。

1.植物細胞工程的應用

植物細胞工程技術的應用，催生了一大批先進實用的研究成

果和技術，培育了一批優良品種，包括植物細胞工程與植物來

源生物產品的生產、植物體細胞無性系變異與植物改良、細胞突

變體的篩選、植物干細胞培養、原生質體培養、植物細胞培養或

生物反應器生產藥用成分、植物快速繁殖技術、體細胞胚胎發生

及人工種子、作物育種技術、組織或細胞培養物的超低溫保存及

種質庫的建立。在大力推廣常規脫毒和快繁技術的同時，加快發

展植物快繁生物反應器和光自養微繁技術，將為種業帶來新的變

革。生產微型營養器官的人工種子可能成為最先規?；瘧玫娜?/p>

工種子技術，以體細胞胚為繁殖體的人工種子技術需要進一步研

究和完善。應用植物細胞培養技術生產植物來源的生物產品，盡

管目前僅在少數植物上實現了商業化生產，但隨著植物細胞工程

生物反應器技術的完善，其應用領域將進一步擴大。

2.藥用植物細胞培養

藥用植物細胞中含有各種特殊的代謝產物、藥用成分和各種

香精等。其中有些是人工所不能合成的物質；有些是整體植物中

含量甚微或整株植物十分缺乏，而培養細胞中的含量卻很高，如

檸檬葉、雞眼藤的培養細胞中蒽醌含量比完整植株中高10倍。

因此，培養藥用植物細胞并生產這些有用成分已受到生物學、醫

學及商業界人士的極大關注。

近50年來，這一領域的研究取得了飛速的發展。目前已經

對400多種藥用植物進行了相關研究，從培養細胞中分離到600

多種次級代謝產物，其中60多種在含量上超過或等于其原植物，

3

20種以上干重超過1%。紫草、人參、黃連、老鸛草細胞等已達

到商品化水平；長春花、毛地黃細胞等已實現工業化生產；牙簽

草、三分三、紅花等20多種藥用植物細胞正在向商品化過渡。

在我國，人參細胞培養技術也已實現產業化；三分三細胞在80

年代即完成了10L發酵罐中試；紫草、三七等的細胞培養也取

得較大的進展。西洋參、云南蘿芙木、三尖杉、盾葉薯芋、九連

小檗、薄荷、柴胡、丹參、當歸、青蒿、長春花、紫背天葵、延

胡索、水仙、粗榧、水飛薊、羅鍋底、重樓等的細胞培養研究也

已進行。

3.現有標準情況

植物細胞工程技術呈現發展規?；?、管理規范化和操作自動

化的趨勢。目前國外一些國家在組織培養實驗室、種苗快繁的質

量管理、植物來源生物產品的生產和質量管理中已實行良好的實

驗室規范(GLP)、生產規范(GMP)、危害分析和關鍵控制點

(HACCP)系統。我國一些植物快繁企業也開展了GMP認證。

植物細胞工程技術在產生巨大的社會經濟效益的同時，必然

對其技術產品的質量管理提出更高的要求。目前國內動物細胞體

外培養技術成熟，已建立相關的國家標準，如GB/T24863-2010

禽畜動物細胞體外培養和保存技術規程。植物組培技術也已制定

了相關行業和地方標準，如LY/T1882-2010林木組織培養育苗

技術規程、NY/T2306-2013花卉種苗組培快繁技術規程、DB/T

752-2009植物種苗快繁技術規程等。但藥用植物細胞培養相關

的技術規程或標準尚處于空白，缺乏規范的培養技術規程，會導

致培養過程出現污染、褐變、玻璃化、細胞缺乏生成產物的能力

或生產能力不穩定、生產中質控混亂等問題，最終造成人力、物

力、財力和時間上的巨大浪費。例如清洗與滅菌、培養基配制等

操作不規范易造成污染。培養基組成和配制的差異會造成玻璃化、

缺乏生成產物能力等。尤其是藥用植物因含有較高含量的次生代

謝產物，其細胞培養更易產生褐變、玻璃化等狀況，因此亟需制

定一個規范的藥用植物細胞培養標準通則。

4

（二）成立標準起草組

1.標準起草組成立方式

標準起草組由負責人召集相關科研院所、標準使用企業推薦

及面向相關企業征集專家等方式召集起草組成員，于2021年2

月1日通過召開線上會議和電話溝通的方式成立項目組（詳見附

件2天山雪蓮培養物等2個團體標準起草組成立會議紀要）。

2.標準起草組組成情況

①標準起草組組成情況：

標準起草單位由珍稀瀕危藥用植物國家地方聯合工程研究

中心（發改委批準的珍稀瀕危藥用植物研究機構），中國中醫科

學院中藥資源中心（國家級研究中藥的專門機構），大連普瑞康

生物技術有限公司（主要藥用植物細胞生產企業），廣西藥用植

物園（省級中藥的研究機構），安徽中醫藥大學（省級中藥的研

究機構），大連源盛泰醫療投資股份有限公司（主要藥用植物細

胞使用企業）、北京同仁堂健康藥業有限公司（主要藥用植物細

胞使用企業）、浙江中醫藥大學（省級中藥的研究機構），包括中

藥鑒定、中藥生產、中藥分析、中醫臨床應用等不同領域專家共

18人，共有高級職稱9人，中級職稱3人，其他職稱6人（附

件3《藥用植物細胞培養技術規程》起草組成員知情同意書、。

②標準起草組成員名單及分工：見表1。

表1標準起草組成員及其工作內容

序

姓名單位職務/職稱專業學位工作內容

號

中藥資源和分

1黃璐琦中國中醫科學院研究員博士總體設計

子生藥學

大連普瑞康生物技術技術流程管

2劉漢石高級工程師經濟學碩士

有限公司控

中國中醫科學院中藥中藥資源與鑒總體負責、

3袁媛研究員博士

資源中心定標準起草

珍稀瀕危藥用植物國

正高級工程

4劉雅萍家地方聯合工程研究生物工程碩士標準起草

師

中心

標準起草及

5秦雙雙廣西藥用植物園副研究員中藥資源博士

宣講

5

大連普瑞康生物技術

6劉禹中級生物化工博士標準起草

有限公司

中國中醫科學院中藥標準起草及

7李曉琳副研究員中藥資源博士

資源中心宣講

標準起草及

8謝冬梅安徽中醫藥大學教授中藥資源博士

宣講

大連普瑞康生物技術

9陳梓-生物工程碩士標準起草

有限公司

大連普瑞康生物技術生物化學與分

10金銀兵-碩士標準起草

有限公司子生物學

中國中醫科學院中藥

11趙玉洋助理研究員生物技術本科草案修改

資源中心

大連普瑞康生物技術食品科學與工

12張顯林-碩士標準起草

有限公司程

中國中醫科學院中藥

13周駿輝助理研究員生物技術碩士草案修改

資源中心

大連普瑞康生物技術

14吳俊罡-發酵碩士標準起草

有限公司

中科院深圳先進技術

15趙喬-植物學博士草案修改

研究院

大連源盛泰醫療投資化學工程與工

16黃利-碩士草案修改

股份有限公司藝

北京同仁堂健康藥業正高級工程

17張宏醫學博士草案修改

有限公司師

18朱愛松浙江中醫藥大學教授中醫學博士草案修改

3.利益沖突聲明

標準起草組包含了科研、生產和醫療等不同領域的專家，不

存在利益沖突，可避免標準推薦意見的影響。

（三）標準制定的可行性論證、編制計劃制定及項目調研

2021年2月1日在標準起草組的線上會議上，對天山雪蓮

培養物等2個擬進行起草團體標準的研制背景、標準框架等進行

了匯報，與會專家聽取了匯報，對《藥用植物細胞培養技術規程》

團體標準研制的意義、目的、可行性進行了探討和論證，認為具

有編制需求和廣泛的應用前景。根據起草組專家意見確定了標準

編制工作的整體框架和詳細計劃，并對標準研制、標準推廣等項

目內容進行了分工（詳見附件1天山雪蓮培養物等2個團體標準

起草組成立會議紀要）。會后起草組成員對藥用植物細胞培養的

技術要求包括：工作區條件、清洗與滅菌要求、試劑與培養基、

細胞培養、保存標準等進行了調研、整理形成了《藥用植物細胞

6

培養技術規程》項目調研報告（附件4《藥用植物細胞培養技

術規程》團體標準項目調研報告）。

（四）提案、申請、立項

2021年2月23日中國中醫科學院中藥資源中心向中華中醫

藥學會提出立項申請，中華中醫藥學會標準化委員會開始了立項

的三次形式審查，按反饋表的要求，標準編寫組逐條認真填寫修

改意見表，并經過了質詢、說明和修改，于2021年4月9日通

過了形式審查。2021年4月13日-20日以專家函審的形式進行

了立項審查，共9位專家無記名投票，贊成、有建議8票，贊成

票過3/4多數，審查專家認為該標準可行性高，擬解決的問題需

求巨大，對推動中藥產業標準化有重要意義，建議同意立項。此

后又通過標準化委員會秘書長會，獲準立項。2021年6月3日，

正式發布立項公告。

（五）標準草案起草

1.標準的實驗研究

外植體選擇、愈傷組織誘導、細胞培養是藥用植物細胞培養

的主要步驟，嚴格控制組織培養過程中培養基的各營養成分用量，

以及激素濃度和配比是保證藥用植物細胞大規模生產成功的關

鍵。2021年3月~2021年12月，工作組以天山雪蓮、黃芩、紅

豆杉開展了藥用植物細胞培養條件優化的實驗研究。上述實驗數

據為草案的撰寫提供了依據。具體的方法及結果如下：

1.1天山雪蓮細胞培養條件的優化

配制植株誘導MS培養基和誘導愈傷組織MS培養基，選取

生長良好的天山雪蓮植株作為外植體，接種于誘導愈傷組織MS

培養基上

1.1.1天山雪蓮細胞誘導方法的比較

分別稱取硝酸鉀190重量份、硝酸銨165重量份、硫酸鎂

37重量份、磷酸二氫鉀17重量份、氯化鈣44重量份，分別加

水1000體積份，并加熱至完全溶解；將5種溶液混合，加水至

7

5000體積份，混合均勻，得MS培養基母液A，4℃保存備用；

分別稱取硫酸錳6.76重量份、硫酸鋅3.44重量份、硼酸2.48重

量份、碘化鉀0.332重量份、鉬酸鈉0.1重量份、硫酸銅0.00005

重量份、氯化鈷0.00005重量份，分別加水200體積份，并加熱

到完全溶解；將7種溶液混合，加水至2000體積份，混合均勻，

得MS培養基母液B，4℃保存備用；分別稱取EDTANa27.45重

量份、硫酸亞鐵5.57重量份，分別加水1000體積份，并加熱至

完全溶解；將2種溶液混勻，加熱，加水至2000體積份，得MS

培養基母液C，4℃保存備用；稱取甘氨酸0.4重量份、鹽酸硫胺

素0.08重量份、鹽酸吡哆素0.1重量份、煙酸0.1重量份和肌醇

20重量份，加水1000體積份，并加熱至完全溶解，加水至1000

體積份，混合均勻，得MS培養基母液D，4℃保存備用；取蔗

糖120重量份，加水2000體積份溶解，加熱至沸騰，加入MS

培養基母液A100體積份、MS培養基母液B10體積份、MS培

養基母液C20體積份和MS培養基母液D10體積份，得混合培

養基母液；取瓊脂24重量份，加水2000體積份攪拌后，加入上

述混合培養基母液中，加熱至沸騰，瓊脂全部溶化；加水至4000

體積份；滴加4％氫氧化鈉，調pH至5.8，得植株誘導MS培養

基；分裝；滅菌；備用。

配制MS培養基母液，母液比例為A:B:C:D=5:2:2:1，4℃

保存備用；取0.15～0.25g的2,4-D，滴加4％氫氧化鈉至完全

溶解，加水至1000體積份，搖勻，得2，4-D母液，4℃保存備

用；取0.05～0.15重量份6-BA，滴加4％氫氧化鈉至完全溶解，

加水至500體積份，搖勻，得6-BA母液，4℃保存備用；取蔗

糖120重量份，加水2000體積份溶解，加熱至沸騰，加入上述

MS培養基母液A200體積份、MS培養基母液B20體積份、MS

培養基母液C40體積份、MS培養基母液D20體積份、2,4-D母

液20體積份和6-BA母液4體積份，得混合培養基母液；取瓊

脂24重量份，加水2000體積份，攪拌，加入上述混合培養基母

液中，加熱至沸騰，瓊脂全部溶化；加水至4000體積份；滴加4％

氫氧化鈉，調pH至5.8，得誘導愈傷組織MS培養基；分裝；滅

8

菌；備用。

將保藏的天山雪蓮種子滅菌，徹底滅菌的天山雪蓮種子在無

菌條件下接種在配好的植株誘導MS培養基上，每25ml培養基

中接種8～15粒種子；在25℃，連續光照的條件下培養10天，

出芽后，培養成天山雪蓮植株。1%升汞滅菌11min，無菌水清

洗5次，染菌率最低，出芽率為100%，滅菌效果最好。

天山雪蓮植株繼續培養至5～8cm，選取生長良好的天山雪

蓮植株作為外植體；將外植體接種于誘導愈傷組織MS培養基上，

每25ml培養基中接種6～10塊直徑為0.5cm的外植體，暗培養

5～10d；誘導產生愈傷組織，愈傷組織在光照條件下培養，光

照條件為8～12小時/天，溫度為22～28℃。

1.1.2穩定高產天山雪蓮細胞系篩選

通過對天山雪蓮愈傷組織的誘導和培養得到了4種新疆天

山雪蓮細胞系：白色系、黃色系、綠色系和紫紅色系；對4種細

胞系分別進行了繼代培養，通過對其生長速度、總黃酮含量的檢

測，確定紫紅色細胞系為長勢較好，總黃酮化合物含量最高的細

胞系。用無菌苗的根、莖、葉以及子葉也均能獲得上述紫紅色細

胞系，優選采用莖作為外植體。

選取紫紅色細胞系為原始細胞系，用目測法從固體培養基中

挑選顏色較深、色彩鮮亮的紫紅色愈傷組織在MS中添加6-BA、

NAA、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體培養基上繼續繼代培養。

培養條件為25℃，光照10~12小時、2000Lux。為更好的優化

細胞系，繼代時接種塊大小控制在3mm以下。對所選擇細胞系

逐步馴化，經過近100代篩選獲得了可以傳代培養的穩定高產天

山雪蓮細胞系，該細胞系生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅色，結構

致密、團粒狀，質地均一、容易分離；其高效液相指紋圖譜與野

生天山雪蓮基本吻合，且綠原酸的含量高于野生天山雪蓮；天山

雪蓮總黃酮含量為細胞干重的8~12％。

1.1.3天山雪蓮細胞系的繼代培養

比較3種繼代培養基：①MS培養基；②B5培養基；③

N6培養基。培養基中均添加0.2～0.5mg/L6-BA、2~4mg/LNAA，

9

pH值5.2~5.8；培養時間15～20天。天山雪蓮細胞系繼代培養

時，使用MS培養基獲得的天山雪蓮培養物干重較多，天山雪蓮

總黃酮含量較高；使用N6培養基中獲得的天山雪蓮培養物中天

山雪蓮總黃酮含量遠高于其它兩個培養基，但獲得的天山雪蓮培

養物干重最低。綜合上述指標，繼代培養中選擇MS培養基。

1.1.4液固交替生產方法

1.1.4.1液體搖床培養制種

①選種

選取培養10~14天，長勢較好，顏色鮮艷，呈紫紅色，顆粒

均勻，質地均一的細胞系作種子細胞。

②培養基配制

采用500ml培養瓶，每瓶裝120~150ml培養液，培養液成

分為MS中添加6-BA、NAA及30g/L蔗糖，pH值為5.5；高溫

滅菌：121℃，20min。

③接種

無菌條件下，將培養物用鑷子夾碎后接種到裝有120~150ml

培養液的500ml培養瓶中，接種量5％(W/V，g·FW/ml)。

④搖床培養

培養條件：培養溫度為25℃，搖床轉速110rpm，培養時間

9d，光照11h、2000Lux。培養過程中，發現染菌立即挑出。

1.1.4.2固體培養

①液態種子細胞的選取

用顯微鏡觀察檢測，選取顏色鮮艷、呈紫紅色、長勢較好、

分散性好、顆粒均勻無污染的培養物作生產用種子細胞。

②培養基

MS中添加6-BA、NAA、0.6g/L瓊脂及30g/L蔗糖的固體

培養基。

③接種

無菌條件下，將培養瓶中的培養液濾除，將培養物轉移到墊

有無菌濾紙的無菌培養皿中，挑取生長旺盛、顏色鮮艷、呈紫紅

色，分散性好、顆粒均勻、無污染的細胞團轉接至固態培養基上，

10

接種塊大小為4~6mm。

④固體培養

培養溫度：25℃，光照11h、2000Lux；培養周期：15天。

1.1.4.3培養物的收集及循環生產

①留種

大規模生產的同時，可以從中選擇生長旺盛、顏色鮮艷、呈

紫紅色，結構致密、呈團粒狀，質地均勻為特征的愈傷組織留種，

用于液體搖床培養，選種量以不超過總生產量的15％為宜。

②培養物的收集

收集剩余培養物，低溫真空干燥，即可。根據需要，可以將

干燥的培養物磨成粗粉或細粉，或者用來提取黃酮及其他活性成

分。

1.2黃芩細胞培養條件的優化

1.2.1黃芩細胞系培養

將在MS固體培養基上穩定繼代的愈傷組織，轉入到MS液

體培養基（3％蔗糖，pH5.8）中進行懸浮培養，光照16h/黑暗8

h進行培養，以黑暗條件作為對照，搖床轉速120r/min，培養

溫度（25±1）℃，接種量約為2g/L鮮重，設3個重復。培養液

中附加0.5mg/L2,4-D和3mg/LTDZ。

1.2.2黃芩細胞系有效成分的積累

1.2.2.1黃芩苷、黃芩素的測定

取黃芩懸浮細胞液5mL，4℃、12000g離心后，除去上清，

沉淀中精密加入甲醇1mL，稱定質量，超聲提取120min，取出，

再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，

0.45um濾膜濾過。色譜柱：TC-C18(4.6mmx250mm,5um)。

流動相：乙腈-水-甲酸（23:77:10)(A)；乙腈-水-甲酸（80:20:10)

(B)；梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0-15min，100%(A)；15-25min，

100%-87%(A)；25-40min，87%-52%(A)；40-60min，52%-0%(A)。

檢測波長280nm；分析時間60min：柱溫30℃。

1.2.2.2光照對黃芩細胞系中黃芩苷含量的影響

在光照條件下，黃芩苷含量在第20天含量最高，達到218.31

11

μg/g，隨后呈逐漸降低趨勢，在第26天下降為148.95μg/g，降幅

達31.77%；在黑暗條件下，黃芩苷的變化趨勢與光照條件一致，

第20天為183.78μg/g，到第26天降為96.32μg/g，降幅達47.59%。

圖1黃芩懸浮細胞中黃芩苷含量的動態變化（P≤0.05）

1.3紅豆杉細胞培養條件的優化

1.3.1紅豆杉細胞培養

取葉及子葉、胚芽作為外植體，在無菌條件下，用無菌手術

剪刀和無菌鑷子將無菌苗根、莖、葉及子葉、胚芽切成2~5mm

長的小段，將外植體接種于培養基上，每30ml培養基中接種8～

10塊直徑為0.5cm的外植體，將外植體放于22℃，暗培養5～

10d；之后轉移至溫度為25℃的培養室培養10～20d；最后轉移

至溫度28℃的培養室培養10～15d，獲得紅豆杉愈傷組織。其

中幼嫩葉片和胚芽作為外植體誘導率最高。

1.3.2高產細胞系篩選

選取生長旺盛、無褐變、黃白色特征的愈傷組織進行周期性

的繼代培養，愈傷組織的培養條件為：20g愈傷組織于1000ml

培養基培養，培養周期為35d，培養溫度為23℃。選取生長旺

盛、無褐變、黃白色特征的愈傷組織作為種子細胞，每培養基中

接種8塊直徑為0.8～1.0m的種子細胞進行光培養，光照條件為

3～6小時/天，培養溫度為22～28℃，培養30～35d后收獲。

2.撰寫標準草案

12

2021年12月，根據項目工作組專家研討確定的標準范圍、調

研結果、文獻證據和實驗數據，項目組起草了《藥用植物細胞培

養技術規程》草案、編制說明。

草案成稿于2022年12月下旬，完成后進行了組內專家的論證，

論證采用通訊形式通過微信將草案發送給組內其他主要成員，除

撰寫人外的其他起草組主要成員對草案暫無修改意見。

（六）專家征求意見

2022年1月下旬標準起草單位以網絡形式，通過電子郵件向

北京中醫藥大學、福建農林大學、南方醫科大學、南京中醫藥大

學、江蘇大學、甘肅中醫藥大學、沈陽藥科大學、成都中醫藥大

學、中國藥科大學、安徽省食品藥品檢驗研究院、廣東省藥品檢

驗所、國家藥典委員會、中國食品藥品檢定研究院、黑龍江中醫

藥大學等不同領域的非參與單位專家征求意見，共收到30名專家

“征求意見稿”，回函并有建議的專家30名。

（七）草案修訂

2022年4月-7月，起草組對專家意見進行匯總和研究處理，

給出“采納”、“部分采納”或“未采納”的處理意見，匯總形成

意見匯總處理表”（詳見征求意見匯總處理表-藥用植物細胞培養

技術規程）。經過匯總研究《藥用植物細胞培養技術規程》（草案）

修改意見后，根據專家意見對《藥用植物細胞培養技術規程》（草

案）中涉及的名稱、術語、定義、工作區條件、清洗與滅菌、培

養基配制、細胞培養與保存等進行了規范，修改完善了《藥用植

物細胞培養技術規程》（草案），最終擬定《藥用植物細胞培養技

術規程》送審稿，完成定稿工作。

（八）草案送審

2022年7月23日，起草組向中華中醫藥學會報送了送審材料，

包括送審稿、編制說明、征求意見匯總處理表、推廣方案。

四、與國內外同類標準的對比和最新標準采用情況

13

（一）描述國內外是否有已發布且正在實施中的同領域標準？本

標準與其相比，有什么區別？

目前國內外并無正在實施或已發布的植物細胞培養相關標

準。本標準是新制定的藥用植物細胞培養的技術規程。在母液的

配制和保存、培養基的配置、接種前的操作準備上與LY/T

1882-2010林木組織培養育苗技術規程和DB/T752-2009植物種

苗快繁技術規程有相似之處，參考了上述標準。但藥用植物細胞

培養和組織培養存在差異，因此在操作規程的其它部分與上述標

準存在差異。

（二）是否引用相關標準？引用的內容是什么？

1.GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

引用內容為“實驗用水要求”。

2.LY/T1882-2010林木組織培養育苗技術規程

引用內容為“母液的配制和保存”及“培養基的配置”。

3.DB/T752-2009植物種苗快繁技術規程

引用內容為“接種前的操作準備”。

五、與現行強制性國家標準或政策法規的關系

本標準草案與現行強制性國家標準及政策法規無矛盾或沖

突。

六、代表性分歧意見的處理經過和依據

項目編制過程中無重大分歧，關于方法細節的分歧可通過會

議討論處理。

七、宣傳、貫徹標準和后效評價標準的要求和措施

（一）宣傳、貫徹標準的措施

1.標準的實施單位

本標準發布后，擬在珍稀瀕危藥用植物國家地方聯合工程研

14

究中心，中國中醫科學院中藥資源中心，大連普瑞康生物技術有

限公司，廣西藥用植物園，安徽中醫藥大學，大連源盛泰醫療投

資股份有限公司、北京同仁堂健康藥業有限公司、浙江中醫藥大

學實施。

2.其他宣傳、貫徹本標準的措施

2.1標準培訓

通過網絡的形式或借助學術會議舉辦每年至少一次全國范

圍的標準培訓班，面向全國植物細胞培養物生產企業、原料使用

企業、銷售企業、科研院所的相關人員宣傳、推廣《藥用植物細

胞培養技術規程》這一團體標準，指導如何運用標準生產、質控

和開展科學研究等。此外，通過郵件、電話、微信等形式指導標

準應用，并對標準應用過程中的問題進行咨詢和解答。

2.2標準應用

面向全國植物細胞培養物生產企業、原料使用企業、銷售企

業、科研院所推廣《藥用植物細胞培養技術規程》這一團體標準，

指導標準應用，并對標準應用過程中的問題進行咨詢和解答。

2.3媒體宣傳

通過網頁、微信公眾號、中藥相關的網絡平臺等進行標準的

宣傳和推廣；通過在學術會議做相關報告、發放宣傳資料來進行

標準的宣傳和推廣。

（二）標準的用戶評價

擬于標準實施2年后，通過發放調查問卷的模式開展標準的

用戶評價，評價內容包括：

（1）該標準的應用情況，應用規模；

（2）該標準的適用性，是否適用于貴單位的產品或技術服

務；

（3）實施標準的過程中，是否遇到問題;

15

（4）對標準的建議和意見。

（三）標準的修訂

擬于標準實施3年后根據執行情況開展標準的更新或修訂工

作。

八、廢止現行有關標準的建議

無。

九、相關附錄

附件1《藥用植物細胞培養技術規程》文獻/標準調研報告

附件2《天山雪蓮培養物》等2個團體標準起草組成立會議紀

要

附件3《藥用植物細胞培養技術規程》起草人知情同意書

附件4《藥用植物細胞培養技術規程》團體標準項目調研報告

16

附件1

《藥用植物細胞培養技術規程》文獻

/標準調研報告

17

目錄

1植物細胞工程、植物組織培養及植物細胞培養.............................................................1

1.1植物細胞工程..................................................................................................................1

1.2植物組織培養..................................................................................................................1

1.2.1植物組織培養概述.......................................................................................................1

1.2.2植物組織培養技術原理...............................................................................................1

1.3植物細胞培養..................................................................................................................2

1.4植物細胞工程的應用......................................................................................................2

1.4.1原生質體培養...............................................................................................................2

1.4.2植物細胞培養或生物反應器生產藥用成分...............................................................3

1.4.3植物快速繁殖技術.......................................................................................................4

1.4.4體細胞胚胎發生及人工種子.......................................................................................4

1.4.5作物育種技術...............................................................................................................5

1.4.6組織或細胞培養物的超低溫保存及種質庫的建立...................................................7

2植物細胞培養.....................................................................................................................8

2.1植物細胞培養技術的發展..............................................................................................8

2.1.1基礎理論發展階段.......................................................................................................8

2.1.2基本技術發展階段.......................................................................................................9

2.1.3應用研究發展階段.......................................................................................................9

2.2植物細胞培養技術的應用..............................................................................................9

2.2.1植物細胞工程與植物來源生物產品的生產...............................................................9

2.2.2植物體細胞無性系變異與植物改良.........................................................................10

2.2.3細胞突變體的篩選.....................................................................................................11

2.2.4植物干細胞培養.........................................................................................................11

2.3藥用植物細胞培養技術................................................................................................12

2.3.1藥用植物細胞培養.....................................................................................................12

2.3.2藥用植物細胞培養與植物細胞細胞培養的比較.....................................................13

2.3.3存在問題及展望.........................................................................................................14

1

1植物細胞工程、植物組織培養及植物細胞培養

1.1植物細胞工程

細胞工程是應用細胞生物學、遺傳學和分子生物學的理論和方法，從細胞水

平上對細胞進行大規模培養和分子水平上的基因改造[1]。根據研究材料的不同，

可分為植物細胞工程和動物細胞工程。植物細胞工程是以植物細胞全能性為理論

基礎，以植物組織與細胞培養為技術支持，在細胞和亞細胞水平對植物進行遺傳

操作，實現植物改良和利用，或獲得植物來源的生物產品的科學技術[2]。植物細

胞工程的基本技術包括組織培養技術和體細胞雜交技術。

1.2植物組織培養

1.2.1植物組織培養概述

植物組織培養即植物的離體培養，是指在無菌和人工控制的環境條件下，利

用適當的培養基，對離體的植物器官、組織、細胞及原生質體進行培養，使其生

成完整植株的技術。植物組織培養廣義上是指對植物的植株、器官、組織以及原

生質體進行培養的技術；狹義上是指對植物的組織及培養產生的愈傷組織進行培

養的技術[3]。植物組織培養是植物生物技術的重要組成部分和基本研究手段，已

滲透到生物學科的各個領域，在植物的快繁、脫毒、植物育種、種質資源的保存

和次生代謝物的生產等領域發揮著巨大的作用，產生了巨大的經濟效益和社會效

益，是現代生物學科中最有生命力的學科之一。

1.2.2植物組織培養技術原理

植物組織培養的原理是細胞全能性。細胞全能性是指高度分化的植物體細胞

具有全能性，細胞經分裂和分化后，均具有同樣的或基本相同的成套的遺傳物質，

只不過在特定條件下才會表達，如一定營養的物質、激素和其他適宜條件[4]。組

織培養基于此原理誘導形成愈傷組織，在傷口表面新生的組織，再在愈傷組織上

形成新的叢生芽。

1

1.3植物細胞培養

植物細胞培養是應用生物工程研究成果，在細胞水平上生產植物生物制品

的技術。植物細胞培養是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分離的組織置于

液體培養基或固體培養基中進行培養，得到分散成游離的懸浮細胞或細胞群，通

過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量的細胞群體的一種技術[3]。早在20世紀

50年代人們就發現離體培養的高等植物細胞具有合成并積累次生代謝產物的潛

力。在當前植物資源短缺和需求量不斷加大的形勢下，靠提取分離途徑已很難滿

足市場需求，利用植物細胞培養技術生產植物產品已成為工業化生產植物產品的

一條有效途徑。這些產品既可用作藥物生產的原料，也可作為工業、農業、食品

添加劑等的原料。自紫草細胞培養提取出紫草寧成為第一個植物細胞培養技術商

品至今，國內外動、植物細胞大規模培養研究很快遍布各個醫藥領域。運用工程

細胞培養生產有價值的新型藥物和分離有效成分的技術越來越得到了醫藥界廣

泛關注和認可。該技術尤其適合于資源短缺、采集困難、種植要求高的名貴藥材。

運用植物細胞培養技術研制與開發現代天然產物是當今國際細胞培養技術產業

化的熱點問題和主要發展方向之一，也是我國實現中藥現代化，開創低成本、高

產出、無污染的工業化生產天然植物藥的新思路。

1.4植物細胞工程的應用

植物細胞工程技術的應用，催生了一大批先進實用的研究成果和技術，培

育了一批優良品種。在大力推廣常規脫毒和快繁技術的同時，加快發展植物快繁

生物反應器和光自養微繁技術，將為種業帶來新的變革。生產微型營養器官的人

工種子可能成為最先規模化應用的人工種子技術，以體細胞胚為繁殖體的人工種

子技術需要進一步研究和完善。應用植物細胞培養技術生產植物來源的生物產品，

盡管目前僅在少數植物上實現了商業化生產，但隨著植物細胞工程生物反應器技

術的完善，其應用領域將進一步擴大。

1.4.1原生質體培養

原生質體培養和體細胞雜交是植物細胞工程的核心技術之一，為克服植物遠

2

緣雜交不親和性，創造新的種質資源，實現植物遺傳轉化和進行細胞學的基礎研

究提供了重要的技術支撐。自1971年Takebe等首次報道獲得煙草葉肉原生質體

再生植株以來，原生質體培養和體細胞雜交技術一直是植物細胞工程的重要研究

領域，在分離原生質體的材料選擇、培養基與培養環境控制、體細胞雜交技術等

方面進行了大量研究，建立了原生質體培養和體細胞雜交的技術程序。到1976

年，有12種植物的原生質體能再生植株，1983年增加到70種，1986年超過80

種，到90年代初期達到100種以上。原生質體培養是80年代的一個研究熱點。

日本和中國在這一領域做出了很大的貢獻。日本科學家成功地進行了大約70個

植物品種的原生質體培養。我國獲得了30個以上品種的原生質體再生植株，其

中包括難度較大的重要糧食作物和經濟作物大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高

粱、大麥、棉花、油菜、馬鈴薯等[5]。在木本植物、藥用植物、蔬菜和真菌原生

質體培養方面的進展也十分迅速。

1.4.2植物細胞培養或生物反應器生產藥用成分

植物細胞培養是指利用植物細胞，以現代生物工程技術手段來進行大規模工

業生產，來獲得人類所需產品的技術。1956年Routier與Nickell首次提出以植

物細胞培養物來合成藥物，而后在1967年Kaul與Staba采用了多升發酵罐對牙

簽草進行了大規模細胞和組織培養的研究，并通過培養得到了呋喃色酮[6]。植物

細胞生物反應器由于技術、工藝和成本等原因，目前僅有少數產品(人參皂苷、

紫草寧、紫紅素、紫杉醇等)在韓國、日本、德國等國家實現了商業化應用。隨

著技術的進一步完善和生產成本的降低，該技術在植物來源生物產品的生產方面

將有廣闊的發展前景。

植物生物反應器是指通過植物細胞懸浮培養技術，培養的天然的或轉基因的

植物細胞，組織或整個植株作為“工廠”來大量生產人類所需產品。在我國植物生

物反應器的研究于20世紀90年代初期開始，目前在培育轉基因植物和構建高效

植物表達載體等主要技術方面與國外技術相差很小，但是對于植物生物反應器研

究與應用的積累上與國外發達國家還存在較大差距，在國家通過“九五”計劃對植

物生物反應器進行政策扶持后，目前已經取得的成果有：①使馬鈴薯與番茄導入

乙型肝炎病毒包膜蛋白的基因，并獲得高效表達的外源基因植株。②使馬鈴薯導

3

入產毒素大腸桿菌熱敏毒素b亞基及定居因子CS6B抗原蛋白基因，并獲得高效

表達重組抗原蛋白的馬鈴薯植株。③得到了口蹄疫流行株的基因文庫并得到了O

型口蹄疫口服疫苗VP1基因，可作為疫苗研究進行轉基因表達蛋白[7]。

1.4.3植物快速繁殖技術

60年代，法國的Morel用莖尖培養的方法大量繁殖蘭花獲得成功。植物快

速繁殖技術、試管苗工廠化生產和無病毒種苗生產技術在70年代得到了快速的

發展。通過離體培養獲得小植株并且具有快速繁殖潛力的植物已有100多科、

1000種以上，有的已經發展成為工業化生產的商品。植物快繁技術包括用于快

速繁殖優良品種、瀕危物種及轉基因植物的組織培養技術以及通過切取莖尖進行

組織培養，從而獲得脫毒苗的作物脫毒技術。種類也由以觀賞植物為主逐漸發展

到果樹、林木、蔬菜和大田作物。美國、法國、意大利、荷蘭等歐美國家試管苗

的年產量均在數千萬株以上，并且以每年7%-8%的速度增加。

我國快速繁殖和無病毒種苗生產的研究始于70年代。“六五”期間主要是研

究、積累階段，到“七五”期間研究成果開始向應用轉化并大見成效。馬鈴薯無毒

種薯和甘蔗種苗已在生產上大面積種植。蘭花、香石竹、月季、菊花、唐菖蒲、

百合、花燭、非洲菊、蒲包花、大花萱草、非洲紫羅蘭、大巖桐、重瓣玉簪、花

葉芋、瑞香、橡皮樹、草莓、茶花、桉樹、楊樹、蘋果、柑桔、棗樹、枸杞、醋

栗、葡萄、木薯、無籽西瓜已進行規?；a或中間試驗。試管苗的年產量已由

90年代初期的2000萬株左右發展到現在的5000萬到1億株以上。此外，一些

作物脫毒技術也不斷被開發出來，如微型脫毒馬鈴薯生產技術、馬鈴薯脫毒小薯

的噴霧無基質栽培技術等。

1.4.4體細胞胚胎發生及人工種子

據不完全統計，能大量產生胚狀體的植物已有43科、92屬、100多種。

一些重要作物如水稻、小麥、玉米、珍珠谷等，也能通過離體培養產生胚狀體。

1977年，Murashige第一次提出利用植物組織培養中體細胞胚胎發生的特點，把

胚狀體包埋在膠囊內形成球狀結構，使其具有種子的機能并可直接播種于田間的

設想。人工種子是以植物組織培養得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，

4

經過人工薄膜包裝得到的種子。80年代初，美、日、法等國相繼開展了人工種

子的研究，并且在胡蘿卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、萵苣、花旗松等植物上獲得了

初步的成功。歐洲將人工種子研究納入“尤里卡計劃”。印度、芬蘭、瑞士、韓國

等國也開展了研究。我國人工種子的研究開始于“七五”期間，并且被列入了“863

高技術研究發展計劃”。對胡蘿卜、芹菜、黃連、苜蓿、西洋參、云杉、華腺萼

木、四會貢桃、番木瓜、芫荽等十幾種材料進行了系統的研究。目前這一領域存

在的最主要的問題是模擬人工種皮。相信隨著人工種皮制作和其它一些問題的突

破，人工種子總有一天會實現工業化生產，給農業生產帶來根本性的變革。

1.4.5作物育種技術

應用于作物育種的植物細胞工程技術包括細胞融合與體細胞雜交、胚胎培養、

單倍體育種、體細胞無性系變異、細胞突變體的篩選等。

(1)細胞融合與體細胞雜交

第一棵體細胞雜種植株是在1972年建立的，美國的Carlson誘導粉藍煙草和

郎氏煙草的原生質體融合并獲得了雜種植株。早期的研究對象主要集中在茄科的

煙草屬、曼陀羅屬和矮牽牛屬，以后逐漸轉移到茄屬、番茄屬、顛茄屬和十字花

科的蕓苔屬、擬南芥屬和傘形科的胡蘿卜屬、歐芹屬。隨著重要糧油作物的原生

質體再生植株的成功，研究對象又再一次轉移。用于融合的親本細胞也由最初的

品種間進展到種間、屬間甚至科間。

亞太地區大約誘導了50多個種間和屬間的原生質體融合形成植株，其中日

本占一半。通過木本植物柑桔類種屬間的體細胞雜交，培育出新的柑桔雜交品種，

有性雜交不親和的番茄+馬鈴薯間的體細胞雜交也獲得了雜種植株。通過馬鈴薯

的栽培品種與野生種的體細胞雜交，得到了抗晚疫病和卷葉病的體細胞雜種。白

菜型油菜與甘藍的體細胞雜交，得到了甘藍型油菜?？崎g的大豆+粉藍煙草、大

豆+煙草也產生了連續增殖的雜種細胞系，更遠緣的大豆+水稻產生了愈傷組織。

日本科學家還利用不對稱細胞融合技術培育獲得世界上第一個商品煙草雄性不

育系，應用這種雄性不育系，又開發了胡蘿卜、卷心菜和茄子的F1代雜種。我

國科學家利用煙草與黃花煙草和粉藍煙草的體細胞雜交開發出新的煙草商品品

種。

5

(2)胚胎培養

植物胚胎培養是胚、胚珠、子房和胚乳的離體培養技術，其應用領域包括胚

胎的發育機理、克服雜交不親合性和胚拯救、克服珠心胚的干擾、打破種子休眠，

縮短育種周期，獲得體細胞胚和人工種子，建立植物高效再生體系等，并在農作

物、園藝作物、林木和藥用植物上廣泛應用。胚乳培養的主要目的是獲得具有利

用價值的三倍體植株，還可作為研究淀粉等營養物質合成和代謝的實驗體系。植

物離體受精技術是植物細胞工程中的重要實驗技術，為研究植物胚胎發育機理提

供了新的實驗系統，為開發新的植物轉基因途徑提供了可能。目前，已經有100

篇以上幼胚培養成為植株的報道，有40多個雜種胚培養成功。印度科學家在栽

培種菜豆、黃麻和花生的遠緣雜交中獲得了理想的重組體。日本科學家獲得了3

個柑桔屬、李屬和蕓苔屬品種和5個百合栽培種。中國農科院蔬菜所培養結球甘

藍和大白菜的雜種胚得到了種間雜種。中科院植物所和北京市農科院合作育成早

熟桃新品種“京早3號”，成熟期比一般早熟桃提前15-20天。西北植物所得到了

節節草和普通小麥的屬向雜種。中國農科院棉花所獲得了栽培棉和野生棉的種間

雜種。大麥+小麥、大麥+提莫菲維小麥、小麥+冰草(育成新品種小堰6號)、小

麥+大賴草、小麥+簇毛麥、小麥+黑麥、硬粒小麥+簇毛麥等也通過胚培養獲得

了雜種。煙草屬間雜種、水稻品種間雜種也已經得到。

(3)單倍體育種

加倍單倍體技術(DoublehaploidTechnology)是指利用植物組織培養技術培養

單倍體植物材料(花藥、花粉、未受精的子房和胚珠)獲得單倍體植物，然后通過

自然或人工加倍的方法獲得雙倍體植株的技術。其中以花藥和花粉培養應用最為

廣泛。利用加倍單倍體技術進行花藥和花粉培養，已在250多種植物上獲得成功，

中國、加拿大、澳大利亞、歐盟等在花卉育種中取得了突出的研究成果。

我國于1970年開始這方面的研究，并在70年代成為一個熱點，也取得了很

大的成果。培育40種以上植物的花粉或花藥發育成單倍體植株，其中小麥、黑

麥、小冰麥、玉米、橡膠樹、楊樹、辣椒、甜菜、白菜、油菜、柑桔、甘蔗