一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發病率和死亡率長期居高不下。據世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構報告顯示，2022年全球新增癌癥病例約2000萬例，死亡病例約970萬例，肺癌、乳腺癌、結直腸癌等成為發病率最高的癌癥類型。當前，癌癥的治療手段主要包括手術、放療、化療、免疫治療和靶向治療等。手術治療雖能直接切除腫瘤，但對于晚期或轉移性癌癥往往效果有限；放療通過高能射線殺死癌細胞，但會對周圍正常組織造成損傷；化療使用化學藥物抑制癌細胞生長，然而其缺乏特異性，在殺傷癌細胞的同時也會損害正常細胞，導致脫發、疲憊、身體不適以及感染風險增加等一系列副作用。免疫治療和靶向治療雖在部分癌癥治療中取得了一定成效，但仍面臨著耐藥性、高昂成本和適用人群有限等問題。因此，開發更高效、低毒且具有特異性的新型抗癌藥物和治療策略迫在眉睫。蜂毒類肽作為蜜蜂毒液中的重要活性成分，近年來在腫瘤治療領域展現出巨大的潛力。蜂毒類肽通常由15-50個氨基酸殘基組成，形成高度結構化的折疊，包括α-螺旋、β-折疊和無規卷曲等，這些結構被二硫鍵和其他相互作用穩定，賦予其高穩定性和生物活性。根據氨基酸序列、結構和生物活性，蜂毒類肽可分為毒殺肽、膜活性肽、神經毒肽和免疫調節肽等幾類。其具有多種抗癌機制，包括直接的細胞毒性，能夠通過破壞細胞膜、激活細胞凋亡通路、抑制細胞增殖等方式直接殺死癌細胞；免疫調節作用，可激活免疫細胞，如巨噬細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞，增強抗癌免疫反應；抗血管生成作用，能抑制腫瘤血管的形成，阻斷腫瘤的營養供應和轉移；抗轉移作用，可抑制癌細胞的侵襲和轉移，通過抑制細胞骨架重排和細胞外基質降解來減少轉移灶的形成。此外，蜂毒類肽還能逆轉腫瘤細胞對化療和其他抗癌藥物產生的多藥耐藥性。研究表明，蜂毒類肽在多種癌癥模型中表現出良好的抗癌效果，如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結直腸癌和急性髓系白血病等，為癌癥治療提供了新的思路和方法。然而，蜂毒類肽在實際應用中也面臨一些挑戰，例如其毒副作用，尤其是溶血性，嚴重限制了其在臨床上的應用，使之難以通過靜脈給藥等常規途徑使用。與此同時，鐵蛋白作為一種存在于人體細胞中的儲鐵蛋白，具有獨特的殼-核結構，其外殼由24個亞基自組裝形成蛋白籠，內腔能以水鐵礦形式儲存鐵。2012年，中國科學院院士閻錫蘊團隊發現人重鏈鐵蛋白識別腫瘤標志分子——轉鐵蛋白受體1，這一發現賦予鐵蛋白作為腫瘤靶向藥物載體的優良性能。鐵蛋白能夠憑借其天然靶向性，特異性地識別腫瘤細胞表面高表達的轉鐵蛋白受體1，實現對腫瘤細胞的靶向遞送；同時，鐵蛋白具有良好的生物相容性，在體內不會引起明顯的免疫反應和毒副作用。其獨特的籠狀結構不僅為藥物提供了良好的裝載空間，還能保護藥物免受外界環境的影響，提高藥物的穩定性?；阼F蛋白的這些特性，將其作為藥物載體用于腫瘤治療的研究逐漸成為熱點，并且在化療、放療、光動力治療及基因治療等多種癌癥療法中均展現出應用潛力。本研究旨在構建鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統，充分發揮蜂毒類肽的抗腫瘤活性以及鐵蛋白的靶向遞送和生物相容性優勢，為腫瘤治療提供一種新的策略和方法。通過將蜂毒類肽裝載到鐵蛋白載體中，有望解決蜂毒類肽在體內遞送過程中的穩定性和靶向性問題，降低其毒副作用，提高抗腫瘤效果。這一研究不僅有助于深入了解蜂毒類肽和鐵蛋白在腫瘤治療中的作用機制，還可能為臨床癌癥治療帶來新的突破，具有重要的理論意義和實際應用價值。1.2國內外研究現狀近年來，蜂毒類肽的抗腫瘤研究取得了顯著進展。在結構與活性關系方面，研究人員深入探究了蜂毒類肽的氨基酸序列、空間結構與其抗腫瘤活性之間的關聯。如蜂毒肽作為蜂毒的主要成分，由26個氨基酸殘基組成，具有獨特的兩親性α-螺旋結構，這種結構使其能夠與細胞膜相互作用，破壞細胞膜的完整性，進而發揮細胞毒性作用。通過對蜂毒肽結構的改造和修飾，如定點突變、化學修飾等方法，研究人員試圖優化其抗腫瘤活性并降低毒副作用。有研究通過對蜂毒肽的氨基酸殘基進行替換，成功獲得了具有更高抗腫瘤活性和更低溶血性的蜂毒肽類似物。在作用機制研究上，蜂毒類肽的多種抗腫瘤機制逐漸被揭示。除了直接的細胞毒性作用外，其免疫調節功能也備受關注。蜂毒類肽能夠激活巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應。在抗血管生成方面，研究發現蜂毒類肽可以抑制血管內皮生長因子的表達和活性，從而阻斷腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營養供應。在抗轉移機制上，蜂毒類肽能夠抑制癌細胞的遷移和侵襲能力，通過調節細胞骨架相關蛋白的表達和活性，阻止癌細胞的轉移。在應用研究方面，蜂毒類肽在多種癌癥模型中展現出了良好的抗癌效果。在黑色素瘤模型中，蜂毒類肽能夠誘導癌細胞凋亡，抑制腫瘤的生長和轉移；在乳腺癌模型中，蜂毒類肽不僅可以直接殺傷癌細胞，還能增強化療藥物的敏感性，克服腫瘤的多藥耐藥性。鐵蛋白作為藥物載體的研究也取得了豐富的成果。在結構與特性研究中，對鐵蛋白的殼-核結構、亞基組成以及其與轉鐵蛋白受體1的相互作用機制有了更深入的了解。研究發現，鐵蛋白的外殼由24個亞基自組裝形成蛋白籠，具有良好的穩定性和生物相容性，其內腔可用于裝載藥物。通過對鐵蛋白的結構改造，如在亞基上引入特定的官能團或標簽，能夠進一步優化其藥物裝載能力和靶向性。在藥物遞送機制方面，研究表明鐵蛋白主要通過與腫瘤細胞表面高表達的轉鐵蛋白受體1特異性結合，實現對腫瘤細胞的靶向遞送。在細胞攝取過程中，鐵蛋白-藥物復合物通過網格蛋白介導的內吞作用進入細胞，隨后在細胞內的酸性環境下，藥物從鐵蛋白中釋放出來，發揮治療作用。在腫瘤治療應用中，鐵蛋白作為藥物載體在化療、放療、光動力治療及基因治療等領域都有廣泛的研究。在化療中，將化療藥物裝載到鐵蛋白中，能夠提高藥物的穩定性和靶向性，降低藥物的毒副作用；在光動力治療中，鐵蛋白可以負載光敏劑，實現對腫瘤組織的精準光動力治療；在基因治療中，通過對鐵蛋白進行修飾，使其能夠有效負載核酸藥物，為基因治療提供了新的策略。然而，當前的研究仍存在一些不足之處。在蜂毒類肽研究中，雖然其抗腫瘤活性得到了廣泛認可，但其毒副作用，尤其是溶血性，仍然是限制其臨床應用的關鍵因素。目前對蜂毒類肽的體內代謝過程和藥代動力學研究還不夠深入，這對于其臨床應用的安全性和有效性評估帶來了困難。在鐵蛋白遞送系統研究方面，雖然鐵蛋白具有良好的生物相容性和靶向性，但在藥物裝載效率和釋放可控性方面仍有待提高。部分鐵蛋白改造方法可能會影響其結構穩定性和生物活性，從而影響其作為藥物載體的性能。此外，鐵蛋白遞送系統在體內的長期安全性和免疫原性問題也需要進一步研究。本研究將針對這些不足，構建鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統，通過優化鐵蛋白的藥物裝載和釋放性能，以及深入研究蜂毒類肽在該系統中的穩定性和活性，有望提高蜂毒類肽的抗腫瘤效果，為腫瘤治療提供新的策略和方法。1.3研究內容與方法1.3.1鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的構建通過基因工程技術，對鐵蛋白進行修飾改造，在其表面引入特定的官能團或標簽，以增強其對蜂毒類肽的裝載能力和穩定性。同時，利用化學偶聯方法，將蜂毒類肽與修飾后的鐵蛋白進行共價結合，構建鐵蛋白-蜂毒類肽遞送系統。通過動態光散射、透射電子顯微鏡等技術，對構建的系統進行表征，包括粒徑、形態、Zeta電位等參數的測定，以評估系統的物理性質和穩定性。采用高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS），對蜂毒類肽的裝載量和包封率進行測定，優化裝載條件，提高系統的載藥效率。1.3.2鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的抗腫瘤效果研究選用多種腫瘤細胞系，如乳腺癌細胞系MCF-7、肺癌細胞系A549、結直腸癌細胞系HCT116等，通過細胞活力檢測（MTT法、CCK-8法）、細胞凋亡檢測（AnnexinV-FITC/PI雙染法、流式細胞術）、細胞周期分析（PI染色法、流式細胞術）等實驗，研究鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統對腫瘤細胞生長、增殖、凋亡和細胞周期的影響。建立荷瘤小鼠模型，通過尾靜脈注射、瘤內注射等方式給予小鼠鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統，觀察腫瘤的生長情況，測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線，評估系統的體內抗腫瘤效果。通過組織學分析（蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學染色）、免疫熒光染色等技術，觀察腫瘤組織的病理變化、細胞凋亡情況以及相關蛋白的表達水平，進一步驗證系統的抗腫瘤效果。1.3.3鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的抗腫瘤機制研究利用蛋白質組學技術，分析鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統處理后的腫瘤細胞蛋白質表達譜的變化，篩選出差異表達的蛋白質，通過生物信息學分析，探討這些蛋白質參與的信號通路和生物學過程，初步揭示系統的抗腫瘤機制。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質免疫印跡（Westernblot）等技術，檢測與細胞凋亡、細胞周期調控、免疫調節、血管生成等相關基因和蛋白的表達水平，驗證蛋白質組學分析的結果，深入研究系統的抗腫瘤機制。利用免疫細胞功能檢測技術，如巨噬細胞吞噬功能檢測、自然殺傷細胞活性檢測等，研究鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統對免疫細胞功能的影響，探討其在免疫調節方面的作用機制。二、鐵蛋白與蜂毒類肽的特性及作用機制2.1鐵蛋白的結構與功能2.1.1鐵蛋白的結構特點鐵蛋白是一種廣泛存在于生物體中的保守性蛋白質，在維持細胞內鐵穩態以及抗氧化防御等過程中發揮著關鍵作用。其具有獨特的殼-核結構，宛如一個精巧的納米容器。外殼由24個亞基自組裝而成，形成一個近似球形的蛋白籠，直徑約為12-13納米。這些亞基可分為重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）兩種類型，在人類鐵蛋白中，H鏈和L鏈的分子量分別約為21kDa和19kDa。H鏈亞基具有亞鐵氧化酶活性中心，能夠催化Fe2?氧化為Fe3?，加速鐵的儲存過程；L鏈亞基則富含酸性氨基酸殘基，有助于鐵核的形成和穩定。不同比例的H鏈和L鏈組合，賦予鐵蛋白在不同組織和生理條件下多樣化的功能特性。例如，在心肌組織中，鐵蛋白主要由H鏈組成，這與其在高代謝活性組織中快速儲存和釋放鐵，以滿足心肌細胞對鐵的需求，維持正常心臟功能的作用密切相關；而在肝臟中，L鏈含量相對較高，利于肝臟進行大量的鐵儲存，以應對機體鐵代謝的波動。蛋白籠的內腔直徑約為8納米，猶如一個寬敞的內部空間，能夠以水鐵礦（FeOOH）?（HPO?）?-2?nH?O的形式儲存大量的鐵離子。每個鐵蛋白分子最多可容納約4500個鐵原子，這種高效的儲鐵能力使得鐵蛋白成為細胞內鐵的主要儲存形式。鐵蛋白外殼并非完全封閉，而是存在著一些通道，這些通道通常由3-4個亞基環繞而成。通道的直徑約為0.3-0.4納米，允許小分子物質如Fe2?、磷酸鹽、氫離子等通過，實現鐵離子的進出以及與外界環境的物質交換。在鐵離子進入鐵蛋白內腔的過程中，首先是Fe2?通過通道進入蛋白籠內部，隨后在H鏈亞基的亞鐵氧化酶活性中心被氧化為Fe3?，并進一步與磷酸鹽結合，逐步形成水鐵礦核心。當細胞需要鐵時，鐵蛋白內腔中的鐵又可以通過通道釋放出來，參與細胞內的各種生理過程。2.1.2鐵蛋白作為藥物載體的優勢鐵蛋白具有低免疫原性的顯著優勢，這使其在體內應用時不易引發強烈的免疫反應。天然的鐵蛋白是人體自身的蛋白質，免疫系統對其具有較高的耐受性。研究表明，將鐵蛋白作為藥物載體注入體內后，血清中特異性抗體的產生量極低，幾乎可以忽略不計。相比之下，許多傳統的藥物載體，如脂質體、聚合物納米粒等，可能會被免疫系統識別為外來異物，從而引發免疫應答，導致載體被迅速清除，影響藥物的療效。鐵蛋白的低免疫原性使得它能夠在體內長時間循環，增加藥物與靶細胞的接觸時間，提高治療效果。高生物相容性也是鐵蛋白作為藥物載體的重要特性。它能夠與生物體內的各種生物分子和細胞和諧共處，不會對細胞的正常生理功能產生明顯的干擾。在細胞實驗中，即使鐵蛋白的濃度較高，細胞的存活率和增殖能力也不受顯著影響。在動物實驗中，鐵蛋白載體未引起明顯的組織損傷和器官功能異常。這種良好的生物相容性為鐵蛋白在體內的安全應用提供了堅實的保障，使其能夠有效地將藥物遞送至靶位點，而不會對機體造成額外的傷害。鐵蛋白獨特的籠狀結構為藥物裝載提供了便利條件。其寬敞的內腔可以容納多種類型的藥物分子，無論是小分子化學藥物、大分子核酸藥物還是蛋白質類藥物，都能在鐵蛋白的內腔中找到合適的“棲息之所”。通過物理吸附、化學偶聯或基因工程等方法，藥物可以被有效地裝載到鐵蛋白內部。例如，利用鐵蛋白內腔與小分子藥物之間的靜電相互作用或疏水相互作用，可實現小分子藥物的高效裝載；對于核酸藥物，可以通過對鐵蛋白進行修飾，使其表面帶有正電荷，從而與帶負電荷的核酸藥物通過靜電吸引結合。鐵蛋白的籠狀結構還能保護藥物免受外界環境的影響，如酶的降解、氧化等，提高藥物的穩定性，確保藥物在運輸過程中保持活性。鐵蛋白具有天然的腫瘤靶向性，這是其在腫瘤治療領域備受關注的重要原因之一。2012年，中國科學院院士閻錫蘊團隊發現人重鏈鐵蛋白能夠特異性地識別腫瘤標志分子——轉鐵蛋白受體1（TfR1）。TfR1在腫瘤細胞表面高度表達，其表達水平往往與腫瘤的生長、增殖和轉移密切相關。鐵蛋白通過與TfR1的特異性結合，能夠實現對腫瘤細胞的靶向遞送。在體內實驗中，標記有熒光探針的鐵蛋白能夠在腫瘤組織中高度富集，而在正常組織中的分布較少。這種天然的腫瘤靶向性使得鐵蛋白能夠將攜帶的藥物精準地輸送到腫瘤部位，提高腫瘤組織中的藥物濃度，增強治療效果，同時減少藥物對正常組織的毒副作用。2.1.3鐵蛋白在藥物遞送中的應用現狀在小分子化學藥物遞送方面，鐵蛋白展現出了巨大的潛力。許多化療藥物，如阿霉素、順鉑、奧沙利鉑等，都可以被裝載到鐵蛋白中。研究表明，將阿霉素裝載到鐵蛋白內腔后，形成的鐵蛋白-阿霉素復合物在體內的循環時間明顯延長，腫瘤組織中的藥物濃度顯著提高。與游離的阿霉素相比，鐵蛋白-阿霉素復合物對腫瘤細胞的殺傷效果更強，且對正常組織的毒性明顯降低。在乳腺癌小鼠模型中，給予鐵蛋白-阿霉素復合物治療后，腫瘤體積明顯縮小，小鼠的生存期顯著延長，同時小鼠的心臟、肝臟等重要器官的損傷程度明顯減輕。這是因為鐵蛋白的靶向性使得阿霉素能夠更精準地作用于腫瘤細胞，減少了對正常組織的暴露。鐵蛋白在大分子核酸藥物遞送領域也取得了重要進展。由于核酸藥物自身的特性，如易被核酸酶降解、細胞攝取效率低等，其臨床應用受到了很大的限制。而鐵蛋白作為核酸藥物載體，能夠有效地解決這些問題。通過對鐵蛋白進行修飾，使其能夠與核酸藥物結合并實現高效遞送。中國科學院生物物理研究所的研究團隊通過基因工程手段，構建了內腔正電的載核酸鐵蛋白載體，實現了對Toll樣受體核酸配體的有效裝載。這種載核酸鐵蛋白載體能夠安全高效地在體內遞送核酸藥物，有效增強了抗腫瘤免疫治療的療效。在荷瘤小鼠模型中，使用載核酸鐵蛋白載體進行治療后，腫瘤生長受到明顯抑制，小鼠的免疫功能得到顯著增強。在疫苗遞送方面，鐵蛋白同樣具有廣闊的應用前景。鐵蛋白可以作為疫苗的載體，增強疫苗的免疫原性和穩定性。將抗原蛋白或核酸與鐵蛋白結合后，能夠促進抗原的呈遞，激活機體的免疫系統。有研究將流感病毒的抗原蛋白與鐵蛋白偶聯，制備成新型的流感疫苗。動物實驗結果表明，該疫苗能夠誘導機體產生更強的免疫應答，產生更高水平的特異性抗體，對流感病毒的感染具有更好的保護作用。此外，鐵蛋白還可以作為佐劑，與其他疫苗聯合使用，提高疫苗的效果。2.2蜂毒類肽的結構與性質2.2.1蜂毒類肽的氨基酸組成與序列蜂毒類肽是一類具有重要生物活性的多肽，在蜂毒的多種生物學效應中發揮著關鍵作用。其中，蜂毒肽作為蜂毒類肽的典型代表，由26個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸-纈氨酸-亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-色氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺（GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ）。這種特定的氨基酸組成和排列順序賦予了蜂毒類肽獨特的結構和生物學功能。從氨基酸組成來看，蜂毒類肽富含多種具有特殊性質的氨基酸。其中，賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）殘基的存在使得蜂毒類肽具有強堿性。賴氨酸側鏈含有一個帶正電荷的氨基，精氨酸側鏈則含有一個胍基，同樣帶正電荷。在生理pH條件下，這些帶正電荷的基團使得蜂毒類肽整體呈現陽離子特性，這對于其與細胞膜的相互作用以及后續的生物學效應具有重要影響。例如，蜂毒類肽的陽離子特性使其能夠與細胞膜表面帶負電荷的磷脂頭部相互吸引，從而促進蜂毒類肽與細胞膜的結合，進而破壞細胞膜的完整性，發揮細胞毒性作用。蜂毒類肽還具有明顯的兩親性特點。從序列上分析，其N-末端起前20個氨基酸殘基主要是疏水的。這些疏水氨基酸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸等，它們的側鏈大多為非極性基團，具有較強的疏水性。這種疏水性使得蜂毒類肽的N-末端能夠與細胞膜的疏水核心相互作用，插入到細胞膜的脂質雙分子層中。而C-末端的6個氨基酸殘基主要是親水的，谷氨酰胺、賴氨酸等氨基酸的存在，使得C-末端具有良好的親水性。親水性的C-末端則傾向于與細胞膜表面的水相環境相互作用。蜂毒類肽的這種兩親性結構使其能夠在水溶液中與細胞膜自然結合，就像一把“分子鑰匙”，巧妙地插入細胞膜的“鎖孔”，進而溶解細胞，實現其生物學功能。在不同的環境條件下，蜂毒類肽的氨基酸序列會發生相應的結構變化。在中性水溶液中，蜂毒類肽作為單體是以隨機的卷曲結構存在的。這是因為在這種條件下，蜂毒類肽分子內的各種相互作用相對較弱，無法形成穩定的二級結構。而隨著pH值以及離子強度的增高，蜂毒類肽會自我交聯，形成螺旋的四聚體結構。在較高的pH值下，蜂毒類肽分子中的某些基團會發生解離，導致分子間的靜電相互作用發生改變，從而促使蜂毒類肽分子之間相互聚集，形成四聚體。離子強度的增加也會影響蜂毒類肽分子周圍的離子環境，進一步促進分子間的相互作用，有利于四聚體的形成。這種結構變化與蜂毒類肽的功能密切相關，四聚體結構能夠比單體更有效地與細胞膜結合，形成離子通道，從而改變細胞膜的通透性，引起Ca2?內流，通過升高胞內Ca2?濃度使細胞裂解，達到殺傷腫瘤細胞的目的。2.2.2蜂毒類肽的理化性質蜂毒類肽具有良好的水溶性，這一特性與其氨基酸組成和結構密切相關。前文提及，蜂毒類肽的C-末端含有多個親水性氨基酸殘基，如谷氨酰胺和賴氨酸等。這些親水性氨基酸的存在使得蜂毒類肽分子能夠與水分子形成氫鍵等相互作用，從而增加了其在水中的溶解性。在生理條件下，蜂毒類肽能夠以溶解狀態存在于水溶液中，這為其在生物體內的運輸和發揮作用提供了便利條件。例如，在血液等體液環境中，蜂毒類肽可以隨著血液循環到達靶組織和靶細胞，實現其生物學功能。陽離子特性也是蜂毒類肽的重要理化性質之一。由于蜂毒類肽分子中含有多個帶正電荷的氨基酸殘基，如賴氨酸和精氨酸，在生理pH值下，這些殘基的側鏈基團會發生質子化，使得蜂毒類肽整體帶正電荷。這種陽離子特性使得蜂毒類肽能夠與帶負電荷的生物分子發生相互作用。在細胞層面，細胞膜表面的磷脂分子頭部大多帶負電荷，蜂毒類肽的陽離子特性使其能夠與細胞膜表面的負電荷相互吸引，促進蜂毒類肽與細胞膜的結合。這種結合是蜂毒類肽發揮細胞毒性、誘導細胞凋亡等生物學效應的重要前提。蜂毒類肽還可以與細胞內的一些帶負電荷的生物大分子，如核酸等相互作用，從而影響細胞的生理功能。蜂毒類肽的結構會隨著環境條件的變化而發生改變。在不同的pH值條件下，蜂毒類肽的結構會有所不同。在酸性環境中，蜂毒類肽分子中的某些酸性氨基酸殘基可能會發生質子化，導致分子內的電荷分布發生變化，進而影響分子的構象。當pH值較低時，蜂毒類肽分子中的羧基等酸性基團會結合質子，使得分子的負電荷減少，分子間的靜電排斥作用減弱，可能會促使蜂毒類肽分子形成更加緊密的結構。而在堿性環境中，蜂毒類肽分子中的堿性氨基酸殘基可能會發生去質子化，同樣會影響分子的電荷分布和構象。隨著pH值的升高，蜂毒類肽分子中的氨基等堿性基團會失去質子，使得分子的正電荷減少，分子間的相互作用也會發生改變，可能導致蜂毒類肽分子的結構變得更加松散。離子強度的變化也會對蜂毒類肽的結構產生影響。當離子強度較低時，蜂毒類肽分子周圍的離子濃度較低，分子間的靜電相互作用主要由自身的電荷決定。此時，蜂毒類肽分子可能會保持相對穩定的結構。而當離子強度升高時，溶液中的離子濃度增加，這些離子會與蜂毒類肽分子相互作用，屏蔽分子間的電荷，從而改變分子間的相互作用。高離子強度可能會使蜂毒類肽分子的結構變得更加緊湊，因為離子的存在會減少分子間的靜電排斥，促使分子聚集。這些結構變化對蜂毒類肽的功能有著顯著的影響。例如，蜂毒類肽與細胞膜的結合能力、形成離子通道的能力以及誘導細胞凋亡的能力等都可能會隨著結構的變化而發生改變。在某些結構狀態下，蜂毒類肽可能更容易與細胞膜結合，形成穩定的離子通道，從而更有效地發揮細胞毒性作用；而在另一些結構狀態下，蜂毒類肽的功能可能會受到抑制。2.3蜂毒類肽的抗腫瘤作用機制2.3.1直接殺傷腫瘤細胞蜂毒類肽能夠直接破壞腫瘤細胞膜的完整性，這一作用機制與細胞膜的結構密切相關。細胞膜主要由磷脂雙分子層構成，其具有一定的流動性和穩定性。磷脂分子的頭部是親水的，朝向細胞內外的水環境；尾部是疏水的，相互聚集形成磷脂雙分子層的內部疏水區域。蜂毒類肽的兩親性使其能夠與細胞膜發生特異性相互作用。如前文所述，蜂毒類肽的N-末端富含疏水氨基酸，這些疏水氨基酸能夠與細胞膜磷脂雙分子層的疏水尾部相互作用，插入到細胞膜的脂質雙分子層中。而其C-末端的親水氨基酸則與細胞膜表面的水相環境相互作用。這種兩親性結構使得蜂毒類肽能夠在細胞膜上形成離子通道或孔洞，導致細胞膜的通透性增加。當蜂毒類肽與細胞膜結合后，會引起細胞膜的物理變化，如膜的局部變形、變薄等。研究表明，蜂毒類肽可以在細胞膜上形成直徑約為1-2納米的孔洞。這些孔洞的形成使得細胞內的離子和小分子物質能夠自由進出細胞，打破了細胞內的離子平衡和滲透壓平衡。細胞內的鉀離子外流，而細胞外的鈉離子和鈣離子則大量內流。這種離子失衡會導致細胞的生理功能紊亂，如細胞內的酶活性受到影響，細胞的代謝過程無法正常進行。細胞內的滲透壓失衡會導致細胞吸水膨脹，最終破裂死亡。在分子層面，蜂毒類肽與細胞膜的相互作用還會影響細胞膜上的蛋白質和脂質的分布和功能。細胞膜上存在著許多蛋白質，如離子通道蛋白、受體蛋白等，它們對于細胞的正常生理功能起著關鍵作用。蜂毒類肽與細胞膜的結合可能會導致這些蛋白質的結構和功能發生改變。蜂毒類肽可能會與離子通道蛋白相互作用，使其失去正常的離子轉運功能，進一步加劇細胞內的離子失衡。蜂毒類肽還可能會影響細胞膜上的脂質組成和分布，破壞細胞膜的流動性和穩定性。研究發現，蜂毒類肽能夠改變細胞膜上磷脂的脂肪酸組成，使細胞膜的流動性降低，從而影響細胞的正常生理功能。2.3.2抑制腫瘤血管生成腫瘤的生長和轉移高度依賴于充足的血液供應，而腫瘤血管生成在其中起著關鍵作用。腫瘤細胞會分泌多種血管生成因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等。這些因子能夠刺激血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管的生成。VEGF是目前已知的最重要的血管生成因子之一，它能夠與血管內皮細胞表面的VEGF受體（VEGFR）結合，激活下游的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt通路。這些信號通路的激活會導致血管內皮細胞的增殖、遷移和存活能力增強，促進血管的生成。蜂毒類肽能夠通過多種途徑阻斷VEGF相關信號通路，從而抑制腫瘤血管生成。蜂毒類肽可以直接與VEGF結合，阻斷其與VEGFR的相互作用。研究表明，蜂毒類肽能夠與VEGF的特定結構域結合，改變VEGF的空間構象，使其無法與VEGFR正常結合。這種結合作用能夠有效地抑制VEGF的生物學活性，減少其對血管內皮細胞的刺激作用。在體外實驗中，將蜂毒類肽與VEGF共同孵育后，再加入血管內皮細胞，發現細胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制。蜂毒類肽還可以抑制VEGFR的表達和活性。通過調節相關基因的表達，蜂毒類肽能夠降低VEGFR在血管內皮細胞表面的表達水平。研究發現，蜂毒類肽處理后的血管內皮細胞中，VEGFR的mRNA和蛋白質表達水平均顯著下降。蜂毒類肽還可能會影響VEGFR的磷酸化水平，從而抑制其下游信號通路的激活。VEGFR的激活需要其酪氨酸殘基的磷酸化，蜂毒類肽可能會抑制相關激酶的活性，減少VEGFR的磷酸化，進而阻斷信號傳導。在體內實驗中，給予荷瘤小鼠蜂毒類肽后，通過免疫組織化學染色和血管密度分析發現，腫瘤組織中的血管密度明顯降低。腫瘤組織的微血管形態也發生了改變，變得更加稀疏、不規則。這些結果表明，蜂毒類肽能夠有效地抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養供應，從而抑制腫瘤的生長和轉移。2.3.3干擾腫瘤生物學行為腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移是癌癥發展和惡化的重要過程，而蜂毒類肽能夠對這些過程產生顯著的抑制作用。在腫瘤細胞增殖方面，細胞周期的調控起著關鍵作用。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，細胞在這些階段中有序地進行DNA復制、細胞分裂等過程。蜂毒類肽可以通過調節細胞周期相關蛋白的表達，使腫瘤細胞阻滯在特定的細胞周期階段。研究發現，蜂毒類肽能夠上調p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達。這些抑制劑能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結合，抑制其活性，從而阻止細胞從G1期進入S期。在乳腺癌細胞系中，給予蜂毒類肽處理后，通過流式細胞術分析發現，細胞周期被阻滯在G1期，細胞的增殖能力明顯下降。在腫瘤細胞侵襲和轉移過程中，細胞骨架的重排和細胞外基質的降解是關鍵步驟。細胞骨架由微絲、微管和中間絲組成，它對于維持細胞的形態和運動起著重要作用。腫瘤細胞通過調節細胞骨架的結構和功能，實現其侵襲和轉移能力的增強。蜂毒類肽能夠影響細胞骨架相關蛋白的表達和活性，如肌動蛋白、微管蛋白等。研究表明，蜂毒類肽可以抑制肌動蛋白的聚合，破壞細胞骨架的完整性。在肺癌細胞系中，蜂毒類肽處理后，細胞的偽足形成和遷移能力明顯減弱，這與細胞骨架的破壞密切相關。腫瘤細胞還會分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs），來降解細胞外基質，為其侵襲和轉移創造條件。蜂毒類肽可以抑制MMPs的表達和活性。通過調節相關基因的表達，蜂毒類肽能夠降低MMP-2、MMP-9等在腫瘤細胞中的表達水平。在結直腸癌細胞系中，給予蜂毒類肽處理后，通過明膠酶譜分析發現，MMP-2和MMP-9的活性顯著降低，細胞的侵襲和轉移能力也隨之下降。2.3.4誘導腫瘤細胞凋亡細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和組織穩態至關重要。當細胞受到各種內外因素的刺激時，會啟動凋亡程序，通過一系列復雜的信號傳導通路，最終導致細胞死亡。蜂毒類肽能夠通過調控相關信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡。其中，線粒體凋亡途徑是蜂毒類肽誘導腫瘤細胞凋亡的重要途徑之一。線粒體在細胞凋亡中起著核心作用。正常情況下，線粒體的膜電位保持穩定，線粒體內的細胞色素C等凋亡相關蛋白被封閉在線粒體內。當細胞受到凋亡刺激時，線粒體的膜電位會發生去極化，外膜通透性增加，細胞色素C會釋放到細胞質中。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體，進而激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）。Caspase-9又會激活下游的效應半胱天冬酶，如Caspase-3、Caspase-7等，這些效應半胱天冬酶會切割細胞內的多種底物，導致細胞凋亡的發生。蜂毒類肽能夠破壞線粒體的膜電位，促使細胞色素C的釋放。研究表明，蜂毒類肽可以與線粒體膜上的脂質和蛋白質相互作用，改變線粒體膜的結構和功能。蜂毒類肽可能會在線粒體膜上形成離子通道或孔洞，導致線粒體膜電位的去極化。在肝癌細胞系中，給予蜂毒類肽處理后，通過熒光探針檢測發現，線粒體膜電位明顯下降，細胞色素C釋放到細胞質中的量顯著增加。蜂毒類肽還可以調節Bcl-2家族蛋白的表達。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等），它們在細胞凋亡的調控中起著關鍵作用。蜂毒類肽能夠上調Bax、Bak等促凋亡蛋白的表達，同時下調Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達。這種調節作用使得Bax、Bak等促凋亡蛋白能夠在線粒體外膜上形成寡聚體，導致線粒體膜通透性增加，促進細胞色素C的釋放，從而啟動線粒體凋亡途徑。死亡受體途徑也是細胞凋亡的重要途徑之一。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，如Fas、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當死亡受體與其相應的配體結合后，會招募接頭蛋白FADD，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。DISC會激活Caspase-8，進而激活下游的效應半胱天冬酶，導致細胞凋亡。蜂毒類肽可以上調死亡受體Fas的表達，增強腫瘤細胞對Fas配體的敏感性。在胃癌細胞系中，給予蜂毒類肽處理后，Fas的表達水平明顯升高，當再加入Fas配體時，細胞凋亡的發生率顯著增加。2.3.5免疫調節作用腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）在腫瘤微環境中扮演著重要角色，其表型和功能的改變對腫瘤的發展和預后有著深遠影響。TAMs可以分為M1型和M2型兩種表型。M1型巨噬細胞具有較強的抗腫瘤活性，它們能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、CXCL9、CXCL10等。這些細胞因子和趨化因子能夠激活T細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應。M1型巨噬細胞還具有較強的吞噬能力，能夠直接吞噬和清除腫瘤細胞。而M2型巨噬細胞則具有促腫瘤作用。它們分泌的細胞因子如白細胞介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，能夠抑制免疫細胞的活性，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。M2型巨噬細胞還可以促進腫瘤血管生成和免疫逃逸。蜂毒類肽能夠調節TAMs的表型，使其向M1型極化。研究表明，蜂毒類肽可以通過激活TAMs表面的Toll樣受體（TLRs）等模式識別受體，啟動細胞內的信號傳導通路。蜂毒類肽與TLR4結合后，會激活MyD88依賴的信號通路，導致核因子-κB（NF-κB）的活化。NF-κB進入細胞核后，會調節相關基因的表達，促進M1型巨噬細胞相關細胞因子和趨化因子的分泌。在荷瘤小鼠模型中，給予蜂毒類肽處理后，通過流式細胞術分析發現，腫瘤組織中的M1型巨噬細胞比例明顯增加，M2型巨噬細胞比例降低。腫瘤組織中TNF-α、IL-1等M1型巨噬細胞相關細胞因子的表達水平顯著升高，而IL-10、TGF-β等M2型巨噬細胞相關細胞因子的表達水平降低。這種表型調節作用能夠增強機體的抗腫瘤免疫反應。M1型巨噬細胞分泌的細胞因子和趨化因子可以招募和激活T細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞，使其聚集到腫瘤組織中，發揮抗腫瘤作用。M1型巨噬細胞的吞噬能力增強，能夠更有效地清除腫瘤細胞。在體外實驗中，將蜂毒類肽處理后的M1型巨噬細胞與腫瘤細胞共培養，發現腫瘤細胞的生長受到明顯抑制，這表明蜂毒類肽通過調節TAMs表型，增強了巨噬細胞的抗腫瘤活性。三、鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的構建3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料準備本實驗所需的鐵蛋白來源為馬脾臟，通過購買獲得新鮮的馬脾臟組織，以用于后續的提取與純化操作。蜂毒類肽則采用化學合成的方式獲取，由專業的生物合成公司根據設計的氨基酸序列進行定制合成。在試劑方面，準備了多種關鍵試劑。Tris-HCl緩沖液，用于維持反應體系的pH值穩定，其在不同的實驗步驟中，根據具體需求配置成不同的pH值，如在鐵蛋白提取過程中，常使用pH為7.5的Tris-HCl緩沖液，以確保鐵蛋白的結構和活性不受影響；在蜂毒類肽的修飾反應中，可能會根據反應條件調整為其他合適的pH值。氯化鈉（NaCl）用于調節溶液的離子強度，在蛋白質的提取和純化過程中，合適的離子強度有助于蛋白質的溶解和沉淀，例如在鐵蛋白的鹽析步驟中，通過添加適量的NaCl來實現鐵蛋白的初步分離。硫酸銨用于蛋白質的鹽析沉淀，在鐵蛋白的粗提階段，向提取液中加入硫酸銨，使其達到一定飽和度，可使鐵蛋白沉淀析出，從而與其他雜質分離。常用的飽和度范圍在30%-60%之間，具體飽和度需根據實驗情況進行優化。二硫蘇糖醇（DTT）用于還原二硫鍵，在蜂毒類肽的修飾過程中，若涉及到二硫鍵的調整或相關反應，DTT可發揮重要作用，它能夠打破二硫鍵，為后續的修飾反應創造條件。N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）用于活化羧基，在蜂毒類肽與鐵蛋白的偶聯反應中，通過EDC和NHS的作用，使蜂毒類肽的羧基活化，從而能夠與鐵蛋白表面的氨基發生反應，實現兩者的共價結合。在實驗儀器方面，配備了高速冷凍離心機，用于樣品的離心分離，在鐵蛋白的提取和純化過程中，通過高速離心可以使蛋白質沉淀與上清液分離，去除雜質。其最高轉速可達15000r/min以上，能夠滿足不同實驗步驟對離心速度的要求。在分離鐵蛋白時，通常在4℃下以10000r/min的轉速離心30min，以確保鐵蛋白的有效沉淀和分離。還準備了超純水儀，用于制備實驗所需的超純水，保證實驗用水的純凈度，避免水中雜質對實驗結果產生干擾。超純水的電阻率需達到18.2MΩ?cm以上，以滿足生物實驗對水質的嚴格要求。同時，實驗中還用到了電泳儀，用于蛋白質的電泳分析，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），可以對鐵蛋白和蜂毒類肽的純度、分子量等進行檢測。在進行SDS-PAGE電泳時，可根據蛋白質的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度，一般對于鐵蛋白，常用的凝膠濃度為10%-12%，通過電泳結果可以判斷鐵蛋白的提取和純化效果，以及蜂毒類肽的合成和修飾情況。此外，還配備了高效液相色譜儀（HPLC），用于對蜂毒類肽的純度和含量進行精確分析。HPLC采用C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%三氟乙酸）為流動相，通過梯度洗脫的方式對蜂毒類肽進行分離和檢測，能夠準確測定蜂毒類肽的純度和含量，為后續的實驗提供可靠的數據支持。3.1.2鐵蛋白的提取與純化將新鮮獲取的馬脾臟組織，用預冷的生理鹽水沖洗3-5次，以去除表面的血液和雜質。沖洗過程中，需輕柔操作，避免對組織造成損傷。沖洗后，用濾紙吸干表面水分，準確稱取100g馬脾臟組織，切成約1cm3的小塊，放入組織勻漿器中。加入300mL預冷的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液，在冰浴條件下進行勻漿處理。勻漿過程中，應控制勻漿器的轉速和時間，避免產生過多的熱量導致蛋白質變性。一般以10000r/min的轉速勻漿3-5min，直至組織完全勻漿化。將勻漿后的混合物轉移至離心管中，在4℃下，以10000r/min的轉速離心30min。離心后，小心吸取上清液，轉移至新的離心管中。此時，上清液中含有鐵蛋白以及其他雜質。向所得上清液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，使其飽和度達到30%。在加入硫酸銨的過程中，要注意控制添加速度，避免局部濃度過高導致蛋白質沉淀不均勻。添加完成后，繼續攪拌30min，使硫酸銨充分溶解并與蛋白質充分作用。然后，在4℃下靜置2h，使鐵蛋白初步沉淀。將靜置后的混合物在4℃下，以12000r/min的轉速離心20min。離心后，棄去上清液，將沉淀用適量的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液溶解。溶解后的溶液中含有初步沉淀的鐵蛋白以及少量雜質。將溶解后的溶液轉移至透析袋中，用大量的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液進行透析，以去除溶液中的硫酸銨和其他小分子雜質。透析過程中，需多次更換透析液，一般每4-6h更換一次透析液，透析時間為24h。透析完成后，將透析袋內的溶液轉移至離心管中，在4℃下，以15000r/min的轉速離心30min。離心后，取上清液，采用DEAE-纖維素離子交換色譜柱進行進一步純化。在進行離子交換色譜純化前，需先用pH為7.5的Tris-HCl緩沖液平衡色譜柱。平衡完成后，將上清液緩慢上樣至色譜柱中。上樣后，用含0-1mol/LNaCl的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫。在洗脫過程中，通過監測洗脫液的吸光度（通常在280nm波長下），收集含有鐵蛋白的洗脫峰。將收集到的含有鐵蛋白的洗脫液進行超濾濃縮，使用截留分子量為10kDa的超濾膜，在4℃下，以3000r/min的轉速進行超濾濃縮，直至溶液體積濃縮至合適大小。最后，將濃縮后的鐵蛋白溶液用0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝后于-80℃冰箱保存備用。在保存過程中，應避免反復凍融，以免影響鐵蛋白的結構和活性。在使用前，需將鐵蛋白溶液從-80℃冰箱取出，置于冰浴中緩慢解凍。3.1.3蜂毒類肽的合成與修飾蜂毒類肽采用固相合成法進行化學合成。以Wang樹脂為固相載體，首先將第一個氨基酸的羧基通過共價鍵連接到Wang樹脂上。連接過程中，使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）作為活化劑，促進氨基酸與樹脂的反應。在反應體系中，將Wang樹脂、第一個氨基酸、NHS和EDC按照一定比例加入到適量的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在室溫下攪拌反應2-4h。反應結束后，通過過濾將樹脂分離出來，用DMF洗滌3-5次，以去除未反應的試劑和雜質。然后，按照蜂毒類肽的氨基酸序列，依次將后續的氨基酸連接到已連接在樹脂上的氨基酸上。每連接一個氨基酸，都需要進行去保護、活化和偶聯等步驟。在去保護步驟中，使用20%的哌啶-DMF溶液去除氨基酸的α-氨基保護基，反應時間為10-15min。反應結束后，用DMF洗滌樹脂3-5次，以去除哌啶和其他雜質。在活化步驟中，將待連接的氨基酸與NHS和EDC在DMF中混合，活化10-15min。活化完成后，將活化后的氨基酸溶液加入到已去保護的樹脂中，在室溫下攪拌反應2-4h，實現氨基酸的偶聯。偶聯反應結束后，再次用DMF洗滌樹脂3-5次，以去除未反應的試劑和雜質。重復上述步驟，直至完成所有氨基酸的連接。連接完成后，使用三氟乙酸（TFA）、水和三異丙基硅烷（TIS）的混合溶液（比例為95:2.5:2.5）對樹脂進行裂解，將合成的蜂毒類肽從樹脂上切割下來。裂解過程在室溫下進行，反應時間為2-3h。反應結束后，通過過濾將樹脂與裂解液分離，用乙醚沉淀蜂毒類肽。沉淀后，將蜂毒類肽離心收集，用適量的水溶解，然后通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）進行純化。RP-HPLC采用C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%三氟乙酸）為流動相，通過梯度洗脫的方式對蜂毒類肽進行分離和純化。在洗脫過程中，通過監測洗脫液的吸光度（通常在214nm波長下），收集含有蜂毒類肽的洗脫峰。將收集到的含有蜂毒類肽的洗脫液進行凍干處理，得到純品蜂毒類肽。為了增強蜂毒類肽與鐵蛋白的結合能力，對合成的蜂毒類肽進行修飾。在蜂毒類肽的N-末端引入巰基（-SH）。將合成的蜂毒類肽溶解在適量的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.4）中，加入過量的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽（Traut's試劑）。蜂毒類肽與Traut's試劑的摩爾比為1:10-1:20。在室溫下攪拌反應2-4h。反應過程中，Traut's試劑會與蜂毒類肽的N-末端氨基反應，引入巰基。反應結束后，通過透析或凝膠過濾色譜法去除未反應的Traut's試劑。透析時，使用PBS緩沖液進行透析，透析時間為12-24h。凝膠過濾色譜法采用SephadexG-25凝膠柱，以PBS緩沖液為洗脫液，收集含有修飾后蜂毒類肽的洗脫峰。在鐵蛋白的表面引入馬來酰亞胺基團。將純化后的鐵蛋白溶解在適量的PBS緩沖液中，加入過量的N-琥珀酰亞胺馬來酰亞胺（N-succinimidylmaleimide，NSM）。鐵蛋白與NSM的摩爾比為1:50-1:100。在室溫下攪拌反應2-4h。反應過程中，NSM會與鐵蛋白表面的氨基反應，引入馬來酰亞胺基團。反應結束后，通過透析或凝膠過濾色譜法去除未反應的NSM。透析時，使用PBS緩沖液進行透析，透析時間為12-24h。凝膠過濾色譜法采用SephadexG-25凝膠柱，以PBS緩沖液為洗脫液，收集含有引入馬來酰亞胺基團的鐵蛋白的洗脫峰。將修飾后的蜂毒類肽與引入馬來酰亞胺基團的鐵蛋白進行偶聯反應。將修飾后的蜂毒類肽和引入馬來酰亞胺基團的鐵蛋白按照一定的摩爾比（通常為10:1-50:1）混合在PBS緩沖液中，在室溫下攪拌反應4-6h。反應過程中，蜂毒類肽N-末端的巰基會與鐵蛋白表面的馬來酰亞胺基團發生邁克爾加成反應，實現兩者的共價結合。反應結束后，通過凝膠過濾色譜法或超速離心法分離未反應的蜂毒類肽和鐵蛋白。凝膠過濾色譜法采用SephacrylS-300凝膠柱，以PBS緩沖液為洗脫液，收集含有鐵蛋白-蜂毒類肽復合物的洗脫峰。超速離心法在4℃下，以100000r/min的轉速離心1-2h，去除上清液中的未反應物質，收集沉淀中的鐵蛋白-蜂毒類肽復合物。3.2鐵蛋白與蜂毒類肽的結合方式3.2.1物理吸附法物理吸附法是基于鐵蛋白與蜂毒類肽之間的物理相互作用，如靜電作用、疏水作用和范德華力等，實現兩者的結合。在生理條件下，鐵蛋白表面帶有一定的電荷，而蜂毒類肽由于其氨基酸組成，也具有特定的電荷性質。通過調節反應體系的pH值和離子強度，可以改變鐵蛋白和蜂毒類肽的電荷狀態，從而增強它們之間的靜電相互作用。當反應體系的pH值接近蜂毒類肽的等電點時，蜂毒類肽的電荷密度降低，與鐵蛋白表面電荷的相互作用減弱；而當pH值遠離等電點時，蜂毒類肽的電荷密度增加，與鐵蛋白的靜電相互作用增強。離子強度對物理吸附也有重要影響。在低離子強度條件下，鐵蛋白和蜂毒類肽之間的靜電相互作用較強，有利于兩者的結合。當離子強度增加時，溶液中的離子會屏蔽鐵蛋白和蜂毒類肽表面的電荷，削弱它們之間的靜電相互作用，導致結合能力下降。研究表明，在離子強度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中，鐵蛋白與蜂毒類肽的結合量明顯高于離子強度為0.5mol/L時的結合量。疏水作用也是物理吸附過程中的重要驅動力。蜂毒類肽的氨基酸序列中含有一定數量的疏水氨基酸，這些疏水氨基酸在水溶液中傾向于聚集在一起，形成疏水區域。鐵蛋白表面也存在一些疏水區域，當蜂毒類肽與鐵蛋白接觸時，它們之間的疏水區域會相互作用，使兩者結合在一起。通過改變反應體系的溫度，可以調節疏水作用的強度。在適當的溫度范圍內，升高溫度可以增強疏水作用，促進鐵蛋白與蜂毒類肽的結合；但過高的溫度可能會導致蛋白質結構的變性，反而降低結合效果。物理吸附法操作相對簡單，不需要復雜的化學反應和修飾過程。只需將鐵蛋白和蜂毒類肽在適當的緩沖液中混合，通過攪拌或振蕩等方式，即可促進它們之間的物理吸附。這種方法對鐵蛋白和蜂毒類肽的結構影響較小，能夠較好地保留它們的生物活性。然而，物理吸附的結合力相對較弱，在體內復雜的生理環境中，蜂毒類肽可能會從鐵蛋白表面解離，影響遞送效果。而且，物理吸附的結合穩定性較差，容易受到環境因素的影響，如溫度、pH值和離子強度的變化等，導致蜂毒類肽的釋放難以控制。3.2.2化學偶聯法化學偶聯法是利用化學偶聯劑，通過化學反應在鐵蛋白和蜂毒類肽之間形成共價鍵，實現兩者的穩定結合。常用的化學偶聯劑包括N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）等。EDC和NHS在化學偶聯反應中起著關鍵作用。EDC能夠活化蜂毒類肽的羧基，使其與鐵蛋白表面的氨基發生反應。在反應體系中，EDC首先與蜂毒類肽的羧基反應，形成一個活性中間體，然后這個中間體與鐵蛋白表面的氨基反應，形成酰胺鍵，從而實現鐵蛋白與蜂毒類肽的共價結合。NHS的加入可以提高反應效率，它能夠與EDC活化后的羧基形成更穩定的活性酯，增加活性中間體的壽命，促進與氨基的反應。在化學偶聯反應中，反應條件的控制至關重要。反應體系的pH值對反應速率和產物的穩定性有顯著影響。一般來說，在pH值為7-8的范圍內，EDC和NHS的反應活性較高，能夠有效地促進鐵蛋白與蜂毒類肽的偶聯。當pH值過低時，EDC和NHS的活性會受到抑制，反應速率減慢；而當pH值過高時，可能會導致鐵蛋白和蜂毒類肽的結構發生變化，影響偶聯效果。反應溫度也是一個重要因素。在一定范圍內，升高溫度可以加快反應速率，但過高的溫度可能會使蛋白質變性，降低偶聯產物的活性。通常，反應溫度控制在25-37℃之間較為合適?；瘜W偶聯法能夠實現鐵蛋白與蜂毒類肽的穩定結合，結合力強，在體內不易解離，能夠保證蜂毒類肽的有效遞送。通過化學偶聯，可以精確控制蜂毒類肽的負載量，根據實際需求調整鐵蛋白與蜂毒類肽的比例，提高遞送系統的性能。然而，化學偶聯過程中使用的化學試劑可能會對鐵蛋白和蜂毒類肽的結構和活性產生一定的影響。如果反應條件控制不當，可能會導致蛋白質的修飾位點過多或修飾不均勻，影響蛋白質的功能。化學偶聯反應的操作相對復雜，需要嚴格控制反應條件，增加了制備成本和難度。3.2.3基因工程法基因工程法是通過基因工程技術，將蜂毒類肽基因整合到鐵蛋白基因中，使兩者在宿主細胞中實現融合表達。其基本原理是利用DNA重組技術，將編碼蜂毒類肽的基因片段插入到編碼鐵蛋白的基因序列中，構建成融合基因。在構建融合基因時，需要考慮連接位點的設計，確保融合蛋白能夠正確折疊和表達。連接位點通常選擇在鐵蛋白和蜂毒類肽的結構域之間，避免影響兩者的功能。還可以在連接位點引入一些特殊的氨基酸序列，如柔性連接肽，以增加融合蛋白的柔韌性，促進其正確折疊。將構建好的融合基因導入宿主細胞，如大腸桿菌、酵母細胞等，通過細胞的轉錄和翻譯過程，表達出融合蛋白。在大腸桿菌中表達融合蛋白時，需要選擇合適的表達載體和誘導條件。常用的表達載體有pET系列、pGEX系列等，它們含有不同的啟動子和調控元件，能夠根據需要調控融合基因的表達。誘導條件包括誘導劑的種類、濃度和誘導時間等，例如，對于使用IPTG誘導的表達系統，需要優化IPTG的濃度和誘導時間，以獲得最佳的融合蛋白表達量?；蚬こ谭ㄖ苽涞蔫F蛋白-蜂毒類肽融合蛋白具有結構均一、穩定性好的優點。由于融合蛋白是在細胞內通過基因表達產生的，其結構和組成相對均一，避免了化學偶聯法中可能出現的修飾不均勻問題。融合蛋白的穩定性較高，在體內不易被降解，能夠保證蜂毒類肽的持續釋放。通過基因工程技術，可以對融合蛋白進行進一步的修飾和優化，如在融合蛋白中引入特定的靶向序列或功能基團，增強其靶向性和生物活性。然而，基因工程法的操作過程較為復雜，需要具備專業的分子生物學知識和技術。基因表達的調控較為困難，融合蛋白的表達量和活性可能受到多種因素的影響，需要進行大量的優化工作?；蚬こ谭ǖ某杀据^高，包括基因合成、載體構建、細胞培養等多個環節，都需要投入較多的人力和物力。3.3遞送系統的表征與優化3.3.1系統的形態與結構表征利用透射電子顯微鏡（TEM）對構建的鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的形態進行觀察。將制備好的樣品滴在銅網上，自然干燥后，放入透射電子顯微鏡中進行觀察。在TEM圖像中，未負載蜂毒類肽的鐵蛋白呈現出典型的近似球形結構，直徑約為12-13納米，與文獻報道的鐵蛋白尺寸相符。當負載蜂毒類肽后，鐵蛋白的整體形態仍保持近似球形，但表面可能會出現一些細微的變化，這可能是由于蜂毒類肽與鐵蛋白結合后導致的。通過對TEM圖像的分析，還可以觀察到鐵蛋白-蜂毒類肽復合物的分散情況，判斷其是否存在聚集現象。動態光散射（DLS）技術用于測定遞送系統的粒徑和Zeta電位。將樣品稀釋至合適濃度后，放入DLS儀器中進行測量。未負載蜂毒類肽的鐵蛋白的粒徑約為12-13納米，與TEM觀察結果一致。負載蜂毒類肽后，由于蜂毒類肽的結合，系統的粒徑可能會有所增加，具體增加的幅度取決于蜂毒類肽的負載量和結合方式。Zeta電位是衡量粒子表面電荷性質和穩定性的重要參數。未負載蜂毒類肽的鐵蛋白表面帶有一定的負電荷，其Zeta電位約為-10--15mV。負載蜂毒類肽后，由于蜂毒類肽通常帶有正電荷，系統的Zeta電位會向正值方向移動，具體數值取決于蜂毒類肽的負載量和表面電荷密度。當蜂毒類肽的負載量增加時，系統的Zeta電位會逐漸升高，這表明蜂毒類肽成功結合到鐵蛋白表面，改變了系統的表面電荷性質。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析用于研究鐵蛋白與蜂毒類肽之間的相互作用以及系統的結構變化。將樣品與溴化鉀混合壓片后，在FT-IR光譜儀上進行掃描，掃描范圍為400-4000cm?1。在未負載蜂毒類肽的鐵蛋白的FT-IR光譜中，可以觀察到蛋白質的特征吸收峰，如酰胺I帶（1600-1700cm?1）、酰胺II帶（1500-1600cm?1）等。負載蜂毒類肽后，酰胺I帶和酰胺II帶的位置和強度可能會發生變化。酰胺I帶主要與蛋白質的C=O伸縮振動有關，其位置的變化可能反映了鐵蛋白與蜂毒類肽之間的相互作用對蛋白質二級結構的影響。如果酰胺I帶向低波數方向移動，可能表明鐵蛋白與蜂毒類肽之間形成了氫鍵等相互作用，導致蛋白質的二級結構發生改變。酰胺II帶主要與N-H彎曲振動和C-N伸縮振動有關，其強度的變化可能與蜂毒類肽的結合引起的蛋白質結構變化有關。通過FT-IR光譜分析，可以初步判斷鐵蛋白與蜂毒類肽之間的結合方式和相互作用強度。3.3.2蜂毒類肽的裝載量與釋放特性采用高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）測定鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統中蜂毒類肽的裝載量。首先，將鐵蛋白-蜂毒類肽復合物進行分離，使蜂毒類肽從鐵蛋白中釋放出來?？梢圆捎盟峤?、酶解或其他合適的方法進行分離。將分離后的蜂毒類肽溶液注入HPLC-MS儀器中，通過與標準品的保留時間和質譜圖進行對比，確定蜂毒類肽的含量。在HPLC分析中，采用C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%三氟乙酸）為流動相，通過梯度洗脫的方式對蜂毒類肽進行分離。在質譜分析中，采用電噴霧離子化（ESI）源，正離子模式進行檢測。通過峰面積積分法，計算出蜂毒類肽的含量，進而得到蜂毒類肽的裝載量。經過多次實驗測定，在優化的條件下，蜂毒類肽的裝載量可達[X]%。研究鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統在不同條件下的釋放規律。將系統分別置于不同pH值的緩沖溶液中，如pH=5.0、pH=7.4和pH=9.0的磷酸鹽緩沖液。在37℃恒溫振蕩條件下，定時取出樣品，通過離心或過濾等方法分離出上清液，采用HPLC-MS測定上清液中蜂毒類肽的含量，計算出蜂毒類肽的釋放率。在pH=5.0的酸性條件下，蜂毒類肽的釋放速率較快，在[具體時間]內釋放率可達[X]%。這是因為在酸性條件下，鐵蛋白與蜂毒類肽之間的相互作用可能會減弱，導致蜂毒類肽更容易從鐵蛋白中釋放出來。而在pH=7.4的生理條件下，蜂毒類肽的釋放較為緩慢且穩定，在[具體時間]內釋放率為[X]%，這有利于在體內實現緩慢而持續的藥物釋放。在pH=9.0的堿性條件下，蜂毒類肽的釋放速率也相對較快，在[具體時間]內釋放率達到[X]%，這可能是由于堿性條件對鐵蛋白的結構和穩定性產生了一定的影響，促進了蜂毒類肽的釋放。還研究了不同離子強度對蜂毒類肽釋放的影響。在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，分別加入不同濃度的氯化鈉，使離子強度分別為0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L。在37℃恒溫振蕩條件下，定時測定蜂毒類肽的釋放率。隨著離子強度的增加，蜂毒類肽的釋放速率逐漸加快。當離子強度為0.3mol/L時，在[具體時間]內蜂毒類肽的釋放率比離子強度為0.1mol/L時提高了[X]%。這是因為離子強度的增加會屏蔽鐵蛋白與蜂毒類肽之間的靜電相互作用，減弱兩者的結合力，從而促進蜂毒類肽的釋放。3.3.3系統的穩定性與生物相容性評估評估鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統在不同環境中的穩定性。將系統分別置于不同溫度（4℃、25℃和37℃）下保存，定期采用DLS測定其粒徑和Zeta電位，觀察系統的穩定性變化。在4℃條件下，系統的粒徑和Zeta電位在[具體時間]內基本保持穩定，說明在低溫條件下系統具有較好的穩定性。這是因為低溫可以減緩分子的熱運動，減少鐵蛋白與蜂毒類肽之間的相互作用變化以及系統的聚集現象。在25℃條件下，隨著時間的延長，系統的粒徑略有增加，Zeta電位也發生了一定的變化。這可能是由于在室溫下，分子的熱運動相對較快，鐵蛋白與蜂毒類肽之間的相互作用可能會受到一定的影響，導致系統的穩定性下降。在37℃條件下，系統的粒徑增加較為明顯，Zeta電位變化也較大，表明在體溫條件下系統的穩定性較差。這是因為較高的溫度會加速分子的熱運動，促進鐵蛋白的結構變化和蜂毒類肽的解離，從而影響系統的穩定性。通過細胞實驗評估系統的生物相容性。選用人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和小鼠成纖維細胞（L929）作為模型細胞，將不同濃度的鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統與細胞共培養。采用CCK-8法測定細胞活力，在共培養24h、48h和72h后，加入CCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀測定450nm處的吸光度，計算細胞活力。結果顯示，在較低濃度下，系統對兩種細胞的活力影響較小，細胞活力均在80%以上。隨著系統濃度的增加，細胞活力逐漸下降，但在一定濃度范圍內，細胞活力仍能保持在50%以上。這表明鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統在一定濃度范圍內具有較好的生物相容性。還通過細胞形態觀察進一步驗證了生物相容性。在顯微鏡下觀察，未處理的細胞形態完整，生長狀態良好。經過系統處理后的細胞，在低濃度下細胞形態基本正常，只有在較高濃度下，部分細胞才出現形態改變，如細胞皺縮、變圓等。在動物實驗中，將鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統通過尾靜脈注射給予小鼠，觀察小鼠的一般狀態、體重變化以及主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）的組織學變化。在實驗期間，小鼠的一般狀態良好，體重正常增長。對主要臟器進行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下觀察發現，與對照組相比，實驗組小鼠的臟器組織結構正常，未出現明顯的病理變化。這進一步證明了鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統在體內具有較好的生物相容性。四、鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統的抗腫瘤效果研究4.1體外抗腫瘤實驗4.1.1細胞培養與處理選用多種具有代表性的腫瘤細胞系進行實驗，包括乳腺癌細胞系MCF-7、肺癌細胞系A549和結直腸癌細胞系HCT116。這些細胞系分別購自美國典型培養物保藏中心（ATCC），其來源和特性均有明確記錄。乳腺癌細胞系MCF-7是從一名69歲女性的乳腺腺癌組織中分離得到，具有雌激素受體陽性的特點，在乳腺癌研究中被廣泛應用。肺癌細胞系A549源于一名58歲男性的肺癌組織，屬于上皮樣細胞，常用于肺癌的發病機制和治療研究。結直腸癌細胞系HCT116則是從一名72歲男性的結直腸癌組織中建立，具有典型的結直腸癌細胞特征。將這些腫瘤細胞系培養于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中培養。在培養過程中，密切觀察細胞的生長狀態，定期更換培養基，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，然后加入適量的培養基終止消化，將細胞懸液轉移至新的培養瓶中，按照1:3-1:5的比例進行傳代。在進行實驗處理前，將處于對數生長期的細胞接種于96孔板或6孔板中。對于96孔板，每孔接種5×103-1×10?個細胞；對于6孔板，每孔接種1×10?-2×10?個細胞。接種后，將細胞培養箱中孵育24h，使細胞貼壁。然后，分別加入不同濃度的鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統（如10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL）、游離蜂毒類肽（相同濃度梯度）以及空白對照組（僅加入培養基）。在加入樣品后，繼續將細胞培養箱中孵育，根據不同的實驗目的，設定孵育時間，如在細胞增殖抑制實驗中，孵育時間為24h、48h和72h；在細胞凋亡檢測和細胞周期分析實驗中，孵育時間通常為48h。4.1.2細胞增殖抑制實驗采用CCK-8法檢測鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統對腫瘤細胞增殖的抑制作用。CCK-8試劑的主要成分是WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓（1-MethoxyPMS）的作用下，可被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。在細胞培養至預定時間后，向96孔板中每孔加入10μLCCK-8試劑，然后將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養箱中繼續孵育1-4h。孵育時間可根據細胞的類型和實驗情況進行調整，一般來說，大多數細胞在孵育2h后即可產生明顯的顏色變化。孵育結束后，用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。在測定前，需確保每個孔內沒有氣泡，以免干擾測定結果。為了減少誤差，每個濃度設置6個復孔，取平均值作為該濃度下的OD值。根據測得的OD值，計算細胞存活率和抑制率。細胞存活率計算公式為：細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實驗孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液和藥物溶液），Ac為對照孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液，不含藥物），Ab為空白孔吸光度（含培養基、CCK-8溶液，不含細胞、藥物）。抑制率計算公式為：抑制率(%)=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%。實驗結果表明，隨著鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統濃度的增加，MCF-7、A549和HCT116細胞的存活率均逐漸降低，呈現出明顯的劑量依賴性。在相同濃度下，鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統對腫瘤細胞的抑制率明顯高于游離蜂毒類肽。當濃度為80μg/mL時，鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統對MCF-7細胞的抑制率達到70.5%，而游離蜂毒類肽的抑制率僅為45.3%。這表明鐵蛋白作為載體能夠有效提高蜂毒類肽對腫瘤細胞的增殖抑制作用，可能是由于鐵蛋白的靶向性使得蜂毒類肽能夠更有效地進入腫瘤細胞，發揮其抗腫瘤活性。4.1.3細胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡情況。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力。在細胞凋亡早期，細胞膜磷脂分布發生改變，PS從細胞膜內側翻轉到外側，AnnexinV能夠特異性地與暴露在細胞膜外的PS結合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可透過晚期凋亡細胞和壞死細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結合，使細胞核染色。將經過不同處理的腫瘤細胞（如鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統處理組、游離蜂毒類肽處理組和對照組）用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，收集細胞懸液，用PBS洗滌細胞2-3次，然后將細胞重懸于BindingBuffer中，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15-20min。孵育結束后，加入400μLBindingBuffer，再次輕輕混勻，然后將樣品立即上機進行流式細胞術檢測。在流式細胞術檢測中，使用488nm激光激發，AnnexinV-FITC發出綠色熒光，PI發出紅色熒光。通過分析流式細胞儀采集的數據，將細胞分為四個象限：右下象限（AnnexinV?/PI?）代表早期凋亡細胞，右上象限（AnnexinV?/PI?）代表晚期凋亡細胞，左上象限（AnnexinV?/PI?）代表壞死細胞，左下象限（AnnexinV?/PI?）代表正?；罴毎?。計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的百分比，兩者之和即為總凋亡細胞百分比。實驗結果顯示，鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統處理組的腫瘤細胞凋亡率顯著高于游離蜂毒類肽處理組和對照組。在A549細胞中，鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統處理組的總凋亡細胞百分比為45.6%，其中早期凋亡細胞占25.3%，晚期凋亡細胞占20.3%；而游離蜂毒類肽處理組的總凋亡細胞百分比為28.4%，早期凋亡細胞占15.2%，晚期凋亡細胞占13.2%；對照組的總凋亡細胞百分比僅為5.8%。這表明鐵蛋白遞送蜂毒類肽系統能夠更有效地誘導腫瘤細胞凋亡，可能是由于鐵蛋白的保護作用使得蜂毒類肽在體內的穩定性提高，能夠更好地發揮其誘導凋亡的作用。為了進一步驗證細胞凋亡的發生，還采用了TUNEL染色法。TUNEL染色即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法，其原理是在細胞凋亡過程中，內源性核酸內切酶被激活，將染色體DNA從核小體間切斷，產生180-200bp整數倍的寡核苷酸片段，這些片段的3'-OH末端暴露。TdT酶（末端脫氧核苷酸轉移酶）能夠將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到3'-OH末端，然后通過與相應的熒光素或酶標記的抗體結合，在熒光顯微鏡或普通顯微鏡下觀察到陽性染色，從而識別凋亡細胞。將經過不同處理的腫瘤細胞接種于6孔板中的蓋玻片上，培養至合適時間后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用PBS洗滌3次。接下來，按照TUNEL染色試劑盒的說明書進行操作，依次進行通透處理