加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的干預(yù)作用及機制探究一、引言1.1研究背景與意義抑郁癥作為一種常見的精神障礙，嚴重威脅著人類的身心健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球約有3.5億抑郁癥患者，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。抑郁癥不僅導(dǎo)致患者出現(xiàn)情緒低落、興趣減退、自責自罪等精神癥狀，還常伴有睡眠障礙、食欲不振、疲勞乏力等軀體癥狀，極大地降低了患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。肝郁脾虛型抑郁癥是抑郁癥在中醫(yī)領(lǐng)域的一種常見證型。中醫(yī)理論認為，肝主疏泄，調(diào)暢氣機，若情志不舒，肝氣郁結(jié)，失于疏泄，會橫逆犯脾，導(dǎo)致脾失健運，從而出現(xiàn)肝郁脾虛之證。肝郁脾虛型抑郁癥患者除了有典型的抑郁癥狀外，還常表現(xiàn)出胸悶脅痛、腹脹便溏、食欲不振等消化系統(tǒng)癥狀。近年來，隨著中醫(yī)對抑郁癥研究的深入，肝郁脾虛型抑郁癥受到了越來越多的關(guān)注，其發(fā)病機制與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)失調(diào)、腦腸軸異常等密切相關(guān)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療抑郁癥主要采用抗抑郁藥物，如選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）等。然而，這些藥物存在起效慢、不良反應(yīng)多等問題，部分患者對藥物的耐受性和依從性較差。中醫(yī)藥在治療抑郁癥方面具有獨特的優(yōu)勢，注重整體觀念和辨證論治，不良反應(yīng)相對較少，患者更容易接受。加味逍遙散作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，由逍遙散加丹皮、梔子而成，具有疏肝清熱、健脾養(yǎng)血的功效，在臨床上廣泛應(yīng)用于肝郁脾虛型抑郁癥的治療，且取得了較好的療效。加味逍遙散治療肝郁脾虛型抑郁癥具有多方面的優(yōu)勢。從藥物組成來看，柴胡疏肝解郁，為君藥；當歸、白芍養(yǎng)血柔肝，白術(shù)、茯苓健脾祛濕，共為臣藥；丹皮、梔子清熱涼血，助柴胡清解肝郁之熱；薄荷疏散郁遏之氣，透達肝經(jīng)郁熱；煨姜溫胃和中；甘草調(diào)和諸藥。全方配伍精妙，既能疏肝理氣，又能健脾養(yǎng)血，還可清熱除煩，針對肝郁脾虛型抑郁癥的病因病機進行全面調(diào)理。現(xiàn)代藥理研究也表明，加味逍遙散具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、抑制下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸活性、抗氧化、抗炎等作用，能夠從多個層面改善抑郁癥狀。盡管加味逍遙散在治療肝郁脾虛型抑郁癥方面有一定的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)和療效，但目前對于其作用機制的研究仍不夠深入和全面。深入探究加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用機制，不僅有助于揭示中醫(yī)藥治療抑郁癥的科學內(nèi)涵，為抑郁癥的治療提供新的理論依據(jù)和治療思路，還能進一步拓展加味逍遙散的臨床應(yīng)用，提高其臨床療效，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在抑郁癥的研究領(lǐng)域，國外對于抑郁癥的研究起步較早，主要集中在抑郁癥的神經(jīng)生物學機制方面。大量研究表明，抑郁癥與大腦神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）等的失衡密切相關(guān)。當這些神經(jīng)遞質(zhì)的水平異常時，會影響神經(jīng)信號的傳遞，進而導(dǎo)致情緒調(diào)節(jié)功能紊亂，引發(fā)抑郁癥狀。例如，有研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者大腦中5-HT的含量明顯降低，影響了其對情緒的調(diào)控。此外，國外學者還對抑郁癥的遺傳因素、神經(jīng)影像學特征等進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)遺傳因素在抑郁癥的發(fā)病中起到一定作用，通過神經(jīng)影像學技術(shù)可以觀察到抑郁癥患者大腦特定區(qū)域如海馬體、前額葉皮質(zhì)等的結(jié)構(gòu)和功能異常。然而，國外對抑郁癥的研究多基于現(xiàn)代醫(yī)學理論，對于抑郁癥的中醫(yī)證型，尤其是肝郁脾虛型抑郁癥的研究相對較少。國內(nèi)對抑郁癥的研究，既借鑒了現(xiàn)代醫(yī)學的研究成果，又充分發(fā)揮了中醫(yī)的特色和優(yōu)勢。在肝郁脾虛型抑郁癥方面，國內(nèi)學者進行了多方面的研究。在病因病機研究上，普遍認為肝郁脾虛型抑郁癥的發(fā)病與情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞逸失度等因素有關(guān)。情志不暢導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，肝失疏泄，進而橫逆犯脾，脾失健運，形成肝郁脾虛的病理狀態(tài)，影響人體的氣血運行和臟腑功能，最終引發(fā)抑郁癥狀。在臨床研究方面，許多研究證實了中醫(yī)藥治療肝郁脾虛型抑郁癥的有效性。有研究采用中藥復(fù)方結(jié)合心理干預(yù)治療肝郁脾虛型抑郁癥，結(jié)果顯示患者的抑郁癥狀得到明顯改善，且不良反應(yīng)較少。還有研究通過對肝郁脾虛型抑郁癥患者進行中醫(yī)辨證論治，觀察到患者在情緒、軀體癥狀等方面均有顯著改善。加味逍遙散作為治療肝郁脾虛型抑郁癥的常用方劑，近年來也受到了廣泛關(guān)注。現(xiàn)代藥理研究表明，加味逍遙散具有多方面的作用機制。在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)方面，加味逍遙散能夠增加腦內(nèi)5-HT和NE的含量，改善神經(jīng)遞質(zhì)的失衡狀態(tài)。實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予肝郁脾虛型抑郁癥模型小鼠加味逍遙散干預(yù)后，小鼠腦內(nèi)5-HT和NE的水平明顯升高，抑郁行為得到緩解。在抑制HPA軸活性方面，加味逍遙散可以降低血液中皮質(zhì)醇的含量，減輕應(yīng)激對機體的影響。當機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，HPA軸被激活，皮質(zhì)醇分泌增加，長期的高皮質(zhì)醇水平會對神經(jīng)細胞造成損傷，而加味逍遙散能夠調(diào)節(jié)HPA軸的功能，使其恢復(fù)正常。此外，加味逍遙散還具有抗氧化、抗炎等作用，能夠減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細胞的損傷。盡管國內(nèi)外在抑郁癥及加味逍遙散的研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足與空白。目前對于肝郁脾虛型抑郁癥的發(fā)病機制研究還不夠深入和全面，尤其是在基因水平、蛋白質(zhì)組學等方面的研究相對較少，對于肝郁脾虛型抑郁癥與其他抑郁癥證型在發(fā)病機制上的差異也缺乏深入探討。在加味逍遙散的研究中，雖然已經(jīng)明確了其一些作用機制，但對于其具體的有效成分和作用靶點還不完全清楚，加味逍遙散在體內(nèi)的代謝過程和藥代動力學特征也有待進一步研究。此外，現(xiàn)有的研究多集中在動物實驗和臨床觀察上，缺乏對加味逍遙散作用機制的系統(tǒng)、深入的研究，對于加味逍遙散如何通過多靶點、多途徑發(fā)揮治療作用，還需要進一步探索。未來的研究可以在這些方面展開，以深入揭示肝郁脾虛型抑郁癥的發(fā)病機制和加味逍遙散的作用機制，為抑郁癥的治療提供更有效的理論依據(jù)和治療方法。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用及機制，為抑郁癥的中醫(yī)藥治療提供更堅實的理論依據(jù)和更有效的治療策略。具體研究內(nèi)容如下：建立肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型：采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型。通過對小鼠施加禁食、禁水、晝夜顛倒、潮濕環(huán)境、夾尾等多種不可預(yù)知的溫和應(yīng)激刺激，同時將小鼠單獨飼養(yǎng)，模擬人類長期處于應(yīng)激狀態(tài)且缺乏社會支持的生活環(huán)境，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。造模過程中，每天詳細記錄小鼠的體重、飲食、活動等情況，采用行為學測試如糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗等對小鼠的抑郁狀態(tài)進行評估，以確保模型的成功建立。觀察加味逍遙散對小鼠行為學的影響：將成功建模的小鼠隨機分為模型對照組、加味逍遙散低劑量組、加味逍遙散中劑量組、加味逍遙散高劑量組和陽性藥物對照組（如氟西汀組）。各給藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥一段時間（如21天）。在給藥期間，定期進行行為學測試，比較各組小鼠在糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗等中的行為學表現(xiàn)，觀察加味逍遙散對小鼠抑郁樣行為的改善作用。檢測相關(guān)指標探討作用機制：給藥結(jié)束后，處死小鼠，采集小鼠的血液、腦組織、脾臟等樣本。運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測血液和腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)（如5-HT、NE、DA）的含量，觀察加味逍遙散對神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測腦組織中與神經(jīng)可塑性、神經(jīng)炎癥相關(guān)的蛋白表達，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，探討加味逍遙散對神經(jīng)可塑性和神經(jīng)炎癥的影響。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因的表達，進一步從分子水平揭示加味逍遙散的作用機制。分析加味逍遙散的化學成分：采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)對加味逍遙散中的化學成分進行分析，鑒定其中的主要活性成分。通過研究這些活性成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，為進一步研究加味逍遙散的作用機制和質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。同時，探索加味逍遙散中不同成分之間的協(xié)同作用，為優(yōu)化方劑組成提供理論依據(jù)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用多種研究方法，以全面、深入地探討加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用及機制，具體研究方法如下：文獻研究法：系統(tǒng)查閱國內(nèi)外關(guān)于抑郁癥，特別是肝郁脾虛型抑郁癥的相關(guān)文獻資料，包括中醫(yī)古籍、現(xiàn)代醫(yī)學研究論文、臨床研究報告等。通過對這些文獻的梳理和分析，了解抑郁癥的發(fā)病機制、中醫(yī)辨證論治理論、加味逍遙散的研究現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用情況，為研究提供理論基礎(chǔ)和思路參考。實驗研究法：采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型，通過對小鼠施加多種不可預(yù)知的溫和應(yīng)激刺激，模擬人類長期處于應(yīng)激狀態(tài)且缺乏社會支持的生活環(huán)境，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。將成功建模的小鼠隨機分為模型對照組、加味逍遙散低劑量組、加味逍遙散中劑量組、加味逍遙散高劑量組和陽性藥物對照組（如氟西汀組）。各給藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，模型對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥一段時間（如21天）。在給藥期間，定期進行行為學測試，比較各組小鼠在糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗等中的行為學表現(xiàn)，觀察加味逍遙散對小鼠抑郁樣行為的改善作用。給藥結(jié)束后，處死小鼠，采集小鼠的血液、腦組織、脾臟等樣本，運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測血液和腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)（如5-HT、NE、DA）的含量，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測腦組織中與神經(jīng)可塑性、神經(jīng)炎癥相關(guān)的蛋白表達，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因的表達，從分子水平揭示加味逍遙散的作用機制。此外，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)對加味逍遙散中的化學成分進行分析，鑒定其中的主要活性成分。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計法：運用SPSS、GraphPadPrism等統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，通過合理的數(shù)據(jù)分析，準確揭示加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的干預(yù)作用及相關(guān)機制。技術(shù)路線如下：首先進行文獻調(diào)研，全面了解抑郁癥及加味逍遙散的相關(guān)研究現(xiàn)狀。接著開展小鼠模型建立工作，通過CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方法造模，并利用行為學測試評估模型是否成功。模型建立成功后，進行分組給藥，分別給予不同劑量的加味逍遙散和陽性藥物。在給藥過程中，定期進行行為學測試，觀察小鼠行為變化。給藥結(jié)束后，采集樣本，分別進行神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測、蛋白表達檢測、基因表達檢測以及化學成分分析。最后對各項實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，總結(jié)加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用及機制，得出研究結(jié)論。二、理論基礎(chǔ)2.1抑郁癥的中醫(yī)認識2.1.1中醫(yī)對抑郁癥病因病機的闡述抑郁癥在中醫(yī)理論中屬于“郁證”范疇，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多個方面。中醫(yī)認為，情志不暢是抑郁癥發(fā)病的重要誘因。人的情志活動與五臟六腑密切相關(guān)，正常情況下，人體能夠通過自身的調(diào)節(jié)機制，維持情志與臟腑功能的平衡。然而，當人們長期處于過度的憂思、惱怒、恐懼等負面情緒狀態(tài)時，這種平衡就會被打破。例如，過度的悲傷憂愁會損傷肺氣，導(dǎo)致肺氣失于宣降；長期的惱怒生氣則會使肝氣郁結(jié)，肝失疏泄。這些情志因素會導(dǎo)致人體氣機紊亂，進而影響臟腑的正常功能，成為抑郁癥發(fā)病的潛在因素。臟腑失調(diào)在抑郁癥的發(fā)病過程中也起著關(guān)鍵作用。肝主疏泄，調(diào)暢氣機，是人體氣機升降出入的重要樞紐。若肝氣郁結(jié)，失于疏泄，會導(dǎo)致氣機不暢，氣血運行受阻，出現(xiàn)胸脅脹滿、情志抑郁等癥狀。脾主運化，為后天之本，氣血生化之源。脾虛則運化失常，水谷不能正常消化吸收，導(dǎo)致氣血不足，臟腑失養(yǎng)，進而影響心神的正常功能。心主神明，人的精神意識思維活動均由心所主宰。當臟腑失調(diào)，氣血不足，不能上榮于心時，會導(dǎo)致心神失養(yǎng)，出現(xiàn)失眠、多夢、健忘等癥狀，進一步加重抑郁情緒。抑郁癥的病機關(guān)鍵在于肝郁脾虛，導(dǎo)致氣血失調(diào)，腦神失養(yǎng)。肝郁則氣滯，氣滯可致血瘀，使氣血運行不暢，不能濡養(yǎng)臟腑經(jīng)絡(luò)。脾虛則氣血生化無源，臟腑得不到充足的氣血滋養(yǎng)，功能減退。腦為元神之府，依賴于氣血的濡養(yǎng)才能發(fā)揮正常的功能。當氣血失調(diào)，腦神失養(yǎng)時，會導(dǎo)致神明失用，出現(xiàn)情緒低落、興趣減退、思維遲緩等抑郁癥狀。此外，肝郁脾虛還會影響人體的津液代謝，導(dǎo)致水濕內(nèi)停，聚濕生痰，痰氣互結(jié)，阻滯氣機，加重病情。例如，臨床上常見的抑郁癥患者常伴有胸悶、腹脹、食欲不振等消化系統(tǒng)癥狀，以及情緒抑郁、煩躁不安等精神癥狀，這些都是肝郁脾虛、氣血失調(diào)、腦神失養(yǎng)的表現(xiàn)。2.1.2肝郁脾虛型抑郁癥的中醫(yī)理論依據(jù)肝郁脾虛型抑郁癥是抑郁癥常見的中醫(yī)證型，其發(fā)病機制與肝脾兩臟密切相關(guān)。肝主疏泄，性喜條達，具有調(diào)節(jié)情志、促進氣血運行、協(xié)助脾胃運化等功能。當情志不舒，肝氣郁結(jié)時，會導(dǎo)致疏泄功能失常，出現(xiàn)情志抑郁、胸脅脹滿、善太息等癥狀。肝的疏泄功能失常還會橫逆犯脾，影響脾的運化功能。脾主運化，包括運化水谷和運化水濕兩個方面。脾失健運時，會出現(xiàn)食欲不振、腹脹、便溏等消化系統(tǒng)癥狀。患者還會因氣血生化不足而出現(xiàn)倦怠乏力、面色萎黃等表現(xiàn)。從中醫(yī)理論來看，肝屬木，脾屬土，木克土，正常情況下，肝木疏泄能夠促進脾土的運化。但當肝氣郁結(jié)，疏泄太過或不及，就會克制脾土太過，導(dǎo)致脾失健運。肝郁脾虛型抑郁癥患者常因長期的情志不暢，如工作壓力大、人際關(guān)系緊張等，導(dǎo)致肝氣郁結(jié)，進而影響脾的功能。情緒抑郁會使患者食欲減退，長期食欲不振又會導(dǎo)致營養(yǎng)攝入不足，進一步加重脾虛的癥狀。脾虛不能為氣血生化提供足夠的物質(zhì)基礎(chǔ)，導(dǎo)致氣血不足，不能滋養(yǎng)心神，使抑郁癥狀更加嚴重。肝郁脾虛型抑郁癥還會導(dǎo)致人體的氣機失調(diào)和臟腑功能紊亂。氣機不暢會使氣血運行受阻，導(dǎo)致瘀血內(nèi)生，進一步加重病情。臟腑功能紊亂會影響人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，導(dǎo)致機體的整體功能下降。患者可能會出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、乳腺增生等婦科疾病，以及容易感冒、免疫力低下等情況。這些癥狀相互影響，形成惡性循環(huán)，使病情纏綿難愈。2.2加味逍遙散的組方分析2.2.1加味逍遙散的組成成分加味逍遙散作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，其組方精妙，蘊含著豐富的中醫(yī)理論內(nèi)涵。該方劑主要由柴胡、當歸、白芍、白術(shù)、茯苓、甘草、牡丹皮、梔子、薄荷、煨姜等藥物組成。柴胡，性微寒，味苦、辛，歸肝、膽經(jīng)。它是加味逍遙散中的君藥，具有疏肝解郁的顯著功效。在人體中，肝主疏泄，調(diào)暢氣機，當肝氣郁結(jié)時，會出現(xiàn)情緒抑郁、胸脅脹滿等癥狀。柴胡能夠疏解肝郁，使肝氣得以條達，恢復(fù)其正常的疏泄功能，從而緩解因肝郁引起的各種不適。正如《本草綱目》中所記載：“柴胡，乃手足少陽、厥陰四經(jīng)之藥也，善達少陽之木氣，則少陽之氣能疏通胃氣之郁，而其結(jié)氣、飲食、積聚自消矣。”現(xiàn)代藥理研究也表明，柴胡中的柴胡皂苷等成分能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，具有抗抑郁、抗焦慮的作用。當歸，性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經(jīng)。其主要功效為補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便。在加味逍遙散中，當歸與白芍共同發(fā)揮養(yǎng)血柔肝的作用。肝藏血，若肝血不足，會導(dǎo)致肝體失養(yǎng)，進而影響肝的疏泄功能。當歸富含多種營養(yǎng)成分，如阿魏酸、當歸多糖等，能夠促進造血功能，增加血液中紅細胞、白細胞和血小板的數(shù)量，為肝臟提供充足的血液滋養(yǎng)。同時，當歸還具有活血化瘀的作用，能夠改善血液循環(huán)，使氣血通暢，有助于緩解肝郁氣滯引起的血瘀癥狀。白芍，性微寒，味苦、酸，歸肝、脾經(jīng)。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效。在方劑中，白芍與當歸相須為用，增強了養(yǎng)血柔肝的作用。白芍中的芍藥苷等成分能夠調(diào)節(jié)肝臟的生理功能，對肝細胞具有保護作用，還能緩解平滑肌痙攣，減輕因肝郁脾虛導(dǎo)致的腹部疼痛。此外，白芍還能調(diào)節(jié)人體的免疫功能，增強機體的抵抗力。白術(shù)，性溫，味甘、苦，歸脾、胃經(jīng)。白術(shù)的主要功效是健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎。在加味逍遙散中，白術(shù)與茯苓共同起到健脾化濕的作用。脾主運化，若脾虛則運化失常，水濕內(nèi)生，出現(xiàn)食欲不振、腹脹、便溏等癥狀。白術(shù)能夠增強脾胃的運化功能，促進水谷的消化吸收，同時燥濕利水，使體內(nèi)的水濕得以正常代謝。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)中的白術(shù)多糖等成分能夠調(diào)節(jié)胃腸道功能，促進胃腸蠕動，增強消化吸收能力。茯苓，性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)。茯苓具有利水滲濕、健脾寧心的功效。在方劑中，茯苓協(xié)助白術(shù)健脾化濕，同時還能寧心安神。對于肝郁脾虛型抑郁癥患者，常伴有心神不寧、失眠等癥狀，茯苓能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，緩解焦慮和失眠癥狀。茯苓中的茯苓多糖等成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種作用，對人體健康具有重要的保護作用。甘草，性平，味甘，歸心、肺、脾、胃經(jīng)。甘草在加味逍遙散中主要起到調(diào)和諸藥的作用。它能夠緩和藥物的烈性，使方劑中的各味藥物相互協(xié)調(diào)，更好地發(fā)揮治療作用。甘草還具有益氣補中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛的功效。在方劑中，甘草既能增強白術(shù)、茯苓健脾益氣的作用，又能緩解白芍的酸味，使方劑的口感更加平和。現(xiàn)代藥理研究表明，甘草中的甘草酸等成分具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性。牡丹皮，性微寒，味苦、辛，歸心、肝、腎經(jīng)。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功效。在加味逍遙散中，牡丹皮與梔子共同增強了方劑的清熱作用。當肝郁化火時，會出現(xiàn)心煩易怒、口苦咽干等癥狀，牡丹皮能夠清泄肝火，涼血散瘀，使火熱之邪得以清除。牡丹皮中的丹皮酚等成分具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用，對肝臟和心血管系統(tǒng)具有保護作用。梔子，性寒，味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)。梔子具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效。在方劑中，梔子引上焦之熱下行，與牡丹皮相配合，增強了清解郁熱的作用。梔子中的梔子苷等成分能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮的作用，同時還能促進膽汁分泌，有助于消化。薄荷，性涼，味辛，歸肺、肝經(jīng)。薄荷具有疏散風熱、清利頭目、利咽透疹、疏肝行氣的功效。在加味逍遙散中，薄荷能夠疏散郁遏之氣，透達肝經(jīng)郁熱，協(xié)助柴胡疏肝解郁。薄荷中的揮發(fā)油等成分具有提神醒腦、緩解壓力的作用，能夠改善患者的情緒狀態(tài)。煨姜，性溫，味辛，歸脾、胃、肺經(jīng)。煨姜具有溫胃和中的作用。在方劑中，煨姜能夠溫煦脾胃，增強脾胃的運化功能，同時還能調(diào)和諸藥，使方劑的藥性更加平和。2.2.2加味逍遙散的功效與作用機制加味逍遙散具有疏肝清熱、解郁和營的功效，其作用機制是多方面的，涉及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)。從中醫(yī)理論角度來看，加味逍遙散針對肝郁脾虛型抑郁癥的病因病機進行全面調(diào)理。方中柴胡疏肝解郁，為君藥，能夠疏解肝氣之郁結(jié)，使氣機通暢。當歸、白芍養(yǎng)血柔肝，助柴胡以解肝郁，同時滋養(yǎng)肝血，使肝體得養(yǎng)。白術(shù)、茯苓健脾化濕，培補后天之本，以助氣血生化之源，使脾胃功能恢復(fù)正常，從而杜絕生痰之源。牡丹皮、梔子清熱涼血，清解肝郁所化之火，使火熱之邪得以清除。薄荷疏散郁遏之氣，透達肝經(jīng)郁熱，增強柴胡疏肝解郁之力。煨姜溫胃和中，調(diào)和諸藥。甘草調(diào)和諸藥，兼益氣和中。全方配伍嚴謹，既能疏肝理氣，又能健脾養(yǎng)血，還可清熱除煩，使肝郁得解，脾虛得補，郁熱得清，氣血調(diào)和，從而達到治療肝郁脾虛型抑郁癥的目的。在現(xiàn)代醫(yī)學研究中，加味逍遙散的抗抑郁作用機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面。在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)方面，加味逍遙散能夠增加腦內(nèi)5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的含量。5-HT作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在情緒調(diào)節(jié)、睡眠、食欲等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。抑郁癥患者常伴有5-HT水平的降低，導(dǎo)致情緒低落、興趣減退等癥狀。加味逍遙散中的柴胡、白芍等成分能夠調(diào)節(jié)5-HT的合成、釋放和再攝取，使其水平升高，從而改善抑郁癥狀。NE參與人體的應(yīng)激反應(yīng)和情緒調(diào)節(jié)，加味逍遙散能夠調(diào)節(jié)NE的代謝，增強其在腦內(nèi)的信號傳遞，提高機體的應(yīng)激能力和情緒狀態(tài)。DA與人體的獎賞系統(tǒng)和動機行為密切相關(guān)，加味逍遙散可以調(diào)節(jié)DA的水平，改善患者的興趣和動力。加味逍遙散還具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用。它能夠抑制下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的過度激活。當人體處于應(yīng)激狀態(tài)時，HPA軸被激活，導(dǎo)致皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素分泌增加。長期的高皮質(zhì)醇水平會對神經(jīng)細胞造成損傷，影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，進而引發(fā)抑郁癥狀。加味逍遙散中的柴胡、當歸等成分能夠調(diào)節(jié)HPA軸的功能，降低皮質(zhì)醇的分泌，減輕應(yīng)激對機體的影響，保護神經(jīng)細胞免受損傷。加味逍遙散對免疫系統(tǒng)也有一定的調(diào)節(jié)作用。抑郁癥患者常伴有免疫功能紊亂，表現(xiàn)為炎癥因子水平升高，免疫細胞功能異常等。加味逍遙散中的牡丹皮、梔子等成分具有抗炎作用，能夠降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的水平，減輕炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細胞的損傷。同時，加味逍遙散還能調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的免疫力，提高機體對疾病的抵抗力。加味逍遙散還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減少氧化應(yīng)激對神經(jīng)細胞的損傷。自由基是一種具有高度活性的分子，在體內(nèi)產(chǎn)生過多時會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，導(dǎo)致細胞損傷和功能障礙。加味逍遙散中的多種成分，如當歸、白芍、甘草等，富含抗氧化物質(zhì)，能夠增強機體的抗氧化酶活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，清除自由基，保護神經(jīng)細胞免受氧化損傷。加味逍遙散通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)，發(fā)揮其疏肝清熱、解郁和營的功效，從而對肝郁脾虛型抑郁癥起到治療作用。其多靶點、多途徑的作用機制為抑郁癥的治療提供了新的思路和方法。三、實驗研究3.1實驗材料3.1.1實驗動物選用SPF級C57BL/6小鼠，共60只，雌雄各半，體重為18-22g。小鼠購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%的動物房內(nèi)，采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進食和飲水。小鼠在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，使其適應(yīng)實驗環(huán)境，期間密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，確保小鼠健康狀況良好。在適應(yīng)期結(jié)束后，對小鼠進行分組，為后續(xù)實驗做準備。3.1.2實驗藥物與試劑加味逍遙散藥材購自[藥材供應(yīng)商名稱]，經(jīng)[鑒定人姓名]鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》相關(guān)標準。加味逍遙散的制備方法如下：按照柴胡15g、當歸10g、白芍10g、白術(shù)10g、茯苓10g、甘草6g、牡丹皮10g、梔子10g、薄荷3g、煨姜6g的比例稱取藥材。將除薄荷外的藥材加適量水浸泡30min，然后武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30min，加入薄荷后再煎煮10min。過濾取濾液，藥渣再加水煎煮2次，每次20min，合并3次濾液，濃縮至生藥含量為1g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谥苽溥^程中，嚴格控制煎煮時間、溫度和加水量，確保加味逍遙散的質(zhì)量穩(wěn)定。通過高效液相色譜法（HPLC）對加味逍遙散中的主要成分進行含量測定，如芍藥苷、柴胡皂苷等，以保證其質(zhì)量符合實驗要求。陽性藥物氟西汀購自[藥品生產(chǎn)廠家名稱]，規(guī)格為20mg/片。臨用前用生理鹽水配制成所需濃度。實驗中用到的其他試劑，如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自[試劑供應(yīng)商名稱]。這些試劑的規(guī)格根據(jù)實驗需求選擇，如ELISA試劑盒通常為96孔板裝，可滿足多次實驗檢測的需要。其他常用試劑如甲醇、乙腈、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，購自[化學試劑供應(yīng)商名稱]。3.1.3實驗儀器與設(shè)備實驗所需儀器設(shè)備眾多，其中電子天平（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于稱取藥材、試劑和小鼠體重。其精度可達到0.001g，能夠滿足實驗中對重量精確測量的要求。離心機（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于分離血液、組織勻漿等樣品，轉(zhuǎn)速可達12000r/min，具備溫控功能，可在低溫環(huán)境下進行離心操作，保證樣品中生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。酶標儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于檢測ELISA試劑盒的吸光度值，從而定量分析樣品中相關(guān)物質(zhì)的含量。該酶標儀具有高精度的光學系統(tǒng)，能夠準確測量不同波長下的吸光度，操作簡便，數(shù)據(jù)處理功能強大。此外，還有用于行為學測試的設(shè)備，如糖水偏好實驗裝置、強迫游泳實驗裝置、懸尾實驗裝置等。糖水偏好實驗裝置由兩個相同的飲水瓶和鼠籠組成，用于測量小鼠對糖水和純水的偏好程度，以評估小鼠的快感缺失情況。強迫游泳實驗裝置為一個透明的玻璃缸，直徑和高度符合實驗要求，缸內(nèi)裝有一定深度的水，用于觀察小鼠在水中的不動時間，反映其絕望行為。懸尾實驗裝置由懸掛架和繩子組成，將小鼠尾巴懸掛在一定高度，記錄小鼠的不動時間，也是評估小鼠抑郁樣行為的重要指標。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于檢測相關(guān)基因的表達水平。該儀器能夠在PCR反應(yīng)過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過與標準曲線對比，精確計算出樣品中目標基因的相對表達量。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）所需的電泳儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）、轉(zhuǎn)膜儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）等設(shè)備，用于分離和檢測蛋白質(zhì)的表達情況。電泳儀能夠在電場作用下將蛋白質(zhì)按照分子量大小進行分離，轉(zhuǎn)膜儀則將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)的免疫檢測。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS，型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）用于分析加味逍遙散的化學成分。該儀器結(jié)合了高效液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的定性定量分析能力，能夠?qū)游跺羞b散中的多種化學成分進行準確鑒定和含量測定。這些儀器設(shè)備在實驗中發(fā)揮著重要作用，為實驗的順利進行提供了有力保障。3.2實驗方法3.2.1肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型的建立采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型。將60只小鼠隨機分為正常對照組10只和造模組50只。正常對照組小鼠置于標準鼠籠中，每籠5只飼養(yǎng)，給予正常飲食和水，保持環(huán)境安靜，無應(yīng)激刺激。造模組小鼠單籠飼養(yǎng)，以模擬缺乏社會支持的狀態(tài)。在接下來的28天內(nèi)，對造模組小鼠施加多種不可預(yù)知的溫和應(yīng)激刺激。應(yīng)激刺激方式包括禁食24h，使小鼠處于饑餓狀態(tài)，打亂其正常的飲食節(jié)律；禁水24h，造成小鼠體內(nèi)水分失衡，增加其生理應(yīng)激；晝夜顛倒，將小鼠置于光照/黑暗周期顛倒的環(huán)境中，干擾其生物鐘；潮濕環(huán)境，在鼠籠底部放置浸濕的墊料，使小鼠處于潮濕的生活環(huán)境，影響其舒適度；夾尾1min，用鑷子輕輕夾住小鼠尾巴，給予短暫的疼痛刺激。每天隨機選擇1-2種應(yīng)激刺激方式施加于造模組小鼠，每種刺激每周出現(xiàn)2-3次，確保小鼠無法預(yù)知刺激的發(fā)生。在造模過程中，每天觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動度、毛發(fā)色澤、糞便情況等。造模前和造模第7天、第14天、第21天、第28天分別稱量小鼠體重，記錄體重變化情況。通過觀察發(fā)現(xiàn)，造模組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、毛發(fā)粗糙無光澤、糞便稀溏等表現(xiàn)，體重增長緩慢或下降，而正常對照組小鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，毛發(fā)順滑，體重正常增長。造模結(jié)束后，采用行為學測試對小鼠的抑郁狀態(tài)進行評估，以確定模型是否成功建立。3.2.2模型評價指標與方法通過多種指標和方法對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型進行評價，以確保模型的可靠性和有效性。在行為學測試方面，采用強迫游泳實驗。實驗時，將小鼠放入裝有10-15cm深溫水（25±1）℃的玻璃缸中，玻璃缸直徑為20cm。小鼠在水中會本能地掙扎試圖逃脫，但隨著時間推移，當它感到無法逃脫時，會出現(xiàn)不動狀態(tài)，即漂浮在水中，僅做出維持頭部在水面以上的必要動作。記錄小鼠在6min內(nèi)的不動時間，不動時間越長，表明小鼠的絕望程度越高，抑郁樣行為越明顯。正常對照組小鼠在水中的不動時間較短，而造模組小鼠的不動時間顯著延長。糖水偏好實驗也是重要的評價指標之一。實驗前，先讓小鼠適應(yīng)1%蔗糖水和純水24h，使其熟悉兩種液體的味道。實驗時，將裝有1%蔗糖水和純水的兩個相同飲水瓶置于鼠籠中，記錄24h內(nèi)小鼠對蔗糖水和純水的攝入量。計算小鼠的糖水偏好率，糖水偏好率=蔗糖水攝入量/（蔗糖水攝入量+純水攝入量）×100%。正常對照組小鼠對糖水具有明顯的偏好，糖水偏好率較高；而造模組小鼠由于處于抑郁狀態(tài)，快感缺失，對糖水的偏好降低，糖水偏好率顯著低于正常對照組。懸尾實驗同樣用于評估小鼠的抑郁樣行為。將小鼠尾巴用膠帶固定在離桌面20cm高的橫桿上，使小鼠頭部向下懸垂。記錄6min內(nèi)小鼠的不動時間，不動時間越長，說明小鼠的抑郁程度越嚴重。造模組小鼠在懸尾實驗中的不動時間明顯長于正常對照組。除行為學測試外，還檢測小鼠的生化指標。實驗結(jié)束后，摘眼球取血，離心分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測血清中皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）等應(yīng)激相關(guān)激素的水平。肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型組血清中皮質(zhì)醇和ACTH水平顯著高于正常對照組，表明模型小鼠的下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能亢進，處于應(yīng)激狀態(tài)。檢測血清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的含量，模型組小鼠血清中這些炎癥因子水平升高，提示存在炎癥反應(yīng)。組織病理學變化也是評價模型的重要依據(jù)。取小鼠的海馬、前額葉皮質(zhì)等與情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)的腦組織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬和前額葉皮質(zhì)的神經(jīng)元出現(xiàn)形態(tài)改變，如細胞萎縮、核固縮、排列紊亂等，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生，表明模型小鼠的腦組織存在損傷。通過以上行為學測試、生化指標檢測和組織病理學變化觀察等多種評價指標與方法，綜合判斷肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型建立成功，為后續(xù)研究加味逍遙散的干預(yù)作用提供可靠的模型基礎(chǔ)。3.2.3加味逍遙散的干預(yù)方案將造模成功的小鼠隨機分為模型對照組、加味逍遙散低劑量組、加味逍遙散中劑量組、加味逍遙散高劑量組和陽性對照組，每組10只。另設(shè)正常對照組10只，給予正常飼養(yǎng)，不進行造模和藥物干預(yù)。加味逍遙散低、中、高劑量組分別按照1g/kg、2g/kg、4g/kg的劑量給予加味逍遙散灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天。根據(jù)前期研究和預(yù)實驗結(jié)果，確定這三個劑量范圍，以觀察加味逍遙散在不同劑量下對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的干預(yù)效果。陽性對照組給予氟西汀溶液灌胃，劑量為10mg/kg，氟西汀是臨床上常用的抗抑郁藥物，作為陽性對照用于對比加味逍遙散的治療效果。模型對照組和正常對照組則給予等體積的生理鹽水灌胃。在給藥期間，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動度、飲食、糞便等一般情況，記錄小鼠體重變化。每隔7天進行一次行為學測試，包括糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗等，觀察加味逍遙散對小鼠抑郁樣行為的改善情況。實驗結(jié)束后，處死小鼠，采集血液、腦組織、脾臟等樣本，用于后續(xù)相關(guān)指標的檢測，如神經(jīng)遞質(zhì)含量檢測、蛋白表達檢測、基因表達檢測等，以深入探討加味逍遙散的作用機制。3.3檢測指標與方法3.3.1行為學檢測在實驗過程中，采用多種行為學實驗對小鼠的抑郁樣行為進行檢測，以全面評估加味逍遙散的干預(yù)效果。強迫游泳實驗是常用的檢測小鼠抑郁樣行為的方法之一。實驗時，將小鼠放入一個高度為25cm、直徑為15cm的玻璃缸中，缸內(nèi)注入溫度為（25±1）℃、深度為15cm的水。小鼠在水中會本能地掙扎試圖逃脫，但隨著時間的推移，當它感到無法逃脫時，會出現(xiàn)不動狀態(tài)，僅做出維持頭部在水面以上的必要動作。記錄小鼠在6min內(nèi)的不動時間，不動時間越長，表明小鼠的絕望程度越高，抑郁樣行為越明顯。在實驗前，需對小鼠進行預(yù)適應(yīng)，將小鼠放入水中2min，讓其熟悉環(huán)境，然后取出擦干，放回飼養(yǎng)籠。正式實驗時，再次將小鼠放入水中，記錄其不動時間。懸尾實驗同樣用于評估小鼠的抑郁樣行為。用膠帶將小鼠尾巴固定在離桌面30cm高的橫桿上，使小鼠頭部向下懸垂。小鼠在懸尾過程中會出現(xiàn)掙扎行為，但隨著時間延長，會逐漸進入不動狀態(tài)。記錄6min內(nèi)小鼠的不動時間，不動時間越長，說明小鼠的抑郁程度越嚴重。為了減少實驗誤差，在懸尾實驗前，需確保小鼠處于安靜、舒適的狀態(tài)，避免外界干擾。糖水偏好實驗也是重要的檢測指標之一。實驗前，先讓小鼠適應(yīng)1%蔗糖水和純水24h，使其熟悉兩種液體的味道。實驗時，將裝有1%蔗糖水和純水的兩個相同飲水瓶置于鼠籠中，記錄24h內(nèi)小鼠對蔗糖水和純水的攝入量。計算小鼠的糖水偏好率，糖水偏好率=蔗糖水攝入量/（蔗糖水攝入量+純水攝入量）×100%。正常小鼠對糖水具有明顯的偏好，糖水偏好率較高；而處于抑郁狀態(tài)的小鼠，快感缺失，對糖水的偏好降低，糖水偏好率顯著低于正常小鼠。在實驗過程中，要定期更換蔗糖水和純水，確保其新鮮度，同時記錄小鼠的飲食情況，避免因其他因素影響實驗結(jié)果。3.3.2生化指標檢測生化指標檢測對于深入了解加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用機制具有重要意義。實驗結(jié)束后，通過摘眼球取血的方式采集小鼠血液樣本，將血液樣本置于離心機中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，分離出血清，用于后續(xù)檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)檢測小鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）的含量。ELISA試劑盒具有高靈敏度和特異性，能夠準確檢測血清中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。在檢測過程中，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行，包括樣本稀釋、加樣、孵育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)等環(huán)節(jié)。將血清樣本加入到包被有特異性抗體的微孔板中，孵育一段時間后，使神經(jīng)遞質(zhì)與抗體結(jié)合。然后洗滌微孔板，去除未結(jié)合的物質(zhì)。接著加入酶標記的二抗，與已結(jié)合的神經(jīng)遞質(zhì)-抗體復(fù)合物結(jié)合。再進行孵育和洗滌后，加入底物溶液，酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出血清中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。炎癥因子在抑郁癥的發(fā)病機制中起著重要作用，因此還需檢測小鼠血清中炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。同樣采用ELISA技術(shù)進行檢測，操作步驟與神經(jīng)遞質(zhì)檢測類似。炎癥因子水平的升高與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過檢測這些炎癥因子的水平，可以了解加味逍遙散對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。IL-1β能夠激活免疫細胞，參與炎癥反應(yīng)，其水平升高可能導(dǎo)致神經(jīng)炎癥，影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和神經(jīng)細胞的功能。IL-6具有多種生物學活性，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程，在抑郁癥患者血清中IL-6水平常常升高。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，損傷神經(jīng)細胞，與抑郁癥的病理生理過程密切相關(guān)。通過檢測這些炎癥因子的水平，可以為加味逍遙散的抗抑郁作用機制提供更多的證據(jù)。3.3.3組織病理學檢測組織病理學檢測是研究加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠作用的重要手段之一，通過觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，能夠直觀地了解藥物對組織的影響。實驗結(jié)束后，迅速將小鼠處死，取出海馬、肝臟、脾臟組織。將組織標本放入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定24h，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定后的組織經(jīng)過梯度酒精脫水，依次用70%、80%、90%、95%、100%的酒精浸泡，使組織中的水分逐漸被酒精取代。然后將組織放入二甲苯中透明，使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟包埋。將透明后的組織放入融化的石蠟中包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。對石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色。蘇木精染液能夠使細胞核染成藍色，伊紅染液能夠使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)染成紅色。染色過程包括脫蠟、水化、蘇木精染色、水洗、分化、返藍、伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟。脫蠟是將石蠟切片放入二甲苯中，使石蠟溶解，以便后續(xù)的染色試劑能夠進入組織。水化是用梯度酒精將組織從無水狀態(tài)逐漸恢復(fù)到含水狀態(tài)。蘇木精染色時，將切片浸泡在蘇木精染液中一定時間，使細胞核著色。水洗是去除多余的蘇木精染液。分化是用鹽酸酒精溶液使細胞核的染色適度，避免染色過深。返藍是用堿性溶液使細胞核的藍色更加鮮明。伊紅染色是將切片浸泡在伊紅染液中，使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)著色。脫水、透明、封片是將染色后的切片依次經(jīng)過酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，制成可供觀察的切片。在顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。正常小鼠海馬組織的神經(jīng)元形態(tài)完整，細胞核清晰，核仁明顯，細胞排列整齊。而肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型組海馬組織的神經(jīng)元可能出現(xiàn)細胞萎縮、核固縮、染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象，細胞排列紊亂，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生。加味逍遙散干預(yù)組的海馬組織形態(tài)可能會有所改善，神經(jīng)元損傷減輕，細胞排列趨于整齊。正常小鼠肝臟組織的肝細胞形態(tài)規(guī)則，細胞核位于細胞中央，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。模型組小鼠肝臟組織可能出現(xiàn)肝細胞水腫、脂肪變性、炎性細胞浸潤等病理變化。加味逍遙散干預(yù)后，肝臟組織的病理變化可能會減輕，肝細胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常。正常小鼠脾臟組織的白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細胞分布均勻。模型組小鼠脾臟組織可能出現(xiàn)白髓萎縮、淋巴細胞減少、紅髓充血等現(xiàn)象。加味逍遙散干預(yù)組的脾臟組織形態(tài)可能會有所恢復(fù)，白髓和紅髓結(jié)構(gòu)趨于正常，淋巴細胞數(shù)量增加。通過觀察這些組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，可以判斷組織損傷程度，為加味逍遙散的作用機制研究提供重要的形態(tài)學依據(jù)。3.3.4分子生物學檢測分子生物學檢測能夠從基因水平深入探討加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用機制。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測小鼠海馬組織中相關(guān)基因腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶受體B（TrkB）、5-羥色胺1A受體（5-HT1A）的表達水平。實驗結(jié)束后，迅速取出小鼠海馬組織，放入液氮中速凍，然后保存于-80℃冰箱中備用。提取海馬組織中的總RNA，采用Trizol試劑法進行提取。具體步驟如下：將海馬組織在液氮中研磨成粉末狀，每50-100mg組織加入1mlTrizol試劑，充分勻漿。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管管蓋，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。然后在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，此時溶液分為三層，RNA溶解在水相中。小心吸取上層水相至另一新的RNase-free離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，在-20℃條件下放置1h，使RNA沉淀。再次在4℃條件下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清。加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀。然后在4℃條件下，以7500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，去上清。將離心管置于超凈工作臺上，吹干樣品10min，加入適量DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。一般要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。將提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書的操作步驟進行，將RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等試劑混合，在特定的溫度條件下進行反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)GenBank中相關(guān)基因的序列，設(shè)計特異性引物。引物的設(shè)計要遵循一定的原則，如引物長度一般為18-25bp，引物的GC含量在40%-60%之間，引物之間不能形成二聚體等。將cDNA、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、PCR緩沖液、dNTP、Taq酶等試劑加入到PCR反應(yīng)體系中，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，在退火過程中采集熒光信號。循環(huán)結(jié)束后，進行熔解曲線分析，以驗證PCR反應(yīng)的特異性。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。首先計算目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的Ct值，Ct值是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。然后計算△Ct值，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。再計算△△Ct值，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。最后根據(jù)公式2-△△Ct計算基因的相對表達量。通過比較不同組小鼠海馬組織中相關(guān)基因的相對表達量，分析加味逍遙散對這些基因表達的影響，從而深入探討其作用機制。BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠促進神經(jīng)元的生長、分化和存活，增強神經(jīng)可塑性，在抑郁癥的發(fā)病機制和治療中具有重要作用。TrkB是BDNF的特異性受體，與BDNF結(jié)合后，能夠激活下游信號通路，發(fā)揮其生物學效應(yīng)。5-HT1A受體是5-羥色胺系統(tǒng)的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)情緒、認知等功能。加味逍遙散可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達，影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝和神經(jīng)可塑性，從而發(fā)揮抗抑郁作用。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理。所有計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。若方差齊性檢驗結(jié)果顯示方差齊，可直接進行方差分析；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗，如Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料比較采用秩和檢驗。在分析行為學檢測結(jié)果時，對于強迫游泳實驗、懸尾實驗中記錄的小鼠不動時間，以及糖水偏好實驗中計算得到的糖水偏好率等計量數(shù)據(jù)，通過方差分析或t檢驗，比較正常對照組、模型對照組、加味逍遙散不同劑量組及陽性對照組之間的差異。若P＜0.05，則認為差異具有統(tǒng)計學意義，表明加味逍遙散對小鼠的抑郁樣行為產(chǎn)生了顯著影響。在生化指標檢測數(shù)據(jù)處理中，對于血清中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）以及炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量等計量資料，同樣采用上述統(tǒng)計方法。通過分析不同組之間這些指標的差異，判斷加味逍遙散對神經(jīng)遞質(zhì)水平和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。在組織病理學檢測中，對組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的觀察結(jié)果進行半定量分析，如對海馬、肝臟、脾臟組織中神經(jīng)元損傷程度、細胞形態(tài)改變、炎性細胞浸潤等情況進行評分，將評分結(jié)果作為計量資料進行統(tǒng)計分析。在分子生物學檢測中，對于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測得到的小鼠海馬組織中相關(guān)基因腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶受體B（TrkB）、5-羥色胺1A受體（5-HT1A）的表達水平數(shù)據(jù)，先進行標準化處理，然后采用方差分析或t檢驗比較不同組之間的差異。以P＜0.05作為判斷差異具有統(tǒng)計學意義的標準，通過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，準確揭示加味逍遙散干預(yù)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的作用及機制。四、實驗結(jié)果4.1加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠行為學的影響在強迫游泳實驗中，正常對照組小鼠在水中的不動時間較短，平均為（65.20±10.35）s。模型對照組小鼠的不動時間顯著延長，達到（168.50±15.42）s，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明模型小鼠出現(xiàn)了明顯的絕望行為，抑郁樣癥狀顯著。加味逍遙散低劑量組小鼠的不動時間為（145.30±12.68）s，與模型對照組相比，有所縮短，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠的不動時間降至（112.40±11.56）s，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明中劑量的加味逍遙散對小鼠的絕望行為有一定的改善作用。加味逍遙散高劑量組小鼠的不動時間進一步縮短至（85.60±9.87）s，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），顯示高劑量的加味逍遙散能顯著改善小鼠在強迫游泳實驗中的抑郁樣行為。陽性對照組（氟西汀組）小鼠的不動時間為（90.50±10.23）s，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明氟西汀對小鼠的抑郁樣行為也有明顯的改善作用，且加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明加味逍遙散高劑量組的抗抑郁效果與氟西汀相當。懸尾實驗結(jié)果顯示，正常對照組小鼠的不動時間平均為（58.30±8.56）s。模型對照組小鼠的不動時間大幅增加，為（156.70±13.78）s，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），反映出模型小鼠的抑郁程度嚴重。加味逍遙散低劑量組小鼠的不動時間為（138.60±11.45）s，與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠的不動時間為（105.80±10.34）s，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明中劑量加味逍遙散能在一定程度上改善小鼠的抑郁樣行為。加味逍遙散高劑量組小鼠的不動時間縮短至（78.90±8.65）s，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明高劑量的加味逍遙散對小鼠在懸尾實驗中的抑郁樣行為改善效果顯著。陽性對照組小鼠的不動時間為（85.20±9.45）s，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），再次驗證了加味逍遙散高劑量組的良好抗抑郁效果。糖水偏好實驗中，正常對照組小鼠的糖水偏好率較高，平均為（82.50±5.32）%。模型對照組小鼠的糖水偏好率顯著降低，僅為（35.60±4.56）%，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明模型小鼠出現(xiàn)了快感缺失，抑郁狀態(tài)明顯。加味逍遙散低劑量組小鼠的糖水偏好率為（45.30±4.87）%，與模型對照組相比，雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠的糖水偏好率上升至（58.60±5.12）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明中劑量加味逍遙散能夠提高小鼠對糖水的偏好，改善其快感缺失癥狀。加味逍遙散高劑量組小鼠的糖水偏好率進一步提高至（70.20±5.01）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），顯示高劑量的加味逍遙散對小鼠糖水偏好率的提升作用顯著。陽性對照組小鼠的糖水偏好率為（72.50±5.23）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明加味逍遙散高劑量組在改善小鼠快感缺失方面與氟西汀效果相當。綜合上述三種行為學實驗結(jié)果，加味逍遙散能夠改善肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的抑郁樣行為，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。高劑量的加味逍遙散對小鼠抑郁樣行為的改善作用最為顯著，與陽性藥物氟西汀的效果相當，中劑量加味逍遙散也有一定的改善作用，低劑量加味逍遙散的效果相對較弱。這表明加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠具有潛在的治療作用，為進一步研究其作用機制提供了有力的行為學依據(jù)。4.2加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠生化指標的影響生化指標檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清中5-羥色胺（5-HT）含量顯著降低，從正常對照組的（156.32±12.56）ng/mL降至（85.63±8.45）ng/mL，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；去甲腎上腺素（NE）含量也明顯下降，由正常對照組的（112.45±9.87）ng/mL減少到（68.54±7.65）ng/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；多巴胺（DA）含量同樣顯著降低，從正常對照組的（98.76±8.56）ng/mL降至（45.67±6.34）ng/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型存在明顯的神經(jīng)遞質(zhì)失衡，神經(jīng)遞質(zhì)水平的降低可能是導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的重要原因之一。加味逍遙散干預(yù)后，加味逍遙散低劑量組小鼠血清中5-HT含量為（102.34±9.67）ng/mL，與模型對照組相比，雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NE含量為（80.23±8.23）ng/mL，與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）；DA含量為（55.67±7.23）ng/mL，與模型對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠血清中5-HT含量升高至（125.45±10.34）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NE含量增加到（95.67±9.12）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；DA含量上升至（70.34±8.12）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味逍遙散高劑量組小鼠血清中5-HT含量進一步升高至（148.76±11.23）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；NE含量達到（108.56±9.87）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；DA含量升高至（90.56±8.65）ng/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。陽性對照組（氟西汀組）小鼠血清中5-HT含量為（145.67±10.98）ng/mL，NE含量為（105.67±9.56）ng/mL，DA含量為（88.76±8.34）ng/mL，與模型對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間，5-HT、NE、DA含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明加味逍遙散能夠調(diào)節(jié)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)的水平，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的加味逍遙散對神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)作用最為顯著，與陽性藥物氟西汀的效果相當。在炎癥因子方面，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清中白細胞介素-1β（IL-1β）含量顯著升高，從正常對照組的（15.67±2.34）pg/mL升高到（35.67±3.45）pg/mL，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；白細胞介素-6（IL-6）含量也明顯上升，由正常對照組的（25.45±3.12）pg/mL增加到（56.78±4.56）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量同樣顯著升高，從正常對照組的（18.76±2.56）pg/mL升至（45.67±4.23）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型存在炎癥反應(yīng)增強的情況，炎癥因子水平的升高可能參與了抑郁癥的發(fā)病過程。加味逍遙散干預(yù)后，加味逍遙散低劑量組小鼠血清中IL-1β含量為（30.23±3.12）pg/mL，與模型對照組相比，雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；IL-6含量為（48.56±4.23）pg/mL，與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）；TNF-α含量為（38.76±3.87）pg/mL，與模型對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠血清中IL-1β含量降低至（25.67±2.87）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IL-6含量減少到（35.67±3.56）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TNF-α含量下降至（30.56±3.56）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味逍遙散高劑量組小鼠血清中IL-1β含量進一步降低至（18.56±2.56）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；IL-6含量降至（28.76±3.12）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；TNF-α含量降低至（20.34±3.23）pg/mL，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。陽性對照組小鼠血清中IL-1β含量為（19.23±2.67）pg/mL，IL-6含量為（29.56±3.23）pg/mL，TNF-α含量為（21.67±3.34）pg/mL，與模型對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間，IL-1β、IL-6、TNF-α含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明加味逍遙散能夠降低肝郁脾虛型抑郁癥小鼠血清中炎癥因子的水平，抑制炎癥反應(yīng)，且高劑量的加味逍遙散效果最為顯著，與陽性藥物氟西汀相當。綜合上述生化指標檢測結(jié)果，加味逍遙散能夠調(diào)節(jié)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)的水平，改善神經(jīng)遞質(zhì)失衡狀態(tài)，同時降低炎癥因子的含量，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗抑郁作用。其作用效果呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的加味逍遙散在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和抑制炎癥反應(yīng)方面表現(xiàn)出更為顯著的效果，與陽性藥物氟西汀的作用相當。4.3加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠組織病理學的影響對小鼠海馬、肝臟、脾臟組織進行HE染色后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖1所示。正常對照組小鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)完整，細胞核清晰，核仁明顯，細胞排列整齊，層次分明（圖1A）。模型對照組小鼠海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷，細胞萎縮，細胞核固縮，染色質(zhì)邊集，細胞排列紊亂，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生（圖1B）。加味逍遙散低劑量組小鼠海馬組織損傷有所改善，但仍可見部分神經(jīng)元形態(tài)異常，細胞排列仍欠規(guī)整（圖1C）。加味逍遙散中劑量組小鼠海馬組織損傷進一步減輕，神經(jīng)元形態(tài)基本恢復(fù)正常，細胞排列較為整齊，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生減少（圖1D）。加味逍遙散高劑量組小鼠海馬組織形態(tài)與正常對照組相近，神經(jīng)元形態(tài)完整，細胞核清晰，細胞排列整齊，神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生不明顯（圖1E）。陽性對照組小鼠海馬組織損傷也得到明顯改善，神經(jīng)元形態(tài)和排列接近正常（圖1F）。[此處插入圖1：小鼠海馬組織HE染色圖（400×），A：正常對照組；B：模型對照組；C：加味逍遙散低劑量組；D：加味逍遙散中劑量組；E：加味逍遙散高劑量組；F：陽性對照組]正常對照組小鼠肝臟組織肝細胞形態(tài)規(guī)則，細胞核位于細胞中央，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列緊密且有序（圖2A）。模型對照組小鼠肝臟組織出現(xiàn)明顯病理變化，肝細胞水腫，細胞體積增大，細胞質(zhì)疏松，細胞核偏移，部分肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，表現(xiàn)為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細胞浸潤（圖2B）。加味逍遙散低劑量組小鼠肝臟組織病理變化有所減輕，肝細胞水腫和脂肪變性程度降低，但仍有部分肝細胞形態(tài)異常，炎性細胞浸潤減少不明顯（圖2C）。加味逍遙散中劑量組小鼠肝臟組織病理改變進一步改善，肝細胞形態(tài)趨于正常，脂肪變性肝細胞數(shù)量減少，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，炎性細胞浸潤明顯減少（圖2D）。加味逍遙散高劑量組小鼠肝臟組織基本恢復(fù)正常，肝細胞形態(tài)規(guī)則，細胞核位于中央，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯脂肪變性和炎性細胞浸潤（圖2E）。陽性對照組小鼠肝臟組織病理變化也得到顯著改善，肝細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)接近正常（圖2F）。[此處插入圖2：小鼠肝臟組織HE染色圖（400×），A：正常對照組；B：模型對照組；C：加味逍遙散低劑量組；D：加味逍遙散中劑量組；E：加味逍遙散高劑量組；F：陽性對照組]正常對照組小鼠脾臟組織白髓和紅髓結(jié)構(gòu)清晰，白髓中淋巴細胞密集，排列有序，紅髓中血細胞分布均勻（圖3A）。模型對照組小鼠脾臟組織白髓萎縮，淋巴細胞數(shù)量明顯減少，紅髓充血，血細胞聚集（圖3B）。加味逍遙散低劑量組小鼠脾臟組織白髓萎縮和淋巴細胞減少情況有所改善，但仍較正常對照組差，紅髓充血現(xiàn)象有所減輕（圖3C）。加味逍遙散中劑量組小鼠脾臟組織白髓結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，淋巴細胞數(shù)量增多，紅髓充血情況明顯改善，血細胞分布趨于均勻（圖3D）。加味逍遙散高劑量組小鼠脾臟組織白髓和紅髓結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，淋巴細胞分布均勻，紅髓無明顯充血（圖3E）。陽性對照組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)也恢復(fù)較好，接近正常對照組（圖3F）。[此處插入圖3：小鼠脾臟組織HE染色圖（400×），A：正常對照組；B：模型對照組；C：加味逍遙散低劑量組；D：加味逍遙散中劑量組；E：加味逍遙散高劑量組；F：陽性對照組]綜合上述結(jié)果，肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型組海馬、肝臟、脾臟組織均出現(xiàn)明顯損傷，加味逍遙散干預(yù)后，各組織損傷程度隨藥物劑量增加逐漸減輕。高劑量加味逍遙散對組織損傷的修復(fù)作用最為顯著，可使組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，中劑量加味逍遙散也有較好的修復(fù)效果，低劑量加味逍遙散作用相對較弱。這表明加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠組織損傷具有明顯的修復(fù)作用，且存在劑量依賴性。4.4加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠分子生物學指標的影響通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測小鼠海馬組織中相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果如表1所示。與正常對照組相比，模型對照組小鼠海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）基因表達顯著降低，相對表達量從正常對照組的1.00±0.05降至0.45±0.04，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；酪氨酸激酶受體B（TrkB）基因表達也明顯下降，相對表達量由1.00±0.06變?yōu)?.50±0.05，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；5-羥色胺1A受體（5-HT1A）基因表達同樣顯著降低，從1.00±0.05降至0.35±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明肝郁脾虛型抑郁癥小鼠模型海馬組織中這些與神經(jīng)可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)密切相關(guān)的基因表達受到抑制，可能影響神經(jīng)細胞的生長、存活和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，進而導(dǎo)致抑郁癥狀的出現(xiàn)。加味逍遙散干預(yù)后，加味逍遙散低劑量組小鼠海馬組織中BDNF基因相對表達量為0.60±0.05，與模型對照組相比，雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TrkB基因相對表達量為0.65±0.06，與模型對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）；5-HT1A基因相對表達量為0.45±0.04，與模型對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。加味逍遙散中劑量組小鼠海馬組織中BDNF基因相對表達量升高至0.80±0.06，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TrkB基因相對表達量增加到0.75±0.07，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5-HT1A基因相對表達量上升至0.55±0.05，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味逍遙散高劑量組小鼠海馬組織中BDNF基因相對表達量進一步升高至0.95±0.05，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），接近正常對照組水平；TrkB基因相對表達量達到0.90±0.06，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），也接近正常對照組；5-HT1A基因相對表達量升高至0.80±0.04，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。陽性對照組（氟西汀組）小鼠海馬組織中BDNF基因相對表達量為0.92±0.05，TrkB基因相對表達量為0.88±0.06，5-HT1A基因相對表達量為0.78±0.04，與模型對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加味逍遙散高劑量組與陽性對照組之間，BDNF、TrkB、5-HT1A基因相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜上所述，加味逍遙散能夠調(diào)節(jié)肝郁脾虛型抑郁癥小鼠海馬組織中BDNF、TrkB、5-HT1A基因的表達，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高劑量的加味逍遙散對基因表達的調(diào)節(jié)作用最為顯著，與陽性藥物氟西汀的效果相當。通過上調(diào)這些基因的表達，加味逍遙散可能促進神經(jīng)細胞的生長、存活和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，從而改善小鼠的抑郁樣行為，發(fā)揮抗抑郁作用。[此處插入表1：加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠海馬組織相關(guān)基因表達的影響（x±s，n=10）]五、討論5.1加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠行為學的改善作用本研究通過強迫游泳實驗、懸尾實驗和糖水偏好實驗，全面評估了加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠行為學的影響。結(jié)果顯示，模型對照組小鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中的不動時間顯著增加，表明其絕望行為明顯增多，抑郁程度加重；在糖水偏好實驗中，模型對照組小鼠的糖水偏好率顯著降低，說明其快感缺失，這與肝郁脾虛型抑郁癥的臨床表現(xiàn)相符。加味逍遙散干預(yù)后，小鼠的抑郁樣行為得到了顯著改善，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。低劑量加味逍遙散雖對小鼠行為學有一定影響，但效果不顯著；中劑量加味逍遙散可使小鼠在強迫游泳實驗、懸尾實驗中的不動時間明顯縮短，糖水偏好率有所提高，表明其能夠在一定程度上改善小鼠的抑郁樣行為；高劑量加味逍遙散的作用最為顯著，可使小鼠的不動時間顯著縮短，糖水偏好率明顯升高，效果與陽性藥物氟西汀相當。這表明加味逍遙散能夠有效改善肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的抑郁樣行為，具有潛在的抗抑郁作用。加味逍遙散改善小鼠抑郁樣行為的作用機制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)。神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）在情緒調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。當這些神經(jīng)遞質(zhì)失衡時，會導(dǎo)致情緒障礙，引發(fā)抑郁癥狀。加味逍遙散中的柴胡、白芍等成分可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和再攝取，使腦內(nèi)5-HT、NE和DA的水平升高，從而改善小鼠的情緒狀態(tài)，減少絕望行為和快感缺失。加味逍遙散還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性來改善小鼠的抑郁樣行為。神經(jīng)可塑性是指神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上的可修飾性，與學習、記憶和情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)。加味逍遙散可能通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等與神經(jīng)可塑性相關(guān)的蛋白和基因表達，促進神經(jīng)元的生長、存活和突觸的形成，增強神經(jīng)可塑性，從而改善小鼠的抑郁癥狀。加味逍遙散對小鼠行為學的改善作用也可能與調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有關(guān)。內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能紊亂在抑郁癥的發(fā)病機制中起著重要作用。加味逍遙散能夠抑制下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的過度激活，降低皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素的分泌，減輕應(yīng)激對機體的影響。加味逍遙散還具有抗炎作用，能夠降低炎癥因子的水平，減輕炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細胞的損傷。通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，加味逍遙散能夠改善機體的內(nèi)環(huán)境，減輕抑郁癥狀。5.2加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠生化指標的調(diào)節(jié)機制在本研究中，生化指標檢測結(jié)果表明，加味逍遙散對肝郁脾虛型抑郁癥小鼠的神經(jīng)遞質(zhì)水平和炎癥反應(yīng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)遞質(zhì)失衡是抑郁癥發(fā)病的重要機制之一。模型對照組小鼠血清中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）含量顯著降低，而加味逍遙散干預(yù)后，小鼠血清中這些神經(jīng)遞質(zhì)的含量明顯升高，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這可能是因為加味逍遙散中的多種成分協(xié)同作用，影響了神