由致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary)引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產中最重要的病害，其危害性、防治難度及對其社會造成的影響已超過了水稻稻瘟病及小麥銹病，被視為國際第一大作物病害。為了更有效地利用微生物源活性物質控制馬鈴薯晚疫病，在本實驗室前期已明確梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)與白菜黑斑病菌 礎上，對這兩種真菌進行混合發酵的可行性、混合發酵條件及發酵產物中抑菌活性的穩定性方面進行了初步研究，以期為生產中利用這種抗菌物質控制馬鈴薯晚疫病提供理論取得了如下主要結果：1通過對峙培養明確了對致病疫霉有顯著拮抗作用的兩種拮抗菌(梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌)之間無拮抗或抑制作用，在同一平板上可生長至完全融為一體，其最適生長條件基本一致，兩者可以進行混合發酵。2對兩種拮抗菌的混合發酵條件進行了優化測試，初步確定了最適的混合發酵條件為：培養基初始pH為6.29,在25℃、黑暗中靜置培養4d。3明確了混合發酵液不同濃度的抑菌效果。在最適發酵條件下所得發酵液的濃度為7mg/mL時，對致病疫霉的抑制率為92.15%,高于兩者單獨發酵后再以10mg/mL的濃度等體積混合后的抑菌率(89.8%),表明兩種拮抗菌混合發酵可能產生了協同或增效作用，因而可有效地提高發酵液的抑菌活性。4測定了不同溫度和pH值對混合發酵液中抑菌物質活性的影響，混合發酵液經不同溫度處理后，與未經高溫處理的對照相比，隨處理溫度升高對致病疫霉的抑菌活性逐漸下降，但下降幅度不大，在121℃高溫處理下抑菌率仍能達到66.78%,可保留73%的抑菌活性；混合發酵液經不同pH處理后，抑菌活性也均低于對照，在pH2時抑菌率最低為68.67%,仍保留75.5%的活性，且不同pH值之間抑菌活性的差別不大。表明混合發酵液中的抗菌物質具有很強的熱穩定性和較強的耐強酸、強堿性。5初步研究了復合發酵液對致病疫霉的抑制機理，經復合發酵液處理后發現致病疫霉菌絲出現內含物聚集、變粗或變細等不正常現象；經處理后的致病疫霉菌絲體中可工Ⅱ溶性蛋白含量低于對照，表明復合發酵液有可能抑制致病疫霉菌體中蛋白質的合成。關鍵詞致病疫霉梨黑斑病菌白菜黑斑病菌混合發酵拮抗物質ⅢPotatolateblightcausedbyPhytophthorainfestans(Mont.)deBaryisoneofdiseasesincethedamagesandlosselaboratoryshowedthatbothfermentationsofAlternariakikuchianahadsignificantsuppressionsongrowthofP.infestans.Andtheinhibitionrateoffermentationtogetheras1:1ratiofrwashigherthatofsinglefermentation.Inordertomakactivesubstancesfromabovementioncompoundfermentationoftwospeciesoffungiandstabilityofantagonisticompoundfermentationfilterwereinvestigatedbasedonformerexper(1)Itwasdefinitethattherewasnoantagonisticordepressidualculturemethod,andtheycouldgrowtogethercompletelyonPDAmedium.compoundfermentationof(2)Theconditionsofcompoundfermentationoftwofungiweretestedandoptimized.(3)TohavemadeitclearthatrepresconcentrationsonP.infestans.Theinhibitionrateofcompoundfermentationwas92.15concentration7mg/mLatoptimizedconditions,whichwasmuchbetterthanthat(89.8%)offermentationoftwofungi.Itindicatedthatcompoundfermentatproducesomecooperationorsynergism,whichresultedinmoreeff(4)Theeffectsoftemperaturesancompoundfermentatiocontrol,theinhibitioneffectofallcompoundfermentationsaftertreatmentwithtemperaturedecreasedinsomedegree,buttcouldreach66.78%,whichsuggesttedthatitcouldstillTheinhibitioneffectofcompoundfermentationtreatmentedwithdifferentpHvaluesalsodisplayeddescendingphenomena,however,theinhibitio68.67%,thatindicatedactivityof75.5%stillconserved.TheseresultswereinvestigatedbymorphologicalobservationofmycelialandproteincontentmeasThephenomenaofprotoplastaggregationorgatheringtogether,mycelialthickeningorthining,wereonlyfoundinmycelialtreatedwithcompoundfermentation.Anproteincontentinmycelialtreatedwaslowerthanthatofuntreatedmycelial.ItmanifestedbiosynthesisintreatedmyceKeywordsPhytophthorainfestansA.kikuchianaA.brassicaemixedfermentationV 1 1 1 2 3 3 41.2.2化學防治 4 5 6 61.3.2研究現狀 7 8 8第2章兩種致病疫霉拮抗菌混合發酵及條件優化 9 92.1.1供試菌種 92.1.2培養基 92.1.3試劑 9 2.2實驗方法 2.2.4培養時間 12.2.5初始pH值 2.2.6培養溫度 12.2.7振蕩或靜置 12.2.8光照或黑暗 12.2.9混合發酵液不同濃度的抑制效果 12.3結果與分析 2.3.1兩種真菌共培養的確定 2.3.2培養時間對混合發酵液抑菌活性的影響 2.3.3培養基初始pH的確定 2.3.4培養溫度的確定 2.3.5振蕩或靜置對的抑菌活性影響 2.3.6光照或黑暗條件的確定 2.3.7混合發酵液最適抑菌濃度的確定 2.4討論 第3章混合發酵液中抑菌物質對環境的穩定性及抑菌機理 3.1實驗材料 213.1.1供試菌種 213.1.2培養基、試劑及實驗儀器 213.2實驗方法 213.2.1抗菌物質對溫度的敏感性測定 213.2.2抗菌物質對pH值的適應范圍 213.2.3混合發酵液抑制菌絲生長的顯微觀察 213.2.4混合發酵液對菌體中可溶性蛋白含量的影響 223.3結果與分析 233.3.1不同溫度對抗菌物質活性的影響 233.3.2不同pH對抗菌物質活性的影響 3.3.3對菌絲形態的影響 243.3.4混合酵液對菌體中可溶性蛋白含量的影響 24 2 2參考文獻 28 41作者發表論文情況 42第1章前言1物，是一種富含Vc,低脂肪低熱量的糧食和蔬菜兼用作物，營養豐富。其已成為世界為食品，全脂奶粉和馬鈴薯就可以提供人體所需的一切營養”百多年的歷史。主要在我國的東北、內蒙、華北和云貴等氣候較涼的地區種植，現在我國馬鈴薯種植面積居世界第二位。馬鈴薯產量高，營養豐富，對環境的適應性較強，現已遍布世界各地，熱帶和亞熱帶國家甚至在冬季或涼爽季節也可栽培并獲得較高產量。中國已成為馬鈴薯栽培面積最大的國家，至2005年已達到488.09萬公頃3]。在造紙、紡織、食品、醫藥、化工、鑄造、農業等多個領域，馬鈴薯淀粉及其衍生物被廣泛地應用，具有很高的經濟價值。但馬鈴薯在生產過程中經常遭受許多真菌病害的威脅，其中由致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary)引起的馬鈴薯晚疫病是危害全球馬鈴薯生產的嚴重的具有毀滅性的病害，對馬鈴薯的生產造成極大威脅。馬鈴薯晚疫病起源于墨西哥，19世紀傳入歐洲大陸。1845~1846年，歐洲曾因晚疫病的大流行而發生嚴重的饑荒，造成100萬人死亡，100萬人逃荒。在我國每年因晚疫病造成的經濟損失高達80億人民幣[4]。1950年馬鈴薯晚疫病在我國的大爆發使得“晉、察、綏”主要產區薯塊損失達50%,隨后幾年在黑龍江、內蒙古、甘肅等省嚴重流行[5。20世紀80年代后，致病疫霉A2交配型的出現和卵孢子的產生使得該菌變異性、適應性加強，生理小種組成日趨復雜，導致馬鈴薯晚疫病在世界各地再度猖獗流行[6]。晚疫病造成的危害性、防治難度及對社會影響已超過了水稻稻瘟病和小麥銹病被視為國際第一大作物病害7。國際馬鈴薯中心(InternationalPotatoCenter,簡稱CIP)于1992年將晚疫病列為CIP優先研究目標，并在1996年成立了國際馬鈴薯晚疫病研究協作網，以期能夠減少馬鈴薯晚疫病帶來的損失。2馬鈴薯晚疫病的病原菌為致病疫霉(Phytophthorainfestans(Mont.)deBary),主要侵害葉、莖和薯塊。葉片染病先在葉尖或葉緣生水浸狀綠褐色斑點，病斑周圍具淺綠色暈圈，濕度大時病斑迅速擴大，呈褐色，并產生一圈白霉，即孢囊梗和孢子囊，尤以葉背最為明顯；莖部或葉柄染病現褐色條斑。發病嚴重的葉片萎垂、卷縮，終致全株黑腐，全田一片枯焦，散發出腐敗氣味。塊莖染病初生褐色或紫褐色大塊病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周擴大或爛掉。第1章前言3馬鈴薯晚疫病為真菌類病害，病原為致病疫霉(P.infestans)屬鞭毛菌亞門(Mastigo-mycotina),卵菌綱(Oomycetes)真菌。致病疫霉屬于兼性寄生或半活體營養型致病菌，是一種強寄生菌。其菌絲不具有隔膜，在寄主細胞間擴展，依靠不發達的絲狀吸胞侵入寄主細胞[8]。病菌主要以菌絲體在薯塊中越冬。播種帶苗薯塊，導致不發芽或發芽后出土即死去，有的出土后成為中心病株，病部產生孢子囊借氣流傳播進行再侵染，形成發病中心，致該病出點到面，迅速蔓延擴大。病葉上的孢子囊還可隨雨水或灌溉水滲入土中侵染薯塊，形成病薯，成為翌年主要侵染源。病菌喜日暖夜涼高濕條件，相對濕度95%以上、18—22℃條件下，有利于孢子囊的形成。因此多雨年份，空氣潮濕或溫暖多霧條件下發病重。風風雨傳播再侵染孢子囊風風雨傳播病薯菌絲潛伏在1.2馬鈴薯晚疫病的防治隨著人類對環境保護、農業可持續發展以及綠色食品生產的要求越來越高，近幾年生物防治在農業生產上愈來愈廣泛地被重視。進入20世紀80年代以來，由于病原物生理小種的變異加速，導致原有栽培品種抗性逐漸喪失，晚疫病防治工作的開展舉步維艱。1996年國際馬鈴薯中心召集成立了GILB,即“全球馬鈴薯晚疫病防治倡議組織”,同時將馬鈴薯晚疫病的研究列為優先研究項目9]。聯合國也充分肯定了馬鈴薯在世界糧食生產中上的重要作用，并確定2008年為“國際馬鈴薯年”[10]。迄今為止，馬鈴薯晚療病的防治方法主要以選育抗病品種和化學防治為主。4常規的雜交育種方法仍然是當前我國馬鈴薯育種的主要方法，但已由單純的品種間雜交轉向為種間雜交。馬鈴薯多為同源四倍體，表現為高度的遺傳雜合性，因而選育具有多個農藝性狀優良的品種十分困難，一般都需要較長的年限，使其利用受到一定程度的局限。同時，國內也有一些學者相繼開展了生物技術育種方面的探索，將轉基因技術應用于其中，并已得到了分別表達HarpinEa蛋白基因!、Osmotin蛋白基因[12]、葡萄糖氧化酶基因[13及病原物無毒基因14的馬鈴薯抗晚疫病轉基因植株，但這些研究尚停留于實驗室階段。而且，轉基因技術自身仍然存在諸多有待進一步解決的問題，如轉基因植株的再生問題等；作為植物抗病基因工程理論基礎的分子生物學和分子植物病理學的發展滯后，導致可被利用于抗病基因工程的抗病基因數目較少，且對真核生物體內基因表達調控規律的研究仍有大量問題需要闡明。這些問題的存在無疑在很大程度上限制了植物抗病基因工程的發展15]。目前選用的抗病品種有克新4號品種、高原7號、青薯2號化學藥劑防治是預防馬鈴薯晚疫病的有效手段，也是廣泛采用的措施之一，在馬鈴薯晚疫病防治中占主要位置[17。防治馬鈴薯晚疫病的藥劑主要有甲霜靈錳鋅、瑞毒霉、殺毒礬、薯瘟消、抑快凈等，可根據情況選用。但實踐證明由于化學農藥的大量使用，尤其是作用位點單一的單一藥劑的大力推廣，造成嚴重的環境污染和導致病原菌產生抗藥性，已有報道表明變異小種對防治晚疫病的特效殺菌劑甲霜靈[18、瑞毒霉[19產生了抗性；現在對病原菌的遺傳分析也證明了致病疫霉的群體結構發生了巨大變化。在20世紀70年代以前，僅存在單一的一個基因型US-1或PO-1,這個基因型的病菌都是A1交配型，對甲霜靈敏感，但目前在歐洲大部分地區、東亞、南美和北美等地都是新的基因型占主導地位，新的基因型包含了大量的A2交配型并且對甲霜靈不敏感[20],這使得篩選、研制有效的殺菌劑復配制劑成為目前解決抗藥性問題的途徑之一，如58%雷多米爾-錳鋅可濕性粉劑按用種量0.3%拌種薯塊，對馬鈴薯晚疫病防治效果較好，平均防效為81.3%,增產顯著(增產率為23.2%),減輕了田間馬鈴薯晚疫病的發生與蔓延2。然而化學藥劑對環境的污染和生態平衡的破壞，引起了人們的廣泛關注。同時，由刁第1章前言5致病疫霉是一種非常容易變異的病原菌，在化學藥劑所造成的強大選擇壓力下，往往會形成新的抗藥性的生理小種，這使得尋求更加有效、安全的生物防治方法勢在必行。隨著人類對環境保護、農業可持續發展以及綠色食品生產的要求越來越高，近幾年生物防治在農業生產上愈來愈廣泛地被重視。用化學農藥來對付植物病蟲害，多年來已積累了豐富的經驗，但生態環境的污染和破壞也使人們付出了沉痛的代價，同時食品中的農藥殘留又直接危害人們的健康。生物農藥相對于化學農藥主要有以下幾個方面的優勢：第一，活性高，選擇性強，對非靶標生物相對安全；第二，高效，低殘留，常常能迅速分解，對環境安全；第三，不易產生抗藥性；第四，種類繁多，研發、利用途徑多；第五，作為病蟲綜合防治項目其安全性有效性成為目前的研究熱點。生物防治的主要方法包括利用外源物質誘導植物產生抗性的生物誘抗劑方法和利用有益微生物對病原菌拮抗作用的生物殺菌劑方法兩利用植物誘導抗病性激活植物天然防御機制來防治植物病害已經成為新的研究的熱點[24]。植物抗病誘導是一個很有前途的領域，許多因子都能誘導植物的抗病彩棉[27、馬鈴薯28產生抗病性。Doke等[29用P.infenstans的提取物HWC誘導處理植株上的葉片或離體葉片均使其表現出對晚疫病的顯著抗性。Cohen等[301991年用花生四烯酸、亞麻酸、油酸、二十碳五烯酸和亞油酸等五種不飽和脂肪酸作為激發子誘導馬鈴薯，結果表明上述五種不飽和脂肪酸都可作為誘導馬鈴薯抗晚疫病的有效激發子。其中，花生四烯酸和二十碳五烯酸噴灑植物葉片效果最顯著,誘抗率可達到90%以上，這種抗性至少可以維持12d.Cohen3]等1993年利用茉莉酸及其甲脂處理馬鈴薯，結果表明：茉莉酸能誘導馬鈴薯對P.infestans產生系統抗性和局部抗性。在自然界中很多植物能夠產生殺蟲或抑菌的次生代謝產物，中國傳統的中藥具有許多治病保健功效，也可能作為一種潛在的生物源殺菌劑。20世紀70年代以來，國內56很多學者在這方面進行了探索，并取得了很大進展[32]。對于防治馬鈴薯晚疫病領域的研究，國內學者已逐漸開展了研究并取得了一些成果。Wilkins等報道有1389種植物可能作為殺菌劑，植物中的抗毒素、類黃酮、有機酸以及酚類化合物等均具有殺菌或抑菌活性。毛竹提取物、絲瓜傷流液等都具有抑菌活性33。由蓽撥(PiperlongumL.)果實中提取并純化得到的生物堿pipernonaline也顯示志等發現洋蔥浸出液中的某些水溶性成分，對致病疫霉游動孢子萌發、附著胞形成具有明顯的抑制作用[35,并隨后研究發現，大蒜、丁香等植物離體組織及其提取物對馬鈴薯晚疫病病菌靜止孢萌發、附著孢形成也具有強烈的抑制作用[36,曹克強等[37的研究也發現生物潔凈劑和大蒜提取物對致病疫霉孢子萌發具有最好的抑制作用。隨著提取物濃度的提高，抑制效果也相應提高直到抑制率100%。自然界中有著及其豐富的微生物資源，從微生物代謝產物中開發抗馬鈴薯晚疫病的新型生物農藥已成為研究熱點之一。一些細菌的發酵液、葉圍和根圍真菌對致病疫霉表現出了直接的抑制作用[38。Fakhouri等從熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株G308發酵液中分離到一種新的抗生素N-mercapto-4-formylcarbostyril(Cbs),可在體外抑制Pinfestans的孢子萌發及菌絲生長39。蔣繼志等研究了8種真菌發酵液對致病疫霉的抑制作用，結果表明立枯絲核菌發酵液對其的抑制作用最強，其發酵原液對致病疫生物防治是一門方興未艾的科學，雖然還存在很多局限性，如：見效慢，生物制劑不易成批生產，使用效果不及化學農藥那樣簡便和穩定等等，有待于更進一步地研究和開發。但隨著環境問題的日趨嚴重，減少甚至廢棄有害農藥，用生物方法取代化學方法防治害蟲是農業發展的必然趨勢。生態平衡得以維持和發展41]。許多重要的生化過程靠單種微生物是不能完成或只能微弱用朝著出現有益效果的方向發展，從而完成這一優化的生化過程。因此，復合微生物制7復合微生物制劑是由兩種或多種微生物按合適比例共同培養，充分發揮群體的聯合作用優勢，取得最佳應用效果的一種微生物制劑。復合微生物在保和醫藥領域中都有廣泛的應用。發病率降低50%,每頭豬可節約藥費4元。倪永珍等44對雞進行400d的EM飼喂結果表明，與對照組比較雞的死亡率平均下降了35.5%。據石專林45報道，在飼糧中添加5%的EM稀釋液組的仔雞，只均重比對照組增加155g。美國哥斯達黎加大學應用EM技術來種植香蕉，有效減小了香蕉葉斑病的發生和線蟲類的侵襲，大大提Murray?0對Bacteroidescellulosolvens和Clostridiumsac-charolyticum混合培養分解纖維素進行研究發現，前者分解纖維素為后者提供生的有毒中間產物，消除對前者分解纖維素的反饋抑制。Mori?]認為ClostridiumThermohydro-sulfuriumYM3和C.thermocellumYM4混合培養降解纖維素效果明顯高于單菌培養。Centorbi等[52指出當把Pseudomonas和Clostridiumargentinense一起共同發酵生產的神經毒素比Clostridiumargentinense單獨發酵時高。8微生物混合發酵可以代替許多情況下單菌發酵所不能進行的生產，在生產實踐上獲得廣泛的應用。這主要是由于多菌發酵是一個生物混合體系，體系中的微生物之間大多具有生長代謝協調作用55。但是，從報道的文獻來看，在該方向上的研究目前還局限在生產的發酵工藝的初步優化階段，在菌與菌之間的具體共生協作機理方面還研究得較少，對于實踐缺乏有效的理論指導。但是我們相信隨著菌與菌之間的細胞生物學、生物化學與分子生物學、分子免疫學等各方面研究的不斷深人，人們將會更充分的了解有關微生物的具體特性，通過調節各種條件發揮其混合效應，從而深入挖掘混合發酵的巨大應用潛力。此外，由于微生物混合發酵可以充分利用自然界中大量纖維素資源并改善生態環境，所以它對于實施生態資源的可持續發展戰略也具有重要的實際意義。1.4本研究的目的及意義目前，對馬鈴薯晚疫病的生物防治主要利用拮抗或誘導等方法，其中拮抗試驗多使用單一菌體進行抑菌作用的探討，而把兩種或兩種以上拮抗微生物進行混合發酵，在抑 霉的拮抗效果明顯優于其單獨發酵液的基礎上[56,對這兩種真菌進行混合發酵的可行性、混合發酵條件及發酵產物中抑菌活性的穩定性方面進行了初步研究，為分離純化該抗菌物質打下基礎，從而更有利于將抗菌物質進行商業化生產。9第2章兩種致病疫霉拮抗菌混合發酵及條件優化目前國際上馬鈴薯晚疫病生物防治主要手段之一的拮抗方法進行抑菌試驗時多使用單一菌體進行拮抗，拮抗效果不是非常理想。而把兩種或兩種以上微生物有機地結合在一起混合發酵時，就有可能產生優于單菌發酵的效果[55]。同時劑常常采用各個菌種單獨發酵，在制劑前再將菌體按比例混合的發酵方法。大規模工業生產時若采用這種方法，則必須使用多個發酵罐和使用菌體混合設備，設備成本和操作成本較高[57。目前利用混合發酵拮抗致病疫霉的方法在國內都外鮮有報道。本實驗在郭會婧等單獨發酵的基礎上對進行梨黑斑病菌與白菜黑斑病菌混合發酵，進一步對其進行條件優化，從而總結出混合發酵的最佳發酵條件，為今后實驗或工業生產提供數據支持。2.1實驗材料供試真菌：梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)、白菜黑斑病菌(Altemariabrassicae)為本研究室保存菌種。PDA培養基：馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g、去離子水1000mL。馬鈴薯去皮，切塊煮沸30min,四層紗布過濾，濾液中加20g蔗糖、20g瓊脂，去離子水定容至1000mL,121℃高壓滅菌30min。PDB培養基：馬鈴薯200g、蔗糖20g、去離子水1000mL。黑麥培養基：黑麥60g、蔗糖20g、瓊脂15g、去離子水1000mL。黑麥液體培養基：取60g的黑麥于沸水中煮沸60min后，四層紗布過濾，在濾液中加20g蔗糖，用去離子水定容到1000mL,分裝于250mL的三角瓶中，121℃高壓濕熱滅菌30min。30%H?O?、磷酸、乙醇和丙酮(分析純)。考馬斯亮藍G-250染液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250,溶于50mL的95%乙醇中，再加入100mL85%(w/v)的磷酸，用去離子水定容至1000mL。0.01MTris-HCI(pH8.0):稱取1.2114g的Tris放入1000mL燒杯中，加蒸餾水800mL溶解，用濃鹽酸調pH至8.0,倒入1000mL容量瓶中，加蒸餾水定容冷凍干燥機，冷凍離心機，細菌過濾器，搗碎機，超凈工作臺，生化培養箱，pH2.2.1兩種真菌共培養的確定—對峙培養法梨黑斑真菌和白菜黑斑真菌經PDA培養基25℃活化培養4-7的梨黑斑和白菜黑斑菌菌餅各接于PDA培養基平板對稱的兩側20℃對菌帶。每個處理3次重復。抑菌率(%)=(對照菌落半徑一處理菌落半徑)/對照菌落半徑×1002.2.2拮抗菌混合發酵液的制備在250mL三角瓶中裝入100mLPDB(馬鈴薯蔗糖培養液)培養液，以打孔器分別在25℃靜置培養；拮抗菌混合發酵液經離心(4℃,15000r/min,15min)、過濾除菌(細菌過濾器),濾液4℃保存備用。2.2.3發酵液抑菌活性的測定100ul的混合發酵液，用玻璃涂棒涂布均勻。平板中央接種20℃培養12～15d的致病疫霉菌餅(φ=7mm)一個，另一黑麥培養基平板滴加100ul無菌水，然后接致病疫霉菌餅一個作為前者的對照，20℃恒溫培養箱培養，觀察菌落生長情況。實驗重復三次，第2章兩種致病疫霉拮抗菌混合發酵及條件優化抑菌率=(對照致病疫霉的菌落半徑-處理的致病疫霉菌落半落半徑×100%培養活性的影響。每處理重復3次。試驗重復3次。2.2.5初始pH值方法同2.2.4,在2.2.4確定最佳發酵時間的基礎上，其他條件不變，改變pH值為化對混合培養活性的影響。每處理重復3次。試驗重復3次。方法同2.2.4,在2.2.5確定最佳發酵時間和pH的基礎上，其他條件不變，改變溫度為20℃、23℃、25℃、27℃和30℃,進行發酵液的抑菌活性測定，以確定溫度變化對混合培養活性的影響。每處理重復3次。試驗重復3次。改變為靜置、振蕩20min、靜置20min和振蕩，進行發酵液的抑菌活性測定，以確定振蕩靜置變化對混合培養活性的影響。每處理重復3次。試驗重復3次。條件不變，改變為24h黑暗、20h黑暗4h光照、12h黑暗12h光照、4h黑暗20h光照、每處理重復3次。試驗重復3次。用3個50mL的三角瓶各稱量優化后的混合發酵液10mL,放置于冷凍干燥機中凍干一晝夜，測定代謝產物的干重的平均值，同時得到優化后混合發酵液的濃度。不同濃度的酵液的配制在優化后混合發酵液濃度的基礎上，將酵液分別稀釋為此濃度的90%(6.3mg/mL)、70%(4.9mg/mL)、50%(3.5mg/mL)、30%(2.1mg/mL)和10%(0.7mg/mL),進行抑菌測定，以確定濃度變化對致病疫霉抑制效果的影響，同時進行統計分析，以確定拮抗菌發酵液抑菌的最佳濃度。每處理重復3次。試驗重復3次。2.3結果與分析通過對梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌進行對峙培養的實驗表明，兩種真菌之間無抑菌帶(圖2.1),兩者的菌絲之間無相互抑制作用，故說明梨黑斑真菌與白菜黑斑真菌可以在一起進行混合發酵。在混合發酵的16天中，對致病疫霉抑制效果明顯的天數為4d、6d、8d、10d、14和16d(圖2.2)。其中發酵4天時的抑菌率高達91.96%,培養皿上的致病疫霉菌絲幾習沒有生長，拮抗效果明顯高于白菜黑斑病菌單獨發酵(抑菌率80.51%)[56或梨黑斑病菌單獨發酵(抑菌率70.20%)[56],故可以確定混合發酵條件優化的必要性。發酵8天的抑菌率為73.89%,于對照相比菌絲生長緩慢；而發酵12天的抑菌率明顯降低，為16.11%,菌絲生長與對照接近(圖2.3);在發酵2天時抑菌率最低，為2.04%。河北大學理學碩士學位論文圖2.3混合發酵4、8、12天及對照抑菌效果比較Fig.2.3Comparisonofeffectofinhibitiononmixedcultrue4d,8d,12dandCK2.3.3培養基初始pH的確定生物的生長及其新陳代謝，初期的pH值適應期增長雜菌滋生使發酵菌失去營養競爭優勢，容易造成發酵失敗。混合發酵四天，進行抑菌試驗，兩種真菌不同pH的混合發酵液對致病疫霉菌絲生長在偏酸性有很強的抑制作用，其抑菌率均高于60.19%,pH接近原始發酵液pH時，抑菌效果顯著曾加，在原始pH6.29時抑菌率達到最高，為92.11%(圖2.4)。pH在原始pH下混合發酵四天后，抑菌試驗表明：試驗中測定了不同培養溫度對混合發酵產物抑菌活性的影響(圖2.5)。結果表明在20℃-25℃范圍內，所得混合發酵產物隨溫度升高抑菌率逐漸增加并達到最高，抑菌率由52.48%升至90.85%,但溫度繼續升高至27℃或30℃時，抑菌率急劇下降(不到20%)。以下各項試驗中混合發酵的培養溫度確定為25℃。溫度(℃)振蕩或靜置培養對混合發酵產物的抑菌活性有顯著影響。由圖2.6可見，在24h連續靜置和24h連續靜置中只振蕩20min的條件下，所得混合發酵產物的抑菌率可分別達到91.48%和84.26%,相反，在24h連續振蕩和24h連續振蕩中只靜置20min的條件下，所得混合發酵產物的抑菌率僅分別為9.26%和3.33%。以下各項試驗中混合發酵均在靜置條件下進行。靜置振蕩20min靜置20min震蕩ck靜置振蕩光照或黑暗培養對混合發酵產物的抑菌活性也有顯著影響。由圖2.7可見，在24h連續黑暗、20h黑暗/4h光照、以及12h黑暗/12光照條件下，所得混合發酵產物的抑菌率可分別達到91.11%、86.11%和55%,而在4h黑暗/20h光照及24h連續光照條件下，所得混合發酵產物均明顯的抑菌作用，抑菌率不到3%。因此混合發酵試驗宜在24h連續黑暗的條件下進行。黑暗光照混合酵液代謝物干重的測定凍干后稱重后得到的物質干重為7mg,故可以得到優化后的混合發酵液的濃度為7mg/mL。酵液按原液90%、70%、50%、30%和10%稀釋后，濃度分別為18.9mg/mL、濃度(mg/mL)抑菌率(%)顯著性差異Significance7aACcCdD00e在優化后的最佳發酵條件下(4d、pH6.29、25℃、靜置、黑暗)進行抑菌試驗，隨著濃度的降低，發酵液抑菌效果基本呈下降趨勢(表2.1)。與酵液濃度為0mg/mL的對照相比，發酵原液(濃度為7mg/mL)的抑菌率為92.15%,抑菌率明顯高于其他濃度，抑菌效果最佳。但工業化生產注重成本，故對不同濃度發酵液的抑菌率進行了方差分析，對工業化大生產而言，混合發酵液濃度為2.1mg/mL時效果最佳，其抑菌率為74.44%。利用拮抗微生物及其發酵產物抑制植物病原菌從而控制植物病害，已有多年的研究歷史，并由此已開發出一些生防制劑用以植物病害的有效防治[物的作用強度、穩定性等均有一定的局限性[59,導致許多生防制劑在室內、盆栽或溫室因此，將不同拮抗微生物單獨發酵后的產物混合或直接將不同拮抗微生物進行混合發酵，借助于發酵過程使不同拮抗微生物的發酵產物能夠互補、協同或增效，獲得混合環保、食品、酶制劑[6-62]等方面均有廣泛應用，但在生物防治中[63等將2株抑菌范圍不同的海洋微生物菌株，進行混合發酵條件優化，結果有效的提高了菌株產生代謝產物的抑菌活性，其抑菌活性比單獨發酵提高200%,證明了2株菌株混合發酵的協同效應大于單獨發酵混合后的累加效應，對靶標真菌的致畸作用明顯。屈寧等[64報道的利用甲殼素作為唯一碳源從土壤中篩得的真菌，與細菌混合發酵，結果也表明混合發酵產酶的能力與單獨發酵相比顯著提高；武忠偉等[65的冬蟲夏草與韓芝液體混合發酵條件研究也表明混合發酵在未來研究中的優勢地位。朱峰[66對兩株南海紅樹內生真菌的混合發酵實驗也充分證明了混合發酵技術有可能成為尋找新穎代謝產物的有效途徑。在植物病害防治方面，郭會婧等將拮抗微生物單獨發酵的產物混合后進行抑菌試驗，發現混合后的發酵產物抑菌效果明顯優于單一微生物發酵產物[56],但將不同拮抗微生物進行混合發酵在植物病害生物防治中還不多見，尤其是在防治馬鈴薯晚疫病中還未見報道。郭會婧等67報道在發酵產物相同濃度下(10mg/mL),梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌發酵液對致病疫霉菌絲生長的的抑菌率分別為74.8%和67.8%,而將其等體積混合后的菌率為89.8%,表明兩種拮抗菌的發酵產物混合后可能產生了協同或增效作用。本研究將兩種拮抗菌混合發酵后所得產物在濃度為7mg/mL時的抑菌率為92.15%,明顯高于郭會婧等報道的濃度10mg/mL下最高抑菌率89.8%,表明了混合發酵對抑制致病疫霉的優勢地位。而因此未來可以進一步研究應用混合發酵拮抗菌的代謝產物或者分離物制成生防試劑來抑制或破壞致病疫霉的生長，從而降低和控制晚疫病的發生[6方法抑制病害的產生，不僅是現在世界生物研究的潮流，也是充分利用生物資源的很好方法。本實驗還可以進一步測定酵液活性等指數，深入研究抗菌機制以及抑菌物質的組成等問題，為今后分離純化抗菌物質，深入研究功能基因奠定基礎。第3章混合發酵液中抑菌物質對環境的穩定性及抑菌機理白菜黑斑病菌與梨黑斑病菌混合發酵液對致病疫霉有顯著的抑制作用，兩者均屬于真菌組合，其酵液中的抗菌物質的性質如何，對菌株在生產中的應用有直接影響。單一生防制劑在田間防病效果具有不穩定性，利用多菌種混合發酵制成的混合制劑有可能增強并穩定生防制劑的防病效果，減少化學農藥所造成的污染，如井岡霉素與多菌靈復配對小麥赤霉病[69和復合菌劑AR99對辣椒青枯病[70均有很好的防治效果，這使得開發復配制劑成為生物農藥發展的重要方向[71]。本試驗對白菜黑斑病菌的代謝產物進行初步的穩定性研究，測定混合酵液的穩定性，為今后進一步純化分離酵液成分和田間應用，開發低成本復合型生物農藥提供理論依據。供試真菌：梨黑斑病菌(Alternariakikuchiana)、白菜黑斑病菌(Altemariabrassicae)為本研究室保存菌種。略，見2.1.2,2.1.3和實驗方法把經過濾除菌的白菜黑斑病菌發酵液原液在超凈工作臺內分裝于5支離心管中，分別在40℃、60℃、80℃和100℃處理30min及經高溫濕熱滅菌(121℃)處理30min后，冷卻至室溫，以未經處理的發酵原液作為對照，以致病疫霉為供試菌采用涂布片法進行抗菌物質活性測定，根據抑菌率的變化情況來確定抗菌物質的熱穩定性。實驗重復3次。于5個無菌小三角瓶(50mL)中各加入白菜黑斑病菌的發酵液原液20mL,以1mol/HC1和1mol/LNaOH分別用酸度計調pH值為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0的溶液，放4h后再調回到原pH值(7.0),以未經處理的發酵液原液作對照，以致病疫霉為供試菌進行抗菌物質活性測定，比較抗菌物質生物活用撥針挑取受白菜黑斑病菌發酵液和梨黑斑病菌混合發酵液抑制的致病疫霉菌落用優化后的混合發酵液浸泡致病疫霉5、10、15、20、25和30min,然后取無菌水在黑麥培養基上培養10-12d致病疫霉的菌落邊緣打孔，取直徑7mm的菌餅接種于黑麥液體培養基中(6片菌餅/100mL),20℃靜置培養20d。所確定的最佳抑菌濃度(21mg/mL),分別處理4h、8h、16h、32h,以不加發酵液處理的為對照，收集抽濾后的濕菌絲；準確稱取各處理樣5000r/min離心30min后，取上清液靜置2h,再經4℃、14000r/min離心50min后，取(1)標準曲線繪制原液。分別取原液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.第3章混合發酵液中抑菌物質對環境的穩定性及抑菌機理(2)樣品蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250比色法[72]:準確吸取0.1mL各處理樣品，放于10mL具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍G-250染色劑，將試管中的溶液來回倒轉使溶液混勻后放置2min,用1cm厚的比色杯在595nm下比色，分別測定相應樣品中可溶性蛋白的含量。3.3結果與分析抑菌試驗表明：在不同溫度下處理30min后，復合發酵液對致病疫霉的抑菌活性呈下降的趨勢(圖3.1);其中以121℃高壓滅菌30min的發酵液抑菌活性相對于對照降低的最多(26.9%),其抑菌率為66.78%,但仍保留有73.2%的活性。表明復合發酵液中抗菌物質具有很強的熱穩定性。3.3.2不同pH對抗菌物質活性的影響抑菌試驗表明：經不同pH處理后的發酵液對致病疫霉的抑菌活性均低于對照，在不同pH值之間抑菌活性的差別不大(圖3.2)。經pH2和pH10處理后，其對致病疫霉的抑菌率分別為68.67%和70.92%,各保留75%和78%的抑菌活性，結果表明復合發酵液中的抗菌物質具有較好的耐強酸、強堿性。顯微鏡下觀察復合發酵液對致病疫霉菌絲形態的影響，受抑制的致病疫霉菌絲或變得粗大或變得纖細；菌絲體里面的內含物發生聚集，細胞壁不光滑。接種于黑麥培養基上的經優化后混合發酵液浸泡過的致病疫霉，無論浸泡5、10、15、20、25和30min,其菌柄周圍均無明顯菌絲體生長，可以確定混合發酵液破壞了致病疫霉的生長。0.1處理時間(h)經7mg/mL白菜黑斑病菌發酵液和梨黑斑病菌混合發酵液處理后，致病疫霉菌絲體的可溶性蛋白含量均低于對照(48.9mg/mL)。其中處理32h后可溶性蛋白含量最低 (26.33mg/mL),整體上可溶性蛋白的含量呈下降勢，表明混合發酵液處理致病疫霉菌絲后，均可抑制其蛋白質的合成。任何一株單一菌株，可達91.1%;楊秀芬等[74]在盆載試驗中發現嗜線蟲致病桿菌發酵劑分別與植物生長調節劑赤霉素、α-萘乙酸和3-吲哚乙酸進行復配，測定3種復配制劑的毒力及田間小區試驗藥效。結果表明：3種復配制劑的毒力分別是原藥劑的5.0、1.5、3.4倍，田間小試驗表明加有1000mg·L-劑，藥后7d均能達到2000mg·L-1百草枯的防治效果，并能延遲雜草返青時間2周左1.梨黑斑病菌與白菜黑斑病菌之間對峙培養無抑菌帶，可以進行混合發酵。2.最佳發酵條件為初始pH6.29,在25℃下黑暗中靜置培養4d。3混合發酵提高了發酵液的抑菌活性，7mg/mL的發酵液其抑菌率為92.15%。4.混合發酵液中的抗菌物質具有很強的熱穩定性(可耐121℃高溫)和較強的耐強酸及強堿性(pH2和pH10)。5.混合發酵液可使致病疫霉菌絲體的可溶性蛋白含量均明顯低于對照，表明混合發酵液抑制致病疫霉菌絲蛋白質的合成。河北大學理學碩士學位論文[1]馮延江.馬鈴薯晚疫病及其綜合防治[J].中國馬鈴薯，2002,16(5):302-303.[2]李勤志.我國馬鈴薯產業的經濟分析[D].華中農業碩士學位論文.2005.[4]袁軍海.我國馬鈴薯晚疫病的發生與防治[J].南京農專學報，2003,(2):46-50.[6]王冰林.馬鈴薯晚疫病水平抗性相關基因誘導表達譜及水平抗性機制初探[D].華中農業大學博士學位論文.2005.[7]楊艷麗，羅文富，ChujoyE,等.馬鈴薯無性系對晚疫病的抗病配合力分析[J].山東農業大學學報，200[8]浙江農業大學.農業植物病理學[M].上海：上海科學技術出版社，1979.[9]何衛，張志銘.世界馬鈴薯晚疫病大會簡介[J].馬鈴薯雜志，1999,13(3):182-183.[11]李汝剛，范云六.表達Harpin蛋白的轉基因馬鈴薯降低晚疫病斑生長率[J].中國科學(C輯，1999,[12]李汝剛，伍寧豐，范云六，等.表達Osmotin蛋白的轉基因馬鈴薯對晚疫病的抗性分析[J].生物工程學[13]張立平，楊靜華，李天然，等.表達葡萄糖氧化酶基因抗晚疫病馬鈴薯的培育[J].河北農業大學學報，2001,24(2):59-64.[14]楊希才，劉國勝，王文慧，等.轉無毒基因馬鈴薯抗晚疫病的研究[J].河北農業大學學報，2001,24(2):[15]王金生.分子植物病理學[M].北京：中國農業出版社，1999.[16]華淑英，苗興芬，徐文平.馬鈴薯晚疫病防治技術[J].農業與技術.2006,26(4):124-126.[17]丁海濱，盧揚，鄧祿軍.馬鈴薯晚疫病發病機理及防治措施[J].貴州農業科學，2006,34(5):76-80.[18]楊志輝，張志銘，朱杰華，等.致病疫霉(Phytophthorainfestans)對殺菌劑抗藥性研究進展[J].河北農業大學學報，2001,24(1):104-107.[19]李煒，張志銘，樊慕貞.馬鈴薯晚疫病對瑞毒霉抗性的測定[J].河北農業大學學報，1998,21(3):63-65參考文獻[20]KatoM,MizubutiES,GoodwinSessofclonallineagesofPhytophthorainfestansintheUnitedState[J].Phytopathology,1997,87:973-978.2002,25(增刊):187-189.[25]王晨芳.化學誘導劑在誘導黃瓜抗病性中的作用[D]陜西：西北農林科技大學，2005.[26]李惠霞.β-氨基丁酸誘導辣椒對疫病抗性及其作用機理的研究[D].甘肅：甘肅農業大學，2000.[27]王榮.不同誘抗劑誘導新疆彩棉抗枯萎病研究[D].新疆：新疆大學，2004.[28]CoquozL,BuchalaAJ,MeuwlyPH.ArachidonicacidinduofsalicylicacidandconferssystemicresistaAlternariasolani[J].Phytopathology,1995,85:1219-1224.[29]DokeN,RamirezA.V,TomiyamaK.SystemicinductionofresistancePIbylocaltreatmentwithHWCofthefuguns[J].Phytopathology,1987,119:232-239.[30]YigalCohen,UirichGishi,EgonMosiger.Systemicresistenceofpotatoplantsagainsththorainfestansinducedbyunsaturatedfattyacids[J].Plogy,1991,38:255-263.[31]YigalCohen,UlrichGisi,TherryNiderman.orainfestansinducedinpotatoandtomatoplantsbyjasmonicacier[J].Phytopathology,1993,83:1054-1062.[34]Sung-EunLee,Byeoung-SooPark,Moo-KeyKim,etal.Fungicidalactivityofapiperidinealkaloidderivedfromlongpepper,Piperli[J].CropProtection,2001,20:523-528.河北大學理學碩士學位論文(2):145-151.[37]曹克強，ArienaHC,VanBruggen.兒種植物提取物和天然產物對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用[J].[39]FakhouriW,WalkerF,VoglerB,etal.IsolationandidentificationofN-mercapto-4-formylcarbostyril,an