綠色熒光蛋白(GFP)技術在細胞生物學研究中應用

第1頁熒光現象在許多海洋無脊椎動物中普遍存在著。許多刺胞亞門動物和幾乎全部櫛水母類動物在受到刺激時都能夠發出熒光：刺胞亞門動物多發射綠色熒光，而櫛水母類發射藍色熒光。綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein)，簡稱GFP，它發覺和應用被稱為細胞生物學上一次革命。這種蛋白質結構很特殊，在受到藍光或紫外線刺激時能夠發射綠色熒光，并不需要任何協同因子、底物，適適用作普遍匯報標識，尤其適合于活體細胞或組織。因為GFP穩定、靈敏度高、無生物毒性、熒光反應不需要任何外源反應底物及表示無物種或細胞組織專一性,檢測簡單，結果真實可靠，是一個獨特匯報蛋白(Reporterprotein)。可廣泛用于基因表示與調控、蛋白質定位、轉移及相互作用、信號傳遞、轉染與轉化,以及細胞分離與純化等研究領域。第2頁圖1綠色熒光蛋白第3頁1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先從一個水母類動物AequoreaVictoria中分離純化出了GFP,1992年Prasher[2]等克隆了GFP基因cDNA并分析了GFP一級結構,1994年M.Chalfie[3]等最早用重組野生GFP型基因做匯報基因,成功地在原核和真核生物中得到表示。90年代后,人們對GFP性質和應用進行了不停深入研究,相關GFP及其利用研究進展較快，現在它已經發展成了當代生物學研究一個準確工具。當前在細胞生物學、植物學、動物學、微生物學等學科研究中都有著相當廣泛應用。伴隨人們對GFP發光機制研究深入,經過對其發光團區域和其它區域進行隨機誘變,已經得到了許多GFP突變型,有發藍光或黃光而不是綠光[4]；有發出熒光比野生型強很多,激發后很輕易用肉眼觀察到；有則是溫度突變型,其表示不受溫度限制[5]；有突變體則能夠特異地在一些物種中高效表示。這些突變體極大地拓寬了GFP應用范圍,使GFP在細胞生物學和分子生物學領域應用顯示出更為遼闊和誘人前景。第4頁一、GFP結構

圖2綠色熒光蛋白結構第5頁GFP編碼238個氨基酸多肽單體，只有完整GFP分子才會產生生物熒光，被切斷GFP(即使是C、N末端少數幾個氨基酸)亦能造成GFP失去發光能力[6]。與熒光產生直接相關是GFP分子中一小段被稱為熒光生色團(Chromophore)部位[7]。在GFP初級氨基酸序列上，第65～67個氨基酸(Ser-Tyr-Gty)形成環狀三肽，以共價形式與GFP蛋白肽鍵骨架相連。生色團形成不受種屬限制，其經過細胞內廣泛存在成份作用或經過自催化作用都能產生。熒光生色團非常穩定,不易變性,用酸、堿處理或者加入鹽酸胍都不會使它失去熒光。不過當pH值恢復到中性或者移去變性物時，它熒光又會恢復到變性前水平。GFP生色團之間是經過共價鍵結合。生色團形成機理當前尚不清楚，但在有分子氧存在條件下，酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸，并環化形成六肽，這可能是形成色基必定過程。[8]第6頁二、GFP應用特點1易于檢測GFP熒光反應不需外加任何反應底物，酶或其它共反應因子,也就不存在這些物質可能難于進入細胞問題，只需紫外光或藍光激發,即可發出綠色熒光，GFP發射熒光用肉眼或熒光顯微鏡就能夠檢測到。靈敏度高,對于單細胞水平表示也可識別,同時還可利用其進行定量檢測。因為GFP對活細胞基本無毒害,所以無須特殊處理就能夠很方便地進行活體觀察。而且，含有不一樣光譜特征GFP突變體取得,使在同一細胞中同時分析兩種不一樣蛋白或開啟子成為可能,能夠用于發育細胞學、藥品篩選、分析診療等研究。這就使GFP有可能成為一個快速、簡便、經濟標識蛋白，GFP基因作為報道基因可能有廣泛用途。第7頁2熒光穩定GFP無光漂白現象，在很大pH范圍內(pH7～12)都能夠正常發出熒光，受溫度影響也很小，只有在超出65℃時才會變性，熒光消失。熒光顯微鏡強光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素(fluorescein)強[9]。尤其在450～490nm藍光波長下更穩定,但在340～390nm或395～440nm范圍內，仍會發生光漂白現象。對于長時間光照，GFP也有很好耐受性，依據Sheen等研究，GFP在受體內表示時能夠連續得到不低于10分鐘熒光。第8頁3廣譜性首先表現在它表示幾乎不受種屬范圍限制，在微生物、植物、動物中都取得了成功表示；其次就是沒有細胞種類和位置限制，在各個部位都能夠表示，發出熒光。第9頁4易于載體構建因為GFP較小，只含有238個氨基酸，編碼GFP基因序列也較短，約2.6kb，所以它能夠很方便地同其它序列一起構建各種質粒，而不至于使質粒過大影響轉化頻率。盡管野生型GFP在一些植物和動物中表示很弱，但可經過更換GFP生色團氨基酸、改變堿基組分、除去內含子、更換強開啟子等方法加強表示。Connack等篩選出了三種含Ser65突變突變體，在大腸桿菌中表示時，熒光強度比野生型高約100倍。第10頁5無毒害Chalfie等研究表明：GFP對生活細胞基本無毒害，Sheen等(1995)研究深入表明：在玉米中，即便GFP在細胞中表示量很高時，對細胞也不會產生顯著毒害。不過至今我們還不太了解它對植物再生能力影響。第11頁三、GFP在細胞生物學研究中應用1對細胞生理過程監控在過去幾年中，經過隨機和人工誘變得到了許多不一樣顏色GFP突變體。經過基因操作，許多蛋白都成功與GFP進行了融合，經過這些融合蛋白就能夠對對應蛋白表示和轉運及生理反應進行監控。當前GFP融合蛋白對細胞內快速生理反應匯報大約有三種方式：轉移和定位、GFP光譜生化修飾、熒光共振能量轉移(FRET)。Shen[10]等在培養神經元中發覺，細胞內Ca2+瞬間改變就會引發GFP標識鈣調蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可逆地易位到突觸后膜densities上。Shi[11]等用GFP標識來監控α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)受體，發覺它會從細胞內膜轉移到樹突棘表面，依據突觸中AMPA受體含量能夠解釋突觸緘默、活化原因和機制。Siegel[12〕等將野生型GFP插人ShakeK十通道特殊部位，形成一個異源嵌合體，這個嵌合體發出熒光將會伴隨細胞去極化作用而遲緩降低。相反，Yanagawa[13]等將β-內酰胺酶插人GFP得到了一個融合體，當此融合體與β-內酰胺酶抑制肽(BLIP)結合時,它熒光發射量會大大增加。第12頁2細胞篩選基于GFP能夠吸收、發射光，而且熒光穩定以及檢測方法快速、方便特征，GFP在細胞篩選上應用廣泛。譬如應用流式細胞計數儀來篩選蛋白產量增強細胞。Yuk等[14]使用GFP作為標識能快速篩選出在生長抑制環境下，仍能保持重組蛋白大量表示CHO細胞。另外，研究發覺經過GFP熒光降低，能夠測量出鼠和人細胞凋亡[15]。利用GFP融合蛋白作為細胞表面活體熒光標識，經過篩選已經取得GFP表示E.coli、人體腎細胞和猿猴COS-1細胞等特殊類型。SheenJ等在GFP轉染玉米原生質體中出現兩類細胞叢，第一類與對攝影同，展現紅色熒光，約占細胞總數66.3%；第二類細胞叢展現綠色熒光，熒光強度是對照74倍[16]。所以，用流式細胞計數儀或熒光活化細胞計數儀(FACS)很輕易將兩類細胞分離開來。第13頁3細胞亞結構及蛋白質分子定位對于許多蛋白質來說，易位是它們激活機制中一部分。以前多是用細胞分級分離和免疫細胞化學技術進行研究，而現在利用GFP融合蛋白顯像技術無疑是一個簡便而可靠檢測方法，我們不但能夠更加快地而且能夠更全方面地對蛋白質移動進行研究。近幾年,在GFP技術進步中最主要就是對幾個GFP突變體判定。經過標準熒光顯微鏡，依據它們所發出不一樣顏色熒光，就能夠在活細胞中同時而準確區分各種不一樣熒光融合蛋白以及了解它們分布情況[17]。在實際中，慣用藍綠色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)兩種突變體組合來在活細胞中進行雙色顯示。而其它突變體如藍色熒光蛋白(BFP)和紅色熒光蛋白(RFP)使用還受到許多限制，因為它們有很快光漂白作用或者是發射熒光強度太低。最近又發覺GFP是一個良好細胞間信號傳遞動態標識分子,能夠跟蹤觀察第二信使,如Ca2+和cAMP水平起伏改變,細胞間隙pH值改變等[18]。第14頁4用于細胞內蛋白質動力學研究研究細胞內蛋白質相互作用技術主要有兩種：光漂白熒光恢復法(FRAP)、光漂白熒光損失法(FLIP)。FRAP主要是經過對細胞內特定點或區域進行強烈光照，使熒光發生光漂白作用，再經過相同時間間隔光影像采樣統計下熒光恢復動力學過程。FRAP不但能夠確定細胞器上蛋白，還能夠確定流動蛋白滯留時間。轉錄、m-RNA前體剪切、DNA修復中蛋白質復合體操作機制都能夠用這種方法來研究。FLIP是對細胞一個區域進行連續性光漂白，再對光漂白區外熒光損失進行監控就能夠取得一些標識蛋白之間相關性信息。當前正在體外經過改變光照點大小和固定細胞來研究光漂白作用可逆性，不過還是與活細胞環境有一定差距。另外一個能夠用來研究細胞內反應動力學方法就是熒光相關性分光光鏡檢驗(FCS)。這種方法是首先經過聚焦照射在細胞內形成一個一定大小光洞，光洞中熒光探針移動會引發熒光波動，經過校正計算出熒光顆粒平均滯留時間和平均數量，再依據已知光洞大小和平均光滯留時間就能夠計算出擴散蛋白動力學參數[19]。第15頁5計算細胞生長速度在高水平組合型表示GFP細胞品系中,在細胞生長對數期,綠色熒光蛋白所發出熒光信號與細胞數量親密相關。測量到任何熒光強度都能夠對應地轉變成細胞濃度。盡管在細胞生長后期,用熒光信號計算得到細胞數目略低于培養物中實際數目。但在慣用臺盼藍計數方法中,這個誤差是允許。利用這一技術,能夠測定一些細胞分布和生長情況,尤其是一些透明動物和植物組織內特定細胞、化合物生長、分布情況。也有些人用此項技術進行病毒在植物體內生長、擴散情況研究,取得了不錯效果。第16頁6.觀察細胞內酶活動

GFP突變子不但僅能夠用來探測融合蛋白空間定位，而且能夠對活細胞酶活動，如：磷酸化作用、蛋白水解作用等進行匯報，還能夠測量與酶活動相關細胞內pH、cAMP、Ca2+濃度。經過將外源序列插人GFP基因中，能夠對細胞內酶活動進行觀察以及了解這些酶生理學參數。插入外源基因后所表示融合蛋白中GFP蛋白發色基團會發生構像改變，其發射熒光強度也會發生很大改變。這些指示劑能夠用來檢測細胞內許多酶作用，比如：蛋白水解酶、激酶、氧化還原酶以及一些小配基濃度[20]。第17頁7用于細胞示蹤試驗研究利用GFP熒光能夠清楚地對腫瘤細胞生長和轉移進行追蹤。體內腫瘤侵襲研究要求在周圍正常細胞背景下，能識別少許甚至是單個瘤細胞。以往用抗腫瘤細胞特異性抗原、抗體進行免疫組化分析，操作較為復雜,且反抗原性有較高要求。利用β半乳糖昔酶(LacZ)作為標識基因轉染腫瘤細胞，操作較為復雜，且需底物分子。而用GFP就能夠準確而簡便地對腫瘤細胞進行示蹤。李俠【21】等將攜有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因pEGFP-N3質粒體外轉染C6膠質瘤細胞，篩選穩定表示綠色熒光蛋白細胞克隆，以立體定向法植入SD大鼠腦實質內建立大鼠移植瘤模型。4周后處死大鼠并作鼠腦連續石蠟切片,相鄰切片分別做蘇木素-伊紅(HE)或免疫組化染色后熒光顯微鏡下檢測。在熒光顯微鏡很輕易區分腫瘤區和非腫瘤區，并能發覺侵襲至遠處單個腫瘤細胞，其敏感性和特異性顯著優于HE染色和免疫組化方法。朱君明[22]等將GFP和HTH1雙基因多基因表示載體GC-GFP-P-HTH1-SN轉染NIH-3T3細胞，且移植人Parkinon病模型大鼠紋狀體內后，也清楚地觀察到了NIH-3T3細胞在腦內生長情況。Xin[23]等將EGFP轉人EG4細胞(一個原胚細胞)中，建立了幾株既能夠表示綠色熒光蛋白又依然保持了多能干細胞特征EG4-GFP細胞系，經過對聚集EG4-GFP細胞到8細胞胚胎研究,能夠追蹤到EG4-GFP細胞在體外分化情況以及在胚胎發育中命運。第18頁8.基因表示調控Clontech企業構建了一個叫開啟子匯報載體(Promoterreportervector)即是一個沒有開啟子GFP質粒，專門用來測試各種開啟子對GFP表示效率，以及一些增強子對GFP表示調控效果。發覺用玉米C4PPDK基因5'端非翻譯片段(5'VTR)與花椰菜花葉病毒35S開啟子連接，GFP在玉米原生質體中表示效率比對照質粒(只有35S開啟子)提升近15倍，因為5'VTR片段中含轉錄增強子。用擬南芥菜熱休克(Heat-shock)基因開啟子構建GFP表示載體，用以轉化玉米原生質體。發覺42℃熱激處理中50%原生質體表示GFP熒光，37℃處理熒光較弱，而常溫下培養,則完全觀察不到原生質體中GFP熒光[24]。在高等植物遺傳轉化基因表示調控研究中，已經有很多匯報蛋白被應用，包含LacZ(β半乳糖苷酶)，CAT〔Chloramphenicolacethytransferase〕,Luc(熒光蟲Luciferase)和GUS(β-glucuronidase)等。但這些匯報蛋白都是酶，其表示產物檢測都需要進行細胞固定、組織切片或蛋白提取等破壞性處理，極難用于活體觀察和檢測。GFP作為一個活體匯報蛋白，用于研究基因表示調控，顯著含有其它匯報蛋白不可替換優點。第19頁9.定量分析GFP熒光強度很高，很輕易用儀器定量檢測，而且研究表明GFP熒光強度和與其相連細胞或蛋白有一定相關性，只需要做出一條相關性曲線，就能夠對研究對象進行定量分析。Hack[19]等將用GFP標識神經元特異性鈣調蛋白calretinin(CR)基因轉人畸胎癌細胞中，經過對微血管中GFP熒光測量，再做出GFP和CR含量標準曲線來計算出CR表示量。Mcore[25]等將GFP在體外轉染9L膠質細胞瘤細胞后接種于Fisher大鼠腦內，2周后處死大鼠，進行鼠腦標本切片和熒光顯微鏡觀察，無熒光標識暗區(blackspots)為腫瘤血管區，由此可計數新生血管數量。第20頁10GFP匯報蛋白用于細胞活體分離與純化利用細胞表面標識，經過流體細胞分光光度計或熒光活化細胞篩選儀(FACS)，能夠分離與純化特殊類型細胞，對分析cDNA文庫、研究基因細胞發育或組織專一性表示十分主要[26,27]。利用GFP融合蛋白為細胞表面活體熒光標識，經過篩選已經取得GFP表示大腸桿菌、人體腎細胞和猿猴COS-1細胞特殊類型。SheenJ等在GFP轉染玉米原生質體流體參數分析中發覺，轉染15～18小時后，對照中只有一類細胞叢，表現較強紅色熒光和微弱綠色熒光，而且細胞間熒光強度相當一致，沒有顯著差異。而GFP轉染原生質體中出現兩類細胞叢，第一類與對攝影同，展現紅色熒光，約占細胞總數66.3%；第二類細胞叢展現綠色熒光，熒光強度是對照74倍。所以，用流式細胞分光光度計或熒光活化細胞篩選儀(EpicsElite,ConlterElectronics,MiamiFL,USA)很輕易將兩類細胞分離開來。原生質體能夠起源于不一樣類型組織細胞原生質體表示GFP信息，即可代表某種組織信息。采取發育專一性開啟子構建GFP表示載體，能夠將這些含有基因表示特異性細胞類型分離出來。利用不一樣表示文庫轉染原生質體，經過流體參數分析和細胞分類，能夠揭示在信號傳導路徑中所包含許多反方活化因子(trans-activatingfectors)。GFP在生物學和分子生物學研究中利用還不但僅局限于上述幾個方面。伴隨研究深入開展，其廣泛利用潛力將不停表現出來。第21頁四、存在問題及展望GFP標識蛋白有很顯著優點，但這項技術還是有很多不足。第一，這種方法需要很高空間分辨力，培養細胞要稀疏而且很薄；第二，定量范圍會受到融合蛋白表示水平和顯像分辨力干擾；第三，因為融合蛋白擴散到膜表面需要一定時間，所以動力學響應在一些情況下可能會受到時間上限制；第四，由GFP標識物本身引發電勢干擾是極難預計，因為幾乎沒有其它方法能夠用來做比較；第五，幾乎在全部情況下,細胞內GFP標識分子表示都伴伴隨一些未標識蛋白表示。比如,組成高爾基反面網狀結構膜蛋白TGN38，它正確功效定位和動力學過程需要在同源系統中低水平表示，而在非同源系統中表示或在同源系統中高水平表示，則會造成其斷裂或被錯誤地定位[28]。第六，GFP分子量即使不大(27kDa)，但對蛋白功效影響比一些短(大約10個氨基酸)熒光標識蛋白要大。最終，即使有報道指出，熒光只能在表示GFP細胞中檢測到，不過也有不少人擔心GFP基因可能還不能完全準確地反應轉化情況，GFP基因表示可能有假象存在：首先，細胞本身存在一些能夠受光激發物質，能產生一定量熒光；另首先，GFP基固在受體內表示頻率并不高。Sheen等(1995)在一些被CABGFP基因轉化植株中檢測不到清楚熒光信號。Hu、Sheen、Haselof等l995年在發表文章中也分別提到了這一現象，看來GFP應用條件還需進行深入探索。GFP成像技術是生化和分子細胞生物學中飛速發展一個工具,它已經滲透到了分子生物學、遺傳學、動物學、植物學、生理學等其它許多生命科學領域。有了GFP，培育出奇特熒光動物和熒光植物已不再是夢想。相信伴隨基因工程技術和細胞工程技術日益成熟，GFP一定能夠為我們揭開細胞中許多迄今為止還不為人所知秘密,掀起一場生物學上綠色革命。第22頁參考文件[1]ShimomuraO,JhsonFH,SaigaY,etal.,1962,J.Cell.Comp.Physiol,59:223.[2]PrasherD,EckenrodeV,WardW,etal.,1992,Gene,111:229-233.[3]ChalfieeM,TuY,EuskirchenG,etal.,1994,Science,263:802-805.[4]WachterRMandRemingtonSJ.,1999,Curr,Biol,9:R628-R629.[5]SiemeringKR,GolbikR,SverR,HaseloffJ.,1996,CurrBiol,6:1653-1663.[6]LiX,ZhangG,NgoN,etal.DeletionsoftheAequoreavictoriagreenfluorescentproteindefinetheminimaldomainrequiredforfluorescence[J].JBiolChem,1997,272(45):28545-28549.[7]MoriseH,ShimomuraO,JohnsonFH,etal.IntermolecularenergytransferinthebioluminescentsystemofAequorea[J].Biochemistry,1974,13(12):2656-2662.[8]DelagraveS,YouvanDC.Searchingsequencespacetoengineerproteins:Exponentialensemblemutagenesis[J].Bio/Technology,1993(11):1548-1552.[9]NicolaJandHack.1995,JournalofNeuroscienceMethods,177-184.[10]ShenKandMeverT.1999,Sience,284:162-166.[11]ShiSH,HayashiY,PetraliaRS,etal.,1999,Science,284:1811-1816.[12]SigelMSandIsacoffEY.,1997,Neuron,19:735-741.[13]DoiNandYanagawaH.,1999,FEBSLett,453:305-307

第23頁[14]YukIHY,WildtS,JolicoeurM,etal.AGFP-basedscreenforgrowtharrested,recombinantprotein-producingcells[J].BiotechnolBioeng,(79):74-82.[15]StrebelA,HarrT,BachmannF,etal.Greenfluorescentproteinasanoveltooltomeasureapoptosisandnecrosis[J].Cytometry,(43):126-133.[16]SheenJ,HwangS,NiwaY,etal.Greenfluorescenetproteinasanewvitalmarkerinplantcells[J].ThePlantJournal,1995(8):777-784.[17]EllenbergJ,etal.,1999,TrendsCellBiol.,9:52-56.[18]AlbanoCR,LuCH,BentleyWE,etal.Highthroughputstudiesofgeneexpressionusinggreenfluorescentproteinoxidativetresspr