DNA的復制和修復知識培訓課件現代生物學充分證明DNA是生物遺傳的主要物質基礎。生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現為特定的核苷酸序列，并通過DNA的復制由秦代傳遞給子代。在后代的生長發育過程中，遺傳信息自DNA轉錄給RNA，然后翻譯成特異地蛋白質，以執行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。所謂復制，就是指原來DNA分子為模板合成出相同分子的過程，所謂轉錄，就是在DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應的RNA的過程所謂翻譯，就是在RNA的控制下，根據核酸鏈上的每三個核酸決定一個氨基酸的三聯體密碼規則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質肽鏈過程。在某些情況下RNA也可以是遺傳信息的基本攜帶者，例如，RNA病毒能以自身核酸分子為模板進行復制，致癌RNA病毒還能通過逆轉錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA。DNA的復制原核生物每個細胞只含有一個染色體，真核生物每個下撥常含有多個染色體。在細胞增殖周期的一定階段整個染色體組都將發生精確的復制，隨后以染色體為單位把復制的基因組分配到兩個子代細胞中。染色體DNA的復制和細胞分裂之間存在密切的相互聯系。一旦復制完成，就可發動細胞分裂，細胞分裂結束后，又可開始新一輪DNA復制。線粒體和葉綠體的DNA可用以編碼自身的rRNA和ｔRNA以及一小部分蛋白質，其他的蛋白質則由核基因編碼，并在液泡合成后再運進細胞器。細胞器DNA的復制并不限于核DNA的合成器，而可在整個細胞周期進行。對于某個DNA分子來說，進入或不進入復制是隨機的，因為有些DNA分子在細胞周期中復制不止一次，有些則不發生復制，然而就總體來說，每一細胞周期中細胞器DNA的總量將增加一倍，從而保持了每個細胞的細胞器DNA數量恒定。由于DNA是遺傳信息的載體，在合成DNA時，決定其結構特異性的遺傳信息只能來自其本身，因此必須由原來存在的分子為模板來合成新的分子，即進行自我復制。DNA的雙鏈結構對于維持這類遺傳物質的穩定性和復制的準確性都是極為重要的。DNA的半保留復制DNA由兩條螺旋的多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過氫鍵連接在一起。一條鏈上的核苷酸序列排列順序決定了另一條鏈上的排列順序。由此可見，DNA分子的每一條鏈都含有合成它互補鏈所必需的全部遺傳信息。DNA復制時，母鏈的兩股DNA解開成兩股單鏈，各自作為模板指導子代合成新的互補鏈。子代細胞的DNA雙鏈，其中一股單鏈從親代完整的接受過來，另一股單鏈則完成重新合成。兩個子代細胞的DNA雙鏈，都和親代母鏈的DNA堿基序列一致。此即DNA的半保留復制。1958年Meselson和stahl利用氮的同位素標記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復制。他們讓大腸桿菌在以作為唯一氮源的培養基中生長，連續生長１２代，從而使所有DNA分子標記上。-DNA的密度比普通-DNA的密度大，在氯化銫密度梯度離心時，這兩種DNA能形成不同的區帶。如果將標記的大腸桿菌轉移到普通培養基中培養（含的），經過一代后，所有的DNA密度都介于-DNA和－DNA之間，即形成DNA分子一半含，一半含。兩代后，和-雜合分子等量出現，若再培養，可以看到-DNA分子增多。當把-雜合分子加熱時，它們分開成鏈和鏈。這就充分證明了，在DNA復制時原來的DNA分子可被分成兩個亞單位，分別構成子代分子的一半，這些亞單位經過許多代復制后仍然保持著完整性。在這以后，用許多種原核生物和真核生物復制中的DNA做了類似的實驗，都證實了DNA復制的半保留方式，然而這類實驗所研究的復制中的DNA在提取過程中已被斷成了許多片段，得到的信息只涉及DNA復制前和復制后的狀態。１９６３年Cairn用放射自顯影的方法第一次觀察到完整的正在復制的大腸桿菌染色體DNA。他將脫氧胸苷標記大腸桿菌DNA，然后用溶菌酶把細胞壁消化掉，使完整的染色體DNA釋放出來，鋪在一張透析膜上，在暗處用感光乳膠覆蓋于干燥了的表面上放至若干星期。在這期間由于放射性衰變釋放出離子，使乳膠曝光生成銀粒。顯影后銀粒黑點軌跡勾畫出DNA分子的形狀，黑點數目代表了在DNA分子中的密度。把顯影后的片子放在光學顯微鏡下，姐可以觀察到大綱桿菌染色體的全貌。用這種方法，Cairns闡明了大腸桿菌染色體DNA是一個環狀分子，并以半保留的方式進行復制。半保留復制，即子代DNA分子中僅保留一條親代鏈，另一條鏈是新合成的，這是雙鏈DNA普遍的復制機制。即是單鏈DNA分子，在其復制過程中也通?？偸且€形成雙鏈的復制型式（RF）。半保留復制要求親代DNA的兩條鏈解開，各自作為模板，通過堿基配對的法則，合成出另一條互補鏈。所謂模板即是能提供合成一條互補鏈所需精確信息的核酸鏈。在這里，堿基配對是核酸分子間傳遞信息的結構基礎。無論是復制、轉錄或逆轉錄，在形成雙鏈螺旋分子時都是通過堿基配對來完成的，需要指出的是，堿基、核苷或核苷酸單體之間并不形成堿基對，但是在形成雙鏈螺旋時由于空間結構的關系而構成特殊的堿基對。DNA的半保留復制機制可以說明DNA在代謝上的穩定性，經過許多代的復制，DNA的多核苷酸鏈仍可保持完整，并存在于后代而不被分解掉。DNA與細胞其他成分相比要穩定得多，這和它的遺傳功能是相符的。但是這種穩定是相對的，DNA在代謝上并不是完全惰性的物質。在細胞內外各種物理、化學和生物因子的作用下，DNA會發生損傷，需要修復；在復制和轉錄過程中DNA也會有損耗，而必須進行更新。在發育和分化過程中，DNA的特定序列還可能進行修飾、刪除、擴增和重排。DNA復制的起點和終點基因組能獨立進行復制的單位叫做復制子。每個復制子都含有控制復制起始地起點（），可能還有終止復制的終點。復制是在起始階段進行控制的，一旦復制開始，它將繼續下，直到整個復制子完成復制。原核生物的染色體和質粒，真核生物的細胞器DNA都是環狀雙鏈分子。實驗表明，它們都在一個固定的起點開始復制，復制方向大多是雙向的，即形成兩個復制叉或生長點，分別向兩側進行復制；也有一些單向的，只形成一個復制叉或生長點。通常復制是對稱的，兩條鏈同時進行復制。DNA在復制叉處兩條鏈解開，各自合成其互補鏈，在電子顯微鏡下可以看到形如眼的結構，環狀DNA的復制眼形成希臘字母形結構。真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復制起點，因此是多復制子。通過放射自顯影的實驗可判斷DNA復制是雙向進行的，還是單項進行的。在復制開始時，先用低放射性的-脫氧胸苷標記大腸桿菌，經數分鐘中后，再轉移到含有高放射性的-脫氧胸苷培養基中繼續進行標記。這樣在放射自顯圖像上，復制器起始區的放射性標記密度較低，感光還原的銀顆粒密度就較低；繼續合成區標記大腸桿菌放射性標記密度較高，感光還原的銀顆粒密度就較高。若是單向復制，銀顆分布密度應是一端低，一端高。若是雙向復制，則應是中間密度低，兩端密度高。由大腸桿菌所獲得的放射自顯圖像都是兩端密，中間疏，這就清楚證明了大腸桿菌染色體DNA是雙向修復的。大多數生物染色體DNA的復制是雙向的，并且是對稱的，然而也有例外?？莶輻U菌染色體DNA的復制雖是雙向，但是兩個復制叉移動的距離不同。一個復制叉僅在染色體上移動五分之一距離，然后停下等待另一復制叉完成五分之四距離。質粒R6K的兩個復制叉的移動也是不對稱的。有一種單向的特殊復制方式，稱為滾動環。噬菌體是環狀單分子，它在復制過程中首先形成共價閉環的雙聯分子（復制型),然后其正鏈由A蛋白在特定位置切開，游離出一個3’末端，A蛋白連在5’末端。隨后在DNA聚合酶催化下，以環狀負鏈為模板，從正鏈的３’－OH末端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動合成出新的正鏈。合成一圈后，露出切口順序，A蛋白再次將其切開，并連在切出的5’磷酸基末端，游離出單位噬菌體環狀單分子DAN。實驗證明某些雙鏈的DNA和合成也可以通過滾動環的方式進行。例如噬菌體復制的后期。另一種單向復制的特殊方式稱為取代環或D－環式。線粒體的DNA復制方式采取這種方式（纖毛蟲的線粒體DNA為線型分子，復制方式與此不同）。雙鏈環在固定點解開進行復制，但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代。真核生物染色體DNA的復制要比原核生物慢得多，這是由于真核生物的染色體具有復雜的高級結構，復制時需要解開核小體，復制后又需重新合成核小體。綜上染色體的復制方式有：直線雙向復制：單點雙向（T7）多起點雙向：真核染色體DNA滾環復制：環狀單鏈DNA，Ｄ型復制：線粒體、葉綠體DNA多復制叉復制：第一輪復制尚未完成，復制起點就開始第二輪的復制。在大腸桿菌營養豐富時，可采取多復制叉復制方式。DNA反應聚合有關的酶DNA由脫氧核糖核苷酸聚合而成。與DNA稽核反應有關的酶包括多種DNA聚合酶和DNA連接酶。DNA聚合酶１９５６年Kornberg首先從大腸桿菌提取液中發現了DNA聚合酶。其后從廣泛不同的生物中都找到這種酶。有適量DNA和鎂離子存在時，該酶能催化四種脫氧核糖核酸三磷酸合成DNA，所合成的DNA具有與天然DNA相同的化學結構和物理性質。ｄATP、dGTP、dCTP和dTTP四種脫氧核糖核苷酸三磷酸缺一不可；它們不能被相應的二磷酸或一磷酸化合物所取代，也不能被核糖核苷酸所取代。在DNA聚合酶催化下，脫氧核糖核苷酸被加到DNA鏈的末端，同時釋放出無極磷酸。DNA聚合酶催化的鏈延長反應中，鏈的３’羥基對進入的脫氧核糖核苷三磷酸的磷原子發生親核供給，從而形成３’５’磷酸二酯鍵并脫下焦磷酸。形成磷酸二酯鍵所需要的能量來自－與－磷酸基之間高能磷酸鍵的裂合，聚合反應是可逆的，但隨后的焦磷酸水解可推動反應的完成。DNA由５’段向３’端方向延長。DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核酸自身發生聚合，它需要引物鏈的存在，加入的核苷酸則由模板鏈所決定。與生物小分子的合成不同，信息大分子的合成除了需要有底物、能量和酶外，還需要模板。DNA聚合酶催化的反應是按模板的指令進行的，只有當進入的堿基能與模板鏈的堿基形成Watson－Crick類型的堿基對時，才能在該酶催化下形成磷酸二脂鍵。因此，DNA聚合酶是一種模板指導的酶。加入各種不同生物來源的DNA做模板，可以同樣引起和促進新的DNA的酶促合成，而產物DNA的性質完全不取決于聚合酶的來源，也與四種核苷酸前體的相對比例無關，而僅僅取決于所加入的模板DNA。產物DNA作為模板的雙螺旋DNA具有相同的堿基組成，這說明在DNA聚合酶的作用下，模板DNA和兩條鏈都能進行復制。DNA聚合酶的反應可以利用雙鏈DNA作為模板和引物，可以了利用單鏈DNA作為模板和引物。在單鏈DNA的復制中，３－羥基末端通過鏈的自身回折成為引物鏈，其余未配對的鏈則為模板鏈，由此形成發夾環結構。雙鏈DNA的復制發生在切口、缺口或末端單鏈區。綜上所述，DNA聚合酶的反應特點為：１。以四種脫氧核糖核苷三磷酸作為底物２.反應需要接受模板的指導３.反應需要有引物３’羥基的存在４.DNA鏈的生長方向為5’-3’5.產物DNA性質與模板相同，這就表明了DNA聚合酶合成的產物是模板的復制物。各種不同類型的DNA聚合酶大腸桿菌中共含有五種不同的DNA聚合酶，分別成為l、ll、lll、lV、VDNA聚合酶l反應時需要有引物鏈（DNA鏈或RNA鏈）是一個多功能酶，可以催化以下反應。通過核苷酸聚合反應，使DNA鏈沿著5’方向到3’方向延長（DNA聚合酶活性）由３’水解DNA鏈（３’→５’核酸外切酶活性）由５’水解DNA鏈（５’→３’核酸外切酶活性）由３’端發生焦磷酸解無極焦磷酸鹽與脫氧核糖核苷酸之間的焦磷酸基交換焦磷酸解釋聚合反應的逆反應，焦磷酸交換反應則是由前兩個反應連續重復多次引起的。實際上DNA聚合酶l兼具３’→５’核酸外切酶活性以及５’→３’核酸外切酶活性DNA聚合酶被酶蛋白切開的大片段稱為Klenow片段，呈右手結構，右手結構是核酸聚合酶的共同特征。模板核酸落入核酸聚合酶拇指結構和指形結的凹槽時，引起構象改變，從而使聚合酶能夠握住核酸分子。聚合酶之所以能夠辨認進入的底物核苷酸，因為凹槽空間只允許底物與模板之間形成符合配對原則的堿基配對。非配對堿基因空間位置不合適而不能進行聚合反應，這就保證了新合成的鏈嚴格按照模板的互補堿基順序進行聚合，在這里，酶對底物進行了專一的核對，然而錯配的堿基仍然不可避免的會出現。DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性能切除單鏈DNA的３’末端核苷酸，而對雙鏈DNA不起作用，故不能形成堿基對的錯配核苷酸可被酶水解下來。然而在正常聚合條件下，3’-5’核酸外切酶活性不能作用于生長鏈；若一旦出現錯配堿基對，聚合反應即停止，生長鏈的３’末端核苷酸落入３’→５’外切酶位點，錯配核苷酸迅速被除去，然后聚合反應才得以繼續進行下去。3’-5’核酸外切酶活性被認為起著校對的功能，它能糾正聚合過程中的堿基錯配。由此可見，DNA復制過程中堿基配對要受到雙重核對：一是聚合酶的選擇作用，二是3’-5’核酸外切酶的校對作用。有了3’-5’核酸外切酶校對，大大降低了錯誤率。3’-5’核酸外切酶的校對作用對DNA復制的忠實性極為重要。如果沒有這種活性，DNA復制的錯誤將大大增加，例如T4噬菌體突變率很高，從這種變異株得到的T4DNA聚合酶中3’-5’外切酶活性很弱，在DNA復制中非常容易出錯誤，起著促突變因子的作用。（相對的，就起到抗突變因子的作用）所以3’-5’核酸外切酶活性對聚合酶的比值與DNA復制的準確性有關，進而影響到自然突變率?？雇蛔兙甑腄NA聚合酶雖然是高度保真的，但在進化中未必優越，因為一定的自然突變率隊生物的進化是必要的，若外切酶活性較強，甚至在聚合條件下失去對外切酶的抑制作用，造成正常聚合的核苷酸不斷被切除，這是個耗能大，效率低的系統。DNA聚合酶ｌ尚有５’－３’外切酶活性，它只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，從5’末端水解下核苷酸或寡核苷酸。因而該酶被認為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。DNA半不連續合成中岡崎片段５’端RNA引物的切除也有賴于這個外切酶。DNA聚合酶ｌｌ聚合酶ｌ合成DNA的速度太慢，只及細胞DNA復制速度的百分之一。其次，其持續合成能力較低，細胞內DNA合成的復制不會頻繁中斷，另外遺傳學分析表明許多基因突變都會影響DNA的復制，但和聚合酶l無關。通過對缺乏聚合酶l的變異菌株發現其DNA復制正常，但是損傷的修復機制有明顯的缺陷。由此直接表明，DNA聚合酶l不是復制酶，而是修復酶。后來證明，在DNA復制過程中起著取代RNA引物的作用，只是參與局部修復。聚合酶ｌｌ為多亞基酶，酶活力比聚合酶ｌ高，也是由四種脫氧核糖核苷三磷酸為底物，從５’－３’方向合成DNA，并需要有缺口的雙鏈DNA作為模板一引物，但缺口不能太大否則酶活力將降低。反應需要鎂離子和氨根離子激活。聚合酶ｌｌ具有３’－５’核酸外切酶活性，但是無５’-３’核酸外切酶活性。聚合酶ｌｌ也不是復制酶，而是一種修復酶。聚合酶ｌｌｌ聚合酶ｌｌｌ也是由多個亞基組成的蛋白質，現在認為它是大腸桿菌細胞內真正負責從新和成的DNA的復制酶。雖然每個大腸桿菌細胞中只有１０－２０個聚合酶ｌｌｌ分子，然而它催化的合成速度達到了體內ＤＮＡ合成的速度。聚合酶ll與lll基本性能是相同的：1.都需要模板的指導，以四種脫氧核糖核苷三磷酸作為底物，并且需要有3’-OH引物鏈存在，聚合反應按5’-3’方向進行2.他們都沒有5’-3’外切酶活性，但都有3’-5’核酸外切酶活性，在聚合過程中起校對作用3.它們都是多亞基酶，DNA聚合酶ll和lll共用了許多輔助亞基。聚合酶ll和聚合酶lll與聚合酶l相比有明顯的區別：聚合酶ll和聚合酶lll最宜作用于帶有小段缺口的雙鏈DNA；而DNA聚合酶l最宜作用于具有大段單鏈區的雙鏈DNA，甚至是帶有很短引物的單鏈DNA。它們的聚合速度、持續合成能力均有很大不同，反映了它們功能的不同。聚合酶ｌV和Ｖ這兩種酶涉及DNA的錯誤傾向修復。當DNA受到較嚴重損傷時，即可誘導產生這兩個酶，但修復缺乏準確性，因而出現高突變率。DNA鏈接酶DNA聚合酶只能催化多核苷酸鏈的延長反應，不能使鏈之間連接。環狀DNA的復制表明，必定存在一種酶，能催化鏈的兩個末端之間形成共價連接。即DNA鏈接酶，其能催化雙鏈DNA切口處的5’磷酸基和3’羥基生成磷酸二脂鍵。連接反應需要供給能量，大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以腺胺三磷酸（ATP）作為能量來源大腸桿菌DNA鏈接酶要求斷開的兩條鏈由互補鏈將它們聚在一起，形成雙螺旋結構。它不能將兩條游離的DNA分子連接起來。DNA的半不連續復制在體內，DNA的兩條鏈都能作為模板合成出兩條新的互補鏈。但是由于DNA分子的兩條鏈是反向的。DNA聚合酶的合成方向都是5’-3’，這就很難說明DNA在復制時兩條鏈如何作為模板合成其互補鏈。所以日本學者岡崎提出了DNA的半不連續復制模型。認為3’-5’走向的DNA實際上是由許多5‘-3’方向合成的DNA片段連接起來的。岡崎用-脫氧胸苷標記噬菌體T4感染的大腸桿菌，然后通過堿性密度離心法分離標記的DNA產物，發現短時間內首先合成的是較短的DNA片段，接著出現較大的分子，最初出現的DNA片段長度約為1000個核苷酸左右，一般稱為岡崎片段。用DNA連接酶變異的溫度敏感株進行實驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量DNA片段積累。這說明在DNA復制過程中首先合成較短的片段，然后由DNA連接酶連成大分子。這也就是不連續合成。DNA的不連續合成不只局限于細菌，真核生物染色體的DNA復制也是如此。不過岡崎的實驗并不能判斷DNA鏈的不連續合成只發生在一條鏈上，還是兩條鏈都如此，對岡崎片段進行測定，其數量遠遠超過新合成的DNA的一般，似乎兩條鏈都是不連續的。后來發現這是由于尿嘧啶代替胸腺嘧啶摻入DNA所造成的。DNA中的尿嘧啶可被尿嘧啶－DNA-糖苷酶切除，隨后該處的磷酸二脂鍵斷裂，一些核苷酸被水解，造成一個缺口，最后缺口空襲被填補和修復，在此過程中也會產生一些類似岡崎片段的DNA片段。用缺乏糖苷酶的變異菌株進行實驗，DNA的尿嘧啶將不再被切除，此時新合成的DNA大約有一半放射性標記出現于岡崎片段中，另一半直接進入大的片段。由此可見，DNA復制時，一條鏈是連續的，另一條鏈是不連續的，此即半不連續復制。以復制叉向前移動的方向為標準，一條模板鏈是３’→５’走向，在其上DNA能以５’－３’方向連續合成，成為前導鏈；另一條模板鏈是５’－３’走向，但是在其DNA上也是從5’-3’合成，但是與復制叉的移動方向是相反，隨著復制叉的移動，形成許多不連續的片段，最后練成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為滯后鏈。由于DNA復制酶系不易從DNA模板上解離下來，因此前導鏈的合成通常是連續的。但是有很多因素會影響前導鏈的連續性，例如模板鏈的損傷、復制因子和底物供應不足，都會引起前導鏈復制中斷并從另一新起點開始。RNA引物DNA聚合酶不能發動新鏈的合成，只能催化已有的鏈的延長反應。RNA聚合酶則不同，它只需要DNA模板存在，就可以在其上合成出新的RNA鏈。所以DNA合成需要引物，RNA合成不需要引物。岡崎片段是新合成的鏈，它是如何開始的，引物又是什么?現在知道DNA模板上需要先合成一段RNA引物，DNA聚合酶從RNA引物的３’－OH端開始合成新的DNA鏈。岡崎片段的合成除了需要四種脫氧核糖核苷酸外，還需要四種核糖核苷酸。新合成的DNA片段上共價連接著一段小RNA鏈。專一的水解酶證明，RNA鏈位于DNA片段的５’末端。RNA引物是在DNA模板鏈的一定部位合成并互補于DNA鏈，合成方向是5’-3’，催化該酶的反應是引物合成酶（該酶作用時酶與另外６種蛋白質結合形成引發體）。引物的長度通常為幾個核苷酸至十多個核苷酸，DNA聚合酶ｌｌｌ可在其上聚合脫氧核糖核苷酸，直至岡崎片段的合成。RNA引物的消除和缺口的填補是由DNA聚合酶ｌ來完成的，最后由DNA連接酶將岡崎片段練成長鏈。生物體之所以要用如此復雜的機制去復制DNA，主要是為了保持DNA復制的高度忠實性，生物體的自發突變都是由DNA復制時堿基對的錯配引起的。DNA聚合酶對底物的選擇作用以及３’－５’外切酶的校對作用使錯配概率大大降低，在體內結構下，其復制的復雜結構進一步提高了復制的準確性；修復系統可以檢查出錯配堿基和DNA各種損傷并加以修復。DNA聚合酶之所以要有引物的存在即不能從無到有合成新的鏈是因為在未核實前一個核苷酸處于正確配對狀態，是不會進行聚合反應的。RNA聚合酶沒有校對功能，因此不需要引物，RNA引物都是從新開始合成的，它的錯配可能性大，在完成引物作用后DNA聚合酶ｌ將其刪除，而代之以高保真的DNA鏈。DNA復制的拓撲性質（未整理，P419）DNA的復制過程DNA復制過程可分為三個階段：起始、延伸和終止。其間的反應和參與作用的酶和輔助因子各有不同。在DNA合成的生長點，即復制叉上，分布著各種各樣與復制有關的酶和蛋白因子，它們構成的復合物稱復制體。DNA復制的階段表現在其復制體結構的變化。復制的起始大腸桿菌復制的起點稱為，由245個bp(堿基對）構成，其序列和控制元件在細菌復制點中十分保守。關鍵序列在于兩組段的重復：三個13bp的序列和四個9bp序列（DnaA蛋白結合位點）。正如上面所說大腸桿菌起點復制包括多種酶和輔助因子。Dna蛋白各帶一個ATP結合在此位點上，并聚集在一起，DNA纏繞其上，形成起始復合物。ＨU蛋白可與DNA結合，促使雙鏈DNA彎曲。DanB借助水解ATP產生的能量，沿著DNA鏈５’－３’方向移動，解開DNA的雙鏈，此時稱為前引發復合物。DNA雙鏈的解開還需要DNA旋轉酶（拓撲異構酶ll）和單鏈結合蛋白（SSB），前者可以消除解螺旋酶產生的拓撲張力，后者保護單鏈并防止恢復雙鏈。至此引物合成酶合成RNA引物，并開始DNA的復制。復制的起始要求DNA呈負超螺旋，并且起點附近的基因處于轉錄狀態，這是因為DnaA只能與負超螺旋的DNA相結合。RNA聚合酶對復制起始的作用，可能是因其在起點鄰近處合成一段RNA，形成RNA突環，影響起點的結構，因而有利于DnaA的作用。DNA復制的調節發生在起始階段，一旦開始復制，如無意外受阻，就能一直進行到完成。DNA復制的發動與DNA甲基化以及細菌質膜的相互作用有關。Dam甲基化酶可以使起始序列中的腺嘌呤的第六位Ｎ甲基化。DNA完成復制后，大腸桿菌的親代鏈依然保持著甲基化，而新合成的鏈未甲基化，因此是半甲基化的DNA。半甲基化的起點不能發生復制的起始，直到Dam甲基化酶使起點完全甲基化。甲基化的延遲可能是因為與膜結合而阻礙了Dam甲基化酶的作用。復制的延伸復制的延伸階段同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。這兩條鏈合成的基本反映相同，并且都由DNA聚合酶ｌｌｌ催化。但兩條鏈的合成也有明顯差別前者持續合成，后者分段合成。因此參與的蛋白質因子也有不同親代DNA首先必須由DNA解旋酶將雙鏈解開，其產生的拓撲異構張力由拓撲異構酶釋放，分開的鏈被單鏈結合蛋白所穩定。自此之后，前導鏈與滯后鏈的合成便有所不同復制起點解開后形成兩個復制叉，既可進行雙向復制。前導鏈開始合成后通常都一直繼續下去。先由引物合成酶（DnaG蛋白）在起點處合成一段RNA引物，前導鏈的引物一般比岡崎片段的引物略長一些，大約10-60個核苷酸。隨后DNA聚合酶ｌｌｌ在引物上加入脫氧核糖核苷酸，前導鏈的合成與復制叉的移動保持同步。滯后鏈的合成是分段進行的，需要不斷地合成岡崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶ｌｌｌ在引物上加入脫氧核糖核酸。為了使前導鏈與滯后鏈的合成協調一致，即被同一個DNA聚合酶lll二聚體所合成，滯后鏈必須繞成一個突環。合成岡崎片段需要DNA聚合酶ｌｌｌ不斷與模板脫開，然后在新的位置上又與模板結合。這一作用是夾子和復合物來完成的。DnaB有兩個功能，其一是解螺旋酶，以解開DNA的雙螺旋；另一活化引物合成酶，促進其合成RNA引物。由DnaB解螺旋酶和Dna引物合成酶構成了復制體的一個基本功能單位稱為引發體。無論哪一種引發體，都能依賴ATP沿著復制叉運動方向在DNA鏈上移動，并合成岡崎片段的RNA引物。引物的合成方向與復制叉的前進方向正好相反。DNA聚合酶ｌｌｌ在模板鏈上合成岡崎片段，遇上一個岡崎片段時即停止合成，亞基隨即脫開DNA鏈，可能正是此停頓為合成RNA引物的信號。復制的終止細菌環狀染色體的兩個復制叉向前推移，最后在終止區相遇并停止復制，該區含有多個約２２ｂｐ的終止子位點。大腸桿菌有六個終止子位點，分別稱為，與ｔｅｒ位點結合的蛋白值成為Ｔｕｓ。Tuｓ－ｔｅｒ復合物只能阻止一個方向的復制叉前移，即不讓對側復制叉超過中點后過量復制。在正常情況下，兩個復制叉前移的速度是相等的，到達終止區后就停止復制。DNA聚合酶l通過5’-3’外切酶活性切除RNA引物并完成缺口處DNA復制。DNA連接酶封閉DNA鏈上切口。真核生物DNA的復制（未吸整理）真核生物的DNA通常都與組蛋白構成核小體，以染色質的形式存在于細胞核中。DNA的損傷修復DNA在復制過程中可能產生錯配。DNA重組、病毒基因的整合，常常會局部破壞DNA的雙螺旋結構。某些物理化學因子，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑等，都能作用于DNA，造成其結構與功能的破壞，從而引起生物突變，甚至導致死亡。然而在一定條件下，生物機體能使其DNA的損傷得到修復。這種修復是生物在長期進化過程中獲得的一種保護功能。造成DNA損傷的原因可能是生物因素、物理因素或是化學因素；可能來自細胞內部，也可能來自細胞外部；受到破壞的可能是DNA的堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵。總之DNA的正常雙螺旋結構遭到破壞，就可能影響其功能。細胞對DNA損傷的修復系統有五種錯配修復（識別并修正錯誤堿基配對的過程）遺傳性非息肉結腸直腸癌（HNPCC）或Lynch綜合征是由于DNA錯配修復有缺陷而造成的。DNA復制過程中如果發生錯配，如果新合成鏈被矯正，基因編碼信息可得到恢復；但是如果模板鏈被矯正，突變就固定；細胞錯配修復系統能區分“舊”鏈與“新”鏈。Dam甲基化酶可使DNA的GATC序列中腺嘌呤甲基化，復制后的DNA在短期內（數分鐘）為半甲基化的GATC序列，一旦發現錯配堿基，即將未甲基化的鏈切除，并以未甲基化的鏈為模板進行修復合成。大腸桿菌參與錯配修復的蛋白質至少有12種，其功能或是區分兩條鏈或是進行修復過程。其中含有幾個特有的蛋白由mut基因編碼。MutS二聚體識別并結合到DNA錯配堿基部位，MutL二聚體與MutS結合，二者組成的復合物可沿DNA雙鏈向兩方向移動，DNA由此形成突環。水解ATP提供的能量驅使ATP移動，知道遇見GATC序列為止。隨后MutＨ核酸內切酶結合到MutSL上毛病在未甲基化鏈GATC位點的５’端切開。在切除的過程中解螺旋酶ｌｌ和SSＢ幫助鏈的解開。切除的鏈長達１０００個核苷酸以上，直到將錯配的堿基切除。新的DNA鏈由DNA聚合酶lll和DNA連接酶合成并連接。為了矯正一個錯配堿基，不僅需要找出錯配堿基本身，還需要從遠在1kb以外找出GATC序列，找出未甲基化的“新鏈”，加以切除可能長達1000個核苷酸的鏈，然后再合成新鏈，這是一個十分耗能的過程由此可看出維持基因信息的完整性對于生物是何等重要。直接修復紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈兩相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體（）。這種二聚體是由兩個胸腺嘧啶堿基以共價鍵聯結成環丁烷的結構而形成的。其他嘧啶堿基之間也能形成類似的二聚體，但是數量較少。嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結構，使其復制和轉錄功能均受到阻礙。胸腺嘧啶二聚體的形成和修復有多種機制，常見的有光修復和暗修復。最早發現細菌在紫外線照射后立即用可見光照射，可以顯著提高細菌存活率。光復活的機制是可見光（最有效波長為400nm左右）激活了光復活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復活作用是一種高度專一的直接修復方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。光復活酶在生物界分布很廣，從低等單細胞生物一直到鳥類都有，而高等的哺乳類卻沒有。這種修復在植物中特別重要。高等動物更重要的是暗修復，即切除含嘧啶二聚體的核酸鏈，然后再修復合成。另一鐘直接修復的例子是－甲基鳥嘌呤的修復。在烷化劑做喲改下堿基可被烷基化，并改變了堿基配對的性質。甲基化的鳥嘌呤在－甲基鳥嘌呤－DNA甲基轉乙?；缸饔孟拢蓪⒓谆D移到酶自身的半胱氨酸殘基上，甲基轉移酶因此失活，但卻成為其自身基因和另一些修復酶基因轉錄的活化物切除修復所謂切除修復，便是在一些系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復正常結構的過程。這是一種比較普遍的修復機制，它對多種損傷均能起修復作用。切除修復包括兩個過程：一是由細胞內特異的酶找到DNA的損傷部位，切除含有損傷結構的核苷酸鏈，二是修復合成并連接。AP位點以及堿基切除修復細胞內有多種特異的DNA糖苷酶，他們能識別DNA中不正常的堿基，而將其水解下來。例如在DNA復制過程中聚合酶對脫氧胸腺嘧啶核苷三磷酸（dTTP）和脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）的分辨能力是不高的，因此常有少量脫氧尿苷酸摻入到DNA鏈中去。大腸桿菌中的dUTP酶可以分解ｄUTP成ｄUMP，但是作用有限，不能完全避免ｄUTP的混入。而且胞嘧啶脫氨基后也會轉化成尿嘧啶。對于上述可能出現的尿嘧啶，細胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以把它除去。腺嘌呤脫氨后形成次黃嘌呤，這一不正常的堿基可被次黃嘌呤-N-糖苷酶除去。無嘌呤或無嘧啶位點常稱AP位點，是核酸內切酶識別作用位點。AP位點可由多途徑產生，例如一些特異的DNA－Ｎ－糖苷酶可以識別異常堿基，水解該糖苷鍵，產生AP位點。通常只有單個堿基缺陷才可以堿基切除修復。AP位點形成后，即有AP核酸內切酶在AP位點附近將DNA鏈切開。不同AP核酸內切酶的作用方式不同，或在5’切開，或在3’切開。然后核酸外切酶將包括AP位點在內的DNA鏈切除。DNA聚合酶ｌ兼具外切酶活性，并使DNA鏈沿３’端延伸以填補空缺，DNA連接酶將鏈接上，在AP位點上必須切除若干核苷酸后才能修復合成，細胞內沒有酶能夠在AP位置直接將堿基插入，因為DNA合成的前體物質是核苷酸而不是堿基。核苷酸切除修復如果DNA損傷造成DNA螺旋結構較大變形，則需要以核苷酸切除修復方式才能修復。首先識別損傷位點并由核酸內切酶切開磷酸二酯鍵。由５’－３’核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按５’－３’方向DNA鏈，填補已切除的空隙。由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來，這樣完成的修復能使DNA恢復到原來的結構。最常見的是短片段的修復，只有多處發生嚴重損傷才會誘導長片段修復。損傷鏈由切除酶切除，該酶也是一種核酸內切酶，其可識別多種DNA損傷，包括紫外線引起的嘧啶二聚體和其他光反應產物，堿基的加和物。由此可見，切除修復作用是一種普遍的生物功能，它不局限于某種特殊原因造成的損傷，而能一般地識別DNA雙螺旋結構的改變，對遭到破壞而呈現不正常結構的部分加以去除細胞的這種功能，對于保護遺傳物質DNA，使它不被輕易得破壞是有很大重要意義的。細胞的切除修復系統和癌癥的發生也有一定的關系。有一種稱為著色性干皮病的遺傳病，這種病患者對日光或紫外線特別敏感，往往容易出現皮膚癌。經分析表明，